CN105062467A - 一种转子型的双红线粒体荧光探针及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种转子型的双红线粒体荧光探针，该探针化学名称为4-(2-(8-羟基-久洛尼啶)乙烯基)-1-甲基吡啶碘盐；其化学结构式如式(I)所示。实验证实本发明的探针是一个新型的高选择性标记永生化活细胞(SiHa和HeLa细胞)和正常活细胞(HUVEC,BMSC和MC3T3-E1细胞)线粒体的荧光探针。此探针不但可以适用于TPM红外激发源，而且还适用于LSM的多个激发波长(458nm，488nm，514nm，543nm和561nm)。与现有功能相近的线粒体荧光探针比，本发明的探针具有价格低、双光子性能好、激发能量低、光稳定性好、生物相溶性较好的特点，在激光激发荧光生物标记领域具有极大的应用价值。

Description

一种转子型的双红线粒体荧光探针及其应用
技术领域
本发明涉及一种基于分子转子的高信噪比线粒体探针及其应用，尤其涉及一种适用于双光子荧光显微镜红外激发源和共焦显微镜多个激发波长的转子型的双红线粒体荧光探针及其在活细胞中的应用。
背景技术
线粒体是真核细胞内具有重要生理功能的细胞器之一，是细胞进行呼吸作用产生能量的重要场所。线粒体的形态和数量是可以变化的，而这些变化往往和人类疾病相关，例如帕金森氏病和老年痴呆症。因此，原位实时清晰地观察线粒体对于我们理解相关生理过程以及相应的疾病诊断和治疗是非常必要的。目前，基于各种机理、高效识别细胞内线粒体的荧光探针是成像活细胞内线粒体的有效工具。并且，高信噪比的探针有助于获得高保真度的荧光图片。
在生物成像中，红光发射的双光子荧光(双红)探针尤其适合成像活细胞内的靶标。首先，红光的波长范围处于生物光学窗口，其穿透力比短波长的光(蓝光和绿光)要强，从而能够得到更深的活细胞探测深度。而且红光光毒性低，对生物样品损伤小，便于观测。在红光区域，生物组织的受激自发荧光强度很低。其次，一个对比研究有力的说明了当成像深层活细胞和组织时，双光子荧光显微镜(TPM)比单光子共焦显微镜(LSM)有优势。TPM采用穿透力强的红外激光作为激发光源，大大降低了生物组织对激发光的吸收损耗，可用于活细胞及生物组织深层成像，同时大大降低了光漂白、光降解及光毒性问题，这些有利于延长对活细胞及组织的监测时间，而且可以有效的避免组织的自发荧光(自发荧光物质的激发波长一般都在350-560nm的范围内)。另外，由瑞利散射产生的背景噪音小，图像对比度高，且Stokes位移差别明显，易于探测。但是如果一个荧光探针的双光子吸收截面比较小，那么以上所述的TPM的优势则大打折扣。然而，由于单、双光子吸收遵循不同的选率，能用于LSM成像的探针有时并不适用于TPM。目前商业化的红光发射的线粒体探针双光子性能都比较低，因此开发双红线粒体探针是一个比较重要的课题。最近，Suzuki等人报道了一个能够成像HEK293细胞中线粒体的双红探针AC(Tominaga,M.,etal.,2014.Chem.Lett.43,1490-1492.)。随后，Kawamata和Konishi等人设计合成了一个可以在光学窗口发光的线粒体探针PY，并用于HEK293细胞中线粒体成像(Niko,Y.,etal.,2015.J.Mater.Chem.3,184-190.)。这两篇报道作者只是简单的将AC(Ex750nm/Em500-600nm)和PY(Ex950nm/Em600-700nm)应用于HEK293细胞中线粒体成像，并没有给出探针的光稳定性，毒性以及透膜性能。尤其是PY探针需要16h才能进入细胞，这不得不让人担心细胞的状态。Xiao等人报道了一个双红线粒体探针DC-SPC-PPh3(Ex900nm/Em600-660nm)。孵育时间达1h，且探针在细胞中的双光子稳定性只能保持2分钟左右。Gryko等人最近报道了一个双红线粒体探针(Ex760nm/Em420-480nm)，但是作者在细胞成像实验时收集的波段却是蓝光420-480nm。最近，Kim等人报道了一个用来实时成像Corticalneurons中线粒体的双红探针CMT-red(Ex820nm/Em600-700nm)，并研究了探针的光稳定性(Sarkar,A.R.,etal.,2014.Anal.Chem.86,5638-5641.)。但是，目前既适合双光子显微镜使用，又适合共焦显微镜使用，且在活细胞内高选择性标记线粒体内的“双红”荧光探针研究的相对滞后限制了TPM技术在研究活细胞线粒体中的广泛应用。因此，对能在活细胞内使用“双红”线粒体探针的研究迫在眉睫。
