CN110330482A - 配位体及制备方法、荧光探针及制备方法和应用 - Google Patents

配位体及制备方法、荧光探针及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种配位体的制备方法、荧光探针及制备方法和应用。配位体为DATP，由化合物1、NaN3、四丁基硫酸氢铵、二(2‑吡啶甲基)胺、炔丙基溴、CuI、CH2Cl2和CF3COOH的混合溶剂为原料反应得到。荧光探针以DATP和Ni2+为核心，Eu3+和Ni2+通过Ni‑N配位键与配位体连接，Tb3通过Tb‑O和Tb‑N配位键与配位体连接。本发明的荧光探针以DATP为核心制备荧光探针，其Eu3+/Tb3+配合物用于时间分辨荧光检测，可有效消除来自样品和散射光等短寿命荧光的干扰，使制备得到的荧光探针具有很好的水溶性，极高的灵敏度，对组氨酸有很好的选择性，制备方法简单、条件温和，适用于生物体系中组氨酸的测定。

Description

配位体及制备方法、荧光探针及制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种生物技术领域，具体涉及一种配位体及制备方法、荧光探针及制备方法和应用。
背景技术
作为许多蛋白质中必需的氨基酸组分，组氨酸(His)由于其重要的生物学功能而近年来备受关注。最近的研究表明，组氨酸含量的异常通常与各种疾病有关。例如，组氨酸缺乏可能导致类风湿性关节炎，神经性耳聋，肝硬化和肺部疾病。另一方面，血清和尿液中高含量的L-组氨酸可能导致代谢紊乱或组氨酸血症。由于组氨酸具有如此重要的生理作用，准确的检测和量化组氨酸成为生物化学领域和临床应用中的一个重要任务。
目前，用于检测组氨酸的方法主要有毛细管电泳法(Zhou,L.,Yan,N.,Zhang,H.,Zhou,X.,Pu,Q.,Hu,Z.Talanta,2010,82,72-77；Zhang,L.Y.,Sun,M.X.J.Chromatogr.A.,2004,1040,133-140)、液相色谱法(Tateda,N.,Matsuhisa,K.,Hasebe,K.,MIURA,T.Ana.Sci.,2001,17,775-778)、伏安分析法(Shahlaei,M.,Gholivand,M.B.,Pourhossein,A.Electroanalysis,2009,21,2499-2502)、分光光度法(Fabbrizzi,L.,Pallavicini,P.,Parodi,L.,Perotti,A.,Taglietti,A.J.Chem.Soc.,Chem.Commun.,1995,2439)、质谱法(Furuta,T.,Katayama,M.,Shibasaki,H.,Kasuya,Y.J.Chromatogr.BBiomed.Sci.Appl.,1992,576,213-219)及共振光散射测定法(Chen,Z.,Liu,J.,Han,Y.,Zhu,L.2006,Anal.Chim.Acta.,570,109-115)等。然而这些方法需要破坏细胞或者组织结构，检测过程比较耗时，使得它们不适用于活细胞和组织内组氨酸的检测。荧光探针结合适当成像仪器的发光成像技术是一种高灵敏度和高空间分辨率的非破坏性检测目标生物分子的有用工具，目前检测组氨酸的荧光探针常采用将荧光团与金属离子形成配合物的方法来设计，其中，以铜(II)为淬灭剂的荧光团-铜(II)配合物策略是组氨酸探针设计的主要思路(You,Q.H.,Lee,A.W.M.,Chan,W.H.,Zhu,X.M.,Leung,K.C.F.Chem.Commun.,2014,50,6207-6210)；(Pu,F.,Huang,Z.,Ren,J.,Qu,X.Anal.Chem.,2010,82,8211-8216)；(Wang,B.,Gao,Y.,Li,H.W.,Hu,Z.P.,Wu,Y.Org.Biomol.Chem.,2011,9,4032-4034)；(Qiu,S.,Miao,M.,Wang,T.,Lin,Z.,Guo,L.,Qiu,B.,Chen,G.Biosens.Bioelectron.,2013,42,332-336.)