CN106833623A - 一种荧光探针及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种荧光探针，如式(I)所示；其中，R1与R2各自独立地选自H或芳香乙烯基团，且至少一个为芳香乙烯基团；R3选自H、F、Cl、Br、OH、OCH3、N(CH3)2或C1～C6的烷基；R4选自C1～C6的烷基。与现有技术相比，本发明提供的荧光探针由于具有较大的电子共轭体系和平面，探针分子内的电荷转移效应的强弱可以影响分子的荧光发射强度，当与G‑四链体结构发生特异性的作用后，分子内的可转动的双键的柔性受到限制，使分子内电荷转移效应增强，荧光也有明显增强；并且本发明提供的荧光探针具有较低的生物毒性、光毒性和光漂白性，光稳定性较好，也具有良好的水溶性和良好的细胞膜通透性。

Description

一种荧光探针及其制备方法
技术领域
本发明属于核酸检测技术领域，尤其涉及一种荧光探针及其制备方法。
背景技术
核酸不但是一切生物细胞的基本成分，还对生物体的生长、发育、繁殖、遗传及变异等重大生命现象起主宰作用。核酸大分子分为两类：脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，在蛋白质的复制和合成中起着储存和传递遗传信息的作用。
G-四链体(G-quadruplex)是一种特殊的核酸二级结构。人类基因组中很多富鸟嘌呤区域具有形成这一结构的能力，包括端粒末端鸟嘌呤重复序列，以及多种基因的启动子区域，如c-kit、c-myc、c-myb、Bcl-2、Pdgf、Hras、Vegf、Rb和胰岛素基因等。G-四链体结构具有多态性，链的数量和取向、loop的连接方式以及鸟嘌呤的糖苷扭转角以及与羰基负电中心配位的金属离子等多方面决定了G-四链体的类型和构象，这些差异性也为蛋白和小分子化合物提供了多个识别位点。根据链的取向不同，G-四链体分为正平行，反平行与混合型三种构象。
G-四链体结构的形成对于体内的一系列生理过程都存在调控作用。研究证明，某些启动子区域的G-四链体结构会显著影响基因的转录和翻译水平，因此G-四链体结构被认为是起到分子开关的功能，其形成和拆散可能涉及到信号传导、细胞凋亡和细胞增殖等一系列体内重要的生理过程。所以，在体内或者体外试验中，能够特异性地检测出G-四链体结构的存在或者形成，对于研究G-四链体结构的相关生物学功能以及开发以G-四链体结构为靶点的抗癌药物等方面都具有非常重要的作用。
随着生物技术的发展，对于核酸标记的要求越来越高，以往通过同位素效应来进行DNA分子测序的方法已经无法满足需求，而荧光标记作为一种具有检测速度快、重复性好、用样量少、无辐射等优点的标记技术受到广泛重视，并取得迅速发展。目前，已经发现的染色剂有卟啉类、菁类、苯乙烯类等，但是他们的合成的染色剂并没有给今后的工作提供一个简单、可靠成熟的参考性及给下一步的合成提供一个指导的意义，且其对G-四链体的应刚性与选择性并不高。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种对G-四链体具有较高的荧光响应与选择性的荧光探针及其制备方法。
本发明提供了一种荧光探针，如式(I)所示：
其中，R1与R2各自独立地选自H或芳香乙烯基团，且至少一个为芳香乙烯基团；
R3选自H、F、Cl、Br、OH、OCH3、N(CH3)2或C1～C6的烷基；
R4选自C1～C6的烷基。
优选的，所述芳香乙烯基团选自式(1)～式(4)中的一种：
其中，R5～R11各自独立地选自H、F、Cl、Br、OH、OCH3、N(CH3)2、C1～C6的烷基或C3～C6的环烷基；
X、Y各自独立地为C或N，且不同时为N。
优选的，如式(2a)～(2h)的一种所示：
本发明还提提供了一种荧光探针的制备方法，包括：
将式(II)所示的化合物与芳香醛反应，得到式(I)所示的荧光探针；
其中，R1与R2各自独立地选自H或芳香乙烯基团，且至少一个为芳香乙烯基团；
