CN113355086A - 一种用于onoo-检测的比率型时间分辨荧光探针及其制备方法、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于探针技术领域，具体涉及一种用于ONOO‑检测的比率型时间分辨荧光探针及其制备方法、应用。该比率型时间分辨荧光探针通过能量供体Eu3+配合物负载的介孔二氧化硅纳米材料偶联能量受体有机荧光染料。本发明制备纳米探针能够有效的消除复杂样品中背景荧光信号的干扰，从而可以提高检测的灵敏度及准确度；本发明制备方法简便且具有较好的普适性。传统的小分子时间分辨荧光探针合成步骤冗长复杂，不利于该类荧光探针的制备与应用。本发明制备方法简单易操作；可以选择具有不同检测功能的有机荧光染料作为能量受体，制备出系列用于目标组分检测的比率型时间分辨荧光纳米探针。
Description
技术领域
本发明属于探针技术领域，具体涉及一种用于ONOO-检测的比率型时间分辨荧光探针及其制备方法、应用。
背景技术
过氧化亚硝基（ONOO-）作为常见的活性氧物种之一，其是一氧化氮与超氧阴离子或过氧化氢与亚硝酸根反应结合生成的产物。研究表明，ONOO-在信号传导、免疫应答等生理活动中发挥着重要作用。然而，当体内ONOO-含量异常时，往往与许多疾病有关，如炎症、老年痴呆症等（Nat. Chem. Biol. 2008, 4, 278-286；Nat. Commun. 2019, 10, 1087）。因此，建立用于ONOO-的高灵敏度检测方法至关重要。基于荧光探针建立的传感分析技术具有选择性好、灵敏度高、操作简便等优点，在目标组分的检测中有着广泛的应用。目前已经报道了多种用于ONOO-检测的荧光探针，然而这些探针大部分是基于有机荧光染料为发光基团开发的，且其用于ONOO-检测时一般是以单一波长处荧光强度的变化作为检测信号，这类探针在复杂样品ONOO-的分析中往往易受激发光强度、探针浓度、本底背景荧光信号等因素的影响，降低了测定的灵敏度和准确度，因此限制了这些探针的应用。因此，研制能够用于ONOO-检测的比率型时间分辨荧光探针具有重要的应用价值，然而目前该类探针的报道依然很少。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种用于ONOO-检测的比率型时间分辨荧光探针，该探针能够用于ONOO-的时间分辨荧光检测，消除复杂样品中的本底荧光信号，从而提高检测的灵敏度。
本发明还提供了一种上述比率型时间分辨荧光探针的制备方法。
本发明还提供了上述比率型时间分辨荧光探针的应用。
本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：
本发明提供了一种用于ONOO-检测的比率型时间分辨荧光探针，所述荧光探针通过能量供体Eu3+配合物负载的介孔二氧化硅纳米材料偶联能量受体有机荧光染料。
进一步的，所述有机荧光染料为Cy染料。
本发明还提供了一种比率型时间分辨荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
（1）称取PTTA于离心管中，然后加入无水二甲基亚砜（DMSO），搅拌溶解后，加入二环己基碳二亚胺（DCC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），搅拌反应后得到反应液A；
（2）取3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）加入到反应液A中，震荡反应，然后加入六水合氯化铕（EuCl6·H2O）固体，继续反应后，得到反应液B；
（3）向盛有蒸馏水烧瓶中加入三乙胺（TEA），然后加入十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），搅拌得反应液C；
（4）将反应液C加热回流，然后加入正硅酸乙酯（TEOS）和三氯甲烷，搅拌后加入反应液A，回流反应，反应完成后冷却至室温，离心分离，固体用无水乙醇洗涤后得到Eu3+配合物-介孔二氧化硅纳米材料；
（5）将Eu3+配合物-介孔二氧化硅纳米材料分散于无水二甲基亚砜DMSO中，然后加入有机荧光染料，室温下搅拌，反应完成后，离心，固体用蒸馏水洗涤两次后分散在蒸馏水中，4℃保存备用。
进一步的，步骤（1）中，所述PTTA和二甲基亚砜的比例为7.2mg：3-5mL；所述PTTA和二环己基碳二亚胺的质量比为7.2：20-30；所述二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为2-3：6-10；所述反应为在室温下搅拌反应3-5h。
进一步的，步骤（2）中，所述3-氨丙基三乙氧基硅烷和反应液中PTTA的比例为15 –30 μL：7.2mg；所述六水合氯化铕和PTTA的质量比为15.8：7.2；所述震荡反应为室温下反应3 – 5h；所述继续反应的时间为1h。
进一步的，步骤（3）中，所述蒸馏水和三乙胺的体积比为30 – 50：0.1 – 0.3；所述十六烷基三甲基溴化铵和蒸馏水的比例为100 – 400 mg：30 – 50。
进一步的，步骤（4）中，所述三乙胺和正硅酸乙酯的体积比为0.1 – 0.3：1-2；所述正硅酸乙酯和三氯甲烷的体积比为1-2：2-3；所述三乙胺和反应液A的体积比为0.1-0.3：0.2-0.5：所述加热回流的时间为1h；所述回流反应的时间为2h。
