CN111362900A - 响应onoo-的比率型小分子荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明针对提供响应ONOO‑的比率型小分子荧光探针及其制备方法和应用,属于荧光探针检测领域,制备得到的分子探针能应用于生物样本检测比率型的探针分子,以9‑(2‑羧苯基)‑6‑(二乙氨基)‑1,2,3,4‑四氢夹氧杂蒽为荧光基团,以活化的C=C双键为反应活性基团,荧光探针F533具有标记反应迅速、对ONOO‑选择性高、检测限极低、合成方法简便。在生物样本成像中受外界条件的影响小,结果准确。该小分子荧光探针对于进一步了解ONOO‑在机体内的作用机理有着深远意义。
Description
技术领域
本发明属于荧光探针检测领域,尤其涉及响应ONOO-的比率型小分子荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
体内活性氧(简称ROS)的过量产生被认为是多种病理的关键因素,ONOO-是生物体系中极强的氧化剂,可以与一系列的分子靶点反应,包括蛋白质,脂质和核酸,可破坏分子,引起细胞内膜结构破坏,最终导致一系列疾病,如糖尿病,阿茨海默症,癌症,关节炎,自身免疫性疾病等,因此发明一种探针,完成对ONOO-的即时检测非常重要。
到目前为止,高效液相色谱-质谱、电化学分析、毛细管电泳分析、以及以有机探针和纳米材料为基础的拉曼分析法用来检测生物小分子被广泛应用。然而现有大多分析方法误差高,仅能进行定性检测,对于小微剂量的ONOO-难于准确识别并检测。
相较于这些现有分析方法,荧光探针具有高灵敏性,即时检测以及可应用于生命有机体系等独特优势。此外,相较于开关型荧光有机探针的高误差,本发明比率型荧光探针能有效避免来自外界环境或仪器设备的影响。
发明内容
基于上述现有问题,本发明针对提供一种响应ONOO-的比率型小分子荧光探针及其制备方法,制备得到的分子探针能应用于生物样本检测比率型的探针分子,以9-(2-羧苯基)-6-(二乙氨基)-1,2,3,4-四氢夹氧杂蒽为荧光基团,以活化的C=C双键为反应活性基团,荧光探针F533具有标记反应迅速、对ONOO-选择性高、检测限极低、合成方法简便。该小分子荧光探针的设计与合成对于进一步了解ONOO-在机体内的作用机理有着深远意义。
具体发明技术方案如下:
响应ONOO-的比率型小分子荧光探针,以9-(2-羧苯基)-6-(二乙氨基)-1,2,3,4-四氢夹氧杂蒽为荧光基团,以活化的C=C双键为反应活性基团;该分子探针优选为3-[(4-异丙苯基) 亚丙烯基烯]-7-(戊烷-3-烯丙基苯)-10-邻甲苯基-1,2,3,4-四氢夹氧杂蒽,其化学结构式为:
本发明还提供一种上述检测ONOO-的比率型小分子荧光探针的制备方法:优选包括如下步骤:
1)将浓硫酸置入容器,再加入环己酮和2-[4-(二乙氨基)-2-羟基-苯甲酰]苯甲酸,搅拌加热回流,反应结束,待溶液冷却到室温,倒入冰水中,搅拌均匀,然后向混合液体中滴加高氯酸,析出固体,得到中间产物F376,结构为9-(2-羧苯基)-6-(二乙氨基)-1,2,3,4-四氢夹氧杂蒽;
2)将中间产物F376,用无水乙醇溶解,加入4-二甲氨基肉桂醛,室温搅拌反应完全后,将滤液旋干,通过层析柱方法得到目标产物:分子探针F533,结构为3-[(4-异丙苯基)亚丙烯基烯]-7-(戊烷-3-烯丙基苯)-10-邻甲苯基-1,2,3,4-四氢夹氧杂蒽。
上述检测ONOO-的小分子荧光探针的制备方法,具体各优选工艺为:
在步骤(1)中
2-[(4-二乙胺基)-2羟基苯甲酰]苯甲酸与环己酮的摩尔比优选为1:2,
回流反应的时间优选为2h,
加样顺序优选为:先加浓硫酸,冰水浴中先搅拌5分钟,后加入环己酮,继续0℃搅拌5分钟,最后加2-[(4-二乙胺基)-2羟基苯甲酰]苯甲酸,然后控制反应温度为(70-90)℃。
在步骤(2)中,
中间产物9-(2-羧苯基)-6-(二乙氨基)-1,2,3,4-四氢夹氧杂蒽与4-二甲氨基肉桂醛的摩尔比优选为1:2,中间产物的摩尔数为1,4-二甲氨基肉桂醛的摩尔数为2。
