CN103087706B - 一种单、双光子酸性细胞器荧光探针及其应用 - Google Patents

一种单、双光子酸性细胞器荧光探针及其应用 Download PDF

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CN103087706B CN201310018340.2A CN201310018340A CN103087706B CN 103087706 B CN103087706 B CN 103087706B CN 201310018340 A CN201310018340 A CN 201310018340A CN 103087706 B CN103087706 B CN 103087706B
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Abstract

本发明公开了一种单、双光子酸性细胞器荧光探针，其中所述荧光探针是咔唑吡啶类化合物，其通式如（I）所示。本发明还公开了所述荧光探针作为标记酸性细胞器的单光子或双光子荧光探针在显示活细胞中酸性细胞器分布中的应用。本发明的探针具有适用范围广，价格低，能在活性细胞中专一荧光成像酸性细胞器的特点；其作为单光子比率型和双光子光开关型酸性细胞器荧光探针应用前景广阔。

Description

一种单、双光子酸性细胞器荧光探针及其应用
技术领域
本发明涉及一种单光子比率型和双光子光开关型荧光探针及其应用，尤其涉及一种咔唑吡啶类化合物的单、双光子酸性细胞器荧光探针及其应用。
背景技术
酸性细胞器如溶酶体是真核细胞中具有重要生理功能的细胞器之一，尤其是在细胞内消化，细胞凋亡和自体吞噬等生理活动中起着关键作用。同时研究发现，酸性细胞器内pH值异常和癌症关系密切。因此，实现细胞内酸性细胞器的荧光成像，并给出酸性细胞器内的pH分布的信息，有着重要的生命科学与医学价值。
一般来说，观测细胞内分子荧光成像的仪器有激光扫描共聚焦显微镜和双光子荧光显微镜，其中双光子荧光显微镜在成像活细胞方面的优势较为明显。但目前适合这两种显微镜使用的、在活细胞内高选择性标记在酸性细胞器内的荧光探针十分缺乏。同时，随着激光扫描共聚焦显微镜和双光子显微镜技术的不断升级和完善，各种生物荧光探针的研究与开发也在不断创新，并且，从分子水平上设计、开发对活性生物体系（如完整活细胞）中的生理、病理学标记物具有特异性、专一性识别能力的荧光探针分子，始终是生命科学研究中的重要课题。
尤其是近几年来，双光子荧光三维成像技术发展迅速，而专用的双光子荧光探针的开发却未及时跟上，特别是在细胞内高选择性标记酸性细胞器的双光子荧光探针国际上较少报道。这在很大程度上制约了利用双光子三维成像技术进行细胞内酸性细胞器的成像与观测。因而开发、研制具有实际应用价值单、双光子酸性细胞器荧光探针是当务之急。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种单、双光子酸性细胞器荧光探针及其应用。
本发明所述单、双光子酸性细胞器荧光探针，其特征在于：所述荧光探针是咔唑吡啶类化合物，其通式如（I）所示：
其中：上述R1表示烷基或羟烷基，R2表示乙酰基或氢原子。
上述荧光探针中：化合物通式（I）中所述R1优选表示C1-6的烷基。
上述荧光探针中：化合物通式（I）中所述R1最优选表示乙基，所述R2最优选表示乙酰基；即：3-乙酰基-6-(4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑。。
本发明所述单、双光子酸性细胞器荧光探针（咔唑吡啶类化合物）的制备方法概述如下：
为了增加分子在生理环境下的适应性，发明人首先在咔唑氮上引入乙基、丁基或羟乙基，然后利用F-C反应合成了相应乙酰基咔唑，然后将乙酰基咔唑溴化，最后利用Hack反应得到终产物——咔唑吡啶类化合物。
上述咔唑吡啶类化合物的制备反应式如下：
本发明所述荧光探针作为标记酸性细胞器的单光子或双光子荧光探针在显示活细胞中酸性细胞器分布中的应用。
其中，所述酸性细胞器优先指溶酶体或线粒体；所述活细胞优选为HeLa细胞或SiHa细胞。
