CN101100465A

CN101100465A - 阳离子咔唑类化合物及其作为双光子核酸荧光探针的应用

Info

Publication number: CN101100465A
Application number: CNA2007100160551A
Authority: CN
Inventors: 于晓强; 蒋民华; 张献; 张玉生
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2007-06-12
Filing date: 2007-06-12
Publication date: 2008-01-09

Abstract

本发明公开了一种阳离子咔唑类化合物，其通式如(I)或(II)所示，其中所述R表示C_1-4的烷基或羟烷基。本发明还公开了所述阳离子咔唑类化合物作为双光子核酸荧光探针的应用。本发明的阳离子咔唑类化合物具有价格低、激发能量低、显色强、生物相溶性较好的特点。

Description

阳离子咔唑类化合物及其作为双光子核酸荧光探针的应用

技术领域

本发明涉及咔唑类化合物及其应用，尤其涉及阳离子咔唑类化合物及其作为双光子核酸荧光探针的应用。

背景技术

随着荧光显微镜、激光扫描共聚焦显微镜和荧光检测设备的不断升级和提高，荧光探针的研究与开发也在不断创新，并且，从分子水平上设计、开发对生物体系中的生理病理学标记物具有特异性结构和位点识别能力的荧光探针分子，始终是生命科学研究中的重要课题。近几年来，双光子荧光三维成像技术发展迅速，而专用的双光子荧光探针的开发却未及时跟上，目前人们利用的仍然是已有的单光子荧光探针分子，如吖啶、菲啶类染料等DNA及RNA探针，这在很大程度上制约了双光子三维成像技术的广泛应用。因而开发、研制具有实际应用价值的双光子核酸荧光探针是当务之急。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一类新型的DNA选择性识别荧光探针分子，即阳离子咔唑类化合物及其作为双光子核酸荧光探针的应用。

本发明所述的阳离子咔唑类化合物，其通式如(I)或(II)所示：

其中：上述R表示C_1-4的烷基或羟烷基。

上述阳离子咔唑类化合物，其通式优选(II)所示，其中所述R表示C_1-4的烷基或羟烷基。

上述阳离子咔唑类化合物，其通式优选(II)所示，其中所述R优选表示C_1-4的烷基。

上述阳离子咔唑类化合物，其通式优选(II)所示，其中所述R最优选表示C_2-3的烷基。

本发明所述阳离子咔唑类化合物制备方法概述如下：

为了增加分子在生理环境下的适应性，我们首先在氮上引入乙基，然后利用Vilsmeier反应合成了9-乙基咔唑的单、双醛，然后将醛和对烷基(或羟烷基)-N-甲基碘盐缩合得到最终产物阳离子咔唑化合物。

上述阳离子咔唑类化合物的制备反应式如下：

本发明所述阳离子咔唑类化合物作为双光子核酸荧光探针的应用。

实验证明：本发明的阳离子咔唑化合物是一类新型的DNA选择性识别荧光探针分子，与其功能相近的双光子核酸荧光探针比，本发明所述阳离子咔唑类化合物具有价格低、激发能量低、显色强、生物相溶性较好的特点，咔唑衍生物在双光子甚至多光子激发荧光生物标记和无损光动力学治疗领域具有潜在的应用价值。

其中：上述阳离子咔唑类化合物优选3-(1-甲基-4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑碘盐或3，6-双(1-甲基-4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑碘盐。

上述阳离子咔唑类化合物最优选3，6-双(1-甲基-4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑碘盐。

附图说明

图1MVEC对烟草野生型植物进行染色得到的双光子荧光显微照片。

图2BMVEC对烟草野生型植物进行染色得到的双光子荧光显微照片。

图3BMVEC与传统核酸染料DAPI对比实验得到的双光子荧光显微照片。

其中：1为用BMVEC染色得到的双光子荧光显微照片；2为用DAPI染色得到的双光子荧光显微照片；3为用两种染料同时染色得到的双光子荧光显微照片。

具体实施方式

实施例1

4-甲基-N-甲基碘盐的合成：称取11.16g(0.12mol)的4-甲基吡啶放入100mL的圆底烧瓶，逐滴滴下25.00g(0.18mol)的碘甲烷，半小时内滴完。然后升温至45℃反应2h，冷却到室温过滤，得到白色晶体，产率99.5％。¹H NMR(90MHz，DMSO，TMS)δ(ppm)：2.60(s，3H)，4.38(s，3H)，7.90(d，J＝8.67Hz，2H)，8.88(d，J＝7.20Hz，2H)。