进一步的，步骤（5）中，所述Eu3+配合物-介孔二氧化硅纳米材料在无水二甲基亚砜中的浓度为1-2mg/mL；所述无水二甲基亚砜和正硅酸乙酯的体积比为2：1-2；所述有机荧光染料在二甲基亚砜中的浓度为1.5-4mg/mL；所述搅拌的时间为40-50h。
本发明还提供了一种上述制备方法制备的比率型时间分辨荧光探针在检测ONOO-中的应用。
本发明制备的探针解决现有荧光探针在复杂样品分析时易受背景荧光干扰问题。研制的探针能够用于ONOO-的时间分辨荧光检测，因此在ONOO-的检测时能够消除复杂样品中的本底荧光信号，从而提高检测的灵敏度。本发明制备的荧光探针与ONOO-反应，引起Eu3+配合物与Cy染料间的FRET效率改变，使得探针在660 nm和615 nm处的荧光强度发生改变，因此本发明以两处荧光强度的比值作为检测信号，从而提高检测的准确度。本发明提供了一种新型的比率型时间分辨荧光探针制备方法，通过更换探针中能量供体染料与能量受体染料，可以制备系列用于其他目标组分检测的比率型时间荧光分辨探针，为相关组分的检测提供一种高灵敏度、高准确度的分析方法。
本发明的有益效果为：
1. 本发明制备纳米探针兼具了时间分辨荧光和比率荧光检测功能，在复杂样品中ONOO-的检测时具有显著的优势。一方面利用时间分辨荧光检测模式，能够有效的消除复杂样品中背景荧光信号的干扰，从而可以提高检测的灵敏度；另一方面，比率荧光检测技术能够有效的消除由于探针浓度、激发光强度等因素变化的影响，因此可以避免不同测试人员、不同测试仪器等对测定结果的影响，从而提高检测的准确度。
2. 本发明制备的比率型时间分辨荧光纳米探针制备方法简便且具有较好的普适性。传统的小分子时间分辨荧光探针合成步骤冗长复杂，不利于该类荧光探针的制备与应用。本发明制备方法简单易操作，可以选择具有不同检测功能的有机荧光染料作为能量受体，制备出系列用于目标组分检测的比率型时间分辨荧光纳米探针。
附图说明
图1为PTTA 和Cy5染料的结构式图；
其中，A为PTTA结构式；B为Cy5染料结构式。
图2为实施例1制备的荧光探针的透射电镜图。
图3为本发明制备的荧光探针与ONOO-反应的发射光谱。
图4为本发明制备的荧光探针用于ONOO-检测的工作曲线。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的解释和说明。如无特别说明，本发明所使用的原料及试剂均为市售。
本发明所使用的原料PTTA按照文献（J. Lumin. 1997, 75, 149–169）进行制备而成。
实施例1：
称取7.2 mg的PTTA（结构如图1A）于离心管中，然后加入3 mL的无水DMSO，搅拌溶解后，加入20 mg二环己基碳二亚胺（DCC）和70 mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），室温下搅拌反应3小时后得到反应液A。
取20 μL的3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）加入到反应液A中，室温下震荡反应3小时，然后加入15.8 mg六水合氯化铕（EuCl6·H2O）固体，继续反应1小时后，得到反应液B。
向盛有蒸馏水（35 mL）的烧瓶中加入0.1 mL的三乙胺（TEA），然后加入200 mg十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），搅拌半小时后得反应液C。
将反应液C加热回流1小时，然后加入1 mL正硅酸乙酯（TEOS）和3 mL三氯甲烷，搅拌10分钟后加入反应液A（300 μL），回流反应2小时。反应完成后冷却至室温，离心分离，固体用无水乙醇洗涤后得到Eu3+配合物-介孔二氧化硅纳米材料。
将Eu3+配合物-介孔二氧化硅纳米材料分散于DMSO（2 mL）中，然后加入3 mg Cy5染料（结构见图1B），室温下搅拌40小时。反应完成后，离心，固体用蒸馏水洗涤两次后分散在蒸馏水中，4 °C保存备用。
实施例2
称取7.2 mg的PTTA（结构如图1A）于离心管中，然后加入5 mL的无水DMSO，搅拌溶解后，加入30 mg二环己基碳二亚胺（DCC）和80 mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），室温下搅拌反应5小时后得到反应液A。
取25 μL的3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）加入到反应液A中，室温下震荡反应5小时，然后加入15.8 mg六水合氯化铕（EuCl6·H2O）固体，继续反应1小时后，得到反应液B。
向盛有蒸馏水（50 mL）的烧瓶中加入0.2 mL的三乙胺（TEA），然后加入300 mg十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），搅拌半小时后得反应液C。
将反应液C加热回流1小时，然后加入1.5 mL正硅酸乙酯（TEOS）和3 mL三氯甲烷，搅拌10分钟后加入反应液A（400 μL），回流反应2小时。反应完成后冷却至室温，离心分离，固体用无水乙醇洗涤后得到Eu3+配合物-介孔二氧化硅纳米材料。
