CN111372922A - 超低浓度的用于在活细胞和深层组织中脂滴特异性成像的双光子荧光化合物 - Google Patents

超低浓度的用于在活细胞和深层组织中脂滴特异性成像的双光子荧光化合物 Download PDF

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Abstract

本主题涉及具有聚集诱导发光(AIE)特征的荧光化合物。该化合物可用作细胞成像中的脂滴(LD)特异性生物探针，具有较高的光稳定性和亮度。例如，该化合物在超低浓度下可用于活细胞和深层组织中脂滴的特异性双光子染色。这些化合物表现出大的斯托克斯位移(>110nm)、高的固体荧光量子产率(高达0.30)、良好的双光子吸收截面(860nm处为45GM至100GM)、高生物相容性和良好的光稳定性。

Description

超低浓度的用于在活细胞和深层组织中脂滴特异性成像的双 光子荧光化合物
交叉引用
本申请要求于2018年1月11日提交的美国临时专利申请No.62/709,249的优先权，该申请由本申请的发明人提出，并且该申请的全部内容以引用方式并入文本。
技术领域
本主题大体上涉及一系列具有聚集诱导发光特性的荧光化合物，以及这些化合物在超低浓度下对活细胞和深层组织中的脂滴进行成像的应用。
背景技术
脂滴(LD)是大多数细胞和生物体中普遍存在的富含脂质的球形细胞器。脂滴主要包含甘油三酸酯和胆固醇酯，并被具有特定蛋白质的磷脂单层包裹。作为动态细胞器，脂滴参与了许多细胞功能，例如脂质代谢、膜合成和转移、信号转导和蛋白质降解等。最近的研究表明，脂滴也与肥胖、糖尿病、炎性疾病和癌症高度相关。一些诸如透射电子显微成像、拉曼显微成像和免疫荧光显微成像之类的成像技术已经被用于脂滴可视化。然而，这些成像技术通常需要经历复杂的过程、细胞通透性差并且干扰细胞功能。因此，开发用于在包含活细胞和活组织的生物样品中进行直接和选择性脂滴可视化和监视的有效方法非常重要。
荧光成像由于其优异的选择性、卓越的灵敏度和非凡的时空分辨率，已成为对细胞结构和分子过程的定位和动态进行可视化的必不可少的工具。与单光子荧光成像相比，利用两个近红外(NIR)光子作为激发源的双光子(TP)荧光成像由于其更深的组织穿透力、更高的空间分辨率、更低的背景荧光和更低的光损伤和光漂白而在生物医学成像中受到高度青睐。
用于脂滴染色的常规荧光染料尼罗红(Nile Red)和BODIPY 493/503存在一些缺点。尼罗红显示不利的背景染色和较宽的发射，这限制了其在多色成像中的应用。BODIPY493/503表现出很小的斯托克斯位移，因此会产生非辐射能和散射光的干扰。此外，用于脂滴染色的常规染料的孵育浓度通常在5μM至10μM甚至更高的范围内。在如此高的浓度下，这些常规的有机荧光团也遇到了聚集引起猝灭(ACQ)的不利现象。具体地，这些常规的荧光团通常在溶液中时强烈发射，但是由于分子间的π-π堆积和其他非辐射途径而在聚集体形成时导致发射猝灭。先前合成的以纳摩尔浓度进行脂滴成像的少数几种染料在活细胞中表现出非特异性染色并呈现蓝色发射，从而导致信噪比低。这些基于ACQ的染料也显示出较小的斯托克斯位移，并且这些染料的光稳定性受到关注。此外，很少探索基于这些染料的双光子深层组织成像。
与基于ACQ的染料的不同，聚集诱导发光(AIE)荧光团在溶液中不发光或微弱发射，但是一旦通过分子内运动受限(RIM)而聚集，通常会发出强烈的荧光。作为结果，AIE荧光团可以在高浓度和聚集状态下有效，发出明亮的荧光并且具有高的光漂白阈值。
因此，构筑用于脂滴特异性的生物探针的荧光AIEgen是非常需要的。
发明内容
本主题涉及具有聚集诱导发光(AIE)特征的荧光化合物。这些化合物可用作细胞成像中的脂滴(LD)特异性生物探针，具有较高的光稳定性和亮度。例如，这些化合物在超低浓度下可用于活细胞和深层组织中脂滴的特异性双光子染色。这些化合物表现出大的斯托克斯位移(>110nm)、高的固体荧光量子产率(高达0.30)、良好的双光子吸收截面(860nm处为45GM至100GM)、高生物相容性和良好的光稳定性。如本文所述，已成功证明了本发明化合物在活细胞和活小鼠肝脏组织中脂滴的体外和离体双光子成像中的用途。实现了在活小鼠肝脏组织中约70μm的深度的脂滴成功可视化。另外，基于计算的油水分配系数(ClogP)数值的半理论数据表明，这些化合物可以特异性地位于脂滴中。
在一个实施方案中，这些化合物含有以下骨架结构式：
Figure BDA0002453695770000031
其中，R1、R2和R3独立地选自由CnH2n+1、C6H5、C10H7、CnH2nCOOH、CnH2nNCS、CnH2nN3、CnH2nNH2、CnH2nCl、CnH2nBr、CnH2nI和
Figure BDA0002453695770000032
组成的组；
其中，R'选自由CnH2nNCS、CnH2nN3、CnH2nNH2、CnH2nCl、CnH2nBr、CnH2nI和
Figure BDA0002453695770000033
组成的组；
其中，R4、R5和R6独立地选自由H、CH3、F、Cl、Br、I、CN、CF3、NO2、苯基、吡啶基、CH＝CHPh和C≡CPh组成的组；并且
其中，n为范围为1至10的整数。
在另一个实施方案中，化合物包括一种或多种选自由以下物质组成的组中的化合物：
Figure BDA0002453695770000034
Figure BDA0002453695770000041
附图说明
现在将参考附图详细说明各种实施方案。
图1示出了NAP-Br、NAP-CF3、NAP-Py和NAP-Py+的单晶结构。
图2A示出了NAP-Br在晶体结构中的分子堆积。图2B示出了NAP-CF3在晶体结构中的分子堆积。图2C示出了NAP-Py在晶体结构中的分子堆积。图2D示出了NAP-Py+在晶体结构中的分子堆积。图2E示出了NAP-CF3、NAP-Py和NAP-Py+结构中萘与苯之间的二面角(距离的单位为
