CN107286927A - 一种检测细胞内过氧亚硝酸根离子的荧光探针及其合成方法 - Google Patents

一种检测细胞内过氧亚硝酸根离子的荧光探针及其合成方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107286927A
CN107286927A CN201610219268.3A CN201610219268A CN107286927A CN 107286927 A CN107286927 A CN 107286927A CN 201610219268 A CN201610219268 A CN 201610219268A CN 107286927 A CN107286927 A CN 107286927A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mixed liquor
group
cyano group
compound
formula
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201610219268.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107286927B (zh
Inventor
汪鹏飞
刘莎
刘卫敏
张洪艳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Technical Institute of Physics and Chemistry of CAS
Original Assignee
Technical Institute of Physics and Chemistry of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Technical Institute of Physics and Chemistry of CAS filed Critical Technical Institute of Physics and Chemistry of CAS
Priority to CN201610219268.3A priority Critical patent/CN107286927B/zh
Publication of CN107286927A publication Critical patent/CN107286927A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107286927B publication Critical patent/CN107286927B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
    • C09K11/06—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F5/00—Compounds containing elements of Groups 3 or 13 of the Periodic Table
    • C07F5/02—Boron compounds
    • C07F5/025—Boronic and borinic acid compounds
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1003—Carbocyclic compounds
    • C09K2211/1007—Non-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1003—Carbocyclic compounds
    • C09K2211/1011—Condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1003—Carbocyclic compounds
    • C09K2211/1014—Carbocyclic compounds bridged by heteroatoms, e.g. N, P, Si or B

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)

Abstract

本发明提供了一种检测细胞内过氧亚硝酸根离子的荧光探针，其结构如下所示：其中，R1和R2各自独立地选自氢、1～5个碳原子的直链烷基或3～8个碳原子的环烷基；R3选自氰基或酯基。该荧光探针对过氧亚硝酸根离子有很好的选择性，对细胞渗透性好，响应时间极短，检测灵敏度极高，对细胞本身没有毒副作用，适应于细胞内过氧亚硝酸根离子浓度变化的检测。该荧光探针合成方法简单且产率高，适合规模化生产。

Description

一种检测细胞内过氧亚硝酸根离子的荧光探针及其合成方法
技术领域
本发明涉及化学领域，特别涉及一种检测细胞内过氧亚硝酸根离子的荧光探针及其合成方法。
背景技术