9-乙基咔唑(N-1)的合成：在250mL圆底烧瓶中加入咔唑(8.349g)，NaOH(3.0g)，十六烷基三甲基溴化铵(0.075g，浓度为4×10^-3moL/L)和100mL丙酮，搅拌回流2h，冷至室温，加入溴乙烷(3.7mL)，回流24h，有气泡生成，溶液变成淡黄色。回流结束，将丙酮尽量蒸出，剩余物倒入大量冰水中，剧烈搅拌，有大量固体出现，升至室温后，把液体倒入布氏漏斗，抽滤出固体，用蒸馏水充分洗涤三次。将得到的固体干燥后，得到粗产物。产物用丙酮/石油醚重结晶，得到白色针状晶体，产率90％。¹H NMR(400MHzCDCl₃)，δ(ppm)：8.10(d，J＝7.78Hz，2H)，7.46(m，2H)，7.40(d，J＝8.08Hz，2H)，7.22(m，2H)，4.37(m，2H)，1.43(t，J＝7.22Hz，3H)。

3-甲酰基-9-乙基咔唑(N-2)的合成：在250mL干燥的圆底烧瓶中加入DMF(0.93mL)，在冰水冷却下逐滴滴入POCl₃(1.15mL)，搅拌得到白色固体块，将9-乙基咔唑(N-1)(2.438g)溶在7.5mL的CHCl₃中，加入反应瓶，撤去冰水浴，升至室温，发现瓶内固体块消失，将反应瓶移至油浴，搅拌下，回流16h，溶液呈黑绿色，有臭鸡蛋气味。将CHCl₃尽量蒸出，剩余物为深绿色淤泥状固体，倒入大量冰水中，剧烈搅拌，溶液呈黄色，用NaHCO₃调节pH到8左右，室温下继续搅拌1h左右，抽滤出固体，固体溶在氯仿中，上层为黄色溶液，进行萃取，然后用无水MgSO₄干燥。抽滤后，减压蒸出氯仿，得到淡黄色固体，产率93％。¹H NMR(400MHz CDCl₃，TMS)δ(ppm)：10.08(s，1H)，8.59(d，J＝1.34Hz，1H)，8.14(d，J＝7.81Hz，1H)，8.00(m，1H)，7.52(m，1H)，7.45(m.2H)，7.30(m.1H)，4.39(m，2H)，1.45(t，J＝7.24Hz，3H)。

3-(1-甲基-4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑碘盐(MVEC)的合成：在250mL圆底烧瓶中，加入2.0g(8.97mmol)的3-甲酰基-9-乙基咔唑(N-2)，2.2g(9.44mmol)4-甲基-N-甲基碘盐，25mL的甲醇，哌啶两滴，溶液呈淡黄色，80℃下搅拌回流4h，溶液逐渐变成黄色。停止加热，冷却到室温，蒸出甲醇，产物用少量无水乙醇洗涤，得到黄色固体粉末，产物微溶于水和无水乙醇。取少量产物分别溶于水和无水乙醇重结晶，得针状晶体，产率75％。¹H NMR(400 MHz，DMSO，TMS)，δ(ppm)：8.80(d，J＝6.77Hz，2H)，8.58(s，1H)，8.21(m，4H)，7.80(m，1H)，7.75(d，J＝8.63Hz，1H)，7.68(d，J＝8.22Hz，1H)，7.52(t，J＝7.94Hz，2H)，7.30(t，J＝7.30Hz，1H)，4.51(m，2H)，4.24(s，2H)，1.35(t，J＝7.10Hz，3H)。IR(KBr)：3402(pyridine，N-H)，1618(pyridine，-C＝N)，1601，1508，1405(aromatic，C＝C)，978(ethylene，＝C-H)cm^-1。Element analysiscalcd(％)for C₂₂H₂₁N₂I：C 60.00，H 4.77，N 6.36；found：C 60.13，H 4.64，N 6.39。