Figure BDA0002453695770000042
)。
图3A示出了NAP-Br的主要分子间堆积相互作用。图3B示出了NAP-CF3的主要分子间堆积相互作用。图3C示出了NAP-Py的主要分子间堆积相互作用。图3D示出了NAP-Py+的主要分子间堆积相互作用(距离的单位为
Figure BDA0002453695770000051
)。
图4A示出了NAP-Br在无定型态(Z异构体)的1H NMR谱变化。图4B示出了NAP-Br在晶态(E异构体)的1H NMR谱变化。图4C示出了由E异构体(图4B)的溶剂蒸发及随后将所得的固体在CDCl3中再溶解而得到的1H NMR谱图。
图5A示出了NAP AIEgen(10μM)在THF或CH3CN中的归一化的吸收光谱。图5B示出了NAP-Ph(10μM)在THF和具有不同含水率的THF/水混合物中的荧光光谱。图5C示出了NAP-Br(10μM)在THF和具有不同含水率的THF/水混合物中的荧光光谱。图5D示出了NAP-CF3(10μM)在THF和具有不同含水率的THF/水混合物中的荧光光谱。图5E示出了NAP-Py(10μM)在THF和具有不同含水率的THF/水混合物中的荧光光谱。图5F示出了NAP-Py+(10μM)在CH3CN和具有不同含水率的CH3CN/水混合物中的荧光光谱。图5G示出了NAP AIEgen(10μM)的相对最大荧光强度(I/I0)与THF/水混合物或者CH3CN/水混合物的溶剂组成的关系。图5H示出了NAPAIEgen在固态的归一化的荧光光谱。(由于NAP-Py+的溶解性，因而选择CH3CN作为有机溶剂)。
图6A示出了NAP-Ph在不同极性溶剂中的荧光光谱。图6B示出了NAP-Br在不同极性溶剂中的荧光光谱。图6C示出了NAP-CF3在不同极性溶剂中的荧光光谱。图6D示出了NAP-Py在不同极性溶剂中的荧光光谱。图6E示出了NAP-Py+在不同极性溶剂中的荧光光谱。
图7示出了NAP AIEgen的计算的HOMO和LUMO的空间分布以及HOMO/LUMO能隙(单位，eV)。
图8A示出了NAP-Ph在聚集悬浮液中的双光子激发荧光光谱。
图8B示出了NAP-Br在聚集悬浮液中的双光子激发荧光光谱。
图8C示出了NAP-CF3在聚集悬浮液中的双光子激发荧光光谱。
图8D示出了NAP-Py在聚集悬浮液中的双光子激发荧光光谱。
图8E示出了NAP-Py+在聚集悬浮液中的双光子激发荧光光谱。
图8F示出了NAP AIEgen在含有10％THF(NAP-Ph、NAP-Br、NAP-CF3和NAP-Py)或10％CH3CN(NAP-Py+)的水中的聚集悬浮液的双光子吸收截面(1GM≡10-50cm4 s/光子)。
图9示出了固态的NAP AIEgen在800nm激发(强度约0.35mW)下的双光子激发荧光光谱。
图10示出了与NAP-Ph(100nM)、NAP-Br(100nM)、NAP-CF3(100nM)、NAP-Py(100nM)和NAP-Py+(1μM)一同孵育的HeLa细胞的激光共聚焦显微图像。标尺：20μm。
图11示出了NAP AIEgen在HeLa细胞中的原位荧光光谱。
图12示出了与NAP-Ph、NAP-Br、NAP-CF3、NAP-Py和尼罗红一同孵育的HeLa细胞的激光共聚焦显微图像。浓度：100nM。标尺：20μm。
图13示出了与NAP-Py+(1μM)和MitoTraker Deep Red(MTDR，100nM)一同孵育的HeLa细胞的激光共聚焦显微图像。标尺：20μm。
图14示出了尼罗红、BODIPY 493/503、NAP-Ph、NAP-Br、NAP-CF3和NAP-Py的计算的油水分配系数(ClogP)与分子量的关系。
图15示出了用NAP-Ph、NAP-Br、NAP-CF3、NAP-Py和尼罗红染色的HeLa细胞的激光共聚焦显微图像。标尺：20μm。
图16A示出了NAP-Ph在PBS溶液、含有DMPC的PBS溶液以及含有DMPC和TAG的PBS溶液(pH 7.2)中的荧光(FL)强度的变化。图16B示出了NAP-Br在PBS溶液、含有DMPC的PBS溶液以及含有DMPC和TAG的PBS溶液(pH 7.2)中的荧光(FL)强度的变化。图16C示出了NAP-CF3在PBS溶液、含有DMPC的PBS溶液以及含有DMPC和TAG的PBS溶液(pH 7.2)中的荧光(FL)强度的变化。图16D示出了NAP-Py在PBS溶液、含有DMPC的PBS溶液以及含有DMPC和TAG的PBS溶液(pH 7.2)中的荧光(FL)强度的变化。浓度：NAP AIEgen为1μM，DMPC为40μg/mL，TAG为80μg/mL。
图17示出了用NAP-Ph、NAP-Br、NAP-CF3和NAP-Py在HeLa细胞中染色的HeLa细胞的单光子(λex＝405nm)和双光子(λex＝860nm)荧光显微图像。浓度：100nM。标尺：20μm。
图18示出了与NAP-CF3(1μM)一同孵育的活的小鼠肝脏组织的离体双光子(λex＝860nm)图像。标尺：20μm。
图19A至图19F示出了NAP-CF3(1μM)在不同穿透深度的小鼠肝脏组织的离体双光子(λex＝860nm)图像。标尺：20μm。
图19G至图19H示出了沿不同轴重建的3D双光子图像。
图20为示出在连续照射下，NAP AIEgen和尼罗红在HeLa细胞中的光稳定性的图(照射条件：对于NAP AIEgen，405nm激光，激光器功率为12％；对于尼罗红，543nm激光，激光器功率为12％)。
图21A为示出NAP-Ph、NAP-Br、NAP-CF3和NAP-Py在HeLa细胞中的细胞毒性的图。
图21B为示出NAP-Py+在HeLa细胞中的细胞毒性的图。
图22示出了NAP-Ph的1H NMR(400MHz，CDCl3)谱图。