。然而，这些探针由于易受到生物硫醇如半胱氨酸(Cys，大约100M)、还原型的谷胱甘肽(GSH，1-10mM)以及含巯基蛋白质的明显干扰，限制了其在细胞内组氨酸成像检测方面的应用。Yuan等人报道了一种以镍(II)为淬灭剂的荧光团-镍(II)配合物用于组氨酸的荧光检测(Gao,Q.,Song,B.,Ye,Z.,Yang,L.,Liu,R.,Yuan,J.Dalton.Trans.,2015,44,18671-18676)，由于镍(II)离子与组氨酸具有很高的亲和力，可以免受生物硫醇以及含巯基蛋白质的干扰，从而使得以镍(II)为淬灭剂的荧光团-镍(II)配合物可以用于高灵敏、高选择性地检测组氨酸。
上述各种测定方法虽然已经在组氨酸的测定中得到了很好的应用，但由于这些非比率型探针受到来自生物本底的自发荧光、散射光以及激发光强度、探针浓度和样品环境的影响，使得这些探针在用于体内外检测组氨酸过程中具有较低的信噪比和准确度。
基于上述问题，需要寻求一种新型荧光探针用于组氨酸检测的比率型时间分辨荧光分子探针，实现水溶液、细胞、大型蚤以及斑马鱼中组氨酸的测定。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种配位体及其制备方法，荧光探针及其制备方法和应用，荧光探针Ni2+-DATP-Eu3+/Tb3+，具有很好的水溶性，极高的组氨酸测定灵敏度，对组氨酸有很好的选择性，与其他的干扰活性物种作用荧光信号几乎无变化，其制备方法简单、反应条件温和，适用于生物体系中组氨酸的测定。
为了实现上述目的，本发明提供了一种配位体，所述配位体为DATP；所述DATP具有以下式I的结构式：
基于一个总的技术构思，本发明还提供了一种所述的配位体的制备方法，包括以下步骤：
S1、将化合物1、NaN3和四丁基硫酸氢铵在惰性气氛下反应得到化合物2；
S2、将二(2-吡啶甲基)胺、炔丙基溴反应得到中间产物；将所述中间产物与所述化合物2和CuI在惰性气氛下反应得到化合物3；
S3、将所述化合物3在含有CH2Cl2和CF3COOH的混合溶剂中反应得到DATP；
所述化合物1具有以下式III的结构式：
所述化合物2具有以下式IV的结构式：
所述化合物3具有以下式V的结构式：
上述的制备方法，进一步的，所述S1中，所述化合物1、NaN3和四丁基硫酸氢铵的摩尔质量比为2︰20～30︰1～1.5。
上述的制备方法，进一步的，所述S2中，所述二(2-吡啶甲基)胺、炔丙基溴的摩尔质量比为1︰1.1～1.5；所述中间产物、化合物2和CuI的摩尔质量比为1︰1︰0.4～0.6。
上述的制备方法，进一步的，所述S3中，所述含有CH2Cl2和CF3COOH的混合溶剂中，CH2Cl2与CF3COOH的体积比为0.9～1.1︰0.9～1.1。
上述的制备方法，进一步的，所述S1具体为：将DMF、化合物1、NaN3和四丁基硫酸氢铵在氩气保护下，于100～125℃反应24～36h得到化合物2。
上述的制备方法，进一步的，所述S2具体为：
S2-1、将二(2-吡啶甲基)胺、炔丙基溴和K2CO3溶于无水DMF中，在20～35℃下搅拌12～24h得到中间产物；
S2-2、将所述中间产物、CuI和化合物2加入到无水乙腈溶液中，氩气保护下在20～35℃下搅拌2～3h，再回流12h～24h得到化合物3。
上述的制备方法，进一步的，所述S3具体为：将化合物3溶于CH2Cl2-CF3COOH的混合溶剂中，在20～35℃搅拌反应10～24h，得到DATP。
基于一个总的技构思，本发明还提供了一种荧光探针，所述荧光探针以上述配位体和Ni2+为核心，Eu3+和Ni2+通过Ni-N配位键与配位体连接，Tb3通过Tb-O和Tb-N配位键与配位体连接；所述荧光探针具有以下式II的结构式：