本发明还提供一种对ONOO-响应的上述比率型小分子荧光探针的应用,具体的,应用于检测ONOO-的总含量,检测细胞外源性ONOO-浓度或细胞内源性ONOO-浓度及细胞 ONOO-荧光成像。
具体的,内源性浓度是通过加LPS+PMA药物诱导,细胞自己生成的ONOO-,外源性是外部添加ONOO-,最终被细胞吸收,荧光成像都是对细胞内的ONOO-成像。
优选的,建立分子探针F533与ONOO-的线性工作曲线步骤包括:
(1)配制pH=7.40,浓度为10mM的磷酸缓冲盐溶液(简称PBS缓冲溶液),配制浓度为1mM的ONOO-的H2O标准溶液和浓度为1mM的探针F533的DMSO溶液;
(2)准备10组待测液,每组分别将100μL浓度为10mM的PBS缓冲盐溶液和100μL 浓度为0.05mM的探针F533的DMSO溶液,加入生理盐水定容到1mL,混合均匀置入容器中;分别取0μL、2.5μL、5μL、7.5μL、10μL、12.5μL、15μL、17.5μL、20μL、22.5μL浓度为1mM的ONOO-的标准溶液共10份,分别加入到各组待测液中;
(3)反应30min后,通过荧光分光光度计测试荧光强度,得到荧光强度比值,更优选检测ONOO-荧光强度的激发波长为500nm;
(4)以ONOO-的浓度为横坐标,以荧光强度比值为纵坐标,得到关于探针分子对ONOO-浓度、荧光强度比值的线性方程。
优选检测ONOO-效果判断指标如下:
检测速度:立即反应,反应时间为0-10秒,更优选3秒以内;
颜色变化:日光灯下表现为由紫色变为无;紫外灯下表现由红光变为绿光。
在本发明的一些具体实施方式中,利用小分子荧光探针F533检测水样中ONOO-的含量步骤优选包括:
(1)将待测水样和F533按体积比1:4混合,取所得液900mL;(2)向其中加入100μL 浓度为0.05mM的F533,所得溶液在室温下保存1min并检测其荧光强度;(3)根据关于探针分子对ONOO-浓度、荧光强度比值的线性方程,以及荧光强度计算得到水样中含有 ONOO-的含量。
在本发明的另一些具体实施方式中,利用小分子荧光探针F533检测活细胞外源性ONOO-的浓度步骤优选包括:
(1)配制浓度为1mM的ONOO-的水的标准溶液、浓度为1mM的探针F533的DMSO 标准溶液,浓度为1μg/ml的脂多糖水溶液(简称LPS溶液)、浓度为1μg/ml的佛波酯水溶液(简称PMA溶液)。
(2)细胞培养:选择单核巨噬细胞(简称RAW细胞),将复苏好的细胞进行培养,培养基包含10wt%牛胚胎血清、1wt%双抗和89wt%DMEM培养基质,在37℃,5%vol CO2的环境中培养24h,得到长势良好的细胞待用;
(3)将RAW细胞的活细胞置入培养基中培育,共分别培养5组,每组培养基中接种量为2×107~9×107个/mL,先分别加入0μL、5μL、10μL、15μL和20μL浓度为1mM的 ONOO-的标准溶液,再加入10μL浓度为1mM的探针F533的DMSO溶液于37℃共培育 30min;
(4)然后将共培育后细胞置于PBS缓冲溶液中,置入共聚焦下观测成像,收集不同颜色光通道的荧光强度,从而进行荧光强度比值,得到关于细胞外源性ONOO-的浓度与荧光强度比值的线性方程。
在本发明的其他一些优选实施方式中,利用探针F533检测活细胞内源性ONOO-的浓度步骤优选包括:
(1)选择单核巨噬细胞(简称RAW细胞),将复苏好的细胞进行培养,培养基包含10wt%牛胚胎血清、1wt%双抗和89wt%DMEM培养基质,在37℃,5%vol CO2的环境中培养24h,得到长势良好的细胞待用;
(2)将RAW细胞的活细胞置入培养基中培育,共分别培养4组,每组培养基中接种量为2×107~9×107个/mL,培育24h;
(3)取2组培养基,第一组不加LPS溶液和PMA溶液,只加10μL浓度为1mM的探针F533的DMSO溶液和100uL生理盐水作为对照;
(4)向第二组中加入100μL浓度为1μg/ml的LPS溶液、100μL浓度为1μg/ml的PMA 溶液用来刺激细胞产生内源性的ONOO-,再加入10μL浓度为1mM的探针F533的DMSO 溶液进行培养;