图23示出了NAP-Ph的13C NMR(100MHz，CDCl3)谱图。
图24示出了NAP-Ph的MALDI-TOF-HRMS谱图。
图25示出了NAP-Br的1H NMR(400MHz，CDCl3)谱图。
图26示出了NAP-Br的13C NMR(100MHz，CDCl3)谱图。
图27示出了NAP-Br的MALDI-TOF-HRMS谱图。
图28示出了NAP-CF3的1H NMR(400MHz，CDCl3)谱图。
图29示出了NAP-CF3的19F NMR(376MHz，CDCl3)谱图。
图30示出了NAP-CF3的13C NMR(100MHz，CDCl3)谱图。
图31示出了NAP-CF3的MALDI-TOF-HRMS谱图。
图32示出了NAP-Py的1H NMR(400MHz，CDCl3)谱图。
图33示出了NAP-Py的13C NMR(100MHz，CDCl3)谱图。
图34示出了NAP-Py的MALDI-TOF-HRMS谱图。
图35示出了NAP-Py+的1H NMR(400MHz，DMSO-d6)谱图。
图36示出了NAP-Py+的19F NMR(376MHz，DMSO-d6)谱图。
图37示出了NAP-Py+的13C NMR(100MHz，CD3CN)谱图。
图38示出了NAP-Py+的MALDI-TOF-HRMS谱图。
具体实施方式
提供以下定义是为了理解本发明和构建所附专利的权利要求。
定义
应该理解，上面或下面描述的附图仅用于说明目的。附图不一定按比例绘制，重点通常在于说明本教导的原理。附图不旨在以任何方式限制本教导的范围。
在整个申请中，当组合物被描述为具有、包括或包含特定组分时，或者当方法被描述为具有、包括或包含特定的方法步骤时，预期本教导的组合物也可以基本上由所述组分组成或者由所述组分组成，并且本教导的方法也可以基本上由所述方法步骤组成或由所述方法步骤组成。
在本申请中，当元件或组件被称为包括在所列举的元件或组件的列表中和/或从所列举的元件或组件的列表中选择时，应当理解，该元件或组件可以是所述元件或组件中的任何一个，或者该元件或组件可选自由两种或更多种所述元件或组件组成的组。此外，应当理解，本文描述的组合物、装置或方法的元件和/或特征可以以各种方式组合而不脱离本教导的精神和范围，无论在本文中是明确的还是隐含的。
除非另外特别说明，否则术语“包括(include，includes，including)”或“具有(have，has，having)”的使用通常应理解为开放式和非限制性的。
除非另外特别说明，否则本文中单数的使用包括复数(反之亦然)。
应当理解，只要本教导仍然可操作，步骤的顺序或执行某些动作的顺序是不重要的。此外，可以同时进行两个或更多个步骤或动作。
本文所用的术语“λex”是指激发波长。
本文所用的术语“Ph”是指苯基。
本文所用的术语“Py”是指吡啶基。
本文所用的短语“聚集引起猝灭”或“ACQ”是指其中π-共轭荧光团的聚集显著降低荧光团的荧光强度的现象。这种聚集体形成被称为“猝灭”荧光团的光发射。
本文所用的短语“聚集诱导发光”或“AIE”是指在无定形或结晶(固态)状态下聚集时表现出显著的发光增强的化合物所表现出的现象，而它们在稀溶液中表现出弱或几乎没有发光。
如本文所用，“发光强度”是指通常从荧光光谱仪或荧光显微镜测定获得的荧光/磷光的大小；如本文所用，“荧光团”或“荧光体”是指显示荧光的分子；如本文所用的“发光体”或“发光团”是指显示发光的分子；以及如本文所用的“AIEgen”是指具有AIE特征的分子。
如本文所用，“卤代”或“卤素”是指氟、氯、溴和碘。
如本文所用，“烷基”是指直链或支链的饱和烃基。烷基的实例包括甲基(Me)、乙基(Et)、丙基(例如，正丙基和异丙基)、丁基(例如，正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基)、戊基(例如，正戊基、异戊基、戊基)、己基等。在各种实施方案中，烷基可具有1至40个碳原子(即，C1-40烷基)，例如1至30个碳原子(即，C1-30烷基)。在一些实施方案中，烷基可具有1至6个碳原子，并且可称为“低级烷基”。低级烷基的实例包括甲基、乙基、丙基(例如正丙基和异丙基)和丁基(例如正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基)。在一些实施方案中，烷基可如本文所述被取代。烷基通常不被另一个烷基、链烯基或炔基取代。
如本文所用，“链烯基”是指具有一个或多个碳-碳双键的直链或支链烷基。链烯基的实例包括乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、丁二烯基、戊二烯基、己二烯基等。一个或多个碳-碳双键可以是内部的(例如在2-丁烯中)或末端的(例如在1-丁烯中)。在各种实施方案中，链烯基可具有2至40个碳原子(即C2-40链烯基)，例如，2至20个碳原子(即C2-20链烯基)。在一些实施方案中，链烯基可如本文所述被取代。链烯基通常不被另一个链烯基、烷基或炔基取代。
如本文所用，“杂原子”是指除碳或氢之外的任何元素的原子，并且包括(例如)氮、氧、硅、硫、磷和硒。
如本文所用，“芳基”是指芳族单环烃环系统或多环环系统，其中两个或更多个芳族烃环稠合(即，具有共同的键)在一起或至少一个芳族单环烃环与一个或多个环烷基和/或环杂烷基环稠合。芳基在其环系统中可具有6至24个碳原子(例如，C6-24芳基)，其可包括多个稠合环。在一些实施方案中，多环芳基可具有8至24个碳原子。芳基的任何合适的环位置可以与限定的化学结构共价连接。仅具有一个或多个芳族碳环的芳基的实例包括苯基、1-萘基(双环)、2-萘基(双环)、蒽基(三环)、菲基(三环)、戊炔基(五环)等基团。其中至少一个芳族碳环与一个或多个环烷基和/或环杂烷基环稠合的多环体系的实例包括环戊烷的苯并衍生物(即，茚满基，其为5,6-双环环烷基/芳环系统)、环己烷的苯并衍生物(即四氢萘基，其为6,6-双环环烷基/芳环系统)、咪唑啉的苯并衍生物(即苯并咪唑啉基，其为5,6-双环环杂烷基/芳环系统)和吡喃的苯并衍生物(即，色烯基，其为6,6-双环环杂烷基/芳环系统)。芳基的其他实例包括苯并二噁烷基、苯并二氧杂环戊烯基、苯并二氢吡喃基、二氢吲哚基等。在一些实施方案中，芳基可如本文所述被取代。在一些实施方案中，芳基可具有一个或多个卤素取代基，并且可被称为“卤代芳基”。在“卤代芳基”的定义内包括全卤芳基，即所有氢原子均被卤素原子取代的芳基(例如-C6F5)。在某些实施方案中，芳基被另一个芳基取代并且可以被称为联芳基。如本文公开的那样，联芳基中的每个芳基可以被取代。