自从上世纪八十年代研究发现NO在生物体内能通过酶催化合成后，人们开始了有关NO的生物医学方面的研究。1998年的诺贝尔奖授予了发现NO特殊功能的科学家们。特别值得提到的是，NO不仅在生物组织中充当信使分子，NO和·O2 -还能形成过氧亚硝酸(peroxoitrite,ONOO-)。过氧亚硝酸根离子是较NO和·O2 -氧化作用更强、作用更为广泛的一种强效细胞毒性物质，可以由生成部位扩散较远距离而到达靶位，造成较大范围的损伤，是导致细胞和组织损伤的强力氧化剂。过氧亚硝酸根离子可作用于酶、蛋白、脂质及DNA等大分子物质，参与机体的多种病理过程，是NO产生病理损伤作用的主要因子之一，有关过氧亚硝酸根离子的研究受到了人们的极大关注。研究表明，过氧亚硝酸根离子与人类的一系列疾病如炎症、缺血重灌损伤、败血症休克、动脉粥样硬化、糖尿病和神经退行性紊乱的发病机理密切相关。因此研究简便、灵敏、准确测定过氧亚硝酸根离子的方法是生命科学研究中的重要课题之一，对于深入研究各种疾病的病理及促进人体健康具有十分重要的意义。
近年来发展起来的检测方法主要有电化学、液相色谱、气质联用和化学发光法等。其中，荧光发光法因其高选择性、高灵敏性和简便易行等优点，在过氧亚硝酸根离子的检测中有着广阔的发展空间和应用前景。迄今为止已经报道的可用于检测识别过氧亚硝酸根离子的分子结构包括苯乙基酮结构(J.Am.Chem.Soc.,2006,128,6004-6005)、芳香邻二胺结构(J.Am.Chem.Soc.,2006,128,10640-10641,Chem.Eur.J.,2010,16,6464-6472)、有机硒/有机碲和芳氧基苯酚结构(J.Biol.Chem.,2003,278,3170-3175)等。基于以上分子设计方法，国内外科研工作者已经研究并报道了大量的基于不同化学反应类型的过氧亚硝酸根探针分子。然而，目前用来测定过氧亚硝酸根离子的化学传感器，大多数在实际应用中都存在一定的缺陷：发射波长较短，大部分小于500nm；易受其它活性氧/活性氮离子的干扰，尤其常见的是过氧化氢和次氯酸根离子；所需反应时间较长和化合物合成复杂；生物本体自荧光干扰严重等都限制了它们在实际生物体系检测中的应用。因此，继续探索能够满足过氧亚硝酸根离子检测所需的新型荧光探针分子是十分重要的。
基于硼酸盐的荧光分子已经被用于有效检测细胞内的过氧化氢。然而，最近的研究通过停留技术和高效液相色谱法发现，芳基硼酸盐与过氧亚硝酸根离子反应产生相应羟基衍生物的速度比与过氧化氢反应速率快6个数量级(Chem.Res.Toxicol,2012,25,1793-1799.)。我们期望这种与过氧亚硝酸根离子的快速反应可以使得芳基硼酸盐作为特异检测过氧亚硝酸根离子荧光探针的理想物质。近期的研究发现，基于蓝光芘发色团的硼酸盐荧光探针，相比其他活性氧，更易与过氧亚硝酸根离子反应。然而，这种芘-硼探针也会与过氧化氢，次氯酸根、次溴酸根在一定程度上反应，因此发展一种新型过氧亚硝酸根离子探针是非常必须的。我们设计合成了一种新型的苯并香豆素硼酸盐化合物，它可以高灵敏、高选择性检测活细胞中的过氧亚硝酸根离子。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种检测细胞内过氧亚硝酸根离子的荧光探针。
本发明要解决的第二个技术问题是提供一种检测细胞内过氧亚硝酸根离子的荧光探针的合成方法。
为解决上述第一个技术问题，本发明提供一种检测细胞内过氧亚硝酸根离子的荧光探针，其结构如式(I)所示：
其中，R1和R2各自独立地选自氢、1～5个碳原子的直链烷基或3～8个碳原子环烷基；R3选自氰基或酯基。
所述1～5个碳原子烷基为甲基、乙基、丙基、烯丙基、异丙基、丁基、异丁基、戊基或异戊基等；所述3～8个碳原子环烷基为环丙烷基、环丁烷基、环戊烷基、环己烷基或环庚烷基等；所述氰基为甲氰基、乙氰基或丙氰基等；所述酯基为甲酯基、乙酯基、丙酯基或异丙酯基等。
为解决上述第二个技术问题，本发明提供一种检测细胞内过氧亚硝酸根离子的荧光探针的合成方法，合成路线如下(式1)所示：
合成步骤包括：
1)将6-氨基-1,2,3,4-四氢-1-萘酮、碱或碱性盐、卤代烷按照摩尔比为1：2～5：1～3的比例进行称量，将6-氨基-1,2,3,4-四氢-1-萘酮和碱性盐溶于无水有机溶剂中，然后加入卤代烷，加热至40～60℃，搅拌反应18～24h，得第一混合液；反应完毕后将所述第一混合液冷却至室温；然后向所述第一混合液中加入去离子水，用有机溶剂萃取，萃取后的有机相进行干燥、旋蒸除去溶剂，然后进行柱色谱分离，得到化合物(Ⅱ)。
2)将氢化钠、甲酸乙酯、化合物(Ⅱ)、2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(DDQ)按照摩尔比为1～3:2～5:0.5～2:1的比例进行称量，在惰性气体保护下，将氢化钠和甲酸乙酯溶于无水有机溶剂中，室温搅拌反应5～30min，得第二混合液；将化合物(Ⅱ)溶于在无水有机溶剂中，得化合物(Ⅱ)溶液；将化合物(Ⅱ)溶液加入到所述第二混合液中，然后加热至50～70℃，搅拌反应1～2h，得黄色沉淀；过滤、干燥，将得到的黄色固体溶解在无水有机溶剂中；然后再加入2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(DDQ)，室温搅拌反应1～3h，得第三混合液；将所述第三混合液旋蒸除去溶剂，然后进行柱色谱分离，得到化合物(Ⅲ)。
3)将化合物(Ⅲ)、碱性盐和4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯按照摩尔比为1:2～5:1的比例进行称量，在惰性气体保护下，将化合物(Ⅲ)和碱性盐溶于在无水有机溶剂中，室温搅拌反应20～50min，得第四混合液；然后将4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯加入到所述第四混合液中，进行回流反应4～8h，得第五混合液；将所述第五混合液旋蒸除去溶剂，然后进行柱色谱分离，得化合物(Ⅳ)。