(5)将两组分别置入共聚焦下观测成像,收集不同颜色光通道的荧光强度,从而进行荧光强度比值,根据细胞内ONOO-的浓度与荧光强度比值的线性方程,从而得到细胞内源性ONOO-的浓度。
本发明的制备方法,各种物料的添加顺序以及具体反应步骤能由本领域技术人员自行调整,不仅适用于实验室小规模制备,也适合于化工厂的工业化大规模生产。在工业化大规模生产时,具体反应参数能由本领域技术人员通过实验确定。
本发明的有益效果如下:
(1)本发明的比率型荧光标记试剂是以9-(2-羧苯基)-6-(二乙氨基)-1,2,3,4-四氢夹氧杂蒽为荧光基团,以受活化的C=C为反应位点,使探针对ONOO-有优越的选择性,并且会有明显的荧光信号读出。
(2)本发明的比率型荧光标记试剂响应灵敏,对ONOO-的响应时间在数秒内。
(3)本发明的比率型荧光标记试剂检测限低,相比较于商业化的荧光标记试剂,本发明公开的对ONOO-的检测限分别为2nm/L,远远低于细胞内这两种物质正常存在的含量,以便于及时发现和早期诊断过量的ONOO-。
(4)本发明的比率型荧光标记试剂,相比较开关型荧光标记试剂,以荧光强度的比值为基准,而不是直接荧光强度,会大大减少来自外界环境以及仪器等等的影响。
(5)本发明应用于活细胞的检测,进一步推动了生物小分子在生命体中作用的探究。
(6)由于反应后紫外颜色的变化明显,可供裸眼检测,方便快捷。
(7)由于其长波长在红外部分,ONOO-在不过量的情况下对生物活体危害较小。
附图说明
图1是本发明实施例1检测ONOO-的比率型小分子荧光探针的制备方法合成及反应路线图。
图2是本发明实施例1检测ONOO-的比率型小分子荧光探针的质谱图;其中:A、3-[(4- 异丙苯基)亚丙烯基烯]-7-(戊烷-3-烯丙基苯)-10-邻甲苯基-1,2,3,4-四氢夹氧杂蒽的质谱图; B、3-[(4-异丙苯基)亚丙烯基烯]-7-(戊烷-3-烯丙基苯)-10-邻甲苯基-1,2,3,4-四氢蒽与ONOO-反应的质谱图;
图3是本发明实施例1检测ONOO-的比率型小分子荧光探针F533 3-[(4-异丙苯基)亚丙烯基烯]-7-(戊烷-3-烯丙基苯)-10-邻甲苯基-1,2,3,4-四氢夹氧杂蒽与ONOO-反应后产物的 HPLC图;
图4是本发明实施例1检测ONOO-的比率型小分子荧光探针F533的核磁H谱;
图5是本发明实施例1检测ONOO-的比率型小分子荧光探针F533的核磁C谱;
图6是本发明实施例2检测ONOO-的比率型小分子荧光探针的应用中:对过氧亚硝基 ONOO-的荧光滴定图谱及探针F533对过氧亚硝基ONOO-滴定的线性方程;
图7是本发明实施例2检测ONOO-的比率型小分子荧光探针的应用中:探针F533与ONOO-的响应时间与荧光强度的图谱;
图8是本发明实施例3检测ONOO-的比率型小分子荧光探针的应用中,探针F533对水样中的ONOO-(上曲线)和空白组(下曲线)的荧光响应图;
图9是本发明实施例4检测ONOO-的比率型小分子荧光探针的应用中,分子探针F533检测外源性相关细胞图,从左到右为加入0uLONOO-,5uLONOO-,10uLONOO-,15uLONOO-,20uLONOO-。
图10是本发明实施例4和5检测ONOO-的比率型小分子荧光探针的应用中,在细胞内荧光比值强度对ONOO-含量的线性拟合方程曲线。
图11是本发明实施例5检测ONOO-的比率型小分子荧光探针的应用中,检测内源性ONOO-的相关细胞图,从左到右为空白组,LPS+PMA的实验组;
图12是本发明检测ONOO-的比率型小分子荧光探针(A)对各种干扰离子的选择性的荧光光谱图,(B)为探针F533对各种干扰离子的选择性的柱状图;
图13是本发明检测ONOO-的比率型小分子荧光探针对细胞存活率柱状图。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步说明本发明,应该理解的是,本发明实施例的制备方法仅仅是用于阐明本发明,而不是对本发明的限制;在本发明构思的前提下,对本发明制备方法的简单改进都属于本发明要求的保护范围。