如本文所用，“杂芳基”是指含有至少一个选自氧(O)、氮(N)、硫(S)、硅(Si)和硒(Se)环杂原子的芳族单环的环系统或多环的环系统，该多环的环系统中存在的至少一个环是芳族的并含有至少一个环杂原子。多环杂芳基包括那些具有两个或更多个稠合在一起的杂芳基环的，以及那些与一个或多个芳族碳环、非芳族碳环和/或非芳族环杂烷基环稠合的具有至少一个单环杂芳基环的。杂芳基作为整体可具有(例如)5至24个环原子并含有1至5个环杂原子(即5元至20元杂芳基)。杂芳基可以在任何杂原子或碳原子上与所定义的化学结构连接，从而产生稳定的结构。通常，杂芳基环不含O-O、S-S或S-O键。然而，杂芳基中的一个或多个N或S原子可被氧化(例如，吡啶N-氧化物、噻吩S-氧化物、噻吩S,S-二氧化物)。杂芳基的实例包括(例如)如下所示的5-或6-元单环和5-6双环系统：
Figure BDA0002453695770000111
其中T是O、S、NH、N-烷基、N-芳基、N-(芳基烷基)(例如，N-苄基)、SiH2、SiH(烷基)、Si(烷基)2、SiH(芳基烷基)、Si(芳基烷基)2或Si(烷基)(芳基烷基)。这种杂芳基环的实例包括吡咯基、呋喃基、噻吩基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、三唑基、四唑基、吡唑基、咪唑基、异噻唑基、噻唑基、噻二唑基、异噁唑基、噁唑基、噁二唑基、吲哚基、异吲哚基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、喹啉基、2-甲基喹啉基、异喹啉基、喹喔啉基、喹唑晽基、苯并三唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并异噻唑基、苯并异噁唑基、苯并噁二唑基、苯并噁唑基、噌啉基、1H-吲唑基、2H-吲唑基、吲哚嗪基、异苯并呋喃基、萘啶基、酞嗪基、蝶啶基、嘌呤基、噁唑并吡啶基、噻唑并吡啶基、咪唑并吡啶基、呋喃并吡啶基、噻吩并吡啶基、吡啶并嘧啶基、吡啶并吡嗪基、吡啶并哒嗪基、噻吩并噻唑基、噻吩并噁唑基、噻吩并咪唑基等。杂芳基的其他实例包括4,5,6,7-四氢吲哚基、四氢喹啉基、苯并噻吩并吡啶基、苯并呋喃并吡啶基等。在一些实施方案中，杂芳基可如本文所述被取代。
如本文所用，“供体”材料是指具有作为主要电流或电荷载体的空穴的有机材料，例如，有机纳米颗粒材料。
如本文所用，“受体”材料是指具有电子作为主要电流或电荷载体的有机材料，例如，有机纳米颗粒材料。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与当前描述的主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
在提供一系列值的情况下(例如，浓度范围、百分比范围或比率范围)，应理解的是，除了上下文另有明确规定之外，在该范围的上限和下限之间的精确至下限单位的十分之一的各中间值以及任何其他规定范围或在该规定范围内的中间值均包括在所述主题内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且这样的实施方案也包括在所描述的主题内，受所述范围内的任何特别排除的极限值的限制。在所述范围包括一个或两个极限值的情况下，排除所包括的极限值中的任一者或两者的范围也包括在所描述的主题中。
在整个申请中，各种实施方案的描述使用“包含”语言。然而，本领域技术人员将理解，在一些特定情况下，可以使用“基本上由......组成”或“由......组成”的语言来替代性地描述实施方案。
为了更好地理解本教导并且决不限制本教导的范围，除非另有说明，否则在说明书和权利要求中使用的表示数量、百分比或比例以及其他数值的所有数字在所有情况下应理解为被术语“约”修饰。因此，除非有相反的指示，否则在以下说明书和所附权利要求书中列出的数值参数是近似值，其可以根据试图获得的所需性质而变化。至少，每个数值参数至少应根据报告的有效数字的数量并通过应用普通的舍入技术来解释。另外，在将术语“约”使用在定量值之前的情况下，除非另外特别说明，否则本教导还包括具体的定量值本身。如本文所用，术语“约”是指与标称值相差±10％，除非另有说明或推断。
荧光化合物
本主题涉及具有聚集诱导发光(AIE)特征的荧光化合物。本发明的化合物在本文中也称为“NAP AIEgen”，其包括萘单元并具有共轭的供体-受体(D-A)结构。这些化合物表现出大的斯托克斯位移(>110nm)、高的固体荧光量子产率(高达0.30)以及良好的双光子吸收截面(860nm处为45GM至100GM)。该化合物可用于活细胞和活深层组织中脂滴(LD)的特异性双光子染色。如本文中详细描述的，在活细胞中，化合物在纳摩尔浓度或超低浓度(50nM或更小)下显示出脂滴(LD)特异性染色且具有高信噪比。另外，基于计算的油水分配系数(ClogP)数值的半理论数据表明，这些化合物可以特异性地位于脂滴中。使用本发明的化合物，可以使用双光子特异性成像在深达约70μm的深度处以高信噪比使活组织中脂滴的可视化。本发明化合物还表现出高生物相容性和良好的光稳定性。
在一个实施方案中，这些化合物的含有以下骨架结构式：