4)将化合物(Ⅳ)、含有氰基或酯基的化合物和哌啶按照摩尔比为1～3:3～6:1的比例进行称量，在惰性气体保护下，将化合物(Ⅳ)和含有氰基或酯基的化合物溶于无水有机溶剂中，然后加入哌啶，进行回流反应3～8h，得第六混合液；将所述第六混合液冷却至室温，旋蒸除去溶剂，得到化合物(I)，即为荧光探针。
R1和R2各自独立地选自氢、1～5个碳原子的直链烷基或3～8个碳原子的环烷基；R3选自氰基或酯基。
所述1～5个碳原子烷基为甲基、乙基、丙基、烯丙基、异丙基、丁基、异丁基、戊基或异戊基等；所述3～8个碳原子环烷基为环丙烷基、环丁烷基、环戊烷基、环己烷基或环庚烷基等；所述氰基为甲氰基、乙氰基或丙氰基等；所述酯基为甲酯基、乙酯基、丙酯基或异丙酯基等。
所述无水有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、甲苯、四氢呋喃、二甲基亚砜、乙醇或苯甲酸等。
所述碱为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙或氢氧化锂等。
所述碱性盐为碳酸钠、碳酸钾、碳酸镁或碳酸钙等。
所述卤代烷为碘甲烷、溴乙烷、溴丙烷、烯丙基溴、异丙基溴、溴丁烷、异丁基溴、溴戊烷、异戊基溴、环丙基溴、环丁基溴、环戊基溴、环己基溴或环庚基溴等。
所述含有氰基或酯基的化合物为丙二腈、戊二腈、庚二腈、丙二酸二甲酯、丙二酸二乙酯、丙二酸二丙酯或丙二酸二异丙酯等。
在一些优选的实施方式中，所述卤代烷为碘甲烷或环丙基溴；所述含有氰基或酯基的化合物为丙二腈或丙二酸二甲酯。
所述的检测细胞内过氧亚硝酸根离子的荧光探针用于化学模拟生物体系中过氧亚硝酸根离子的检测、生物活细胞以及活组织内的过氧亚硝酸根离子的分析检测和荧光成像检测、临床医学上病变组织中过氧亚硝酸根离子的检测。
本发明的荧光探针在使用时没有特殊的限制，可以将荧光探针溶解在生理盐水中；或将荧光探针溶解在PBS缓冲液中；或将荧光探针溶解在甲醇、乙醇、乙腈、二甲亚砜、二甲基甲酰胺或四氢呋喃等水溶性有机溶剂中；或将荧光探针溶解在水和上述有机溶剂任意比例的混合溶剂中；得荧光探针溶液。
细胞组织内过氧亚硝酸根离子检测的一般方法是将所述荧光探针溶液加入到含有Hela细胞的共聚焦皿中进行孵育；然后将其中一组细胞用激光共聚焦显微镜成像得到空白图像；将另一组细胞放入含有过氧亚硝酸根离子的溶液中孵育，然后用缓冲液冲洗孵育好的细胞后，进行激光共聚焦显微镜成像得到荧光图像。
本发明具有以下优点：
1、本发明的荧光探针以苯并香豆素为母体、用于检测细胞内过氧亚硝酸根离子。
2、本发明的荧光探针对过氧亚硝酸根离子有很好的选择性，超氧根离子、羟基自由基、过氧化氢、一氧化氮、单线态氧、亚硝酸根离子、硝酸根离子等的活性氧和活性氮离子对荧光探针检测过氧亚硝酸根离子没有影响。
3、当过氧亚硝酸根离子的浓度在0.37～10umol/L时,荧光探针溶液的荧光强度与过氧亚硝酸根离子浓度层呈一定的线性关系，说明该荧光探针具有良好的实际应用性。
4、本发明的荧光探针对细胞渗透性好，响应时间极短，检测细胞内过氧亚硝酸根离子的灵敏度极高，对细胞本身没有毒副作用，适用于细胞内过氧亚硝酸根离子浓度变化的检测。
5、本发明的荧光探针结构简单，合成方法简单且产率高，适合规模化生产。
附图说明
图1示出了本发明荧光探针(I)—1对过氧亚硝酸根离子的选择性图。
图2示出本发明荧光探针(I)—1分别在其他活性氧以及活性氮离子、过氧亚硝酸根离子和上述所有活性氧以及活性氮离子共存时的荧光强度变化图。
图3示出了本发明荧光探针(I)—1的荧光强度和过氧亚硝酸根离子浓度的线性关系图。
图4示出了本发明荧光探针(I)—1在人子宫颈癌细胞(Hela细胞)中对过氧亚硝酸根离子的共聚焦显微镜荧光成像图。
具体实施方式
下文将通过提供一些具体的实施方式以举例方式对本发明进行进一步的描述。但是本申请请求保护的技术方案不限于这些具体的实施方式。
实施例1
合成路线如下(式2)所示：
1)6-二甲氨基-1-萘满酮的合成
将6-氨基-1,2,3,4-四氢-1-萘酮(325mg，2mmol)和碳酸钾(830mg，6mmol)溶于5mL的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，再加入碘甲烷(430mg，3mmol)，然后加热至45℃，并搅拌反应24h，得第一混合液；反应完毕后将所述第一混合液冷却至室温；向所述第一混合液中加入10mL去离子水，用乙酸乙酯萃取三次，并用大量水和食盐水进行多次冲洗，萃取后的有机层用无水硫酸镁进行干燥，旋蒸除去溶剂，然后进行柱色谱分离(以体积比为6:1的石油醚和乙酸乙酯的混合液为洗脱剂)，得到白色固体为6-二甲氨基-1-萘满酮，产量为160mg，产率为42.3％。
2)6-二甲氨基-1-羟基-2-萘甲醛的合成
在惰性气体(如氮气、氩气等)保护下，将氢化钠(48mg，2mmol)、甲酸乙酯(0.35mL，4mmol)、5mL无水甲苯依次加入三口圆底烧瓶中，室温搅拌反应10min，得第二混合液；将6-二甲氨基-1-萘满酮(246mg，1mmol)溶解在10mL无水甲苯中，得6-二甲氨基-1-萘满酮溶液；将6-二甲氨基-1-萘满酮溶液加入到所述第二混合液中，然后加热至55℃，并搅拌1h，溶液中得到黄色沉淀；过滤之后将滤渣在真空干燥箱中干燥，不用进行进一步的纯化处理。将得到的黄色固体溶解在40mL无水四氢呋喃中；然后再加入(227mg，1mmol)2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(DDQ)，室温搅拌反应1h，得第三混合液；将所述第三混合液旋蒸除去溶剂，然后进行柱色谱分离(以体积比为5:1的石油醚和乙酸乙酯的混合液为洗脱剂)，得到黄色固体为6-二甲氨基-1-羟基-2-萘甲醛，产量为165mg，产率为59.2％。