还应注意到前面提到的本发明方法的各个优选的技术特征以及下面具体描述的实施例中的各个具体技术特征能够组合在一起,所有这些技术特征的各种组合由本发明具体公开的数值作为上下限的所有数值范围等等都落在本发明的范围内。
下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂如无特殊说明,均能从商业途径得到或由商业途径所得原料合成。
下述实施例中高效液相-质谱分析是利用Agilent 1100质谱系统(Agilent,USA),并配备脱气装置、四元泵、自动进样器,高效液相色谱分离是借助Hypersil GOLD C18柱(2.1 mm×50mm,1.8μm i.d.,Agilent,USA)来完成。荧光检测是利用日立Hitachi F-4600荧光光谱仪来进行,对ONOO-检测激发波长为500nm,激发和发射狭缝宽度均为10.0nm,电压400V,扫描速度2400纳米/分。荧光成像观测是通过Olympus Fluo View FV1000(日本) 共聚焦来进行,用40倍物镜观察。化合物的分离纯化是采用薄层色谱硅胶柱实现,其中,填料为300-400目。
实施例1:
如图1所示,响应ONOO-的比率型小分子荧光探针,以9-(2-羧苯基)-6-(二乙氨基)-1,2,3,4-四氢夹氧杂蒽为荧光基团,以活化的C=C双键为反应活性基团;,以环己酮和2-[4-(二乙氨基)-2-羟基-苯甲酰]苯甲酸和N,N-二甲基肉桂醛为原料,该分子探针为3-[(4- 异丙苯基)亚丙烯基烯]-7-(戊烷-3-烯丙基苯)-10-邻甲苯基-1,2,3,4-四氢夹氧杂蒽,其化学结构式为:
上述检测ONOO-的比率型小分子荧光探针的制备方法:包括如下步骤:
1)将140mL浓硫酸置入容器,再加入10g环己酮和31.3g的2-[4-(二乙氨基)-2-羟基- 苯甲酰]苯甲酸,搅拌加热85℃回流2h,反应结束,待溶液冷却到室温,倒入冰水中,搅拌均匀,然后向混合液体中滴加高氯酸,析出橙红色固体,用正己烷洗涤得到的固体,抽滤前面洗涤后的固体,得到中间产物F376,结构为9-(2-羧苯基)-6-(二乙氨基)-1,2,3,4-四氢夹氧杂蒽;30.2g,产率为96.5%。
2)将400mg中间产物F376,用25ml无水乙醇溶解,加入4-二甲氨基肉桂醛258mg,室温搅拌反应完全后,将滤液旋干,通过层析柱方法得到绿色固体即为目标产物:分子探针F533,结构为3-[(4-异丙苯基)亚丙烯基烯]-7-(戊烷-3-烯丙基苯)-10-邻甲苯基-1,2,3,4-四氢夹氧杂蒽,312mg,产率78%。
上述检测ONOO-的小分子荧光探针的制备方法,具体各工艺为:
在步骤(1)中
2-[(4-二乙胺基)-2羟基苯甲酰]苯甲酸与环己酮的摩尔比为1:2,
反应的时间为2h,
加样顺序为:先加浓硫酸,冰水浴中先搅拌5分钟,然后加入环己酮,0℃搅拌5分钟,最后加2-[(4-二乙胺基)-2羟基苯甲酰]苯甲酸,反应升温至(70-90)℃。
在步骤(2)中,
中间产物9-(2-羧苯基)-6-(二乙氨基)-1,2,3,4-四氢夹氧杂蒽与环己酮与4-(甲基巯基)苯甲醛的摩尔比优选为1:2,,中间产物的摩尔数为1,4-(甲基巯基)苯甲醛的摩尔数为2。
中间产物F376,结构为9-(2-羧苯基)-6-(二乙氨基)-1,2,3,4-四氢夹氧杂蒽HNMR表征如下:
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.27(d,J=7.7Hz,1H),7.75(t,J=7.3Hz,1H),7.66(t,J= 7.6Hz,1H),7.20(d,J=7.4Hz,1H),7.06(dd,J=16.5,9.5Hz,2H),6.85(s,1H),5.27(s,1H), 3.61(d,J=7.0Hz,4H),3.09(s,2H),2.33–2.16(m,2H),1.96(s,2H),1.76(d,J=5.1Hz,2H), 1.30(s,6H).