Figure BDA0002453695770000131
其中，R1、R2和R3独立地选自由CnH2n+1、C6H5、C10H7、CnH2nCOOH、CnH2nNCS、CnH2nN3、CnH2nNH2、CnH2nCl、CnH2nBr、CnH2nI和
Figure BDA0002453695770000132
组成的组；
其中，R'选自由CnH2nNCS、CnH2nN3、CnH2nNH2、CnH2nCl、CnH2nBr、CnH2nI和
Figure BDA0002453695770000133
组成的组；
其中，R4、R5和R6独立地选自由H、CH3、F、Cl、Br、I、CN、CF3、NO2、Ph、Py、CH＝CHPh和C≡CPh组成的组；并且
其中，n为范围为1至10的整数。
在另一个实施方案中，化合物包括一种或多种选自由以下物质组成的组中的化合物：
Figure BDA0002453695770000141
下面提供了用于制备NAP-Ph、NAP-Br、NAP-CF3、NAP-Py和NAP-Py+的示例性反应方案：
Figure BDA0002453695770000151
细胞成像
细胞脂滴(LD)的异常是疾病的关键生物标志物，所述疾病例如为癌症、糖尿病、肥胖症、脂肪肝疾病和炎症性疾病。本文所述的荧光化合物可特异性靶向活细胞和活组织中的脂滴，并提供脂滴的有效荧光探针以用于诊断目的。
本发明化合物是亲脂性化合物。由于脂滴中存在甘油三酸酯和胆固醇酯，因而脂滴的固有环境也具有亲脂性。不限于任何特定的作用机理，据信本发明化合物的脂质滴染色特异性可归因于荧光化合物在疏水脂滴中的积累所产生的类似相互作用(like-likeinteraction)。虽然具有增强的受体能力的基于供体-受体(D-A)的有机染料通常显示出红移的荧光、更多的疏水性和更大的双光子吸收截面，但是以前很难实现疏水性和细胞渗透性之间的平衡。本文所述的本发明的基于萘的D-A化合物可以有效地在超低浓度(例如纳摩尔水平)下用于活细胞和活组织中的脂滴特异性显像。
可以使荧光化合物与靶细胞接触，然后可以使用成像方法使靶细胞中的目的靶标可视化。目的靶标可以是脂滴。成像方法可以包括(例如)荧光显微成像或共聚焦激光扫描显微成像。荧光显微成像可以包括双光子荧光成像。靶细胞可以是活细胞。靶细胞可以在活组织中。化合物的浓度可以为50nM或更低。
本教导将通过以下实施例进行说明。
实施例
材料和仪器
Dulbecco’s改良型基本培养基(DMEM)购自Gibco(Life Technologies)。超纯水由Milli-Q Plus System(美国密理博公司)提供。磷酸盐缓冲盐水(PBS)、胎牛血清(FBS)、青霉素、链霉素和BODIPY 493/503均购自Thermo Fisher Scientific。本研究中使用的其他试剂均购自Sigma-Aldrich，并且无需进一步纯化即可直接使用。用于合成AIEgen的所有化学药品均购自Sigma-Aldrich。
1H NMR和13C NMR谱是在Bruker ARX 400NMR波谱仪上使用CDCl3作为氘代溶剂测定的。在以MALDI-TOF模式运行的Finnegan MAT TSQ 7000质谱仪系统上记录了高分辨率质谱(HRMS)。在Milton Ray Spectronic 3000阵列分光光度计上获得紫外线吸收光谱。在Perkin Elmer LS 55光谱仪上记录稳态荧光光谱。在Olympus BX 41荧光显微镜上收集荧光图像。在Zeiss激光扫描共聚焦显微镜(LSM7 DUO)上收集激光共聚焦扫描显微镜图像，并使用ZEN 2009软件(Carl Zeiss)进行分析。在Olympus FV 300激光共聚焦显微镜上进行双光子荧光成像。在双光子实验中，从Ti：蓝宝石飞秒激光源(Coherent公司的ChamelonUltra)发出的激发波长为860nm，并通过衰减器修改了样品上的入射功率，并用功率监视器(相干)进行了检查。使用多光子发射滤光片(FF01-750；Semrock)来阻挡红外激光。
实施例1
晶体结构分析
NAP-Ph、NAP-Br、NAP-CF3、NAP-Py和NAP-Py+的结构已通过1H NMR、13C NMR和MALDI-TOF-HRMS谱进行了验证(图22至图38)。通过X射线晶体结构分析证实了NAP-Br、NAP-CF3、NAP-Py和NAP-Py+的晶体结构(图1至图4)。在环境温度下，通过缓慢蒸发CH2Cl2和MeOH的混合溶剂(CH2Cl2/MeOH＝3:1，v/v)获得适用于X射线结构分析的NAP-Br、NAP-CF3、NAP-Py和NAP-Py+的单晶。NAP-Br的晶体是E异构体(图4)，其结构已通过1H NMR波谱证实。NAP-CF3具有分子内π-π相互作用，而NAP-Br、NAP-Py和NAP-Py+具有π-π堆积相互作用(图2A至图2E)。存在多种分子内相互作用，例如C–H···O、C–H···N、C–H···F和C–F···F相互作用，来稳定NAP-CF3、NAP-Py和NAP-Py+的不同堆积模式(图3A至图3D)，这可以有助于限制分子内运动并阻止聚集状态下的非辐射过程。C–H···N相互作用可能是NAP-Br的E异构体晶体形成的主要驱动力。晶格中的NAP-Br、NAP-Py和NAP-Py+分子以头到尾的方式排列(图2A、图2C和图2D)，这可能形成J聚集。之前的研究表明，分子平面与聚集方向之间的夹角(0°<θ1<54.7°)证实了J聚集。如图所示，NAP-Br、NAP-Py和NAP-Py+的角度θ1分别为37.15°、19.95°和31.54°(图2A、图2C和图2D)，从而表明这三个AIEgen确实形成了J聚集。与NAP-Py和NAP-Py+不同，NAP-CF3仅在分子堆积中显示分子间π-π相互作用而不是J聚集，这可能是因为NAP-Py和NAP-Py+具有出色的平面性，而NAP-CF3分子高度扭曲(图2E)。NAP-CF3、NAP-Py和NAP-Py+中萘与苯的二面角θ2分别为36.68°、1.20°和5.45°(图2E)。