试验结果证实，本发明所述单、双光子荧光探针（咔唑吡啶类化合物）能够在活细胞中高选择性标记酸性细胞器，在细胞核周区域呈现出明显的荧光显微图像，这为酸性细胞器相关的病理学研究提供了有意的帮助，同时也为开发简捷、直观的荧光检测试剂提供了技术支持。
本发明的的有益效果是：利用大量的实验筛选，本发明确立了一类新型的高选择性标记酸性细胞器荧光探针分子，即咔唑吡啶类化合物。与其功能相近的单光子酸性细胞器荧光探针比，本发明所述咔唑吡啶酮类化合物具有价格低、激发能量低、显色强、生物相溶性较好的特点。进一步的试验证实，本发明的咔唑吡啶类化合物具有高的光开关比和双光子荧光活性吸收截面大的特点。并且本发明所述的探针和已有的探针Hochest33342、MTR具有良好生物相容性，在激光激发荧光生物标记领域具有潜在的应用价值。也预示本发明所述咔唑吡啶类化合物作为单光子比率型和双光子光开关型酸性细胞器荧光探针应用前景广阔。
附图说明
图1：3-乙酰基-6-(4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑对活性SiHa和Hela细胞进行染色在宽场荧光显微镜下得到的荧光显微照片。其中a图为用3-乙酰基-6-(4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑染色得到的荧光显微照片；b图为明场照片；c图为左中两图的合并图即共定位图。
图2：3-乙酰基-6-(4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑和溶酶体红依次对活性SiHa和Hela细胞进行染色后，并在NH4Cl处理前后分别在405和561纳米激光辐照下分为三个通道收集得到的单光子荧光显微照片。其中Ι和ΙΙΙ图为NH4Cl处理前，ΙΙ图为NH4Cl处理后得到图片。a图为405纳米激发蓝色通道的照片，b为405纳米激发绿色通道的照片，c为561纳米激发红色通道的照片，d为明场照片，e图为b、c、d三者合并图片，f图为用其中a图和b图得到的比率照片。
图3：3-乙酰基-6-(4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑对活性SiHa和Hela细胞进行染色后用NH4Cl处理前后在800纳米激光辐照下得到的双光子荧光显微照片。其中Ι和ΙΙΙ图为NH4Cl处理前，ΙΙ和IV图为NH4Cl处理后得到图片。a图为用3-乙酰基-6-(4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑染色得到的双光子荧光显微照片；b图为明场激光扫描的微分显微照片；c图为左中两图的合并图。
图4：3-乙酰基-6-(4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑、线粒体红、Hochest33342分别依次对活性SiHa细胞进行染色后在宽场荧光显微镜下得到的荧光显微照片。其中a图为蓝色通道的照片，b为绿色通道的照片，c为红色通道的照片，d为明场照片，e图为前四者合并图片。
具体实施方式
实施例1
9-乙基咔唑（1a）的合成
将28g(500mmol)的KOH溶于60mL的丙酮溶液中，室温搅拌得到黄色溶液。向上述溶液中加入咔唑(13.2g,80mmol)，室温搅拌4h，得到咖啡色浑浊液。逐渐加入含有1-溴乙烷(9mL,120mmol)的丙酮溶液，反应过夜。将反应液倾入到1000mL水中，有黄色沉淀生成，过滤得到黄色固体。固体用乙醇重结晶，得到白色固体，产率：83%。
1H NMR(300MHz,CDCl3),δ(ppm):8.10(d,J＝7.8Hz,2H),7.39-7.49(m,4H),7.20-7.25(m,2H),4.36(q,J＝7.2Hz,2H),1.43(t,J＝7.2Hz,3H)。
9-丁基咔唑（1b）的合成
工艺同上，合成9-丁基咔唑，产率：82%。