中间产物F376,结构为9-(2-羧苯基)-6-(二乙氨基)-1,2,3,4-四氢夹氧杂蒽CNMR表征如下:
13C NMR(126MHz,CDCl3)δ170.16(s),166.59(s),165.31(s),159.53(s),155.71(s), 134.30(s),133.30(s),131.84(s),130.36(s),130.27(s),129.17(s),128.43(s),121.94(s), 118.03(s),117.48(s),95.48(s),54.79(s),46.23(s),29.58(s),25.10(s),21.33(s),20.89(s).
目标产物F533,结构为3-[(4-异丙苯基)亚丙烯基烯]-7-(戊烷-3-烯丙基苯)-10-邻甲苯基 -1,2,3,4-四氢夹氧杂蒽表征如下:
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.16(d,J=7.5Hz,1H),7.63(d,J=11.4Hz,1H),7.57(t,J=7.3Hz,1H),7.50(t,J=7.4Hz,1H),7.44(d,J=8.3Hz,2H),7.13(d,J=14.9Hz,1H),7.02(d,J=7.3Hz,1H),6.99–6.93(m,1H),6.79(d,J=9.1Hz,1H),6.71(s,1H),6.67(d,J=8.3Hz,2H),6.61(d,J=9.1Hz,1H),4.61(d,J=6.9Hz,1H),4.60(s,1H),3.49(d,J=6.9Hz,4H), 3.02(s,6H),2.65(s,2H),2.30(s,1H),2.04(d,J=16.2Hz,1H),1.71(d,J=34.9Hz,2H),1.24 (s,6H).
目标产物F533,结构为3-[(4-异丙苯基)亚丙烯基烯]-7-(戊烷-3-烯丙基苯)-10-邻甲苯基 -1,2,3,4-四氢夹氧杂蒽CNMR表征如下:
13C NMR(126MHz,CDCl3)δ169.08,158.19,156.24,152.83,151.30,143.07,136.11, 132.36,132.00,129.66,129.52,129.32,126.51,124.99,124.87,119.84,118.00,113.46,113.13, 112.21,105.01,96.06,53.37,45.28,40.26,25.18,21.16,12.77.
将探针F533进行质谱检测,具体见图2,其中,A是F533的质谱图,B是F533与ONOO-反应的质谱图。图3是探针F533与ONOO-反应后产物的HPLC图。
将探针F533进行核磁共振检测,具体见图4-5,其中,图4是F533的核磁H谱,图5 是F533的核磁C谱。
以下说明对ONOO-响应的上述比率型小分子荧光探针的应用,小分子荧光探针结构及制备方法与实施例1相同,分别将其应用于检测ONOO-的总含量、检测细胞外源性ONOO-浓度或细胞内源性浓度及其荧光成像。
具体的,内源性浓度是通过加LPS+PMA药物诱导,细胞自己生成的ONOO-,外源性是外部添加ONOO-,最终被细胞吸收,荧光成像都是对细胞内的ONOO-成像。
实施例2:
建立实施例1所得分子探针F533对ONOO-的浓度滴定的线性工作曲线,检测步骤包括:
(1)配制pH=7.40,浓度为10mM的PBS缓冲溶液,配制浓度为1mM的ONOO-的H2O标准溶液和浓度为1mM的探针F533的DMSO溶液;
(2)分别取0μL、2.5μL、5μL、7.5μL、10μL、12.5μL、15μL、17.5μL、20μL和22.5μL 浓度为1mM的ONOO-的标准溶液共10份,加入到各荧光比色皿中,分别加入100μL浓度为10mM的PBS缓冲盐溶液,再分别加入100μL浓度为0.05mM的探针F533的DMSO 溶液,最后分别加入生理盐水定容到1mL,混合均匀;