目前，分子转子类荧光探针由于具有分析灵敏度高、样品时空分辨力强等特点，已获得广泛的应用。分子转子内的旋转单元可引起激发态的非辐射去活，而黏度的升高可减缓这种旋转，从而导致荧光发射强度随黏度的增大而增强。这种探针一般不受溶剂极性或者pH影响，响应快，且背景噪音低，对于构造高信噪比的“双红”线粒体探针具有很重要的意义。最近，Peng等人报道了两个双红转子型探针Caz-Cy2(Ex720nm/Em575-640nm)和Mito-V(Ex840nm/Em625-675nm)用来成像线粒体的粘度(Liu,F.,etal.,2013,Chem.Eur.J.19,1548-1553；Jiang,N,etal.,2014,Sensor.Actuat.B-Chem.190,685-693.)。但是这类转子型的双红线粒体探针报道很少，且探针的信噪比有待提高。鉴于此，开发新型转子型的双红线粒体探针具有实际意义和应用价值。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种高信噪比的转子型双红线粒体荧光探针及其在活细胞中的应用。
本发明所述转子型的双红线粒体荧光探针，其特征在于：所述荧光探针化学名称为4-(2-(8-羟基-久洛尼啶)乙烯基)-1-甲基吡啶碘盐(HJVPI)；其化学结构式如式(I)所示：
上述转子型的双红线粒体荧光探针制备方法概述如下：
为了得到具有双红性质的线粒体探针，首先选择久洛尼啶作为荧光团。通过将氨基固定在苯环上提高共轭结构使得久洛尼啶具有很好的双光子性质，并且是红光发射。吡啶盐的选择是为了使分子靶向线粒体，并且吡啶盐类化合物光稳定性很好。通过Knoevenagel反应得到最终产物吡啶盐类化合物(HJVPI)。
上述吡啶盐类化合物(HJVPI)具体的制备反应式如下：
本发明所述转子型的双红线粒体荧光探针在标记或显示线粒体在活细胞中分布的应用。
其中，所述活细胞为永生化细胞或正常细胞。具体的，所述永生化细胞是HeLa或SiHa细胞；所述正常细胞是HUVEC、BMSC或MC3T3-E1细胞。
试验结果证实，本发明所述转子型的双红线粒体荧光探针(HJVPI)在粘度环境(甘油)中的双光子荧光活性截面是低粘度环境(水)中的660倍，而目前仅有的一个报道比值为20.8倍。高的信噪比使得HJVPI可以清晰地标记永生化活细胞(SiHa和HeLa细胞)和正常活细胞(HUVEC,BMSC和MC3T3-E1细胞)中的线粒体，这也进一步验证了该荧光探针能够在永生化的活细胞和正常活细胞中高选择性标记线粒体，有望为线粒体相关的病理学研究提供简捷、直观的生物检测试剂。
本发明提供的转子型双红线粒体荧光探针不仅适用于TPM，而且还适用于LSM的多个激发光源(458nm，488nm，514nm，543nm和561nm)。与现有功能相近的线粒体荧光探针比，本发明所述吡啶盐类化合物(HJVPI)具有价格低、双光子性能好、激发能量低、光稳定性好、生物相溶性较好的特点。本发明的HJVPI还具有高的线粒体定位能力和双光子吸收截面大的特点，并且本荧光探针与Hochest33342、MTG等荧光染料具有良好生物相容性，预示本发明所述转子型吡啶盐类化合物(HJVPI)作为“双红”线粒体荧光探针具有广泛的应用，在激光激发荧光生物标记领域具有良好的应用前景。
附图说明
图1：HJVPI和线粒体绿(MTG)依次对活SiHa细胞(I)和BMSC细胞(II)进行染色后，分别在561和458nm激光辐照下分为三个通道收集得到的单光子荧光显微照片。
其中：a图为561nm激发红色通道的照片，b为458nm激发绿色通道的照片，c为a、b合并图片，d图为c图中画线位置两个通道中荧光强度分布图。