实施例2

3，6-二甲酰基-9-乙基咔唑(N-3)的合成：在250mL干燥的圆底烧瓶中加入DMF(12mL)，在冰水冷却下慢慢滴加POCl₃(15mL)，烧瓶内呈白雾状，溶液粘度慢慢增加，搅拌得到一整块白色固体，停止搅拌。9-乙基咔唑(3.155g)溶在20mL DMF中，加入反应瓶，撤去冰水浴，将反应瓶移至油浴，缓缓加热至固体块全部消失，开始搅拌，在100℃下反应30h，冷至室温，将红黑色粘稠反应物小心倒入大量冰水中，剧烈搅拌，慢慢加入NaOH(19.44g)的水溶液(用冰保持温度始终在0℃左右)，再用NaHCO₃调节pH到8左右。室温下继续搅拌2h左右，用400mL CH₂Cl₂反复提取，用无水MgSO₄干燥，抽滤出固体，再蒸出CH₂Cl₂，得到黄色的粗产物，产率86％。¹H NMR(400 MHz CDCl₃)δ(ppm)：10.13(s，2H)，8.66(d，J＝1.31Hz，2H)，8.09(m，2H)，7.55(d，J＝8.54Hz，2H)，4.45(m，2H)，1.52(m，3H)。

3，6-双(1-甲基-4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑碘盐(BMVEC)的合成：在250mL圆底烧瓶中，加入1.5g(5.98mmol)的3，6-二甲酰基-9-乙基咔唑(N-3)，2.85g(12.23mmol)的4-甲基-N-甲基碘盐，25mL的甲醇，哌啶两滴，溶液呈淡黄色，80℃搅拌回流4h，溶液逐渐变成黄色，后又变成红色。停止加热，冷却到室温，蒸出甲醇，产物用少量CH₂Cl₂洗涤，得到红色固体粉末，产率68％。¹H NMR(4Q0 MHz，DMSO，TMS)δ(ppm)：8.84(d，J＝4.4Hz，4H)，8.64(s，2H)，8.21-8.24(t，J＝7.04Hz，6H)，7.96(d，J＝5.44Hz，2H)，7.82(d，J＝5.72Hz，2H)，7.58(d，J＝10.8Hz，2H)，4.54(d，J＝4.76Hz，2H)，4.2(s，6H)，1.37(t，J＝4.78Hz，3H)。IR(KBr)：3396(pyridine，N-H)，1611(pyridine，-C＝N)，1609，1510，1415(aromatic，C＝C)，916(ethylene，＝C-H)cm^-1。Elementanalysis calcd(％)for C₃₀H₂₉N₃I₂：C 52.55，H 4.23，N 6.13；found：C 52.68，H 4.55，N 6.18。

实施例3

4-甲基-N-羟乙基碘盐的合成：于100mL的圆底烧瓶中将4.65g(0.05mol)的4-甲基吡啶和9.46g(0.055mol)的2-羟基碘乙醇混合在甲苯溶液中，溶液在室温搅拌4小时，然后回流30分钟，冷却后，过虑，固体用乙醚清洗。¹H NMR(90MHz acetone，TMS)δ(ppm)：9.05(d，J＝3.4Hz，2H)，8.09(d，J＝6.3Hz，2H)，4.93(t，J＝3.22Hz，2H)，4.04(d，J＝5.01Hz，2H)，4.44(2H)，2.62(3H)。

3-(1-羟乙基-4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑碘盐(PVEC)的合成：在100mL圆底烧瓶中，加入1.115g(5mmol)的3-甲酰基-9-乙基咔唑，1.423(5mmol)4-甲基-N-羟乙基碘盐，25mL的甲醇，哌啶两滴，溶液呈淡黄色，80℃下搅拌回流4h，溶液逐渐变成黄色。停止加热，冷却到室温，蒸出甲醇，产物用少量无水乙醇洗涤，得到桔黄色固体粉末，产物溶于水。取少量产物分别溶于无水乙醇重结晶，得针状晶体。¹H NMR(90MHzmethanol，TMS)δ(ppm)：8.78(d，J＝6.3Hz，2H)，8.50(1H)，7.92(m，10H)，4.61(m，4H)，3.81(m，3H)，1.42(d，J＝6.3Hz，2H)。IR(KBr)：3405(pyridine，N-H)，1611(pyridine，-C＝N)，1588，1513，1408(aromatic，C＝C)，1171(ethylhydroxide，＝C-OH)cm^-1。Elementanalysis calcd(％)for C₂₃H₂₅N₂OI：C 58.72，H 3.36，N 3.76；found：C 58.57，H 3.21，N 3.55。