1H NMR(300MHz,CDCl3),δ(ppm):8.11(d,J＝7.9Hz,2H),7.39-7.47(m,4H),7.21-7.25(m,2H),4.50(t,J＝7.0Hz,2H,methylene-H),1.77–1.84(m,2H,methylene-H),1.30–1.40(m,2H,methylene-H),0.91(t,J＝7.4Hz,3H,methyl-H)。
9-羟乙基咔唑（1c）的合成
工艺同上，合成9-羟乙基咔唑，产率：81%。：
1H NMR(300MHz,CDCl3),δ(ppm):8.79(d,J＝7.8Hz,2H),7.39-7.49(m,4H),7.22-7.25(m,2H),5.26(s,1H,hydroxyl-H),4.58(t,J＝4.4Hz,2H,methylene-H),3.89(t,2H,methylene-H)。
实施例2
3-乙酰基-9-乙基咔唑（2a）的合成
将3.91g,20mmol化合物1a溶于75mL无水二氯甲烷，剧烈搅拌下加入无水AlCl3(5.2g,40mmol),得到黑色沉淀。混合物在冰浴下冷却到0°C，缓慢加入溶于15mL无水二氯甲烷的醋酸酐(2.04g,20mmol)。加完后，撤去冰浴升至室温剧烈搅拌过夜。将反应液倒入大量冰水中，用NaHCO3调节pH到7-8。用CH2C12萃取，有机层用水洗涤，无水MgSO4干燥，过滤，蒸除溶剂。粗产品用柱色谱分离，石油醚/乙酸乙酯（10:1）作淋洗液，得到白色固体，产率：87%。
1H NMR(400MHz,CDCl3),δ(ppm):8.75(d,J=1.52Hz,1H),8.11-8.17(m,2H),7.50-7.54(m，1H)，7.40-7.45(m,2H),7.29-7.32(m,1H),4.40(q,J=7.25Hz,2H),2.72(s,3H),1.45(t,J=7.24Hz,3H).
3-乙酰基-9-丁基咔唑（2b）的合成
工艺同上，合成3-甲酰基-9-丁基咔唑，产率：81%。
1H NMR(400MHz,CDCl3),δ(ppm):8.75(d,J=1.52Hz,1H),8.11-8.17(m,2H),7.50-7.54(m,1H),7.40-7.45(m,2H),7.29-7.32(m,1H),4.50(t,J＝7.0Hz,2H,methylne-H),1.77–1.84(m,2H,methylne-H),1.30–1.40(m,2H,methylne-H),2.72(s,3H),0.91(t,J＝7.4Hz,3H,methyl-H)。
3-乙酰基-9-羟乙基咔唑（2c）的合成
工艺同上，合成3-甲酰基-9-羟乙基咔唑，产率：85%。
1H NMR(400MHz,CDCl3),δ(ppm):8.75(d,J=1.52Hz,1H),8.11-8.17(m,2H),7.50-7.54(m,1H),7.40-7.45(m,2H),7.29-7.32(m,1H),5.26(s,1H,hydroxyl-H),4.58(t,J＝4.4Hz,2H,methylne-H),3.87(t,2H,methylne-H),2.72(s,3H)。
实施例3
3-乙酰基-6-溴-9-乙基咔唑（3a）的合成
氩气保护下，将化合物2(2.2g,9.85mmol)和NBS(1.9g,10.67mmol)加入到60mL的氯仿/冰醋酸混合溶液(1:1,v/v)中，室温条件下反应15h。反应完全后，将反应液倒入500mL水中，用CH2Cl2萃取。有机层用饱和氯化钠溶液洗涤，无水MgSO4干燥，过滤，蒸除溶剂。粗产品用柱色谱分离，石油醚/乙酸乙酯(10:1)作淋洗液，得到白色絮状固体，产率：81%。
1H NMR(400MHz,CDCl3),δ(ppm):8.71(d,J=1.52Hz,1H),8.30(d,J=1.88Hz,1H),8.18(dd,J1=8.70Hz,J2=1.70Hz,1H),7.62(dd,J1=8.64Hz,J2=1.92Hz,1H),7.44(d,J=8.68Hz,1H),7.35(d,J=8.64Hz,1H),4.4(q,J=7.25Hz,2H),2.74(s,3H),1.47(t,J=7.26Hz,3H).
