CN111349101A - 一种对生物细胞粘度响应的Turn-on型荧光分子探针及其制备方法和应用 - Google Patents

一种对生物细胞粘度响应的Turn-on型荧光分子探针及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及荧光分子探针检测技术领域，特别涉及一种对生物细胞粘度响应的Turn‑on型荧光分子探针及其制备方法和应用。2‑2‑2‑氯‑3‑(1,3‑二氢‑3,3‑二甲基‑1‑丙基‑2‑氢‑吲哚‑2‑亚基)亚乙基‑1‑环己烯‑1‑基乙烯基‑3,3‑二甲基‑1‑丙基吲哚鎓氯化物和四氮唑为反应原料，得到2‑[2‑(2‑氯环己酮)]‑3,3‑二甲基‑1‑盐酸氯胍‑3‑氢‑吲哚为荧光基团。本发明基于分子的旋转，扭转分子内电荷转移机制，对生物细胞内粘度敏感，通过提高荧光强度或者延长荧光寿命来响应增加的粘度，具有良好的荧光寿命和对粘度变化的高灵敏性，发射波长在红光部分，有较小的荧光背景干扰。

Description

一种对生物细胞粘度响应的Turn-on型荧光分子探针及其制 备方法和应用
技术领域
本发明涉及荧光分子探针检测技术领域，特别涉及一种对生物细胞粘度响应的Turn-on 型荧光分子探针及其制备方法和应用。
背景技术
细胞内粘度的测定一直是化学生物学研究的难题之一，尽管粘度长期以来被公认为是各 种生物系统中重要的微环境参数，粘度通过影响物质的流动性而有助于生物功能。然而，传 统的用于宏观液体的粘度计不能用于活细胞，这就需要开发新的工具。据我们所知，荧光探 针作为细胞生物学的有力工具，可以满足对活细胞内粘度的检测。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明所要解决的技术问题是，提供一种对生物细胞粘度响 应的Turn-on型荧光分子探针及其制备方法和应用，基于分子的旋转，扭转分子内电荷转移 机制，对生物细胞内粘度敏感，通过提高荧光强度或者延长荧光寿命来响应增加的粘度，具 有良好的荧光寿命和对粘度变化的高灵敏性，发射波长在红光部分，有较小的荧光背景干扰， 可用于荧光成像及进行渗透性较强的生物学研究。
本发明为实现上述目的采用的技术方案是：一种对生物细胞粘度响应的Turn-on型荧光 分子探针，2-2-2-氯-3-(1,3-二氢-3,3-二甲基-1-丙基-2-氢-吲哚-2-亚基)亚乙基-1-环己烯-1-基乙 烯基-3,3-二甲基-1-丙基吲哚鎓氯化物和四氮唑为反应原料，得到2-[2-(2-氯环己酮)]-3,3-二甲 基-1-盐酸氯胍-3-氢-吲哚为荧光基团，该分子探针优选为2-[2-(2,3,4,5,6,7,8,9,13,14-十氢)]-12 氢-1,10-呋喃-(1,4,7,10-四氮唑)-15-乙烯基-3,3-二甲基-正丙基-3氢-吲哚，其化学结构式为：
Figure BDA0002383222240000011
本发明还包括一种对生物细胞粘度响应的Turn-on型荧光分子探针的制备方法，所述荧 光分子探针具有上述的结构，包括以下步骤：
将2-2-2-氯-3-(1,3-二氢-3,3-二甲基-1-丙基-2-氢-吲哚-2-亚基)亚乙基-1-环己烯-1-基乙烯 基-3,3-二甲基-1-丙基吲哚鎓氯化物加入到烧瓶中，再加四氮唑，最后加入氯仿做为溶剂，70-90℃进行反应，反应结束，待溶液冷却到室温，柱层析法分离，得到产物2-[2-(2-氯环己 酮)]-3,3-二甲基-1-盐酸氯胍-3-氢-吲哚为荧光基团，2-[2-(2,3,4,5,6,7,8,9,13,14-十氢)]-12氢 -1,10-呋喃-(1,4,7,10-四氮唑)-15-乙烯基-3,3-二甲基-正丙基-3氢-吲哚,命名为F474。