3)6-二甲氨基-1-亚甲基苯硼酸频哪醇酯-2-萘甲醛的合成
在惰性气体(如氮气、氩气等)保护下，将6-二甲氨基-1-羟基-2-萘甲醛(215mg，1mmol)和碳酸钾(276mg，2mmol)溶解在10mL无水N,N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌反应30min，得第四混合液；然后将4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯(297mg，1mmol)分批加入到所述第四混合液中，进行回流反应8h，得第五混合液；将所述第五混合液旋蒸除去溶剂，然后进行柱色谱分离(以体积比为6:1的石油醚和乙酸乙酯的混合液为洗脱剂)，得到黄色固体为6-二甲氨基-1-亚甲基苯硼酸频哪醇酯-2-萘甲醛，产量为236mg，产率为54.7％。
4)2-氰基-(6-二甲氨基-1-亚甲基苯硼酸频哪醇酯-2)-萘丙烯腈的合成
在惰性气体(如氮气、氩气等)保护下，将6-二甲氨基-1-亚甲基苯硼酸频哪醇酯-2-萘甲醛(215mg，0.5mmol)和丙二腈(66mg，1mmol)溶解在20mL乙醇中，然后逐滴加入哌啶(20μL，0.25mmol)，进行回流反应4h，得第六混合液；将所述第六混合液冷却至室温，旋蒸除去溶剂，得到橙色固体为2-氰基-(6-二甲氨基-1-亚甲基苯硼酸频哪醇酯-2)-萘丙烯腈，即为荧光探针(I)—1，产量为165mg，产率为68.9％。
实施例2
合成路线如下(式3)所示：
1)6-二甲氨基-1-萘满酮的合成
将6-氨基-1,2,3,4-四氢-1-萘酮(325mg，2mmol)和碳酸钾(830mg，6mmol)溶于5mL的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，再加入430mg碘甲烷(3mmol)，然后加热至45℃，搅拌反应24h，得第一混合液。反应完毕后将所述第一混合液冷却至室温，向所述第一混合液中加入10mL去离子水，用乙酸乙酯萃取三次，并用大量水和食盐水进行多次冲洗。萃取后的有机相用无水硫酸镁进行干燥，旋蒸除去溶剂，然后进行柱色谱分离(以体积比为6:1的石油醚和乙酸乙酯的混合液为洗脱剂)，得到白色固体为6-二甲氨基-1-萘满酮，产量为160mg，产率为42.3％。
2)6-二甲氨基-1-羟基-2-萘甲醛的合成
在惰性气体(如氮气、氩气等)保护下，将氢化钠(48mg，2mmol)、甲酸乙酯(0.35mL，4.3mmol)、5mL无水甲苯依次加入三口圆底烧瓶中，室温搅拌10min，得第二混合液；将6-二甲氨基-1-萘满酮(246mg，1.3mmol)溶解在10mL无水甲苯中，得6-二甲氨基-1-萘满酮溶液；将6-二甲氨基-1-萘满酮溶液逐滴加到所述第二混合液中，然后加热至55℃，搅拌反应1h，溶液中得到黄色沉淀，过滤之后将滤渣在真空干燥箱中干燥，不用进行进一步的纯化处理；将得到的黄色固体溶解在10mL无水四氢呋喃中，然后分批加入2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(227mg，1mmol)，常温搅拌反应1h，得第三混合液；将所述第三混合液旋蒸除去溶剂，然后进行柱色谱分离(以体积比为5:1的石油醚和乙酸乙酯的混合液为洗脱剂)，得到黄色固体为6-二甲氨基-1-羟基-2-萘甲醛，产量为165mg，产率为59.2％。
3)6-二甲氨基-1-亚甲基苯硼酸频哪醇酯-2-萘甲醛的合成
在惰性气体(如氮气、氩气等)保护下，将化合物6-二甲氨基-1-羟基-2-萘甲醛(215mg，1mmol)和碳酸钾(276mg，2mmol)溶解在10mL无水N,N-二甲基甲酰胺溶液中，室温搅拌30min，得第四混合液；然后将4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯(297mg，1mmol)分批加入到所述第四混合液中，进行回流反应8h，得第五混合液；将所述第五混合液旋蒸除去溶剂，然后进行柱色谱分离(以石油醚和乙酸乙酯体积比为6:1的混合液为洗脱剂)，得到黄色固体为6-二甲氨基-1-亚甲基苯硼酸频哪醇酯-2-萘甲醛，产量为236mg，产率为54.7％。
4)2-[(6-二甲氨基-1-亚甲基苯硼酸频哪醇酯-2)-乙烯基萘]-丙二酸甲酯的合成
在惰性气体(如氮气、氩气等)保护下，将6-二甲氨基-1-亚甲基苯硼酸频哪醇酯-2-萘甲醛(215mg，0.5mmol)和丙二酸二甲酯(102mg，1mmol)在常温下溶解在苯甲酸中，逐滴加入(20μL，0.25mmom)l哌啶，然后进行回流反应8h，得第六混合液。将所述第六混合液冷却至室温，旋蒸除去溶剂，得到白色固体为2-[(6-二甲氨基-1-亚甲基苯硼酸频哪醇酯-2)-乙烯基萘]-丙二酸甲酯，即为荧光探针(I)―2，产率为173mg，产率为63.5％。
实施例3
合成路线如下(式4)所示：
1)6-二环丙氨基-1-萘满酮的合成