(3)反应30min后,通过荧光分光光度计测试荧光强度,得到荧光强度比值,检测ONOO-荧光强度的激发波长为500nm;
(4)以ONOO-的浓度为横坐标,以荧光强度比值为纵坐标,得到关于探针分子对ONOO-浓度、荧光强度比值的线性方程。
(5)将待测样品与缓冲溶液按体积比1:4混合后,取900mL,并向其中加入100μL 浓度为0.05mM的F533的标准溶液,根据外源性ONOO-浓度、荧光强度比值的线性方程得到ONOO-的浓度。
图6是F533对ONOO-的荧光强度及线性方程图,其中,A是加入0-22.5μM的ONOO-的荧光滴定图,B是对ONOO-滴定的荧光线性方程图。
应用所述的小分子荧光探针时,检测ONOO-效果判断指标如下:
检测速度:立即反应,反应时间为3秒;
颜色变化:日光灯下表现为由紫色变为无;紫外灯下表现由红光变为绿光。
实施例3:
过氧亚硝酸盐是评价水污染的指标之一,在本实施例中,利用小分子荧光探针F533检测水样中ONOO-的含量步骤包括:
(1)将待测水样和F533按体积比1:4混合,取所得液900mL;(2)向其中加入100μL浓度为0.05mM的F533,所得溶液在室温下保存1min并检测其荧光强度;(3)根据实施例 2所得关于探针分子对ONOO-浓度、荧光强度比值的线性方程,以及荧光强度计算得到水样中含有ONOO-的含量。将从图8中得到的荧光强度值带入图6(B)所建立的荧光线性方程,所得数值为1.9mM,即雨水中的ONOO-含量为10.5mM。
其荧光曲线及空白对照组曲线如图8所示。
实施例4:
在本实施例中,利用探针F533检测活细胞外源性ONOO-的浓度步骤包括:
(1)配制浓度为1mM的ONOO-的水的标准溶液、浓度为0.5mM的探针F533的DMSO 标准溶液,浓度为1μg/ml的LPS溶液、浓度为1μg/ml的PMA溶液;
(2)细胞培养:选择RAW细胞,将复苏好的细胞进行培养,培养基包含10wt%牛胚胎血清、1wt%双抗和89wt%DMEM培养基质,在37℃,5%vol CO2的环境中培养24h,得到长势良好的细胞待用;
(3)将RAW细胞的活细胞置入培养基中培育,共分别培养5组,每组培养基中接种量为2×107~9×107个/mL,培育24h,先加入10μL浓度为1mM的探针F533的DMSO溶液,再分别加入0μL、5μL、10μL、15μL和20μL浓度为1mM的ONOO-的标准溶液于37℃共培育30min;
(4)然后将共培育后细胞置于PBS缓冲溶液中,置入共聚焦下观测成像,收集不同颜色光通道的荧光强度,
从而进行荧光强度比值,得到关于细胞外源性ONOO-的浓度与荧光强度比值的线性方程,如图9-10所示。
实施例5:
在本实施例中,利用探针F533检测活细胞内源性ONOO-的浓度步骤优选包括:
(1)选择单核巨噬细胞(简称RAW细胞),将复苏好的细胞进行培养,培养基包含10wt%牛胚胎血清、1wt%双抗和89wt%DMEM培养基质,在37℃,5%vol CO2的环境中培养24h,得到长势良好的细胞待用;
(2)将RAW细胞的活细胞置入培养基中培育,共分别培养4组,每组培养基中接种量为2×107~9×107个/mL,培育24h;
(3)取2组培养基,第一组不加LPS溶液和PMA溶液,只加10μL浓度为1mM的探针F533的DMSO溶液和100uL生理盐水作为对照;
(4)向第二组中加入100μL浓度为1μg/ml的LPS溶液、100μL浓度为1μg/ml的PMA 溶液用来刺激细胞产生内源性的ONOO-,再加入10μL浓度为1mM的F533的DMSO溶液进行培养,
(5)将三组分别置入共聚焦下观测成像,收集不同颜色光通道的荧光强度,从而进行荧光强度比值,图11即为内源性检测ONOO-的相关细胞图,根据细胞内ONOO-的浓度与荧光强度比值的线性方程,通过对照图10的线性方程,从而得到细胞内源性ONOO-的浓度。
探针分子F533的选择性实验