R3选自H、F、Cl、Br、OH、OCH3、N(CH3)2或C1～C6的烷基；
R4选自C1～C6的烷基；
R12与R13各自独立地选自H或CH3，且不同时为H。
优选的，所述式(II)所示的化合物按照以下方法制备：
将式(III)所示的化合物与烷基碘反应，得到式(II)所示的化合物；
其中，R3选自H、F、Cl、Br、OH、OCH3、N(CH3)2或C1～C6的烷基；
R12与R13各自独立地选自H或CH3，且不同时为H；
所述烷基碘中烷基的碳原子数为1～6。
优选的，所述芳香醛选自式(IV)～式(VII)中一种：
其中，R5～R11各自独立地选自H、F、Cl、Br、OH、OCH3、N(CH3)2、C1～C6的烷基或C3～C6的环烷基；
X、Y各自独立地为C或N，且不同时为N。
本发明还提供了上述荧光探针在检测核酸G-四链体结构中的应用。
本发明还提供了上述荧光探针在检测水溶液中核酸G-四链体结构中的应用。
本发明还提供了上述荧光探针在检测琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶中核酸G-四链体结构中的应用。
本发明还提供了上述荧光探针在检测细胞中核酸G-四链体结构中的应用。
本发明提供了一种荧光探针，如式(I)所示；其中，R1与R2各自独立地选自H或芳香乙烯基团，且至少一个为芳香乙烯基团；R3选自H、F、Cl、Br、OH、OCH3、N(CH3)2或C1～C6的烷基；R4选自C1～C6的烷基。与现有技术相比，本发明提供的荧光探针由于具有较大的电子共轭体系和平面，探针分子内的电荷转移效应的强弱可以影响分子的荧光发射强度，当与G-四链体结构发生特异性的作用后，分子内的可转动的双键的柔性受到限制，使分子内电荷转移效应增强，荧光也有明显增强；同时，该类探针的分子结构的柔性的共轭平面，具有可以转动的键，使其可以比较容易堆积在G-四分体的平面上，进而与G-四链体具有较强的作用力，同时与其他二级结构的核酸作用较弱，因此，将该探针与不同二级结构的核酸混合时，如果该核酸是G-四链体结构时，其与探针分子间的特异性作用，产生荧光光谱的改变，当核酸的二级结构为其他结构时，则不会产生明显的信号变化；并且本发明提供的荧光探针具有较低的生物毒性、光毒性和光漂白性，光稳定性较好，也具有良好的水溶性和良好的细胞膜通透性。
附图说明
图1是本发明实施例9中得到的化合物2e与AT、Da21、Ds26、Telo21、Bcl-2、RNA六种核酸在1:1浓度下的荧光谱图；
图2是本发明实施例9中得到的化合物2e滴定G-四链体DNA(Talo21)的荧光谱图；
图3是本发明实施例9中得到的化合物2e滴定G-四链体DNA(Talo21)的荧光光谱中C与F-F0)/F0拟合的曲线图；
图4是本发明实施例9中得到的化合物2e与双链DNA(Ds26、At)、单链DNA(Da21)、RNA和G-四链体(Bcl-2、Telo21)的聚丙酰胺凝胶电泳图；
图5是本发明实施例9中得到的化合物2e、染料DAPI染PC3细胞和2e与染料DAPI复染PC3细胞的成像图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种荧光探针，如式(I)所示：
其中，R1与R2各自独立地选自H或芳香乙烯基团，且至少一个为芳香乙烯基团；
R3选自H、F、Cl、Br、OH、OCH3、N(CH3)2或C1～C6的烷基，优选选自H、F、Cl、Br、OH、OCH3、N(CH3)2或C1～C4的烷基，更优选选自H、F、Cl、Br、OH、OCH3、N(CH3)2或C1～C2的烷基；
R4选自C1～C6的烷基，优选为C1～C4的烷基，更优选为C1～C3的烷基，再优选为C1～C2的烷基。
按照本发明，所述芳香乙烯基团为本领域技术人员熟知的芳香乙烯基团即可，并无特殊的限制，本发明中其优选为C8～C20的芳香乙烯基团，更优选为C8～C15的芳香乙烯基团，再优选为式(1)～式(4)中的一种：