将6-氨基-1,2,3,4-四氢-1-萘酮(325mg，2mmol)和氢氧化钾(336mg，6mmol)溶于5mL的二甲基亚砜溶液中，然后加入环丙基溴(363mg，3mmol)，加热至60℃并搅拌反应24h，得第一混合液；反应完毕后将所述第一混合液冷却至室温，向所述第一混合液中加入20mL去离子水，用乙酸乙酯萃取三次，并用大量水和食盐水进行多次冲洗，萃取后的有机相用无水硫酸镁进行干燥，旋蒸除去溶剂，然后进行柱色谱分离(以体积比为8:1的石油醚和乙酸乙酯的混合液为洗脱剂)，得到白色固体为6-二环丙氨基-1-萘满酮，产量为316mg，产率为65.5％。
2)6-二环丙氨基-1-羟基-2-萘甲醛的合成
在惰性气体(如氮气、氩气等)保护下，将氢化钠(48mg，2mmol)、甲酸乙酯(0.35mL，4.3mmol)、5mL无水甲苯依次加入三口圆底烧瓶中，室温搅拌10min，得第二混合液；将6-二环丙氨基-1-萘满酮(314mg，1.3mmol)溶解在10mL无水甲苯中，得6-二环丙氨基-1-萘满酮溶液；将6-二环丙氨基-1-萘满酮溶液逐滴加入到所述第二混合液中。然后加热至60℃，搅拌反应1h，溶液中得到黄色沉淀，过滤之后将滤渣在真空干燥箱中干燥，不用进行进一步的纯化处理；将得到的黄色固体溶解在10mL无水四氢呋喃中，然后分批加入2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(227mg，1mmol)，常温搅拌反应1h，得第三混合液；将所述第三混合液旋蒸除去溶剂，然后进行柱色谱分离(以体积比为6:1的石油醚和乙酸乙酯的混合液为洗脱剂)，得到黄色固体为6-二环丙氨基-1-羟基-2-萘甲醛，质量为158mg，产率为59.1％。
3)6-二环丙氨基-1-亚甲基苯硼酸频哪醇酯-2-萘甲醛的合成
在惰性气体(如氮气、氩气等)保护下，将6-二环丙氨基-1-羟基-2-萘甲醛(267mg，1mmol)和碳酸钾(276mg，2mmol)溶解在10mL无水N,N-二甲基甲酰胺溶液中，常温搅拌反应30min，得第四混合液；然后将4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯(297mg，1mmol)加入到所述第四混合液中，进行回流反应8h，得第五混合液；将所述第五混合液旋蒸除去溶剂，然后进行柱色谱分离(以石油醚和乙酸乙酯体积比为6:1的混合液为洗脱剂)，得到黄色固体为6-二环丙氨基-1-亚甲基苯硼酸频哪醇酯-2-萘甲醛，产率为271mg，产率为56.1％。
4)2-氰基-(6-二环丙氨基-1-亚甲基苯硼酸频哪醇酯-2)-萘丙烯腈的合成
在惰性气体(如氮气、氩气等)保护下，将6-二环丙氨基-1-亚甲基苯硼酸频哪醇酯-2-萘甲醛(242mg，0.5mmol)和丙二腈(66mg，1mmol)在常温下溶解在20mL乙醇中，然后逐滴加入哌啶0.25mmol，进行回流反应4h，得第六混合液；将所述第六混合液冷却至室温，旋蒸除去溶剂，得到橙色固体为2-氰基-(6-二环丙氨基-1-亚甲基苯硼酸频哪醇酯-2)-萘丙烯腈，即为荧光探针(I)―3，产量为163mg；产率为61.3％。
应用例1
将实施例1合成的荧光探针(I)―1溶解在乙腈和PBS缓冲液的混合液(混合液中乙腈和PBS缓冲液体积比为10：90)中，得pH值为7的浓度为1×10-5mol/L的荧光探针(I)―1溶液，然后向荧光探针(I)―1溶液中分别加入浓度为1×10-5mol/L的过氧亚硝酸根离子和浓度均为1×10-4mol/L的超氧根离子、羟基自由基、过氧化氢、一氧化氮、单线态氧、亚硝酸根离子或者硝酸根离子，观察溶液荧光强度的变化。探针激发波长为420nm，发射波长为578nm。
结果如图1所示，浓度为1×10-5mol/L的过氧亚硝酸根离子加入到浓度为1×10-5mol/L荧光探针(I)―1溶液中，溶液的荧光增强二十倍；分别加入浓度均为1×10-4mol/L的超氧根离子、羟基自由基、过氧化氢、一氧化氮、单线态氧、亚硝酸根离子或者硝酸根离子，发现溶液荧光强度变化很小。
应用例2
将实施例1合成的荧光探针(I)―1溶解在乙腈和PBS缓冲液的混合液(乙腈和PBS缓冲液体积比为10：90)中，得pH值为7的浓度为1×10-5mol/L的荧光探针(I)―1溶液，然后分别加入浓度均为1×10-4mol/L的超氧根离子、羟基自由基、过氧化氢、一氧化氮、单线态氧、亚硝酸根离子、硝酸根离子、浓度为1×10-5mol/L过氧亚硝酸根离子和以上活性氧以及活性氮离子的混合溶液(过氧亚硝酸根离子和其他活性氧以及活性氮离子的浓度比为1:10)，观察溶液在λmax＝578nm处的荧光强度变化情况。
结果如图2所示，其他活性氧以及活性氮离子的存在对过氧亚硝酸根离子的响应没有影响，说明荧光探针(I)―1对过氧亚硝酸根离子具有良好的选择性识别和实际应用性。
应用例3
将实施例1合成的荧光探针荧光探针(I)―1溶解在乙腈和PBS缓冲液的混合液(乙腈和PBS缓冲液体积比为10：90)中，得pH值为7的浓度为1×10-5mol/L的荧光探针(I)―1溶液，然后向所述荧光探针(I)―1溶液中加入不同浓度的过氧亚硝酸根离子，观察在λmax＝578nm处溶液的荧光强度随过氧亚硝酸根离子浓度的变化曲线。
结果如图3所示，当过氧亚硝酸根离子的浓度在0.37～10umol/L时,溶液的荧光强度与过氧亚硝酸根离子浓度呈一定的线性关系(R2＝0.996，Y＝2.17X+0.615)。
应用例4
1)细胞培养