图2：HJVPI对活性SiHa细胞(I)和BMSC细胞(II)进行染色后在900nm激光辐照下得到的双光子荧光显微照片。
其中：a图为用HJVPI染色得到的双光子荧光显微照片；b图为明场激光扫描的微分干涉照片；c图为a、b两图的合并图。
图3：HJVPI对活性SiHa细胞进行染色后在900nm激光连续辐照下得到一系列不同时间的双光子荧光显微照片。
图4：HJVPI对活性SiHa细胞进行染色后分别在LSM不同的激发光源辐照下得到的荧光显微照片。
图5：HJVPI和SYTOX蓝色核酸染料(S-11348)依次对活SiHa细胞进行染色后，分别在宽场荧光显微镜下得到的荧光显微照片。
其中：a图为510-550nm激发红色通道的照片，b为426-450nm激发蓝色通道的照片，c为a、b和DIC图的合并图片。
图6：HJVPI对活性HeLa细胞(a)、MC3T3-E1细胞(b)、HUVEC细胞(c)和BMSC细胞(d)进行染色后在LSM下得到的荧光显微照片。
具体实施方式
实施例1：HJVPI的合成
将4mmol8-羟基久洛尼啶-9-甲醛(0.868g)与4mmolN-甲基-4-甲基吡啶碘盐(0.94g)溶于32mL甲醇，得淡黄色透明溶液，加6滴哌啶，溶液迅速变红色。回流反应8h，冷却，二氯甲烷/甲醇(20：1)作淋洗液，得到紫红色小晶粒，即为4-(2-(8-羟基-久洛尼啶)乙烯基)-1-甲基吡啶碘盐，产率15％。
1HNMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):8.91(s,1H),8.54(d,J＝6.84Hz,2H),8.10(d,J＝15.76Hz,1H),7.87(d,J＝6.88Hz,2H),7.19(s,1H),6.96(d,J＝15.76Hz,1H),4.11(s,3H),3.24-3.18(m,4H),2.65-2.57(m,4H),1.84(s,4H).13CNMR(100MHz,DMSO-d6),δ(ppm):154.3,154.2,147.0,144.2,137.9,125.4,121.5,115.0,114.9,111.1,107.5,49.9,49.2,46.4,27.3,21.91,21.5,21.0.HRMS(m/z)calcdforC20H23IN2O:434.31；found,307.1821(M-I)+。
实施例2：永生化细胞(SiHa和HeLa)和正常细胞(HUVEC,BMSC和MC3T3-E1)培养
将SiHa、HeLa、HUVEC、BMSC和MC3T3-E1细胞株都是在37℃，5％CO2的饱和湿度孵箱中培养。SiHa和HeLa细胞株贴壁培养于内含10％胎牛血清H-DMEM培养液中(含1％双抗)。HUVEC细胞株贴壁培养于内含10％胎牛血清M199培养液中(含2ng/mLFGF-2)。BMSC细胞株贴壁培养于内含10％胎牛血清L-DMEM培养液中(含2ng/mLFGF-2)。MC3T3-E1细胞株贴壁培养于内含10％胎牛血清αMEM培养液中。待细胞生长到对数期，接片培养：①将盖玻片于无水乙醇中浸泡30min，酒精灯烘干后放入一次性35mm培养皿中；②将100mL细胞瓶中的细胞用PBS洗三遍，用1mL0.25％胰酶消化3-5分钟，小心地倒出培养基，加入少量新鲜培养基吹打均匀，细胞计数后，留下合适密度的细胞，将培养基加至所需体积(控制细胞终浓度为1×105)，接种至内含盖玻片的培养皿中，放入CO2培养箱中培养，使细胞爬片生长。
实施例3：HJVPI染色SiHa细胞/BMSC细胞和MTG复染实验
将接种好的细胞爬片用PBS洗三遍，2μMHJVPI染色细胞，在CO2培养箱中30min。吸出培养液，并用PBS洗三遍，洗去未结合的多余染液，用0.2μMMTG染色细胞，在CO2培养箱中30min。然后将染色后的细胞爬片取出，洗去未结合的多余染液，细胞生长面朝下盖在载玻片上，在激光扫描共聚焦荧光显微镜下观察细胞着色部位，荧光分布及亮度变化等，结果发现，MTG和HJVPI在细胞内分布区域相似，计算4个SiHa细胞的平均共定位率为0.91，2个BMSC细胞的平均共定位率为0.89。因此，证实了本发明所述探针HJVPI能专一性的成像线粒体。