进一步的，所述2-2-2-氯-3-(1,3-二氢-3,3-二甲基-1-丙基-2-氢-吲哚-2-亚基)亚乙基-1-环己 烯-1-基乙烯基-3,3-二甲基-1-丙基吲哚鎓氯化物与四氮唑的摩尔比优选为1:5；
所述反应的时间优选为12h；
所述反应温度优选为80℃。
本发明还包括一种对生物细胞粘度响应的Turn-on型荧光分子探针的应用，所述分子探 针具有上述的结构，或通过上述的制备方法制备，应用于检测生物细胞内粘度以及应用于检 测活细胞粘度变化及荧光成像。
进一步的，建立分子探针F474对粘度的滴定线性曲线步骤包括，
(1)配制pH＝7.40，浓度为20mM的PBS缓冲盐溶液；浓度为1mM的分子探针F474的DMSO溶液；
(2)分别取甲醇与丙三醇比例为：10:0，8:2，7:3，6:4，5:5，4:6，3:7，2:8，1:9和0:10 的溶液共10份，在试管内混和均匀，然后再分别加入10μL浓度为1mM的分子探针F474的DMSO溶液，混合均匀，在荧光比色皿中完成测样；
(3)通过荧光分光光度计测试荧光强度，得到荧光强度比值，检测细胞粘度的荧光强度 的激发波长为400nm；
(4)分别以丙三醇的含量为横坐标，以荧光强度比值为纵坐标，得到关于粘度、荧光强 度比值的线性方程。
进一步的，检测分子探针F474在最小粘度和最大粘度的紫外吸收步骤包括，
分别取甲醇与丙三醇比例为：10:0和0:10的溶液共2份，在试管内混均匀，然后再分别 加入10μL浓度为1mM的F474的DMSO溶液，混合均匀，在比色皿中完成测样，得到两份 样品的紫外吸收图谱。
进一步的，检测分子探针F474对不同粘度的荧光寿命的步骤包括，
(1)配制pH＝7.40，浓度为20mM的PBS缓冲盐溶液；浓度为1mM的分子探针F474的DMSO溶液；
(2)分别取甲醇与丙三醇比例为：10:0，8:2，7:3，6:4，5:5，4:6，3:7，2:8，1:9和0:10 的溶液共10份，在试管内混均匀，然后再分别加入10μL浓度为1mM的F474的DMSO溶液， 混合均匀，在荧光比色皿中完成测样；
(3)通过荧光分光光度计测试荧光强度，得到荧光强度比值，检测细胞粘度的荧光强度 的激发波长为400nm；
(4)分别以丙三醇的含量为横坐标，以荧光强度比值为纵坐标，得到关于粘度、荧光强 度比值的线性方程；得到分子探针F474对不同粘度的荧光寿命图。
进一步的，分子探针F474对巨噬细胞成像的步骤包括，
(1)配制浓度为1mM的分子探针F474的DMSO标准溶液，浓度为1μg/ml的莫能菌素 溶液；
(2)细胞培养：将复苏好的巨噬细胞进行培养，培养基包含10％牛胚胎血清、1％双抗、 89％DMEM、在37℃，5％CO2的环境中培养24h,得到长势良好的细胞待用；
(3)将活的巨噬细胞置入培养基中培育，共分别培养3组，每组培养基中接种量为2×107～9×107个/mL，培育24h，分成A，B和C三组，A组巨噬细胞只加入10μM的分子探 针F474孵育30min；B组巨噬细胞先使用15μM的莫能菌素培养30min,然后再用10μM的分 子探针F474孵育30min；C组细胞先使用2μM制霉菌素孵育30min,然后再用10μM的分子探 针F474孵育30min，巨噬细胞共聚焦激光荧光成像，得到关于三组细胞的共聚焦图谱，得到 关于三组细胞荧光图像的强度图。
进一步的，检测分子探针F474对细胞存活率影响的步骤包括，
细胞培养液中加入浓度分别为0M,5M,10M,20M,30M和50M的分子探针F474，在37℃，5％CO2的培养箱中培养24h,将25μL，5mg/mL的4-甲基噻唑基四唑MTT加入到细胞培养液 中培养4h，通过MTT比色皿法来评估细胞存活率，以不加分子探针F474的细胞组存活率为100％，不同浓度分子探针F474加入的实验组相关数据绘制相对做柱状图。