Hela细胞培养条件：将Hela细胞接种在含培养基(DMEM+10％FBS+100μg/mL青霉素+100μg/mL链霉素)的细胞培养瓶中，然后将细胞培养瓶放在温度为37℃，体积为5％的CO2的培养箱中孵育，每两天更换一次新鲜培养基；待细胞长满之后，将Hela细胞接种到共聚焦皿中，孵育24h后细胞绝大多数呈贴壁状态，控制共聚焦皿中的细胞密度约为104；实验时更换一次新鲜培养基，向共聚焦皿中加入浓度为1×10-5mol/L的荧光探针的PBS缓冲液(NaH2PO4-Na2HPO4)，然后将共聚焦皿放在孵育箱中孵育10min，从共聚焦皿吸出培养液并用PBS缓冲溶液冲洗三次；将共聚焦皿分为两组，第一组细胞直接用Nikon C1si型激光共聚焦显微镜在488nm激光激发下成像，第二组细胞在5×10-6mol/L的过氧亚硝酸根离子的溶液中孵育30min后用PBS缓冲溶液冲洗三次，然后进行激光共聚焦显微成像。
2)激光共聚焦显微成像
利用激光共聚焦显微镜成像技术，研究Hela细胞内荧光探针(I)―1对过氧亚硝酸根离子的识别作用。
结果如图4所示，图4(a)是从左至右分别为孵育过的Hela细胞的明场图、荧光图和叠加图，几乎看不到荧光；图4(b)从左至右分别为加入过氧亚硝酸根离子后的明场图、荧光图和叠加图，可以观察到细胞质内有很强的荧光；明场图像表明细胞在整个实验过程中仍保持良好的细胞活力。图中标尺为20μM。
DMEM细胞培养基是直接购买的生物试剂。
DMEM细胞培养基
本发明的上述实施例仅是为清楚说明本发明所作的举例，并非本发明的实施方式的限定。对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动，在这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (10)

1.一种检测细胞内过氧亚硝酸根离子的荧光探针，其特征在于，其结构如式(I)所示：
其中，R1和R2各自独立地选自氢、1～5个碳原子的直链烷基或3～8个碳原子的环烷基；R3选自氰基或酯基。
2.根据权利要求1所述的检测细胞内过氧亚硝酸根离子的荧光探针，其特征在于，所述1～5个碳原子的直链烷基为甲基、乙基、丙基、烯丙基、异丙基，丁基、异丁基、戊基或异戊基；所述3～8个碳原子的环烷基为环丙烷基、环丁烷基、环戊烷基、环己烷基或环庚烷基；所述氰基为甲氰基、乙氰基或丙氰基；所述酯基为甲酯基、乙酯基、丙酯基或异丙酯基。
3.一种如权利要求1～2任一所述的检测细胞内过氧亚硝酸根离子的荧光探针的合成方法，其特征在于，它包括如下步骤：
1)将6-氨基-1,2,3,4-四氢-1-萘酮和碱溶于无水有机溶剂中，或者将6-氨基-1,2,3,4-四氢-1-萘酮和碱性盐溶于无水有机溶剂中，然后加入卤代烷，加热反应，得第一混合液；反应完毕后将所述第一混合液冷却至室温；然后向所述第一混合液中加入去离子水，用有机溶剂萃取，萃取后的有机相进行干燥、旋蒸除去溶剂，然后进行柱色谱分离，得到式(Ⅱ)所示的化合物：
其中，R1和R2各自独立地选自氢、1～5个碳原子的直链烷基或3～8个碳原子的环烷基中的一种；
2)在惰性气体保护下，将氢化钠和甲酸乙酯溶于无水有机溶剂中，室温反应，得第二混合液；将式(Ⅱ)所示化合物加入到所述第二混合液中，然后加热反应，溶液中得到黄色沉淀；过滤、干燥，将得到的黄色固体溶解在无水有机溶剂中；然后再加入2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌，室温反应，得第三混合液；将所述第三混合液旋蒸除去溶剂，然后进行柱色谱分离，得到式(Ⅲ)所示的化合物：
3)在惰性气体保护下，将式(Ⅲ)所示化合物和碱性盐溶于无水有机溶剂中，室温反应，得第四混合液；然后将4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯加入到所述第四混合液中，进行回流反应，得第五混合液，将所述第五混合液旋蒸除去溶剂，然后进行柱色谱分离，得到式(Ⅳ)所示的化合物：
4)在惰性气体保护下，将式(Ⅳ)所示化合物和含有氰基或酯基的化合物溶于无水有机溶剂中，然后加入哌啶，进行回流反应，得第六混合液；将所述第六混合液冷却至室温，旋蒸除去溶剂，得到式(I)所示的化合物，即为荧光探针
其中，R3选自氰基或酯基。
4.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，所述1～5个碳原子的直链烷基为甲基、乙基、丙基、烯丙基、异丙基，丁基、异丁基、戊基或异戊基；所述3～8个碳原子的环烷基为环丙烷基、环丁烷基、环戊烷基、环己烷基或环庚烷基；所述氰基为甲氰基、乙氰基或丙氰基；所述酯基为甲酯基、乙酯基、丙酯基或异丙酯基。
5.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，步骤1)中，所述6-氨基-1,2,3,4-四氢-1-萘酮、碱或碱性盐、卤代烷的摩尔比为1：2～5：1～3；反应温度为40～60℃，反应时间为18～24h。
6.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，所述卤代烷为碘甲烷、溴乙烷、溴丙烷、烯丙基溴、异丙基溴、溴丁烷、异丁基溴、溴戊烷、异戊基溴、环丙基溴、环丁基溴、环戊基溴、环己基溴或环庚基溴；所述含有氰基或酯基的化合物为丙二腈、戊二腈、庚二腈、丙二酸二甲酯、丙二酸二乙酯、丙二酸二丙酯或丙二酸二异丙酯。
7.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，步骤2)中，所述氢化钠、甲酸乙酯、式(Ⅱ)所示化合物、2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌的摩尔比为1～3:2～5:0.5～2:1；将所述化合物(Ⅱ)的溶液加入到所述第二混合液之后，反应温度为50～70℃；反应时间为1～2h；加入2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌之后，室温反应时间为1～3h。