其中，R5～R11各自独立地选自H、F、Cl、Br、OH、OCH3、N(CH3)2、C1～C6的烷基或C3～C6的环烷基；
X、Y各自独立地为C或N，且不同时为N。
更优选的，如式(2a)～(2h)的一种所示：
本发明提供的荧光探针由于具有较大的电子共轭体系和平面，探针分子内的电荷转移效应的强弱可以影响分子的荧光发射强度，当与G-四链体结构发生特异性的作用后，分子内的可转动的双键的柔性受到限制，使分子内电荷转移效应增强，荧光也有明显增强；同时，该类探针的分子结构的柔性的共轭平面，具有可以转动的键，使其可以比较容易堆积在G-四分体的平面上，进而与G-四链体具有较强的作用力，同时与其他二级结构的核酸作用较弱，因此，将该探针与不同二级结构的核酸混合时，如果该核酸是G-四链体结构时，其与探针分子间的特异性作用，产生荧光光谱的改变，当核酸的二级结构为其他结构时，则不会产生明显的信号变化；并且本发明提供的荧光探针具有较低的生物毒性、光毒性和光漂白性，光稳定性较好，也具有良好的水溶性和良好的细胞膜通透性。
本发明还提供了一种上述荧光探针的制备方法，包括：
将式(II)所示的化合物与芳香醛反应，得到式(I)所示的荧光探针；
其中，R1与R2各自独立地选自H或芳香乙烯基团，且至少一个为芳香乙烯基团；
R3选自H、F、Cl、Br、OH、OCH3、N(CH3)2或C1～C6的烷基；
R4选自C1～C6的烷基；
R12与R13各自独立地选自H或CH3，且不同时为H。
其中，所述R1～R11均同上所述，在此不再赘述。
按照本发明，所述式(II)所述的化合物优选按照以下方法制备：
将式(III)所示的化合物与烷基碘反应，得到式(II)所示的化合物；
其中，R3选自H、F、Cl、Br、OH、OCH3、N(CH3)2或C1～C6的烷基；
R12与R13各自独立地选自H或CH3，且不同时为H；
所述烷基碘中烷基的碳原子数为1～6，优选为1～4，更优选为1～3，再优选为1～2。
将式(III)所示的化合物与烷基碘反应；所述式(III)所示的化合物与烷基碘的摩尔比优选为1：(1～10)，更优选为1：(3～8)，再优选为1：(4～8)，最优选为1:6；所述反应的温度优选为60℃～80℃，更优选为70℃～80℃，再优选为70℃；所述反应的时间优选为4～10h，更优选为4～8h，再优选为6～8h，最优选为6h；该反应优选在有机溶剂中进行，所述有机溶剂为本领域技术人员熟知的有机溶剂即可，并无特殊的限制，本发明中优选为环丁砜。反应结束后，优选加入无水乙醚振荡，抽滤，固体用无水乙醚洗涤后，得到式(II)所述的化合物。
将式(II)所示的化合物与芳香醛反应；所述芳香醛为本领域技术人员熟知的芳香醛即可，并无特殊的限制，本发明中优选为C7～C19的芳香醛，更优选为C7～C14的芳香醛，再优选为式(IV)～式(VII)中的一种：
其中，R5～R11各自独立地选自H、F、Cl、Br、OH、OCH3、N(CH3)2、C1～C6的烷基或C3～C6的环烷基；
X、Y各自独立地为C或N，且不同时为N。
按照本发明，所述式(II)所示的化合物与芳香醛的摩尔比优选为1：(1～4)，更优选为1：(2～4)，再优选为1：(2～3)；式(II)所示的化合物与芳香醛反应的反应温度优选为100℃～150℃，更优选为110℃～140℃，再优选为120℃；所述反应的时间优选为1～5h，更优选为2～4h，再优选为3h；该反应优选在有机溶剂中进行，所述有机溶剂为本领域技术人员熟知的有机溶剂即可，并无特殊的限制，本发明中优选为醇溶剂，更优选为正丁醇；在本发明中，该反应体系中优选还加入有机碱；所述有机碱为本领域技术人员熟知的有机碱即可，并无特殊的限制，本发明中优选为4-甲基哌啶。
反应结束后，优选冷却后抽滤，用正丁醇与冰水配置的混合溶液洗涤，得到荧光探针。