基于一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述荧光探针的制备方法，所述制备方法为：将DATP、EuCl3﹒6H2O和TbCl3﹒6H2O于PBS缓冲溶液中混匀，加入Ni2+得到Ni2+-DATP-Eu3+/Tb3+，即为荧光探针。
上述的制备方法，进一步的，Ni2+︰DATP︰Eu3+︰Tb3+的摩尔浓度比为3︰3︰1︰2。
基于一个总的技术构思，本发明还提供了一种所述荧光探针在组氨酸测定中的应用。
上述的应用，进一步的，所述应用的具体过程为：将所述Ni2+-DATP-Eu3+/Tb3+在PBS缓冲溶液中与组氨酸反应，通过测定I610/I540的比值测定组氨酸的含量。
上述的应用，进一步的，所述PBS缓冲溶液的pH为6～8。
上述的应用，进一步的，所述PBS缓冲溶液的浓度为8～20mmol/L。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供了一种配位体DATP，以DATP为核心制备荧光探针，其Eu3+/Tb3+配合物用于时间分辨荧光检测，可有效消除来自样品和散射光等短寿命荧光的干扰，从而使得荧光检测的信噪比与灵敏度显著提高。其Eu3+/Tb3+配合物可实现比率型荧光检测，能够消除激发光强度、样品浓度及样品环境等因素对测定的干扰，有效提高荧光检测的准确度和精密度。
(2)本发明提供了一种荧光探针Ni2+-DATP-Eu3+/Tb3+，具有很好的水溶性，极高的组氨酸测定灵敏度，其最低检测下限为0.12μmol/L，对组氨酸有很好的选择性，与其他的干扰活性物种作用荧光信号几乎无变化，适用于生物体系中组氨酸的测定。
(3)本发明提供了一种配位体和荧光探针的制备方法，制备方法简单、条件温和。
(4)本发明提供了一种荧光探针在组氨酸测定中的应用，荧光探针Ni2+-DATP-Eu3 +/Tb3+与组氨酸反应后Eu3+在610nm处荧光增强15倍，但Tb3+在540nm处荧光强度基本不变，而且产物的荧光寿命达到0.94ms，可用于数百微秒级的时间分辨比率型荧光测定，可以避免来自生物本底的自发荧光、散射光以及激发光强度、探针浓度和样品环境的影响，使得这些探针在用于体内外检测组氨酸过程中具有较高的灵敏度和准确度。同时，可用于活体中组氨酸的时间分辨荧光成像测定，比如大型蚤以及斑马鱼。
(5)本发明提供了一种荧光探针在组氨酸测定中的应用，探针DATP-Eu3+/Tb3+与溴甲基乙酸酯反应生成的AM-DATP-Eu3+/Tb3+更容易地进入活细胞，从而用于活细胞中外源性组氨酸的时间分辨荧光成像测定。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1中配位体DATP合成路线。
图2是本发明实施例1中化合物2的合成路线。
图3是本发明实施例2中探针Ni2+-DATP-Eu3+/Tb3+与组氨酸反应示意图。
图4是本发明实施例2中探针Ni2+-DATP-Eu3+/Tb3+(Ni2+/DATP/Eu3+/Tb3+＝3/3/1/2,Ctotal＝10μM)在pH＝7.4的10mmol/L PBS缓冲溶液中与不同浓度组氨酸反应后其产物荧光光谱的变化情况。
图5是本发明实施例2中使用探针Ni2+-DATP-Eu3+/Tb3+检测组氨酸的工作曲线。
图6是本发明实施例2中不同pH值对探针Ni2+-DATP-Eu3+/Tb3+(■)以及探针与组氨酸反应产物DATP-Eu3+/Tb3+(●)溶液荧光强度比值(I610/I540)的影响。
图7是本发明实施例2中未加组氨酸(空白柱)与组氨酸存在(带网格柱)条件下，在pH＝7.4的10mmol/L PBS缓冲溶液中Ni2+-DATP-Eu3+/Tb3+(Ni2+/DATP/Eu3+/Tb3+＝3/3/1/2,Ctotal＝10μM)与不同反应活性物种反应后荧光强度的比值(I610/I540)。
图8是本发明实施例3中，探针Ni2+-DATP-Eu3+/Tb3+用于Hela细胞中组氨酸的比率型时间分辨荧光成像测定结果。
图9是本发明实施例4中，探针Ni2+-DATP-Eu3+/Tb3+用于大型蚤体内组氨酸的比率型时间分辨荧光成像测定结果。