实施例2
光物理性质
研究了NAP AIEgen的吸收和荧光(FL)数据，并且相应的光谱示于图5A至图5H、图6A至图6E和图7中。相关数据总结在下表1中。
表1. NAP AIEgen的光物理性质
Figure BDA0002453695770000181
a由于NAP-Py+的溶解性，因而选择CH3CN作为有机溶剂。bαAIE＝Φ固体/Φ溶剂。
NAP-Ph在稀THF溶液中的吸收峰(λabs max)为409nm，并且在523nm处显示弱发射峰(λem max)(图5A至图5B)。在THF/水混合物中，NAP-Ph的发射随含水率(fw)的增加而显示轻微的红移，并且其发射强度先降低(fw<20％)，然后增加(fw>20％)。当含水率(fw)增加到90％时，由于聚集体的形成，NAP-Ph的发射(λem max＝557nm)显示出显著增强(图5B)，这表明NAP-Ph表现出聚集增强发光(AEE)的属性。随着含水率的进一步增加(fw＝99％)，发射强度逐渐降低，这对于AIEgen是经常观察到的现象。这种现象可能是由于在含水率高的水-THF混合物中形成的聚集体的形态和大小发生了变化。同样地，如通过进行荧光光谱研究，NAP-Br、NAP-CF3、NAP-Py和NAP-Py+也显示出AEE特性(图5C至图5F)。应该注意的是，与THF或CH3CN中的荧光相比，高含水率(fw>90)中NAP AIEgen的荧光仅增加了几倍(图5G)，这可能是由于松散堆积的聚集体的形成所致。NAP AIEgen具有供体-受体结构，并且随着受体能力的增强(NAP-Py+>NAP-CF3>NAP-Py>NAP-Br>NAP-Ph)，NAP AIEgen的吸收峰显示出红移。在不同的极性溶剂中进一步测定了NAP AIEgen的荧光光谱(图6A至图6E)。NAP-Ph、NAP-Br、NAP-CF3和NAP-Py的最大发射波长从甲苯、乙醚、THF、丙酮到DMSO逐渐增大，表明存在正溶致变色现象(positive solvatochromism)。然而NAP-Py+显示出负溶致变色现象(negativesolvatochromism)。与THF或CH3CN中的荧光相比，除NAP-CF3以外，NAP AIEgen的固体荧光(555nm至676nm的荧光，图3D和表1)均显示红移，可能是由于J聚集的形成所致(图2A、图2C和图2D)。至于NAP-CF3，固态荧光蓝移的原因可能是其扭曲的结构(图2E)，仅导致分子内π-π相互作用而不是J聚集(图2B)。值得一提的是，NAP AIEgen表现出较大的斯托克斯频移(表1)，这可以减少自吸收，从而提供高分辨率并有利于多通道生物成像。通过使用积分球测定NAP AIEgen的荧光量子产率(QY，表1)。NAP AIEgen在有机溶剂(THF或CH3CN)中显示出微弱的发射，这可能是因为分子内运动可以增强非辐射过程；然而，由于多种分子间相互作用，因而固态中的分子内运动会受到限制(图3)，从而得到高的荧光量子产率。应该指出的是，NAP-Py+的固体荧光量子产率很低，这可能是由于NIR荧光染料的能隙狭窄和非辐射跃迁增强所致(图7)。此外，与溶剂中相比，固态NAP AIEgen的荧光寿命更长，这也证明了分子内运动受限(RIM)可以阻止能量通过非辐射通道耗散并增强NAP AIEgen的荧光(表1)。
通过使用高斯09程序包在B3LYP/6-31G的理论水平上进行DFT计算，以进一步研究NAP AIEgen的光学性质。NAP AIEgen的最低空轨道HOMO和最高占有轨道LUMO的计算值如图7所示。NAP AIEgen的HOMO的电子密度主要分布在整个分子中，尤其是在N,N-二甲基氨基取代的萘的部分中，而NAP AIEgen的LUMO的电子密度大部分位于氰芪(cyanostilbene)中(图7)。NAP-Py+的HOMO和LUMO的电子密度显示出明显的分离，这可能是由于其强的ICT效应导致的。NAP AIEgen具有供体-受体结构，并且随着受体能力的增强(NAP-Py+>NAP-CF3>NAP-Py>NAP-Br>NAP-Ph)，HOMO和LUMO能级由于吸电子基团而降低，从而产生更窄的能隙和红移吸收(图7)，这与测得的光物理数据(表1)非常吻合。
实施例3
成像
NAP AIEgen具有基于萘单元以及双光子吸收特性的共轭给体-受体结构。为了证明这一点，测定了这些NAP AIEgen在含有10％THF(NAP-Ph、NAP-Br、NAP-CF3和NAP-Py)或1％CH3CN(NAP-Py+)的H2O中的聚集体悬浮液中、利用飞秒脉冲激光源(800nm至900nm)激发的双光子荧光。如图8A至图8E所示，NAP AIEgen的双光子荧光光谱与单光子激发的荧光光谱相似，揭示了辐射衰减过程的相同激发态。以荧光素为标准，还测定了不同波长下NAPAIEgen的双光子吸收截面(δ)(图8F)。NAP-Ph、NAP-Br、NAP-CF3和NAP-Py在860nm处显示约45GM至100GM的中等双光子吸收截面(δ)值，其大于荧光素的双光子吸收截面值。NAP-Py+由于其较大的共轭和强的分子内电荷转移ICT效应，因此具有非常大的双光子吸收截面(δ)值。为了进一步获得双光子荧光，在800nm(强度约0.35mW)下直接激发固态NAP AIEgen。如图9所示，即使在非常低的激发下，也可以获得NAP AIEgen的强双光子荧光光谱。这些数据表明，NAP AIEgen可用于双光子荧光成像。
通过共聚焦激光扫描显微成像(CLSM)进行了单光子细胞成像实验，以评估NAPAIEgen的生物学应用。在HeLa细胞中孵育15分钟后，获得了细胞质中NAP AIEgen的明亮荧光(图10)，表明NAP AIEgen具有极好的膜通透性。通过Lambda模式获取HeLa细胞中NAPAIEgen的原位荧光光谱(图11)。NAP AIEgen在活细胞中的原位荧光表现出蓝移特征，这可能是由于其分子内电荷转移ICT效应导致的。