6-溴-9-乙基咔唑（3b）的合成
工艺同上，合成-6-溴-9-乙基咔唑，产率：82%。
1H NMR(400MHz,CDCl3),δ(ppm):8.19(d,J=1.88Hz,1H),8.03(d,J=7.84Hz,1H),7.46–7.54(m,2H),7.39(d,J=8.16Hz,1H),7.21–7.27(m,2H),4.32(q,J=7.23Hz,2H),,1.40(t,J=7.24Hz,3H).
3-乙酰基-6-溴-9-丁基咔唑（3c）的合成
工艺同上，合成3-甲酰基-6-溴-9-丁基咔唑，产率：82%。
1H NMR(400MHz,CDCl3),δ(ppm):8.71(d,J=1.52Hz,1H),8.30(d,J=1.88Hz,1H),8.18(dd,J1=8.70Hz,J2=1.70Hz,1H),7.62(dd,J1=8.64Hz,J2=1.92Hz,1H),7.44(d,J=8.68Hz,1H),7.35(d,J=8.64Hz,1H),4.49t,J＝7.0Hz,2H,methylene-H),2.74(s,3H),1.75-1.84(m,2H,methylne-H),1.32-1.40(m,2H,methylne-H),0.91(t,J＝7.4Hz,3H,methyl-H)。
3-乙酰基-6-溴-9-羟乙基咔唑（3d）的合成
工艺同上，合成3-甲酰基-6-溴-9-羟乙基咔唑，产率：84%。
1H NMR(400MHz,CDCl3),δ(ppm):8.71(d,J=1.52Hz,1H),8.30(d,J=1.88Hz,1H),8.18(dd,J1=8.70Hz,J2=1.70Hz,1H),7.62(dd,J1=8.64Hz,J2=1.92Hz,1H),7.44(d,J=8.68Hz,1H),7.35(d,J=8.64Hz,1H),5.29(s,1H,hydroxyl-H),4.58(t,J＝4.5Hz,2H,methylene-H),3.89(t,2H,methylene-H),2.74(s,3H)。
实施例4
3-乙酰基-6-(4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑（4a）的合成
将0.61g(2mmol)化合物3,44.9mg(0.2mmol)醋酸钯，182.62mg(0.6mmol)三邻甲苯基膦，2.2g(16mmol)K2CO3加入到35mL的NMP中。该反应体系用氩气鼓泡30min后加入0.43mL(4mmol)4-乙烯吡啶，升温至130°C，反应36h。反应完毕后，将反应液倾入水中，用CH2Cl2萃取，合并有机相，无水MgSO4干燥，过滤，蒸除溶剂。粗产品经过柱色谱分离，石油醚/乙酸乙酯(2:1)作淋洗液，得到黄色固体，产率：52%。
1H NMR(300MHz,CDCl3),δ(ppm):8.79(d,J=1.5Hz,1H),8.59(dd,J1=4.8Hz,J2=1.5Hz,2H),8.35(d,J=1.2Hz,1H),8.16(dd,J1=8.7Hz,J2=1.5Hz,1H),7.74(dd,J1=8.4Hz,J2=1.5Hz,1H),7.55(d,J=16.2Hz,1H),7.43-7.48(m,4H),7.10(d,J=16.5Hz,1H),4.42(q,J=7.3Hz,2H),2.75(s,3H),1.49(t,J=7.2Hz,3H)。
6-(4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑（4b）的合成
工艺同上，合成6-(4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑，产率：55%。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):8.54(d,J=5.68Hz,1H),8.47(s,1H),8.19(d,J＝7.64Hz,1H),7.80(d,J=8.52Hz?,1H),7.73(d,J=16.4Hz,1H),7.65(t,J=9.16Hz,2H),7.58(d,J=5.76Hz,2H),7.49(t,J=7.38Hz,1H),7.23-7.28(m,2H),4.47(q,J=7.05Hz,2H),1.33(t,J=7.08Hz,3H).