本发明提供的荧光探针制备方法简单，易得，并且结构稳定，便于储存；该荧光探针具有较低的生物毒性、光毒性和光漂白性，且光稳定性佳，具有良好的水溶性和良好的细胞膜通透性；且该荧光探针的光谱范围与生物样品的光谱范围有足够大的差异，在非G-四链体存在的溶液及细胞内具有较低的荧光背景，因此可以特异性地检测识别G-四链体结构，实现了G-四链体结构与其他二级结构的区分，用简单的荧光光谱仪，甚至只需普通紫外灯照射下，肉眼观察就可以识别出核酸样品的二级结构，快捷，操作简便，成本低廉，并且可以实现实地检测。
本发明还提供了上述荧光探针在检测核酸G-四链体结构中的应用。
本发明还提供了上述荧光探针在检测水溶液中核酸G-四链体结构中的应用。
本发明还提供了上述荧光探针在检测琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶中核酸G-四链体结构中的应用。
本发明还提供了上述荧光探针在检测细胞中核酸G-四链体结构中的应用。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种荧光探针及其制备方法进行详细描述。
以下实施例中所用的试剂均为市售。
实施例1：化合物1a的合成
往25ml圆底烧瓶里称取2-二甲基喹哪啶0.2g(1.400mmol)，加入6倍摩尔量的碘甲烷约1.2g，环丁砜5.0ml，将混合物加热到70℃，反应6个小时后，冷却，加入无水乙醚后震荡，抽滤，固体用无水乙醚洗涤，真空干燥后称重，薄层色谱法初步表明没有副产物，得到0.355g纯品1a，化学结构式如下，产率为89.0％。
利用核磁共振对实施例1中得到的化合物1a进行分析，得到其核磁共振氢谱结果：1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.11(d,J＝8.5Hz,1H),8.60(d,J＝9.0Hz,1H),8.38(t,J＝15.7Hz,1H),8.23(t,J＝7.5Hz,1H),8.13(d,J＝8.5Hz,1H),7.99(t,J＝7.5Hz,1H),4.46(s,3H),3.09(s,3H)。
利用质谱仪对实施例1中得到的化合物1a进行分析，得到其质谱结果：ESI-MS m/z:158.2[M+H]+。
实施例2：化合物1b的合成
本实施例的制备方法除了用4-二甲基喹哪啶代替2-二甲基喹哪啶外，其余同实施例1，为褐色固体，化学结构式如下，产率为91.7％。
利用核磁共振对实施例2中得到的化合物1b进行分析，得到其核磁共振氢谱结果：1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.38(d,J＝6.0Hz,1H),8.53(d,J＝8.4Hz,1H),8.49(d,J＝8.9Hz,1H),8.27(t,J＝7.9Hz,1H),8.07(t,J＝6.3Hz,2H),4.59(s,3H),3.00(s,3H)。
利用质谱仪对实施例2中得到的化合物1b进行分析，得到其质谱结果：ESI-MS m/z:158.2[M+H]+。
实施例3：化合物1c的合成
本实施例的制备方法除了用2，4-二甲基喹哪啶代替2-二甲基喹哪啶外，其余同实施例1，为褐色固体，化学结构式如下，纯品1c，产率为94.2％。
利用核磁共振对实施例3中得到的化合物1c进行分析，得到其核磁共振氢谱结果：1HNMR(400MHz,DMSO)δ8.51(d,J＝9.0Hz,1H),8.45–8.36(m,1H),8.23–8.09(m,1H),8.00(s,1H),7.94(t,J＝7.6Hz,1H),4.35(s,3H),2.99(s,3H),2.88(s,3H)。
利用质谱仪对实施例3中得到的化合物1c进行分析，得到其质谱结果：ESI-MS m/z:172.2[M+H]+。
实施例4：化合物1d的合成
本实施例的制备方法除了用8-溴-1,2-二甲基喹啉代替2-二甲基喹哪啶外，其余同实施例1，为褐色固体，化学结构式如下，纯品1d，产率为91.3％。