8.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，步骤3)中，式(Ⅲ)所示化合物、碱性盐、4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯的摩尔比为1:2～5:1；室温反应时间为20～50min；回流反应时间为4～8h。
9.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，步骤4)中，式(Ⅳ)所示化合物、含有氰基或酯基的化合物、哌啶的摩尔比为1～3:3～6:1，回流反应时间为3～8h。
10.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，所述无水有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、甲苯、四氢呋喃、二甲基亚砜、乙醇或苯甲酸。
CN201610219268.3A 2016-04-11 2016-04-11 一种检测细胞内过氧亚硝酸根离子的荧光探针及其合成方法 Active CN107286927B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610219268.3A CN107286927B (zh) 2016-04-11 2016-04-11 一种检测细胞内过氧亚硝酸根离子的荧光探针及其合成方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610219268.3A CN107286927B (zh) 2016-04-11 2016-04-11 一种检测细胞内过氧亚硝酸根离子的荧光探针及其合成方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107286927A true CN107286927A (zh) 2017-10-24
CN107286927B CN107286927B (zh) 2019-03-29

Family

ID=60093450

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610219268.3A Active CN107286927B (zh) 2016-04-11 2016-04-11 一种检测细胞内过氧亚硝酸根离子的荧光探针及其合成方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107286927B (zh)

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107652968A (zh) * 2017-11-06 2018-02-02 北京理工大学 一种过氧化亚硝酰荧光探针及其制备方法和应用
CN107903257A (zh) * 2017-11-16 2018-04-13 华北电力大学 一种基于花菁可视有机分子荧光探针及其制备方法
CN108570063A (zh) * 2018-05-30 2018-09-25 泰山医学院 一种能够检测onoo-的小分子荧光探针及其应用
CN110044864A (zh) * 2019-05-24 2019-07-23 郑州大学 基于香豆素二酮的荧光探针在检测过氧亚硝酸根离子中的应用
CN110964044A (zh) * 2019-12-13 2020-04-07 山东省科学院生物研究所 一种基于双香豆素衍生物的过氧化亚硝酸盐荧光探针、制备方法与应用
CN111372922A (zh) * 2018-01-11 2020-07-03 香港科技大学 超低浓度的用于在活细胞和深层组织中脂滴特异性成像的双光子荧光化合物
CN112442056A (zh) * 2020-11-03 2021-03-05 上海应用技术大学 同时检测次氯酸和过氧化亚硝基阴离子的荧光探针及其合成方法和应用
CN113292582A (zh) * 2021-05-11 2021-08-24 湖南师范大学 一种同时区分羟基自由基和过氧化氢的双功能荧光探针的合成与应用
CN114106024A (zh) * 2021-07-26 2022-03-01 长江大学 一种荧光探针及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZHANG, JIAN: "An arylboronate-based fluorescent probe for peroxynitrite with fast response and high selectivity", 《ANALYTICAL METHODS》 *
ZHOU XIN等: "A ratiometric fluorescent probe based on a coumarin-hemicyanine scaffold for sensitive and selective detection of endogenous peroxynitrite", 《BIOSENSORS & BIOELECTRONICS》 *