为探究F533对于ONOO-的选择性,本发明选择具有代表性的一些离子,分别为1mM的ONOO-,OH,O2 -,H2O2,HClO,GSH,Cys,Hcy,Tempo,NO3 -,NO2 -,NO和1O2,的水溶液,以及配制浓度为30mM Cu2+,Cu+和Fe3+金属离子的离子溶液予以说明。
从图7能够得知,数倍ONOO-浓度的离子加入到F533中,在紫外灯下,当ONOO-加入能够发现红色荧光消失,绿色荧光出现。
相关图谱如图12所示,A为选择性的荧光滴定光谱,表示金属离子对F533选择性影响具体为在紫外灯下加入干扰性离子溶液的现象,B为选择性的柱状光谱,一些常见阴离子对探针选择性研究具体为相应加入干扰离子溶液在紫外灯下的现象。
细胞存活率实验:
细胞存活率的实验主要验证F533毒性对细胞寿命的影响。细胞培养液中加入不同浓度的探针F533,0M、5M、10M、20M、30M和50M,在37℃,5%CO2的培养箱中培养 24h,接着25μL的4-甲基噻唑基四唑MTT,5mg·mL-1,加入到细胞培养液中培养4个小时。结果通过MTT比色皿法来评估细胞存活率。以不加F533的那组细胞存活为100%,不同浓度F533加入的实验组相关数据绘制相对做柱状图,结果如图13所示。
上述是对本发明优选的实施例的说明,以使本领域技术人员能够实现或使用本发明,对这些实施例的一些修改对本领域专业人员来说是显而易见的,本文中所定义的一般原理能够在不脱离本发明的范围或精神情况下,在其他实施例中实现。因此,本发明范围不受上述具体实施例的限制。
Claims (10)
2.响应ONOO-的比率型小分子荧光探针的制备方法,其特征在于,小分子荧光探针具有如权利要求1所述的结构,制备包括如下步骤:
1)将浓硫酸置入容器,再加入环己酮和2-[4-(二乙氨基)-2-羟基-苯甲酰]苯甲酸,搅拌加热回流,反应结束,待溶液冷却到室温,倒入冰水中,搅拌均匀,然后向混合液体中滴加高氯酸,析出固体,得到中间产物F376,结构为9-(2-羧苯基)-6-(二乙氨基)-1,2,3,4-四氢夹氧杂蒽;
2)将中间产物F376,用无水乙醇溶解,加入4-二甲氨基肉桂醛,室温搅拌反应完全后,将滤液旋干,通过层析柱方法得到目标产物:分子探针F533,结构为3-[(4-异丙苯基)亚丙烯基烯]-7-(戊烷-3-烯丙基苯)-10-邻甲苯基-1,2,3,4-四氢夹氧杂蒽。
3.根据权利要求2所述的响应ONOO-的比率型小分子荧光探针的制备方法,其特征在于:上述检测ONOO-的小分子荧光探针的制备方法,具体各工艺为:
在步骤(1)中
2-[(4-二乙胺基)-2羟基苯甲酰]苯甲酸与环己酮的摩尔比优选为1:2,
反应的时间优选为2h,
加样顺序优选为:先加浓硫酸,冰水浴中先搅拌5分钟,后加入环己酮,继续0℃搅拌5分钟,最后加2-[(4-二乙胺基)-2羟基苯甲酰]苯甲酸,控制反应温度为(70-90)℃;
在步骤(2)中,
中间产物9-(2-羧苯基)-6-(二乙氨基)-1,2,3,4-四氢夹氧杂蒽与1,4-二甲氨基肉桂醛的摩尔比优选为1:2,中间产物的摩尔数为1,4-二甲氨基肉桂醛的摩尔数为2。
4.一种对ONOO-响应的比率型小分子荧光探针的应用,其特征在于:小分子荧光探针具有如权利要求1所述的结构或者通过如权利要求2-3所述的方法制备,应用于检测ONOO-的总含量,检测细胞外源性ONOO-浓度或细胞内源性ONOO-浓度及细胞ONOO-荧光成像。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于:内源性浓度是通过加脂多糖水溶液和佛波酯水溶液药物诱导,细胞自己生成的ONOO-,外源性是外部添加ONOO-,最终被细胞吸收,荧光成像都是对细胞内的ONOO-成像。
6.根据权利要求4所述的应用,其特征在于:建立分子探针F533与ONOO-的线性工作曲线步骤包括:
(1)配制pH=7.40,浓度为10mM的磷酸缓冲盐溶液(简称PBS缓冲溶液),配制浓度为1mM的ONOO-的H2O标准溶液和浓度为1mM的探针F533的DMSO溶液;