图10是本发明实施例5中，探针Ni2+-DATP-Eu3+/Tb3+用于斑马鱼体内组氨酸的比率型时间分辨荧光成像测定结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。
本发明涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100ml溶液中含有溶质的克数。
本发明所述重量份可以是μg、mg、g、kg等本领域公知的重量单位，也可以是其倍数，如1/10、1/100、10倍、100倍等。
实施例1
一种本发明的配位体：2,2'，2”，2”'-(((4'-(4-((双(吡啶-2-基甲基)氨基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-[2,2'：6'，2”-三联吡啶]-6,6'-二基)双(亚甲基))双(氮烷三基))四乙酸(简称DATP)；DATP具有以下式I的结构式：
一种本实施例的配位体的合成方法，合成路线如图3所示，具体过程如下：
(1)4’-叠氮基-2,2’:6’,2”-联三吡啶-6,6”-二甲胺四乙酸叔丁酯(化合物2)的合成，其合成路线如图2所示：
1.1、在100mL圆底烧瓶中，依次加入20mL DMF，825mg化合物1(1.0mmol)，650mgNaN3(10mmol)，67.8mg四丁基硫酸氢铵(0.5mmol)，在氩气保护下，于105℃反应24个小时得到反应产物1。
1.2、在步骤1.1的反应产物1中加入少量水，用甲基叔丁基醚萃取(3×40mL)，无水硫酸钠干燥，过滤，蒸干溶剂得到粗产品。
1.3、将步骤1.2的粗产品干燥以后用乙酸乙酯和石油醚(1︰20,v/v)作洗脱剂在中性氧化铝柱层析分离，收集主产物，真空干燥后得570mg淡黄色固体为目标产物，产率为72.4％。
将淡黄色固体的目标化合物进行核磁共振：
1H NMR(CDCl3,400MHz):δ＝8.48(d,J＝8.0Hz,2H),8.16(s,2H),7.84(t,J＝8.0Hz,2H),7.71(d,J＝8.0Hz,2H),4.14(s,4H),3.54(s,8H),1.48(s,36H)；ESI-MS(m/z):811.4[M+Na]+。
从核磁共振的结果可知，目标产物为化合物2：4’-叠氮基-2,2’:6’,2”-联三吡啶-6,6”-二甲胺四乙酸叔丁酯。
(2)4’-{4-[N,N-二(2-吡啶甲基)]亚甲基-1H-1,2,3-三氮唑基}-2,2’:6’,2”-联三吡啶-6,6”-二甲胺四乙酸叔丁酯(化合物3)的合成：
2.1、将100mg(0.50mmol)二(2-吡啶甲基)胺、72mg炔丙基溴(0.61mmol)和150.8mg(1.09mmol)K2CO3溶于5mL无水DMF中，在室温下搅拌12小时得到反应产物2。
2.2、在步骤2.1的反应产物2中加入10mL水，用3×20mL乙酸乙酯萃取，用无水Na2SO4干燥得到粗产品。
2.3、将步骤2.2的粗产品干燥以后用乙酸乙酯和石油醚(1︰2,v/v)作洗脱剂在硅胶柱层析分离，收集主产物，真空干燥后得97.2mg棕色油状物为中间产物，产率为82.0％。
将中间产物进行核磁共振：
1H NMR(CDCl3,400MHz):δ＝8.56(s,2H),7.68-7.63(m,2H),7.51(d,J＝8.0Hz,2H),7.17-7.14(m,2H),3.93(s,4H),3.41(s,2H),2.31(s,1H)；ESI-MS(m/z):238.1[M+H]+。
从核磁共振的结果可知：中间产物为N-炔丙基-二(2-吡啶甲基)胺，结构式为：
2.4、将149mg(0.63mmol)中间产物、50.0mg CuI(0.26mmol)和500mg(0.63mmol)化合物2加入到20mL无水乙腈溶液中，氩气保护下在室温下搅拌2h，再回流12h得到反应产物2。