利用核磁共振对实施例4中得到的化合物1d进行分析，得到其核磁共振氢谱结果：1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.12(d,J＝8.7Hz,1H),8.13(d,J＝8.5Hz,1H),7.55(t,J＝7.5Hz,1H),7.33(t,J＝15.7Hz,1H),7.23(t,J＝7.5Hz,1H),4.46(s,3H),3.10(s,3H)。
利用质谱仪对实施例4中得到的化合物1d进行分析，得到其质谱结果：ESI-MS m/z:237.2[M+H]+。
实施例5：化合物2a的合成
称取0.100g(0.334mmol)的1a于25ml的圆底烧瓶中，加入2倍摩尔量的吲哚-3-甲醛0.194g、正丁醇5.0ml、4-甲基哌啶5滴，在120℃下反应3个小时，冷却后抽滤，用正丁醇和冰水配置的混合溶液洗涤固体，真空干燥称重后得0.133g，为红色固体即为化合物2a，其结构式如下，产率91.2％。
利用核磁共振对实施例5中得到的化合物2a进行分析，得到其核磁共振氢谱结果：1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.31(s,1H),8.81(d,J＝9.1Hz,1H),8.64(d,J＝15.5Hz,1H),8.60(d,J＝9.2Hz,1H),8.44(d,J＝8.9Hz,1H),8.40(d,J＝2.8Hz,1H),8.31–8.17(m,2H),8.08(t,J＝7.7Hz,1H),7.84(t,J＝7.5Hz,1H),7.64–7.48(m,2H),7.31(dd,J＝5.9,3.0Hz,2H),4.46(s,3H)。
利用质谱仪对实施例5中得到的化合物2a进行分析，得到其质谱结果：ESI-MS m/z:271.3[M+H]+。
实施例6:化合物2b的合成
本实施例的制备方法除了用吲哚-2-甲醛代替吲哚-3-甲醛外，其余同实施例5，产物为暗红色固体即为化合物2b，其结构式如下，产率为90.2％。
利用核磁共振对实施例6中得到的化合物2b进行分析，得到其核磁共振氢谱结果：1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.94(s,1H),9.29(d,J＝6.5Hz,1H),8.90(d,J＝8.4Hz,1H),8.49(d,J＝6.5Hz,1H),8.45(d,J＝8.9Hz,1H),8.35–8.22(m,3H),8.12(t,J＝7.7Hz,1H),7.66(d,J＝7.9Hz,1H),7.50(d,J＝8.2Hz,1H),7.29(t,J＝7.6Hz,1H),7.08(dd,J＝14.8,7.1Hz,2H),4.52(s,3H)。
利用质谱仪对实施例6中得到的化合物2b进行分析，得到其质谱结果：ESI-MS m/z:271.3[M+H]+。
实施例7:化合物2c的合成
本实施例的制备方法除了用1b代替1a和吲哚-2-甲醛代替吲哚-3-甲醛外，其余同实施例5，产物为暗红色固体即为化合物2c，其结构式如下，产率为90.2％。
利用核磁共振对实施例7中得到的化合物2c进行分析，得到其核磁共振氢谱结果：1HNMR(400MHz,DMSO)δ11.99(s,1H),9.00(d,J＝9.0Hz,1H),8.60(d,J＝9.1Hz,1H),8.52(d,J＝9.0Hz,1H),8.34(dd,J＝11.3,6.5Hz,2H),8.21–8.14(m,1H),7.93(t,J＝7.5Hz,1H),7.83(d,J＝15.7Hz,1H),7.68(d,J＝8.0Hz,1H),7.51(d,J＝8.2Hz,1H),7.31(t,J＝7.3Hz,1H),7.14(s,1H),7.10(t,J＝7.4Hz,1H),4.54(s,3H)。
利用质谱仪对实施例7中得到的化合物2c进行分析，得到其质谱结果：ESI-MS m/z:271.3[M+H]+.