实施例4

3，6-二(1-羟乙基-4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑碘盐(DPVEC)的合成：在250mL圆底烧瓶中，加入0.2379g(0.95mmol)的3，6-二甲酰基-9-乙基咔唑(3)，0.7g(2.6mmol)的4-甲基-N-羟乙基碘盐，25mL的甲醇，哌啶两滴，溶液呈淡黄色，80℃搅拌回流4h，溶液逐渐变成黄色，后又变成红色。停止加热，冷却到室温，蒸出甲醇，产物用少量CH₂Cl₂洗涤，得到红色固体粉末.¹H NMR(300MHz methanol，TMS)，δ(ppm)：8.71(d，4H)；8.62(m，2H)；8.20(m，6H)；7.98(m，2H)；7.50(m，2H)；4.61(m，4H)；4.55(d，J＝0.6Hz，2H)；4.02(t，J＝1.8Hz，4H)；1.49(t，J＝6.2Hz，3H)。IR(KBr)：3356(pyridine，N-H)，1613(pyridine，-C＝N)，1512，1502，1467(aromatic，C＝C)，1170(ethylhydroxide，＝C-OH)cm^-1。Element analysis calcd(％)for C₃₂H₃₃N₃O₂I₂：C 51.54，H 4.43，N 5.64；found：C 51.13，H 4.64，N 5.49。

实施例5

利用实施例1制得的产物配制MVEC(3-(1-甲基-4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑碘盐)溶液(4ug/ml)1mL、对烟草野生型植物进行染色30min，然后用800nm的激光进行激发，其激发能量为13.5mW，得到双光子荧光显微照片如图1。

实施例6

利用实施例1制得的产物配制BMVEC(3，6-双(1-甲基-4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑碘盐)溶液(2ug/ml)1mL、对烟草野生型植物进行染色30min，然后用800nm的激光进行激发，其激发能量为13.5mW，得到双光子荧光显微照片如图2。

实施例7

BMVEC与传统核酸染料DAPI对比实验：

配制BMVEC和DAPI(1ug/ml)1mL，分别对烟草野生型植物进行染色30min；同时先用实施例1制得的染料BMVEC对烟草野生型植物进行染色30min，然后吸干残存的BMVEC溶液，再用DAPI染色30min；然后把染色的植物用800nm的激光进行激发，BMVEC的激发能量为60mW，DAPI的激发能量为120mW，得到双光子荧光显微照片如图3(其中1为用BMVEC染色得到的双光子荧光显微照片；2为用DAPI染色得到的双光子荧光显微照片；3为用两种染料同时染色得到的双光子荧光显微照片)，由图可以看到，在BMVEC只用DAPI一半能量下，二者染核位点基本重复。

Claims

1.一种阳离子咔唑类化合物，其通式如(I)或(II)所示：

其中：上述R表示C_1-4的烷基或羟烷基。

2.如权利要求1所述的阳离子咔唑类化合物，其通式如(II)所示，其中：所述R表示C_1-4的烷基或羟烷基。

3.如权利要求2所述的阳离子咔唑类化合物，其通式如(II)所示，其中：所述R表示C_1-4的烷基。

4.如权利要求3所述的阳离子咔唑类化合物，其通式如(II)所示，其中：所述R表示C_2-3的烷基。

5.权利要求1所述阳离子咔唑类化合物作为双光子核酸荧光探针的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征是：所述阳离子咔唑类化合物是3-(1-甲基-4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑碘盐或3，6-双(1-甲基-4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑碘盐。

7.如权利要求6所述的应用，其特征是：所述阳离子咔唑类化合物是3，6-双(1-甲基-4-乙烯基吡啶)-9-乙基咔唑碘盐。