为了确认NAP AIEgen在活细胞中的细胞内位置，进行了共染色成像实验。NAP-Ph、NAP-Br、NAP-CF3和NAP-Py在HeLa细胞中示出类似于商业脂滴染料尼罗红的分布(图12)，并且NAP-Ph、NAP-Br、NAP-CF3和NAP-Py相应的皮尔逊系数(Pearson’s coefficient)分别为0.90、0.83、0.85和0.88，表明NAP-Ph、NAP-Br、NAP-CF3和NAP-Py是新型脂滴特异性染料。至于NAP-Py+，则表现出与商业线粒体染料MitoTracker Deep Red FM的高重叠度(Pearson’s系数为0.89)(图13)。据信这是由于线粒体的高负膜电位，像NAP-Py+这样的带正电荷的染料可以染色线粒体。为了确定为什么其他没有正电荷的NAP AIEgen位于脂滴中，接着进行了进一步的研究。
为了解释NAP-Ph、NAP-Br、NAP-CF3和NAP-Py的共染色数据，进行了基本计算。考虑到甘油三酸酯和胆固醇酯所致的脂滴固有的亲脂性环境，可以预期具有高疏水性或高logP(正辛醇/水分配系数)值的亲脂性有机染料可以位于脂滴中，这符合相似相溶原理。通过使用ChemBioDraw 14.0估算了计算的logP(CLogP)值。几乎所有这些脂滴染料的CLogP值都在3.1至16.643的范围内。之前R.W.Horobin教授的小组报道了使用定量结构活性关系(QSAR)模型预测染色脂滴的有机染料的logP值通常超过5。NAP-Ph、NAP-Br、NAP-CF3和NAP-Py的CLogP值为5.184至6.681(图14)，这高于商业脂滴染料尼罗红(4.618)和BODIPY 493/503(5.028)的ClogP值。这些ClogP值可能解释了为什么NAP-Ph、NAP-Br、NAP-CF3和NAP-Py显示出比尼罗红更好的脂滴染色性能。NAP-Py+的ClogP值(0.340)太低，无法满足脂滴染色的条件。这些半理论数据进一步表明，这些亲脂性NAP-Ph、NAP-Br、NAP-CF3和NAP-Py可以特异性地位于脂滴中。
在用50nM NAP-Ph、NAP-Br、NAP-CF3和NAP-Py染色的HeLa细胞中进行单光子成像实验，并使用尼罗红进行比较。出乎意料的是，在低浓度下检测到脂滴中NAP-Ph、NAP-Br、NAP-CF3和NAP-Py的清晰荧光且背景荧光很低(图15)，并且使用的共聚焦激光强度(405nm，强度为12％)非常低。据我们所知，这是用于脂滴成像的最低浓度。尽管尼罗红(50nM)也可以用于脂滴成像，但尼罗红也显示出细胞质中的非特异性染色，从而导致信噪比低，这与以前的研究一致。这些数据表明，NAP-Ph、NAP-Br、NAP-CF3和NAP-Py显示出比尼罗红出色得多的脂滴染色能力。用于脂滴特异性染色的NAP-Ph、NAP-Br、NAP-CF3和NAP-Py浓度极低的原因可能有两个：一个原因是这些AIEgen固有的亲脂性，这通过比尼罗红高的ClogP值得到证明(图14)，从而得出这些AIEgen在脂滴中的特异性靶向；另一个原因是与在溶液中相比，这些AIEgen在脂滴中的荧光增强。为证明后一个原因，在存在1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)和三油酸甘油酯(TAG)的情况下，对NAP-Ph、NAP-Br、NAP-CF3和NAP-Py的荧光变化进行了研究。如图所示。在图16A至图16D中，与在PBS(pH＝7.2)中相比，具有DMPC和TAG的NAP-Ph、NAP-Br、NAP-CF3和NAP-Py的荧光发生蓝移并且强度也得到增加(约1.7倍至3.6倍)，从而获得其在活细胞中增强的荧光和低孵育浓度以用于脂滴特异性染色。这解释了为什么这些AIEgen在活细胞中的原位荧光显示出蓝移特征(图10至图11)。
NAP-Ph、NAP-Br、NAP-CF3和NAP-Py表现出良好的双光子激发荧光和双光子吸收截面(在860nm处为45GM至100GM)。用单光子显微成像将这些AIEgen成功应用于活细胞中的脂滴特异性染色，促使人们研究这些化合物在双光子模式下的效用。使用860nm飞秒脉冲激光对HeLa细胞中的这些NAP AIEgen进行了双光子荧光成像。如图17所示，通过860nm的双光子激发获得了活细胞中脂滴的亮绿色荧光，这与在405nm的单光子激发下的荧光几乎相同。这些数据表明，NAP-Ph、NAP-Br、NAP-CF3和NAP-Py在双光子荧光成像中显示出巨大的潜力。
双光子荧光成像优于单光子模式的成像，这是由于近红外光激发在组织中的高穿透性和低背景荧光以及低激发功率的结果。为了进一步证明这些优点，对与NAP-CF3孵育的活小鼠肝脏组织进行了离体双光子成像。与NAP-CF3(1μM)孵育1小时后，观察到带有NAP-CF3的双光子荧光的明亮球形斑点(图18)。然而，对于没有NAP-CF3的活小鼠肝脏组织，仅获得低背景荧光。这些数据表明，NAP-CF3在活小鼠肝脏组织中显示了极好的脂滴染色特性，背景荧光非常低。为了研究NAP-CF3是否可以在深层活小鼠肝脏组织中显示脂滴特异性染色，捕获了沿Z轴的双光子荧光图像。如图19A至图19F所示，即使在深达70μm的情况下，也可以在不同的Z轴深度处清楚地检测到球形斑点的荧光信号。此外，成功地重建了沿不同视觉方向具有高分辨率的3D双光子荧光图像(图19G至图19H)，这进一步清楚地证明了NAP-CF3双光子成像的高穿透性和高信噪比。这些优异的双光子组织成像特性使NAP-CF3成为可视化活组织中与脂滴相关的生物医学应用的绝佳工具。
实施例4
光稳定性和细胞毒性