实施例8:化合物2d的合成
本实施例的制备方法除了用1b代替1a外，其余同实施例5，产物为砖红色即为化合物2d，其结构式为如下，产率为89.1％。
利用核磁共振对实施例8中得到的化合物2d进行分析，得到其核磁共振氢谱结果：1HNMR(400MHz,DMSO)δ12.15(s,1H),9.11(d,J＝6.7Hz,1H),8.97(d,J＝8.6Hz,1H),8.57(d,J＝15.6Hz,1H),8.42(d,J＝6.7Hz,1H),8.34(d,J＝6.6Hz,2H),8.26(dd,J＝6.1,2.6Hz,1H),8.24–8.17(m,1H),8.01(dd,J＝15.6,9.0Hz,2H),7.62–7.50(m,1H),7.29(dd,J＝5.9,3.0Hz,2H),4.44(s,3H)。
利用质谱仪对实施例8中得到的化合物2d进行分析，得到其质谱结果：ESI-MS m/z:271.3[M+H]+。
实施例9：化合物2e的合成
称取0.100g(0.334mmol)的化合物1c于25ml的圆底烧瓶中，加入2倍摩尔量的吲哚-3-甲醛0.194g、正丁醇5.0ml、4-甲基哌啶5滴，在120℃下反应3个小时，冷却后抽滤，用正丁醇和冰水配置的混合溶液洗涤固体，真空干燥称重后得0.165g，为黑色固体即为化合物2e，化学结构式如下，产率89.2％。
利用核磁共振对实施例9中得到的化合物2e进行分析，得到其核磁共振氢谱结果：1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.05(s,1H),8.77(d,J＝8.2Hz,1H),8.63(d,J＝14.3Hz,1H),8.59–8.49(m,1H),8.36(d,J＝8.8Hz,1H),8.30(s,1H),8.29–8.18(m,2H),8.08(t,J＝7.7Hz,1H),7.94(s,1H),7.86(dd,J＝16.7,9.0Hz,1H),7.58–7.48(m,2H),7.32–7.25(m,2H),4.37(s,2H)。
利用质谱仪对实施例9中得到的化合物2e进行分析，得到其质谱结果：ESI-MS m/z:553.5[M+H]+。
实施例10：化合物2f的合成
本实施例的制备方法除了用吲哚-2-甲醛代替吲哚-3-甲醛外，其余同实施例9，产物为黑褐色即为化合物2f，其结构式如下，产率为83.9％。
利用核磁共振对实施例10中得到的化合物2f进行分析，得到其核磁共振氢谱结果：1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.01(s,2H),12.01(s,2H),8.79(d,J＝8.2Hz,1H),8.67(s,1H),8.57(dd,J＝22.0,15.7Hz,2H),8.38(d,J＝8.9Hz,1H),8.31–8.23(m,4H),8.09(t,J＝7.7Hz,1H),7.94(d,J＝15.8Hz,1H),7.86(t,J＝7.6Hz,1H),7.58–7.51(m,3H),7.29(ddd,J＝9.5,6.1,3.1Hz,4H),4.39(s,3H)。
利用质谱仪对实施例10中得到的化合物2f进行分析，得到其质谱结果：ESI-MS m/z:553.5[M+H]+。
实施例11：化合物2g的合成
本实施例的制备方法除了用1d代替1a外，其余同实施例5，产物为黑褐色固体即为化合物2g.其结构式如下，产率为85.3％。
利用核磁共振对实施例11中得到的化合物2g进行分析，得到其核磁共振氢谱结果：1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.30(s,1H),8.81(d,J＝9.1Hz,1H),7.89(d,J＝9.2Hz,1H),7.83(d,J＝8.9Hz,1H),7.79(d,J＝2.8Hz,1H),7.70(t,J＝7.7Hz,1H),7.54(dd,J＝27.4,20.0Hz,1H),7.30(dd,J＝5.9,3.0Hz,2H),7.23–7.17(m,2H),6.67–6.47(m,2H),4.46(s,3H)。
利用质谱仪对实施例11中得到的化合物2g进行分析，得到其质谱结果：ESI-MS m/z:364.3[M+H]+.