本发明对生物细胞粘度响应的Turn-on型荧光分子探针及其制备方法和应用的有益效果 是：
(1)本发明的比率型荧光标记试剂是以2-[2-(2-氯环己酮)]-3,3-二甲基-1-盐酸氯胍-3-氢- 吲哚为荧光基团，以受活化的旋转双键为反应位点，扭转分子内电荷转移机制的近红外荧光 探针，使探针对粘度会有明显的荧光信号读出。
(2)本发明的比率型荧光标记试剂响应灵敏，对粘度的响应时间在数秒内。
(3)本发明的比率型荧光标记试剂检测限低，相比较于商业化的荧光标记试剂，对粘度 的检测限为1.5nm/L，以便于疾病的及时发现和早期诊断。
(4)本发明应用于活细胞的检测，进一步推动了生物小分子在生命体中作用的探究。
(5)由于反应前后紫外颜色的变化明显，可供肉眼检测，方便快捷。
(6)由于其长波长在红外部分，对生物细胞危害较小。
附图说明
图1是实施例1中分子探针F474的合成路线图；
图2是实施例1中分子探针F474的质谱图；
图3是实施例1中分子探针F474的核磁H谱；
图4是实施例1中分子探针F474的核磁C谱；
图5是实施例2中分子探针F474对体外粘度的荧光滴定图；
图6是实施例2中分子探针F474对体外粘度荧光强度的线性图；
图7是实施例3中分子探针F474在最大最小的粘度中的紫外吸收图；
图8是实施例4中分子探针F474对不同粘度的荧光寿命图；
图9是实施例6中不同浓度分子探针F474对细胞的存活率柱状图；
图10是实施例5中体外分子探针F474对巨噬细胞的共聚焦图谱；
图11是实施例5中分子探针F474对巨噬细胞的共聚焦图谱的强度图。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步详细说明；
实施例1：
如图1-4所示，一种对生物细胞粘度响应的Turn-on型荧光分子探针，2-2-2-氯-3-(1,3-二 氢-3,3-二甲基-1-丙基-2-氢-吲哚-2-亚基)亚乙基-1-环己烯-1-基乙烯基-3,3-二甲基-1-丙基吲哚 鎓氯化物和四氮唑为反应原料，得到2-[2-(2-氯环己酮)]-3,3-二甲基-1-盐酸氯胍-3-氢-吲哚为 荧光基团，该分子探针为2-[2-(2,3,4,5,6,7,8,9,13,14-十氢)]-12氢-1,10-呋喃-(1,4,7,10-四氮 唑)-15-乙烯基-3,3-二甲基-正丙基-3氢-吲哚，其化学结构式为：
Figure BDA0002383222240000041
本发明还包括一种对生物细胞粘度响应的Turn-on型荧光分子探针的制备方法，所述荧 光分子探针具有上述的结构，包括以下步骤：
将2-2-2-氯-3-(1,3-二氢-3,3-二甲基-1-丙基-2-氢-吲哚-2-亚基)亚乙基-1-环己烯-1-基乙烯 基-3,3-二甲基-1-丙基吲哚鎓氯化物加入到烧瓶中，再加四氮唑，最后加入氯仿做为溶剂，80℃ 进行反应，反应结束，待溶液冷却到室温，柱层析法分离，得到产物2-[2-(2-氯环己酮)]-3,3- 二甲基-1-盐酸氯胍-3-氢-吲哚为荧光基团，2-[2-(2,3,4,5,6,7,8,9,13,14-十氢)]-12氢-1,10-呋喃 -(1,4,7,10-四氮唑)-15-乙烯基-3,3-二甲基-正丙基-3氢-吲哚,命名为F474，为暗红色固体。
其中，所述2-2-2-氯-3-(1,3-二氢-3,3-二甲基-1-丙基-2-氢-吲哚-2-亚基)亚乙基-1-环己烯-1- 基乙烯基-3,3-二甲基-1-丙基吲哚鎓氯化物与四氮唑的摩尔比为1:5；
所述反应的时间为12h。