3-乙酰基-6-(4-乙烯基吡啶)-9-丁基咔唑（4c）的合成
工艺同上，合成3-甲酰基-6-(4-乙烯基吡啶)-9-丁基咔唑，产率：55%。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):8.79(d,J=1.5Hz,1H),8.59(dd,J1=4.8Hz,J2=1.5Hz,2H),8.35(d,J=1.2Hz,1H),8.16(dd,J1=8.7Hz,J2=1.5Hz,1H),7.74(dd,J1=8.4Hz,J2=1.5Hz,1H),7.55(d,J=16.2Hz,1H),7.43-7.48(m,4H),7.10(d,J=16.5Hz,1H),4.50(t,J＝7.0Hz,2H,methylne-H),2.75(s,3H),1.77-1.84(m,2H,methylne-H),1.30-1.40(m,2H,methylene-H),0.91(t,J＝7.6Hz,3H,methyl-H).
3-乙酰基-6-(4-乙烯基吡啶)-9-羟乙基咔唑（4d）的合成
工艺同上，合成3-甲酰基-6-(4-乙烯基吡啶)-9-羟乙基咔唑，产率：55%。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):8.79(d,J=1.5Hz,1H),8.59(dd,J1=4.8Hz,J2=1.5Hz,2H),8.35(d,J=1.2Hz,1H),8.16(dd,J1=8.7Hz,J2=1.5Hz,1H),7.74(dd,J1=8.4Hz,J2=1.5Hz,1H),7.55(d,J=16.2Hz,1H),7.43-7.48(m,4H),7.10(d,J=16.5Hz,1H),5.27(s,1H,hydroxyl-H),4.60(t,J＝4.5Hz,2H,methylene-H),3.89(t,2H,methylene-H),2.75(s,3H).
实施例5
SiHa和Hela细胞培养
SiHa或HeLa细胞株贴壁培养于内含10％胎牛血清培养液中，在37℃，5％CO2的饱和湿度孵箱中培养，每2～3d换液传代1次。待细胞生长到对数期，接片培养：①将盖玻片于无水乙醇中浸泡30min，酒精灯烘干后放入一次性35mm培养皿中；②将100ml细胞瓶中的细胞用PBS洗三遍，用1ml0.25%胰酶消化3-5分钟，小心地倒出培养基，加入少量新鲜培养基吹打均匀，细胞计数后，留下合适密度的细胞，将培养基加至所需体积(控制细胞终浓度为1x105)，接种至内含盖玻片的培养皿中，放入CO2培养箱中培养，使细胞爬片生长。
实施例6
3-乙酰基-6-(4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑（4a）染色SiHa和Hela细胞
将接种好的SiHa和Hela细胞爬片，用PBS洗三遍，分别用血清稀释和DMSO:PBS(1:50)混合溶液稀释的5μM的探针溶液在CO2培养箱中染色细胞60min。染色后的玻片取出，洗去未结合的多余染液，细胞生长面朝下盖在载玻片上，在宽场显微镜和双光子荧光显微镜下观察细胞着色部位，荧光分布及亮度变化等，结果见附图。
其中
图1：3-乙酰基-6-(4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑对活性SiHa和Hela细胞进行染色得到宽场荧光显微照片。
图3：3-乙酰基-6-(4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑对活性SiHa和Hela细胞进行染色在800纳米激光辐照下得到的双光子荧光显微照片。其中Ι和ΙΙΙ图为NH4Cl处理前，ΙΙ和IV图为NH4Cl处理后得到图片。
实施例7
3-乙酰基-6-(4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑（4a）和溶酶体红复染实验
将接种好的SiHa和Hela细胞爬片，用PBS洗三遍，分别用血清稀释和DMSO:PBS(1:50)混合溶液稀释的5μM的探针溶液在CO2培养箱中染色细胞60min。染色后的玻片取出，洗去未结合的多余染液，再用PBS稀释的25nM的溶酶体红溶液在CO2培养箱中染色细胞30min。染色后的玻片取出，洗去未结合的多余染液，细胞生长面朝下盖在载玻片上，在共聚焦荧光显微镜下观察细胞着色部位，荧光分布及亮度变化等，结果发现，溶酶体红和3-乙酰基-6-(4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑的在细胞内分布区域相似，计算十个细胞的平均共定位率为0.83，因此，证实了3-乙酰基-6-(4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑（4a）能专一性的成像酸性细胞器（溶酶体）。同时酸性细胞器的pH值分布可以通过比率图片得到，结果见附图。