实施例12：化合物2h的合成
本实施例的制备方法除了用1d代替1a、用吲哚-2-甲醛代替吲哚-3-甲醛外，其余同实施例5，产物为黑褐色固体即为化合物2h，其结构式如下，产率为82.9％。
利用核磁共振对实施例12中得到的化合物2h进行分析，得到其核磁共振氢谱结果：1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.30(s,1H),8.81(d,J＝9.1Hz,1H),7.90(d,J＝9.1Hz,1H),7.85(d,J＝8.7Hz,1H),7.77(d,J＝2.8Hz,1H),7.72(t,J＝7.1Hz,1H),7.56(dd,J＝26.6,20.0Hz,1H),7.31(dd,J＝5.2,3.0Hz,2H),7.21–7.19(m,2H),6.65–6.45(m,2H),4.46(s,3H)。
利用质谱仪对实施例12中得到的化合物2h进行分析，得到其质谱结果：ESI-MS m/z:364.3[M+H]+。
实施例13：核酸选择性
DNA配置:DNA样品购自英骏生物技术有限公司。将DNA适量溶于Tris-HCl的缓冲液中(PH＝7.4，100m Mtris，60mM KCl)或者Tris-醋酸缓冲中(PH＝5.5,100mM Tris，60mMKCl)，超微量紫外定浓，在95℃下加热5min后缓慢冷却退火到室温作为储存液，4℃储存；表1为DNA序列。
将5mM的本发明制备的化合物储备液稀释成5μM的浓度，再加入不同种类的核酸用荧光分光光度计(狭缝宽度＝10，扫描速度＝200nm，Ex＝531nm)测出其各自的荧光强度，发现这一系类化合物与G-四链体DNA的结合之后荧光强度最强。
图1为实施例9中得到的化合物2e与AT、Da21、Ds26、Telo21、Bcl-2、RNA六种核酸在1:1浓度下的荧光谱图；其中1为AT，2为双链Ds26，3为单链Da21，4为RNA，5为G-四链体Bcl-2，6为G-四链体Telo21。
表1 DNA序列
AT ATATATATATAT
Da21 AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
Ds26 CAATCGGATCGAATTCGATCCGATTG
Telo21 GGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG
Bcl2 GGGCGCGGGAGGAAGGGGGCGGG
RNA 从酵母中提取的天然核酸
实施例14：检测限的测定
将5mM的本发明得到的化合物储备液稀释成5μM的浓度，再在荧光分光光度计(狭缝宽度＝10，扫描速度＝200nm，Ex＝531nm)扫描，再往其中慢慢加入telo21的DNA做到使其饱和。
检测限的计算公式：LOD＝K×Sb/m
LOD(化合物的结合常数)，m是浓度C与(F-F0)/F0的所做直线的斜率，Sb为用仪器空白多次测量的标准偏差，K值按照国际纯粹和应用化学联合会建议通常取为3。
图2为实施例9中得到的化合物2e滴定G-四链体DNA(Talo21)的荧光谱图；图2中由下至上化合物2e的浓度依次为0、0.25μM、1.00μM、1.25μM、1.75μM、2.25μM、2.75μM、3.25μM与3.75μM。
图3为实施例9中得到的化合物2e滴定G-四链体DNA(Talo21)的荧光光谱中C与F-F0)/F0拟合的曲线图。
实施例15：核酸凝胶电泳实验
电泳缓冲液与溶液的配置:5×TBE电泳缓冲液、过硫酸铵10％m/V、6X载样缓冲液、亚甲双丙酰胺(29:1)(％，m/V)；
安装电泳装置和配置凝胶溶液；
灌制凝胶；
上样与电泳。
图4为实施例9中得到的化合物2e与双链DNA(Ds26、At)、单链DNA(Da21)、RNA和G-四链体(Bcl-2、Telo21)的聚丙酰胺凝胶电泳图。
实施例16：细胞成像实验
培养细胞：因为PC3细胞的细胞壁较厚，所以用于实验。将细胞接种于直径为10cm的培养皿后，使用10％胎牛血DMEM培养基，37℃、5％CO2环境中培养。
接种细胞：将细胞接种于6孔板中，使细胞的密度约为2×105个/mL，然后在37℃、5％CO2环境中培养24h。