图1是分子探针F474的合成路线图；图2是分子探针F474的质谱图；图3是分子探针F474的核磁H谱；图4是分子探针F474的核磁C谱。
本发明还包括一种对生物细胞粘度响应的Turn-on型荧光分子探针的应用，所述分子探 针具有上述的结构，或通过上述的制备方法制备，应用于检测生物细胞内粘度以及应用于检 测活细胞粘度变化及荧光成像。
实施例2：
建立分子探针F474对粘度的滴定线性曲线步骤包括，
(1)配制pH＝7.40，浓度为20mM的PBS缓冲盐溶液；浓度为1mM的分子探针F474的DMSO溶液；
(2)分别取甲醇与丙三醇比例为：10:0，8:2，7:3，6:4，5:5，4:6，3:7，2:8，1:9和0:10 的溶液共10份，在试管内混和均匀，然后再分别加入10μL浓度为1mM的分子探针F474的DMSO溶液，混合均匀，在荧光比色皿中完成测样；
(3)通过荧光分光光度计测试荧光强度，得到荧光强度比值，检测细胞粘度的荧光强度 的激发波长为400nm；
(4)分别以丙三醇的含量为横坐标，以荧光强度比值为纵坐标，得到关于粘度、荧光强 度比值的线性方程，图5是分子探针F474对体外粘度的荧光滴定图；图6是分子探针F474对 体外粘度荧光强度的线性图。
实施例3：
检测分子探针F474在最小粘度和最大粘度的紫外吸收步骤包括，
分别取甲醇与丙三醇比例为：10:0和0:10的溶液共2份，在试管内混均匀，然后再分别 加入10μL浓度为1mM的F474的DMSO溶液，混合均匀，在比色皿中完成测样，得到两份 样品的紫外吸收图谱。图7是分子探针F474在最大最小的粘度中的紫外吸收图，其中最小粘 度为甲醇，最大粘度为丙三醇。
实施例4：
检测分子探针F474对不同粘度的荧光寿命的步骤包括，
(1)配制pH＝7.40，浓度为20mM的PBS缓冲盐溶液；浓度为1mM的分子探针F474的DMSO溶液；
(2)分别取甲醇与丙三醇比例为：10:0，8:2，7:3，6:4，5:5，4:6，3:7，2:8，1:9和0:10 的溶液共10份，在试管内混均匀，然后再分别加入10μL浓度为1mM的F474的DMSO溶液， 混合均匀，在荧光比色皿中完成测样；
(3)通过荧光分光光度计测试荧光强度，得到荧光强度比值，检测细胞粘度的荧光强度 的激发波长为400nm；
(4)分别以丙三醇的含量为横坐标，以荧光强度比值为纵坐标，得到关于粘度、荧光强 度比值的线性方程；得到分子探针F474对不同粘度的荧光寿命图，图8。
实施例5：
分子探针F474对巨噬细胞成像的步骤包括，
(1)配制浓度为1mM的分子探针F474的DMSO标准溶液，浓度为1μg/ml的莫能菌素 溶液；
(2)细胞培养：将复苏好的巨噬细胞进行培养，培养基包含10％牛胚胎血清、1％双抗、 89％DMEM、在37℃，5％CO2的环境中培养24h,得到长势良好的细胞待用；
(3)将活的巨噬细胞置入培养基中培育，共分别培养3组，每组培养基中接种量为2×107～9×107个/mL，培育24h，分成A，B和C三组，A组巨噬细胞只加入10μM的分子探 针F474孵育30min；B组巨噬细胞先使用15μM的莫能菌素培养30min,然后再用10μM的分 子探针F474孵育30min；C组细胞先使用2μM制霉菌素孵育30min,然后再用10μM的分子探 针F474孵育30min，巨噬细胞共聚焦激光荧光成像，得到关于三组细胞的共聚焦图谱，图10； 得到关于三组细胞荧光图像的强度图，图11。
实施例6：
检测分子探针F474对细胞存活率影响的步骤包括，
细胞培养液中加入浓度分别为0M,5M,10M,20M,30M和50M的分子探针F474，在37℃，5％CO2的培养箱中培养24h,将25μL，5mg/mL的4-甲基噻唑基四唑MTT加入到细胞培养液 中培养4h，通过MTT比色皿法来评估细胞存活率，以不加分子探针F474的细胞组存活率为100％，不同浓度分子探针F474加入的实验组相关数据绘制相对做柱状图，即图9。