将Eu3+配合物-介孔二氧化硅纳米材料分散于DMSO（2 mL）中，然后加入6 mg Cy5染料（结构见图1B），室温下搅拌50小时。反应完成后，离心，固体用蒸馏水洗涤两次后分散在蒸馏水中，4 °C保存备用。
由图2可以看出，本发明制备的纳米探针呈现规则的球形，粒径约40 nm，在探针的表面能够清晰的看到材料自身的孔状结构，这有利于其对能量供体染料的吸附。此外，该纳米探针在水溶液中呈现良好的分散性和稳定性，因此能够用于比率时间分辨荧光分析。
效果实施例
（一）探针与不同浓度的ONOO-反应的荧光性质实验：向探针溶液里加入不同浓度的ONOO-，反应一定时间后，利用荧光光谱仪测定溶液的时间分辨荧光发射光谱。如图3所示，当用330 nm荧光激发时，随着ONOO-浓度的增加，探针在615 nm处的时间分辨荧光强度逐渐上升，在660 nm处的荧光强度逐渐下降，这是加入ONOO-后使得纳米探针中的能量供体Cy5被氧化，导致其结构破坏，因此能量供体Eu3+配合物与能量受体Cy5间的能量传递过程被抑制，从而在两个不同波长处表现出了不同的变化趋势，因此该探针可以用于ONOO-浓度的时间分辨荧光检测。
在上述结果的基础上，再次对探针与ONOO-反应后不同波长处的时间分辨荧光强度的比值（I660/I615）与ONOO-浓度的变化关系进行了考察。由图4可以看出，在0 – 600 μmol/L范围内，探针的荧光强度的比值呈现良好的线性，因此能够用于ONOO-的比率时间分辨荧光定量测定。
Claims (9)
1.一种用于ONOO-检测的比率型时间分辨荧光探针，其特征在于，所述荧光探针通过能量供体Eu3+配合物负载的介孔二氧化硅纳米材料偶联能量受体有机荧光染料。
2.根据权利要求1所述的比率型时间分辨荧光探针，其特征在于，所述有机荧光染料为Cy染料。
3.一种如权利要求1或2所述的比率型时间分辨荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）称取PTTA于离心管中，然后加入无水二甲基亚砜（DMSO），搅拌溶解后，加入二环己基碳二亚胺（DCC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），搅拌反应后得到反应液A；
（2）取3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）加入到反应液A中，震荡反应，然后加入六水合氯化铕（EuCl6·H2O）固体，继续反应后，得到反应液B；
（3）向盛有蒸馏水烧瓶中加入三乙胺（TEA），然后加入十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），搅拌得反应液C；
（4）将反应液C加热回流，然后加入正硅酸乙酯（TEOS）和三氯甲烷，搅拌后加入反应液A，回流反应，反应完成后冷却至室温，离心分离，固体用无水乙醇洗涤后得到Eu3+配合物-介孔二氧化硅纳米材料；
（5）将Eu3+配合物-介孔二氧化硅纳米材料分散于无水二甲基亚砜DMSO中，然后加入有机荧光染料，室温下搅拌，反应完成后，离心，固体用蒸馏水洗涤两次后分散在蒸馏水中，4°C保存备用。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述PTTA和二甲基亚砜的比例为7.2mg：3-5mL；所述PTTA和二环己基碳二亚胺的质量比为7.2：20-30；所述二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为2-3：6-10；所述反应为在室温下搅拌反应3-5h。
5. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述3-氨丙基三乙氧基硅烷和反应液中PTTA的比例为15 – 30 μL：7.2mg；所述六水合氯化铕和PTTA的质量比为15.8：7.2；所述震荡反应为室温下反应3 – 5h；所述继续反应的时间为1h。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述蒸馏水和三乙胺的体积比为30 – 50：0.1 – 0.3；所述十六烷基三甲基溴化铵和蒸馏水的比例为100 – 400 mg：30 – 50。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，所述三乙胺和正硅酸乙酯的体积比为0.1 – 0.3：1-2；所述正硅酸乙酯和三氯甲烷的体积比为1-2：2-3；所述三乙胺和反应液A的体积比为0.1-0.3：0.2-0.5：所述加热回流的时间为1h；所述回流反应的时间为2h。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（5）中，所述Eu3+配合物-介孔二氧化硅纳米材料在无水二甲基亚砜中的浓度为1-2mg/mL；所述无水二甲基亚砜和正硅酸乙酯的体积比为2：1-2；所述有机荧光染料在二甲基亚砜中的浓度为1.5-4mg/mL；所述搅拌的时间为40-50h。
9.一种如权利要求2-8任一项所述制备方法制备的比率型时间分辨荧光探针在检测ONOO-中的应用。
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