探针染色：弃去细胞培养液中的培养基，用预冷的1×PBS洗3次，然后加入1mL的5μM的化合物然后在37℃、5％CO2环境中放置15min。
固定：弃去上步6孔板中的化合物溶液，用预冷的1×PBS洗3次，然后再加入预冷的甲醇1.5mL常温避光放置10min，最后弃去甲醇并再用预冷的1×PBS洗3次，每次浸泡5min。
4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色：在上述6孔板中加入5μM的DAPI溶液1mL并37℃放置10min，然后再用预冷的1×PBS洗6次，每次浸泡5min。
激光共聚焦显微镜检测：检测过程中，DAPI选用蓝光，化合物选用红光。
图5为实施例9中得到的化合物2e、染料DAPI染PC3细胞和2e与染料DAPI复染PC3细胞的成像图。
实施例17：2a-f对G-四链体DNA telo21的荧光滴定的测定
将5mM的化合物储备液稀释成5μM的浓度，放置于荧光分光光度计中，逐渐增加溶液中不同核酸的浓度，并进行荧光强度测定。测定条件为：狭缝宽度10nm，扫描速度200nm/min，激发波长533～617nm，得到结果见表2。
表2 2a-f对G-四链体DNA telo21的荧光滴定的测定结果
表2中a化合物的浓度为5μM；b化合物的异色移；ctelo21的线性检测范围；dtelo21的检测限；e化合物和telo21之间的结合常数；f无信号检测。

Claims (10)

1.一种荧光探针，如式(I)所示：
其中，R1与R2各自独立地选自H或芳香乙烯基团，且至少一个为芳香乙烯基团；
R3选自H、F、Cl、Br、OH、OCH3、N(CH3)2或C1～C6的烷基；
R4选自C1～C6的烷基。
2.根据权利要求1所述的荧光探针，其特征在于，所述芳香乙烯基团选自式(1)～式(4)中的一种：
其中，R5～R11各自独立地选自H、F、Cl、Br、OH、OCH3、N(CH3)2、C1～C6的烷基或C3～C6的环烷基；
X、Y各自独立地为C或N，且不同时为N。
3.根据权利要求1所述的荧光探针，其特征在于，如式(2a)～(2h)的一种所示：
4.一种荧光探针的制备方法，其特征在于，包括：
将式(II)所示的化合物与芳香醛反应，得到式(I)所示的荧光探针；
其中，R1与R2各自独立地选自H或芳香乙烯基团，且至少一个为芳香乙烯基团；
R3选自H、F、Cl、Br、OH、OCH3、N(CH3)2或C1～C6的烷基；
R4选自C1～C6的烷基；
R12与R13各自独立地选自H或CH3，且不同时为H。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述式(II)所示的化合物按照以下方法制备：
将式(III)所示的化合物与烷基碘反应，得到式(II)所示的化合物；
其中，R3选自H、F、Cl、Br、OH、OCH3、N(CH3)2或C1～C6的烷基；
R12与R13各自独立地选自H或CH3，且不同时为H；
所述烷基碘中烷基的碳原子数为1～6。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述芳香醛选自式(IV)～式(VII)中一种：
其中，R5～R11各自独立地选自H、F、Cl、Br、OH、OCH3、N(CH3)2、C1～C6的烷基或C3～C6的环烷基；
X、Y各自独立地为C或N，且不同时为N。
7.权利要求1～3任意一项所述的荧光探针或权利要求4～6任意一项所制备的荧光探针在检测核酸G-四链体结构中的应用。
8.权利要求1～3任意一项所述的荧光探针或权利要求4～6任意一项所制备的荧光探针在检测水溶液中核酸G-四链体结构中的应用。
9.权利要求1～3任意一项所述的荧光探针或权利要求4～6任意一项所制备的荧光探针在检测琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶中核酸G-四链体结构中的应用。
10.权利要求1～3任意一项所述的荧光探针或权利要求4～6任意一项所制备的荧光探针在检测细胞中核酸G-四链体结构中的应用。
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