本发明实施例中的巨噬细胞为：武汉普诺赛生命科技有限公司,小鼠肾脏巨噬细胞，产品 编号：CP-M187；高效液相-质谱分析是利用Agilent 1100质谱系统(Agilent,USA)，并配备 脱气装置、四元泵、自动进样器，高效液相色谱分离是借助Hypersil GOLDC18柱(2.1mm ×50mm,1.8μm i.d.,Agilent,USA)来完成。荧光检测是利用日立Hitachi F-4600荧光光谱仪 来进行，对ONOO-检测激发波长为500nm，激发和发射狭缝宽度均为10.0nm，电压400V， 扫描速度2400纳米/分。荧光成像观测是通过Olympus Fluo ViewFV1000(日本)共聚焦来进 行，用40倍物镜观察。化合物的分离纯化是采用薄层色谱硅胶柱实现，其中，填料为300-400 目。
上述实施例只是为了说明本发明的技术构思及特点，其目的是在于让本领域内的普通技 术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡是根据本 发明内容的实质所做出的等效的变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种对生物细胞粘度响应的Turn-on型荧光分子探针，其特征在于：2-2-2-氯-3-(1,3-二氢-3,3-二甲基-1-丙基-2-氢-吲哚-2-亚基)亚乙基-1-环己烯-1-基乙烯基-3,3-二甲基-1-丙基吲哚鎓氯化物和四氮唑为反应原料，得到2-[2-(2-氯环己酮)]-3,3-二甲基-1-盐酸氯胍-3-氢-吲哚为荧光基团，该分子探针优选为2-[2-(2,3,4,5,6,7,8,9,13,14-十氢)]-12氢-1,10-呋喃-(1,4,7,10-四氮唑)-15-乙烯基-3,3-二甲基-正丙基-3氢-吲哚，其化学结构式为：
Figure FDA0002383222230000011
2.一种对生物细胞粘度响应的Turn-on型荧光分子探针的制备方法，荧光分子探针具有权利要求1所述的结构，其特征在于，包括以下步骤：
将2-2-2-氯-3-(1,3-二氢-3,3-二甲基-1-丙基-2-氢-吲哚-2-亚基)亚乙基-1-环己烯-1-基乙烯基-3,3-二甲基-1-丙基吲哚鎓氯化物加入到烧瓶中，再加四氮唑，最后加入氯仿做为溶剂，70-90℃进行反应，反应结束，待溶液冷却到室温，柱层析法分离，得到产物2-[2-(2-氯环己酮)]-3,3-二甲基-1-盐酸氯胍-3-氢-吲哚为荧光基团，2-[2-(2,3,4,5,6,7,8,9,13,14-十氢)]-12氢-1,10-呋喃-(1,4,7,10-四氮唑)-15-乙烯基-3,3-二甲基-正丙基-3氢-吲哚,命名为F474。
3.根据权利要求2所述的对生物细胞粘度响应的Turn-on型荧光分子探针的制备方法，其特征是：
所述2-2-2-氯-3-(1,3-二氢-3,3-二甲基-1-丙基-2-氢-吲哚-2-亚基)亚乙基-1-环己烯-1-基乙烯基-3,3-二甲基-1-丙基吲哚鎓氯化物与四氮唑的摩尔比优选为1:5；
所述反应的时间优选为12h；
所述反应温度优选为80℃。
4.一种对生物细胞粘度响应的Turn-on型荧光分子探针的应用，所述分子探针具有如权利要求1所述的结构，或通过权利要求2-3任一项所述的制备方法制备，其特征在于：应用于检测生物细胞内粘度以及应用于检测活细胞粘度变化及荧光成像。
5.根据权利要求4所述的对生物细胞粘度响应的Turn-on型荧光分子探针的应用，其特征是：建立分子探针F474对粘度的滴定线性曲线步骤包括，