考虑到这些NAP AIEgen的上述出色的生物成像特性，进行了进一步的实验以评估其光稳定性和细胞毒性。通过共聚焦激光连续照射并每秒收集一次数据，从而评估NAPAIEgen的光稳定性。连续照射10分钟后，NAP-CF3和NAP-Py初始荧光强度仍然保留超过90％，而NAP-Ph、NAP-Br和NAP-Py+的强度信号有所下降(图20)。相比之下，尼罗红的荧光强度急剧降低。这些数据表明，NAP-CF3和NAP-Py可用于长期监测生物样品中脂滴的动态变化。此外，执行标准MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基2H-四氮唑)测定以评估NAPAIEgen在活细胞中的细胞毒性。如图21所示，在HeLa细胞中孵育24小时后，HeLa细胞的存活率非常高，因而这些NAP AIEgen在测试浓度下的细胞毒性可忽略不计。这些数据表明NAPAIEgen与生物样品具有生物相容性。
对本主题如此进行描述，将显而易见的是，可以以许多方式修改或改变该主题。不将此类修改和改变视为背离本主题的精神和范围，并且所有此类修改和改变均旨在包括在所附权利要求的范围内。

Claims (20)

1.一种荧光化合物，其表现出聚集诱导发光特性，所述化合物具有以下骨架结构式：
Figure FDA0002453695760000011
其中，R1、R2和R3独立地选自由CnH2n+1、C6H5、C10H7、CnH2nCOOH、CnH2nNCS、CnH2nN3、CnH2nNH2、CnH2nCl、CnH2nBr、CnH2nI和
Figure FDA0002453695760000012
组成的组；
其中，R'选自由CnH2nNCS、CnH2nN3、CnH2nNH2、CnH2nCl、CnH2nBr、CnH2nI和
Figure FDA0002453695760000013
组成的组；
其中，R4、R5和R6独立地选自由H、CH3、F、Cl、Br、I、CN、CF3、NO2、苯基、吡啶基、CH＝CHPh和C≡CPh组成的组；并且
其中，n为范围为1至10的整数。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物包括一种或多种选自由以下物质组成的组中的化合物：
Figure FDA0002453695760000014
Figure FDA0002453695760000021
3.一种细胞成像的方法，包括：
使靶细胞与权利要求1所述的化合物接触；和
使用成像方法识别所述靶细胞中的目的靶标。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述目的靶标包括脂滴。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述成像方法选自由荧光显微成像和共聚焦激光扫描显微成像组成的组。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述荧光显微成像包括双光子荧光成像。
7.根据权利要求3所述的方法，其中所述靶细胞是活细胞。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述靶细胞在活组织中。
9.根据权利要求3所述的方法，其中所述化合物的浓度为50nM以下。
10.一种荧光化合物，其表现出聚集诱导发光特性，所述化合物包括一种或多种选自由以下物质组成的组中的化合物：：
Figure FDA0002453695760000031
11.一种细胞成像的方法，包括：
使靶细胞与权利要求10所述的化合物接触；和
使用成像方法识别所述靶细胞中的目的靶标。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述目的靶标包括脂滴。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述成像方法选自由荧光显微成像和共聚焦激光扫描显微成像组成的组。
14.根据权利要求11所述的方法，其中所述荧光显微成像包括双光子荧光成像。
15.根据权利要求11所述的方法，其中所述靶细胞是活细胞。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述靶细胞在活组织中。
17.根据权利要求11所述的方法，其中所述化合物的浓度为50nM以下。
18.一种细胞成像的方法，包括：
使靶细胞与具有以下骨架结构式的化合物接触
Figure FDA0002453695760000041
其中，R1、R2和R3独立地选自由CnH2n+1、C6H5、C10H7、CnH2nCOOH、CnH2nNCS、CnH2nN3、CnH2nNH2、CnH2nCl、CnH2nBr、CnH2nI和
Figure FDA0002453695760000042
组成的组；
其中，R'选自由CnH2nNCS、CnH2nN3、CnH2nNH2、CnH2nCl、CnH2nBr、CnH2nI和
Figure FDA0002453695760000043
组成的组；
其中，R4、R5和R6独立地选自由H、CH3、F、Cl、Br、I、CN、CF3、NO2、苯基、吡啶基、CH＝CHPh和C≡CPh组成的组；并且
其中，n为范围为1至10的整数；以及
使用成像方法识别所述靶细胞中的目的靶标。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述化合物包括一种或多种选自由以下物质组成的组中的化合物：
Figure FDA0002453695760000044
Figure FDA0002453695760000051
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述目的靶标包括脂滴。
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