结果见图1。其中a图为561nm激发红色通道的照片，b为458nm激发绿色通道的照片，c为a、b合并图片，d图为c图中画线位置两个通道中荧光强度分布图。
实施例4：HJVPI染色SiHa细胞/BMSC细胞双光子荧光显微实验
将接种好的细胞爬片用PBS洗三遍，2μMHJVPI染色细胞，在CO2培养箱中30min。染色后的细胞爬片取出，洗去未结合的多余染液，细胞生长面朝下盖在载玻片上，在TPM(激发波长：900nm)下观察细胞。
结果见图2。其中a图为用HJVPI染色得到的双光子荧光显微照片；b图为明场激光扫描的微分干涉照片；c图为a、b两图的合并图。
实施例5：HJVPI染色SiHa细胞双光子激光辐照下光稳定性实验
将接种好的细胞爬片用PBS洗三遍，2μMHJVPI染色细胞，在CO2培养箱中30min。染色后的细胞爬片取出，洗去未结合的多余染液，细胞生长面朝下盖在载玻片上，在TPM(激发波长：900nm，平均飞秒脉冲功率为10mW)辐照一系列时间后来观察细胞。
结果见图3。HJVPI对活性SiHa细胞进行染色后在900nm激光连续辐照下得到一系列不同时间的双光子荧光显微照片。
实施例6：LSM多个激光管激发细胞内的HJVPI实验
将接种好的细胞爬片用PBS洗三遍，2μMHJVPI染色细胞，在CO2培养箱中30min。染色后的细胞爬片取出，洗去未结合的多余染液，细胞生长面朝下盖在载玻片上，利用LSM不同的激发源(458nm，488nm，514nm，543nm和561nm)辐照来观察细胞。
结果见图4。HJVPI对活性SiHa细胞进行染色后分别在LSM不同的激发光源辐照下得到的荧光显微照片。
实施例7：HJVPI染色线粒体的细胞是活细胞的验证实验
SYTOX蓝色核酸染料(S-11348)是一种商业化的只染死细胞中核酸的蓝色荧光染料。将接种好的细胞爬片用PBS洗三遍，2μMHJVPI染色细胞，在CO2培养箱中30min。吸出培养液，并用PBS洗三遍，洗去未结合的多余染液。然后用5μMS-11348染色细胞，在CO2培养箱中30min。。染色后的细胞爬片取出，洗去未结合的多余染液，细胞生长面朝下盖在载玻片上，宽场显微镜下观察细胞。S-11348着色的细胞，HJVPI并没有发光，而HJVPI着色的细胞，S-11348并没有发光，说明HJVPI只染色活细胞中的线粒体。
结果见图5。其中a图为510-550nm激发红色通道的照片，b为426-450nm激发蓝色通道的照片，c为a、b和DIC图的合并图片。
实施例8：HJVPI染色多种活细胞(永生化细胞和正常)线粒体的实验
将接种好的HeLa细胞(a)、MC3T3-E1细胞(b)、HUVEC细胞(c)和BMSC细胞(d)细胞爬片用PBS洗三遍，2μMHJVPI染色细胞，在CO2培养箱中30min。将染色后的细胞爬片取出，洗去未结合的多余染液，细胞生长面朝下盖在载玻片上，在488nm激光辐照下观察细胞。
结果见图6。HJVPI对活性HeLa细胞(a)、MC3T3-E1细胞(b)、HUVEC细胞(c)和BMSC细胞(d)进行染色后在LSM下得到的荧光显微照片。

Claims (4)

1.一种转子型的双红线粒体荧光探针，其特征在于：所述荧光探针化学名称为4-(2-(8-羟基-久洛尼啶)乙烯基)-1-甲基吡啶碘盐；其化学结构式如式(I)所示：
2.权利要求1所述转子型的双红线粒体荧光探针在标记或显示线粒体在活细胞中分布的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述活细胞为永生化细胞或正常细胞。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述永生化细胞是HeLa或SiHa细胞；所述正常细胞是HUVEC、BMSC或MC3T3-E1细胞。
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