(1)配制pH＝7.40，浓度为20mM的PBS缓冲盐溶液；浓度为1mM的分子探针F474的DMSO溶液；
(2)分别取甲醇与丙三醇比例为：10:0，8:2，7:3，6:4，5:5，4:6，3:7，2:8，1:9和0:10的溶液共10份，在试管内混和均匀，然后再分别加入10μL浓度为1mM的分子探针F474的DMSO溶液，混合均匀，在荧光比色皿中完成测样；
(3)通过荧光分光光度计测试荧光强度，得到荧光强度比值，检测细胞粘度的荧光强度的激发波长为400nm；
(4)分别以丙三醇的含量为横坐标，以荧光强度比值为纵坐标，得到关于粘度和荧光强度比值的线性方程。
6.根据权利要求4所述的对生物细胞粘度响应的Turn-on型荧光分子探针的应用，其特征是：检测分子探针F474在最小粘度和最大粘度的紫外吸收步骤包括，
分别取甲醇与丙三醇比例为：10:0和0:10的溶液共2份，在试管内混均匀，然后再分别加入10μL浓度为1mM的F474的DMSO溶液，混合均匀，在比色皿中完成测样，得到两份样品的紫外吸收图谱。
7.根据权利要求4所述的对生物细胞粘度响应的Turn-on型荧光分子探针的应用，其特征是：检测分子探针F474对不同粘度的荧光寿命的步骤包括，
(1)配制pH＝7.40，浓度为20mM的PBS缓冲盐溶液；浓度为1mM的分子探针F474的DMSO溶液；
(2)分别取甲醇与丙三醇比例为：10:0，8:2，7:3，6:4，5:5，4:6，3:7，2:8，1:9和0:10的溶液共10份，在试管内混均匀，然后再分别加入10μL浓度为1mM的F474的DMSO溶液，混合均匀，在荧光比色皿中完成测样；
(3)通过荧光分光光度计测试荧光强度，得到荧光强度比值，检测细胞粘度的荧光强度的激发波长为400nm；
(4)分别以丙三醇的含量为横坐标，以荧光强度比值为纵坐标，得到关于粘度、荧光强度比值的线性方程；得到分子探针F474对不同粘度的荧光寿命图。
8.根据权利要求4所述的对生物细胞粘度响应的Turn-on型荧光分子探针的应用，其特征是：分子探针F474对巨噬细胞成像的步骤包括，
(1)配制浓度为1mM的分子探针F474的DMSO标准溶液，浓度为1μg/ml的莫能菌素溶液；
(2)细胞培养：将复苏好的巨噬细胞进行培养，培养基包含10％牛胚胎血清、1％双抗、89％DMEM、在37℃，5％CO2的环境中培养24h,得到长势良好的细胞待用；
(3)将活的巨噬细胞置入培养基中培育，共分别培养3组，每组培养基中接种量为2×107～9×107个/mL，培育24h，分成A，B和C三组，A组巨噬细胞只加入10μM的分子探针F474孵育30min；B组巨噬细胞先使用15μM的莫能菌素培养30min,然后再用10μM的分子探针F474孵育30min；C组细胞先使用2μM制霉菌素孵育30min,然后再用10μM的分子探针F474孵育30min，巨噬细胞共聚焦激光荧光成像，得到关于三组细胞的共聚焦图谱，得到关于三组细胞荧光图像的强度图。
9.根据权利要求4所述的对生物细胞粘度响应的Turn-on型荧光分子探针的应用，其特征是：检测分子探针F474对细胞存活率影响的步骤包括，
细胞培养液中加入浓度分别为0M,5M,10M,20M,30M和50M的分子探针F474，在37℃，5％CO2的培养箱中培养24h,将25μL，5mg/mL的4-甲基噻唑基四唑MTT加入到细胞培养液中培养4h，通过MTT比色皿法来评估细胞存活率，以不加分子探针F474的细胞组存活率为100％，不同浓度分子探针F474加入的实验组相关数据绘制相对做柱状图。
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