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107652968A (zh) * 2017-11-06 2018-02-02 北京理工大学 一种过氧化亚硝酰荧光探针及其制备方法和应用
CN107903257B (zh) * 2017-11-16 2020-09-11 华北电力大学 一种基于花菁可视有机分子荧光探针及其制备方法
CN107903257A (zh) * 2017-11-16 2018-04-13 华北电力大学 一种基于花菁可视有机分子荧光探针及其制备方法
CN111372922B (zh) * 2018-01-11 2022-06-28 香港科技大学 超低浓度的用于在活细胞和深层组织中脂滴特异性成像的双光子荧光化合物
CN111372922A (zh) * 2018-01-11 2020-07-03 香港科技大学 超低浓度的用于在活细胞和深层组织中脂滴特异性成像的双光子荧光化合物
CN108570063A (zh) * 2018-05-30 2018-09-25 泰山医学院 一种能够检测onoo-的小分子荧光探针及其应用
CN110044864A (zh) * 2019-05-24 2019-07-23 郑州大学 基于香豆素二酮的荧光探针在检测过氧亚硝酸根离子中的应用
CN110964044A (zh) * 2019-12-13 2020-04-07 山东省科学院生物研究所 一种基于双香豆素衍生物的过氧化亚硝酸盐荧光探针、制备方法与应用
CN112442056A (zh) * 2020-11-03 2021-03-05 上海应用技术大学 同时检测次氯酸和过氧化亚硝基阴离子的荧光探针及其合成方法和应用
CN112442056B (zh) * 2020-11-03 2022-08-23 上海应用技术大学 同时检测次氯酸和过氧化亚硝基阴离子的荧光探针及其合成方法和应用
CN113292582A (zh) * 2021-05-11 2021-08-24 湖南师范大学 一种同时区分羟基自由基和过氧化氢的双功能荧光探针的合成与应用
CN113292582B (zh) * 2021-05-11 2022-04-15 湖南师范大学 一种同时区分羟基自由基和过氧化氢的双功能荧光探针的合成与应用
CN114106024A (zh) * 2021-07-26 2022-03-01 长江大学 一种荧光探针及其制备方法和应用
CN114106024B (zh) * 2021-07-26 2023-11-03 长江大学 一种荧光探针及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN107286927B (zh) 2019-03-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107286927A (zh) 一种检测细胞内过氧亚硝酸根离子的荧光探针及其合成方法
CN107325095B (zh) 一种溶酶体次氯酸荧光探针及其制备方法和应用
Li et al. A near-infrared fluorescent probe for Cu2+ in living cells based on coordination effect
CN107556305B (zh) 一种用于检测铝离子荧光探针、制备方法及应用
CN106814057B (zh) 一种基于聚集诱导荧光增强特性用于选择性识别atp的荧光探针、合成方法及其应用
CN104357044A (zh) 一种荧光探针及其制备方法和应用
CN113278015B (zh) 一种荧光探针及其制备方法和应用
CN1715919A (zh) 细胞锌离子检测用的氟硼染料荧光探针
CN114014848B (zh) 一种rna荧光探针及其制备方法和应用
CN103896928B (zh) 一种pH荧光化学传感器及其合成方法和应用
CN112939935A (zh) 一种用于溶酶体靶向荧光探针及其合成方法与细胞成像应用
CN107311957A (zh) 一种基于聚集诱导发光和激发态分子内质子转移化合物及其制备方法和应用
CN105154065B (zh) 一种快速专一性识别羟基自由基的荧光探针及其制备方法和应用
CN108864058A (zh) 一类氧杂蒽酮类荧光染料及应用
CN106588910A (zh) 一种双功能荧光探针、制备方法及应用
CN110643355A (zh) 一种检测内质网极性的荧光探针及其制备方法和应用
CN105670608B (zh) 一种可检测活细胞线粒体中镍离子的高选择性荧光探针及其制备方法
CN105153733B (zh) 一种具有大双光子荧光活性截面的膜通透性染料及其应用
CN103087706B (zh) 一种单、双光子酸性细胞器荧光探针及其应用
CN114773305B (zh) 一种2-2环芳吡喃酮pH荧光比率探针的制备方法及应用
CN102627662A (zh) 一类长波长氟硼二吡咯荧光染料的合成及细胞呈像应用
CN109913206A (zh) 一种rna荧光探针及其制备方法和应用
CN113121488B (zh) 一种基于香豆素衍生物的检测偶氮还原酶的荧光探针分子及其制备方法和应用
CN110229203B (zh) 一种氨基己糖酶荧光探针及其制备方法和应用
CN112094260B (zh) 一种h2s近红外荧光分子探针及其制备方法与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant