CN111072632A - 一种利用荧光图像显示细胞膜电位两种状态的荧光探针及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用荧光图像显示细胞膜电位两种状态(正常状态与近零状态)的荧光探针，是4‑[2‑(9‑十二烷基‑9H‑咔唑‑3)乙烯基]‑1‑(2‑羟基乙基)‑吡啶碘盐的化合物，简称CP12。本发明还公开了所述荧光探针在检测细胞膜电位正常状态与近零状态中的应用；在细胞膜电位为正常状态时，所述探针使细胞膜和细胞质均被染色；在细胞膜电位为近零状态时，所述探针仅使细胞膜被染色。且该探针对细胞膜电位的测量不受线粒体膜电位干扰，表现出较高的专一性。本发明探针这种直观快速的区分方式相较于目前使用的细胞膜电位探针产品，使用过程中无需校准，无需绘制标准曲线，省时省力，在生物研究和医疗诊断方面具有广阔的应用前景。

Description

一种利用荧光图像显示细胞膜电位两种状态的荧光探针及其 应用
技术领域
本发明涉及一种检测细胞膜电位的荧光探针及其应用，尤其涉及一种利用荧光图像显示细胞膜电位两种状态(细胞膜电位正常状态与近零状态)的荧光探针及其应用。
背景技术
细胞膜电位是细胞静息状态时细胞膜内外两侧存在的电位差，是反映细胞活性与细胞代谢活动的重要指标，多数细胞的正常膜电位都表现为内负外正，位于-50～-100mV范围内。然而，在某些类型细胞内，细胞膜电位会显著减小。例如，U.V.Lassen在1967年发现人类红细胞的细胞膜电位小于-14mV；S.Hodson在1989年报道了兔子的角膜内皮细胞的细胞膜电位在0mV左右，因而提出了“近零膜电位”的概念。除了本身具有近零膜电位的细胞外，某些细胞的膜电位在不同生理、病理状态时进入近零状态。例如，MCF-7细胞的膜电位会在细胞周期的G0 and G1相降至-9mV；淋巴细胞在促有丝分裂的刺激下细胞膜电位会降至接近零；细胞死亡后细胞膜电位不能维持，也为近零状态。在基础医学领域中，越来越多的研究表明细胞膜电位的近零状态对细胞的生理活动有着重要的影响。例如，HEK-293细胞上的离子通道TRPM4b调控的电流会在近零状态下发生反转。HeLa细胞上的β-半乳糖苷酶的跨膜运输在近零状态下几乎被完全抑制。因此，能够测量或区别细胞膜正常和近零电位的技术方法在生物和医学研究中均具有重要应用价值。
测量细胞膜电位最常用的是膜片钳技术，但它需要运用微玻管电极接触细胞膜，有较高的侵入性，且只针对单个细胞，无法同时对大量细胞进行测量。另一种方法是根据细胞膜电位变化而发生荧光颜色或荧光强度变化的荧光探针法，由于此类探针是小分子化合物，对细胞活动影响小，可同时观察大量细胞群体的膜电位变化，很好地解决了膜片钳技术存在的不足。
目前报道的膜电位荧光探针根据响应时间的快慢可分为快响应型与慢响应型两种。
(1)快响应型膜电位探针也叫电致变色染料，它们在外加电场下发射峰会发生移动，由于移动很小(10nm左右)，故通常收集光谱边缘的光作为信号。因此，这类探针的荧光响应敏感性较小，通常不到10％/100mV。
(2)慢响应型探针是一些带电的脂溶性的荧光团，可快速透过细胞膜，它们又可分为阴离子型和阳离子型。阳离子型膜电位探针是最广泛使用的慢响应型探针，这类探针往往会聚集在线粒体上，而且来自线粒体上的荧光信号往往会超过细胞质中的，从而干扰细胞膜电位的测量，因此在使用时需要线粒体膜电位保持稳定。阴离子型膜电位探针虽然没有上述缺点，但是此型探针有些会与细胞内蛋白结合，对细胞代谢产生影响。除此之外，虽然上述两种慢响应型探针的荧光响应敏感性较大(>80％/100mV)，但都存在使用不便的问题。如慢响应型探针使用时必须要校准，且每次实验通常需要绘制自己的校准曲线，费时费力又不够快速直观。基于此，开发敏感性高、操作简便的能利用荧光图像显示细胞膜电位两种状态(细胞膜电位正常状态与近零状态)的荧光探针具有迫切的现实意义和重要的应用价值。
发明内容
针对目前测量细胞膜电位方法的不足，本发明要解决的问题是提供一种利用荧光图像显示细胞膜电位两种状态(细胞膜电位正常状态与近零状态)的荧光探针及其应用。与现有的细胞膜电位测量方法相比，本发明的荧光探针具有快速、直观、简便的技术特点。
本发明所述利用荧光图像显示细胞膜电位两种状态的荧光探针，其特征在于：所述细胞膜电位两种状态是指细胞膜电位正常状态与近零状态；所述荧光探针是化学名称为4-[2-(9-十二烷基-9H-咔唑-3)乙烯基]-1-(2-羟基乙基)-吡啶碘盐的化合物，简称：CP12；其化学结构如式(I)所示：
Figure BDA0002342285200000021
上述利用荧光图像显示细胞膜电位两种状态的荧光探针(CP12)的制备方法概述如下：
在干燥的三口瓶中加入N-十二烷基咔唑-3-甲醛0.399g，乙醇5ml，通氮气保护，升温至60℃，加热30min后全部溶解，加入化合物1-(2-羟基乙基)-4-甲基吡啶碘盐0.265g，滴加哌啶5滴，升温至回流，过夜，停止加热，冷却后蒸干溶剂，用乙醇重结晶，干燥，得到黄绿色粉末0.2g，产率51％，即为CP12。
上述化合物CP12制备反应式如下：
Figure BDA0002342285200000031
本发明所述利用荧光图像显示细胞膜电位两种状态的荧光探针(CP12)在检测细胞膜电位正常状态与近零状态中的应用。
其中：在细胞膜电位为正常状态时，所述荧光探针CP12易穿过细胞膜进入细胞内，使细胞膜和细胞质均被染色；在细胞膜电位为近零状态时，所述荧光探针CP12不能穿过细胞膜进入细胞内，仅使细胞膜被染色。
上述细胞是指癌细胞或正常细胞。其中：所述癌细胞优选HeLa细胞或SiHa细胞，所述正常细胞优选Fibroblast细胞。
实验结果显示：本发明所述利用荧光图像显示细胞膜电位两种状态的荧光探针(CP12)在473nm激光激发下发射绿色荧光，用该荧光探针检测细胞膜电位正常状态与近零状态时，如果细胞膜与细胞质均显示有绿色荧光则确定该细胞的细胞膜电位为正常状态；如果只有细胞膜显示有绿色荧光则确定该细胞的细胞膜电位为近零状态。实验还证实：本发明所述的荧光探针对细胞膜电位的响应模式不受线粒体膜电位的影响，对细胞膜电位表现出较高的选择性。这样可通过荧光探针染色部位的变化实现直观地区分细胞膜电位的正常与近零两种状态，测量过程中无需校准，可省去绘制标准曲线的繁琐步骤，省时省力。
本发明公开了一种利用荧光图像显示细胞膜电位两种状态的荧光探针，该荧光探针的有益效果是：在细胞膜电位为正常状态时，所述荧光探针易穿过细胞膜进入细胞内，使细胞膜和细胞质均被染色；在细胞膜电位为近零状态时，所述荧光探针不能穿过细胞膜进入细胞内，仅使细胞膜被染色。轻松实现了利用荧光染色部位变化直观快速显示和区分细胞膜电位正常与近零两种状态。且该荧光探针能否透过细胞膜由细胞膜电位状态决定，不受线粒体膜电位变化的干扰，表现出较高的专一性，预示其在生物研究和医疗诊断方面具有良好的应用前景。
附图说明
图1：荧光探针CP12依次对活的SiHa细胞，HeLa细胞和Fibroblast细胞进行染色后，473nm激光激发下获得的激光扫描共聚焦荧光显微镜照片。
照片结果显示：细胞在正常膜电位状态时，荧光探针CP12可容易穿过细胞膜进入细胞内，细胞膜和细胞质均被染色。
图2：荧光探针CP12依次对消除细胞膜电位的SiHa细胞，HeLa细胞和Fibroblast细胞进行染色后，473nm激光激发下获得的激光扫描共聚焦荧光显微镜照片。
照片结果显示：经KCl和缬氨霉素孵育后细胞膜电位呈近零状态，荧光探针CP12仅染色细胞膜，进一步说明当细胞膜电位近零状态时，荧光探针CP12仅停留在细胞膜上，不会穿过细胞膜进入细胞质染色细胞内成分。
图3：荧光探针CP12依次对固定的SiHa细胞，固定的HeLa细胞和固定的Fibroblast细胞进行染色后，473nm激光激发下获得的激光扫描共聚焦荧光显微镜照片。
照片结果显示：细胞被固定死亡后，细胞膜电位为近零状态，荧光探针CP12则不能穿过细胞膜进入细胞内，仅细胞膜被染色。