其中
图2：3-乙酰基-6-(4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑和溶酶体红依次对活性SiHa和Hela细胞进行染色后，并在NH4Cl处理前后分别在405和561纳米激光辐照下分为三个通道收集得到的单光子荧光显微照片。其中Ι和ΙΙΙ图为NH4Cl处理前，ΙΙ图为NH4Cl处理后得到图片。a图为405纳米激发蓝色通道的照片，b为405纳米激发绿色通道的照片，c为561纳米激发红色通道的照片，d为明场照片，e图为b、c、d三者合并图片，f图为用其中a图和b图得到的比率照片。
实施例8
3-乙酰基-6-(4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑（4a）染色SiHa和Hela细胞，并用NH4Cl处理（对比实验）
将接种好的SiHa和Hela细胞爬片，用PBS洗三遍，分别用血清稀释和DMSO:PBS(1:50)混合溶液稀释的5μM的探针溶液在CO2培养箱中染色细胞60min。染色后的玻片，洗去未结合的多余染液，再用NH4Cl溶液培养5分钟左右，用PBS冲洗后，取出细胞，生长面朝下盖在载玻片上，在荧光显微镜下观察细胞着色部位，荧光分布及亮度变化等，结果见附图。
其中
图2：3-乙酰基-6-(4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑和溶酶体红依次对活性SiHa和Hela细胞进行染色后，并在NH4Cl处理前后分别在405和561纳米激光辐照下分为三个通道收集得到的单光子荧光显微照片。其中Ι和ΙΙΙ图为NH4Cl处理前，ΙΙ图为NH4Cl处理后得到图片。a图为405纳米激发蓝色通道的照片，b为405纳米激发绿色通道的照片，c为561纳米激发红色通道的照片，d为明场照片，e图为b、c、d三者合并图片，f图为用其中a图和b图得到的比率照片。
图3：3-乙酰基-6-(4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑对活性SiHa和Hela细胞进行染色后用NH4Cl处理前后在800纳米激光辐照下得到的双光子荧光显微照片。其中Ι和ΙΙΙ图为NH4Cl处理前，ΙΙ和IV图为NH4Cl处理后得到图片。a图为用3-乙酰基-6-(4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑染色得到的双光子荧光显微照片；b图为明场激光扫描的微分显微照片；c图为左中两图的合并图。
实施例9
3-乙酰基-6-(4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑（4a）和线粒体红及Hochest33342复染实验
将接种好的SiHa细胞爬片，用PBS洗三遍，分别用血清稀释和DMSO:PBS(1:50)混合溶液稀释的5μM的探针溶液在CO2培养箱中染色细胞60min。PBS洗去未结合的多余染液，再用PBS稀释的500nM的线粒体红溶液在CO2培养箱中染色细胞30min。用PBS洗去未结合的多余染液，再用PBS稀释的5μM的Hochest33342溶液在CO2培养箱中染色细胞30min。染色后的玻片取出，洗去未结合的多余染液，细胞生长面朝下盖在载玻片上，在宽场显微镜下观察细胞着色部位，荧光分布及亮度变化等，结果见附图。
其中
图4：3-乙酰基-6-(4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑、线粒体红、Hochest33342分别依次对活性SiHa细胞进行染色后在宽场荧光显微镜下得到的荧光显微照片。其中a图为蓝色通道的照片，b为绿色通道的照片，c为红色通道的照片，d为明场照片，e图为前四者合并图片。

Claims (3)

1.一种单、双光子酸性细胞器荧光探针，其特征在于：所述荧光探针是咔唑吡啶类化合物3-乙酰基-6-(4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑。
2.权利要求1所述荧光探针作为标记酸性细胞器的单光子或双光子荧光探针在显示活细胞中酸性细胞器分布中的应用，其中所述酸性细胞器指溶酶体。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述活细胞为HeLa细胞或SiHa细胞。
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