(2)准备10组待测液,每组分别将100μL浓度为10mM的PBS缓冲盐溶液和100μL浓度为0.05mM的探针F533的DMSO溶液,加入生理盐水定容到1mL,混合均匀置入容器中;分别取0μL、2.5μL、5μL、7.5μL、10μL、12.5μL、15μL、17.5μL、20μL、22.5μL浓度为1mM的ONOO-的标准溶液共10份,分别加入到各组待测液中;
(3)反应30min后,通过荧光分光光度计测试荧光强度,得到荧光强度比值,更优选检测ONOO-荧光强度的激发波长为500nm;
(4)以ONOO-的浓度为横坐标,以荧光强度比值为纵坐标,得到关于探针分子对ONOO-浓度、荧光强度比值的线性方程。
7.根据权利要求4所述的应用,其特征在于:应用所述的小分子荧光探针,检测ONOO-效果判断指标如下:
检测速度:立即反应,反应时间为0-10秒,更优选3秒以内;
颜色变化:日光灯下表现为由紫色变为无;紫外灯下表现由红光变为绿光。
8.根据权利要求4-7中任一项所述的应用,其特征在于:利用小分子荧光探针F533检测水样中ONOO-的含量步骤包括:
(1)将待测水样和F533按体积比1:4混合,取所得液900mL;(2)向其中加入100μL浓度为0.05mM的F533,所得溶液在室温下保存1min并检测其荧光强度;(3)根据关于探针分子对ONOO-浓度、荧光强度比值的线性方程,以及荧光强度计算得到水样中含有ONOO-的含量。
9.根据权利要求4-7中任一项所述的应用,其特征在于:利用小分子荧光探针F533检测活细胞外源性ONOO-的浓度步骤包括:
(1)配制浓度为1mM的ONOO-的水的标准溶液、浓度为1mM的探针F533的DMSO标准溶液,浓度为1μg/ml的脂多糖水溶液(简称LPS溶液)、浓度为1μg/ml的佛波酯水溶液(简称PMA溶液)。
(2)细胞培养:选择单核巨噬细胞(简称RAW细胞),将复苏好的细胞进行培养,培养基包含10wt%牛胚胎血清、1wt%双抗和89wt%DMEM培养基质,在37℃,5%vol CO2的环境中培养24h,得到长势良好的细胞待用;
(3)将RAW细胞的活细胞置入培养基中培育,共分别培养5组,每组培养基中接种量为2×107~9×107个/mL,先分别加入0μL、5μL、10μL、15μL和20μL浓度为1mM的ONOO-的标准溶液,再加入10μL浓度为1mM的探针F533的DMSO溶液于37℃共培育30min;
(4)然后将共培育后细胞置于PBS缓冲溶液中,置入共聚焦下观测成像,收集不同颜色光通道的荧光强度,从而进行荧光强度比值,得到关于细胞外源性ONOO-的浓度与荧光强度比值的线性方程。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于:利用探针F533检测活细胞内源性ONOO-的浓度步骤优选包括:
(1)选择单核巨噬细胞(简称RAW细胞),将复苏好的细胞进行培养,培养基包含10wt%牛胚胎血清、1wt%双抗和89wt%DMEM培养基质,在37℃,5%vol CO2的环境中培养24h,得到长势良好的细胞待用;
(2)将RAW细胞的活细胞置入培养基中培育,共分别培养4组,每组培养基中接种量为2×107~9×107个/mL,培育24h;
(3)取2组培养基,第一组不加LPS溶液和PMA溶液,只加10μL浓度为1mM的探针F533的DMSO溶液和100uL生理盐水作为对照;
(4)向第二组中加入100μL浓度为1μg/ml的LPS溶液、100μL浓度为1μg/ml的PMA溶液用来刺激细胞产生内源性的ONOO-,再加入10μL浓度为1mM的探针F533的DMSO溶液进行培养;
(5)将两组分别置入共聚焦下观测成像,收集不同颜色光通道的荧光强度,从而进行荧光强度比值,根据细胞内ONOO-的浓度与荧光强度比值的线性方程,从而得到细胞内源性ONOO-的浓度。
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