图4：荧光探针CP12对CCCP处理后的(细胞线粒体膜电位消失)HeLa细胞进行染色后，473nm激光激发下获得的激光扫描共聚焦荧光显微镜照片(CP12)，相同条件获得的微分干涉图像(DIC)，CP12与DIC图像叠加(共定位)结果(Merged)。
照片结果显示：经CCCP处理后细胞线粒体膜电位消失但细胞膜电位正常时，荧光探针CP12可透过细胞膜进入细胞内，同时染色细胞膜和细胞质(见CP12)，说明荧光探针CP12能否透过细胞膜由细胞膜电位状态决定，不受线粒体膜电位变化的干扰。
具体实施方式
下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
下述实施例中，所使用的实验方法，未做具体说明的，均为常规方法；实施例所用细胞、培养液、试剂均为市售产品。
实施例1本发明所述利用荧光图像显示细胞膜电位两种状态的荧光探针(CP12)的制备
在干燥的三口瓶中加入N-十二烷基咔唑-3-甲醛0.399g，乙醇5ml，通氮气保护，升温至60℃，加热30min后全部溶解，加入化合物1-(2-羟基乙基)-4-甲基吡啶碘盐0.265g，滴加哌啶5滴，升温至回流，过夜，停止加热，冷却后蒸干溶剂，用乙醇重结晶，干燥，得到黄绿色粉末0.2g，产率51％，即为CP12。
上述化合物CP12制备反应式如下：
Figure BDA0002342285200000051
11H NMR(300MHz,DMSO-d6),δ(ppm):8.83(d,J＝6.9Hz,2H),8.60(d,J＝0.9Hz,1H),8.19-8.26(m,4H),7.90(d,J＝9Hz,1H),7.74(d,J＝8.7Hz,1H),7.67(d,J＝8.4Hz,1H),7.49-7.58(m,2H),7.29(t,J＝7.5Hz,1H),5.27(t,J＝5.4Hz,1H),4.54(t,J＝4.5Hz,2H),4.44(t,J＝6.8Hz,2H),3.87(q,J＝4.9Hz,2H),1.78(d,J＝6Hz,2H),1.17-1.25(m,18H),0.833(t,J＝6.9Hz,3H)。
实施例2癌细胞(SiHa和HeLa)和正常细胞(Fibroblast)培养
在37℃，5％CO2的饱和湿度孵箱中，使SiHa、HeLa和Fibroblast细胞株贴壁生长于内含10％胎牛血清H-DMEM培养液中(含1％双抗)。待细胞生长到对数期，分别取SiHa、HeLa、Fibroblast细胞接片培养。具体方法是：①将盖玻片于无水乙醇中浸泡30min，酒精灯烘干后放入一次性35mm培养皿中；②将在细胞皿中长至对数期的细胞用PBS洗三遍，用1mL0.25％胰酶消化3-5分钟后，小心地倒出酶液，再加入少量新鲜培养液，吹打细胞制成均匀细胞悬液，细胞计数后，利用细胞培养液把细胞终浓度调整为1×105个/ml，接种至内含盖玻片的培养皿中，放入37℃，5％CO2的饱和湿度孵箱中培养，使细胞爬片生长，待长至对数生长期备用。
实施例3荧光探针CP12染色活的SiHa、HeLa和Fibroblast细胞
将实施例2制备好的细胞爬片用PBS洗三遍，用2μM CP12分别染色活的SiHa、HeLa和Fibroblast细胞，在室温下孵育20min后吸出培养液，并用PBS洗三遍，洗去未结合的多余染液，细胞生长面朝下盖在载玻片上，在473nm激光激发下利用激光扫描共聚焦荧光显微镜观察细胞着色部位，荧光分布及亮度变化等，结果发现，荧光探针CP12可穿过细胞膜进入细胞内，细胞膜和细胞质均被染色，发出明亮的绿色荧光。
结果见图1。
结果提示：活的细胞其膜电位状态正常，细胞在正常膜电位状态时，荧光探针CP12可容易穿过细胞膜进入细胞内，细胞膜和细胞质均被染色。
实施例4荧光探针CP12染色消除细胞膜电位的SiHa、HeLa和Fibroblast细胞
将实施例2制备好的细胞爬片用PBS洗三遍，用1ml含有140mM KCl和1μM缬氨霉素的Tris缓冲液孵育40min，之后加入2μM CP12分别染色细胞，在室温下孵育20min后吸出培养液，并用含有140mM KCl和1μM缬氨霉素的Tris缓冲液洗三遍，洗去未结合的多余染液，细胞生长面朝下盖在载玻片上，在473nm激光激发下利用激光扫描共聚焦荧光显微镜观察细胞着色部位，荧光分布及亮度变化等，结果发现，荧光探针CP12不能穿过细胞膜进入细胞内，仅细胞膜被染色，发出明亮的绿色荧光。
结果见图2。
结果提示：含有140mM KCl和1μM缬氨霉素的Tris缓冲液孵育40min可消除细胞膜电位，使之呈近零状态。荧光探针CP12不能穿过细胞膜进入细胞质，仅分布于细胞膜上，图像中荧光显示仅细胞膜被染色。进一步证明细胞膜电位近零状态时，荧光探针CP12仅停留在细胞膜上，不会穿过细胞膜进入细胞质染色细胞内成分。
实施例5荧光探针CP12染色固定的SiHa、HeLa和Fibroblast细胞
将实施例2制备好的细胞爬片用PBS洗三遍，用1ml 4％的多聚甲醛溶液处理30min，之后用PBS洗去多聚甲醛溶液并用2μM CP12分别染色固定的细胞，在室温下孵育20min后吸出培养液，并用PBS洗三遍，洗去未结合的多余染液，细胞生长面朝下盖在载玻片上，在473nm激光激发下利用激光扫描共聚焦荧光显微镜观察细胞着色部位，荧光分布及亮度变化等，结果发现，荧光探针CP12不能穿过细胞膜进入细胞内，仅细胞膜被染色，发出明亮的绿色荧光。
结果见图3。
结果提示：多聚甲醛溶液固定后细胞死亡，细胞膜电位不能维持，呈近零状态。荧光探针CP12不能穿过细胞膜进入细胞质，仅分布于细胞膜上，图像中荧光显示仅细胞膜被染色。
实施例6荧光探针CP12染色消除了线粒体膜电位的HeLa细胞
CCCP是线粒体氧化磷酸化解偶联剂，可使线粒体膜电位消失。将实施例2制备好的HeLa细胞爬片用PBS洗三遍，用含有20μM CCCP的PBS缓冲液处理30min，之后加入2μM CP12染色细胞，在室温下孵育20min后吸出培养液，并用含有20μM CCCP的PBS缓冲液洗三遍，洗去未结合的多余染液，细胞生长面朝下盖在载玻片上，在473nm激光激发下利用激光扫描共聚焦荧光显微镜观察细胞着色部位，荧光分布及亮度变化等，结果发现：荧光探针CP12可穿过细胞膜进入细胞内，细胞膜和细胞质均被染色，发出明亮的绿色荧光。
结果见图4。
结果提示：CCCP是能消除线粒体膜电位的化合物，对细胞膜电位影响极小。线粒体电位消失而细胞膜电位正常时，CP12可穿过细胞膜染色细胞质，说明荧光探针CP12染色模式不受线粒体膜电位变化影响，这一特点优于阳离子慢反应型细胞膜电位荧光探针，可大大简化实验操作，提高实验稳定性。

Claims (5)

1.一种利用荧光图像显示细胞膜电位两种状态的荧光探针，其特征在于：所述细胞膜电位两种状态是指细胞膜电位正常状态与近零状态；所述荧光探针是化学名称为4-[2-(9-十二烷基-9H-咔唑-3)乙烯基]-1-(2-羟基乙基)-吡啶碘盐的化合物，简称：CP12；其化学结构如式(I)所示：
Figure FDA0002342285190000011
2.权利要求1所述利用荧光图像显示细胞膜电位两种状态的荧光探针在检测细胞膜电位正常状态与近零状态中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：在细胞膜电位为正常状态时，所述荧光探针CP12易穿过细胞膜进入细胞内，使细胞膜和细胞质均被染色；在细胞膜电位为近零状态时，所述荧光探针CP12不能穿过细胞膜进入细胞内，仅使细胞膜被染色。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：所述细胞是指癌细胞或正常细胞。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述癌细胞为HeLa细胞或SiHa细胞，所述正常细胞为Fibroblast细胞。
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