2.5、将步骤2.4中得到的反应产物2冷却至室温，然后加入25mL 10wt％EDTA水溶液。在室温下搅拌1h，过滤溶液得到反应产物3。
2.6、将步骤2.5中得到的反应产物3用3×20mL乙酸乙酯萃取，用无水Na2SO4干燥有机相。使用乙酸乙酯作为洗脱液，通过中性氧化铝柱色谱法纯化粗产物。粗产物真空干燥后得300mg黄色固体为目标化合物，产率为46.5％。
将步骤2.6中黄色固体的目标化合物进行核磁共振：
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ＝8.91(s,1H),8.59-8.51(m,6H),7.88(t,J＝8.0Hz,2H),7.76(d,J＝8.0Hz,2H),7.72-7.64(m,4H),7.19-7.17(m,2H),4.18(s,4H),4.04(s,2H),3.97(s,4H),3.55(s,8H),1.46(s,36H)；ESI-MS(m/z):1026.4[M+H]+,1048.5[M+Na]+。
从核磁共振的结果可知：黄色固体为化合物3：4’-{4-[N,N-二(2-吡啶甲基)]亚甲基-1H-1,2,3-三氮唑基}-2,2’:6’,2”-联三吡啶-6,6”-二甲胺四乙酸叔丁酯。
(3)4’-{4-[N,N-二(2-吡啶甲基)]亚甲基-1H-1,2,3-三氮唑基}-2,2’:6’,2”-联三吡啶-6,6”-二甲胺四乙酸(DATP)的合成：
3.1、在100mL圆底烧瓶中，将300mg(0.29mmol)化合物3溶于60mL CH2Cl2-CF3COOH的混合溶剂(混合溶剂中CH2Cl2与CF3COOH的体积比为1︰1)中，室温搅拌反应12h，然后蒸干溶剂得到粗产品。
3.2、将步骤3.1的粗产物溶于5mL的甲醇中，搅拌中慢慢加入50mL乙醚，得到黄色沉淀。
3.3、将步骤3.2的黄色沉淀溶于10mL干燥的乙腈中，回流20分钟。离心收集沉淀，将沉淀真空干燥后得100mg黄色固体，即为目标产物，产率为43.1％。
将黄色固体进行核磁共振：
1H NMR(500MHz,DMSO-d6):δ＝9.18(s,1H),8.86(s,2H),8.66(d,J＝4.5Hz,2H),8.60(d,J＝8.0Hz,2H),8.08(t,J＝8.0Hz,2H),7.96(t,J＝8.0Hz,2H),7.74(d,J＝8.0Hz,2H),7.70(d,J＝8.0Hz,2H),7.46(m,2H),4.28(s,2H),4.25(s,4H),4.21(s,4H),,3.64(s,8H)；
13C NMR(125MHz,DMSO-d6):δ＝171.92,158.21,157.13,154.88,153.18,147.38,144.90,142.31,139.04,138.28,124.36,124.14,123.92,123.59,119.79,110.33,59.23,57.23,54.48,48.44；ESI-MS(m/z):800.4[M-H]-,400.1[M-2H]2-。
从核磁共振的结果可知，黄色固体为DATP。
实施例2
一种本发明的荧光探针：Ni2+-DATP-Eu3+/Tb3+，其具有以下式II的结构式：
本实施例的Ni2+-DATP-Eu3+/Tb3+采用以下方法制备得到：
将DATP(6.0μmol)、EuCl3﹒6H2O(2.0μmol)和TbCl3﹒6H2O(4.0μmol)溶于6.0mL的10mM的PBS缓冲溶液中剧烈搅拌0.5h后，然后加入Ni2+(6.0μmol)搅拌0.5h后制得探针Ni2+-DATP-Eu3+/Tb3+。Ni2+︰DATP︰Eu3+︰Tb3+＝3︰3︰1︰2。
将荧光探针Ni2+-DATP-Eu3+/Tb3+进行荧光性质的测定：
(1)荧光光谱
在pH值7.4的10mmol/L PBS缓冲溶液中加入Ni2+-DATP-Eu3+/Tb3+(Ni2+/DATP/Eu3+/Tb3+＝3/3/1/2,Ctotal＝10μM)和组氨酸浓度分别为0,0.5,1,2,3,4,10,40,100,150,200,300,400,500,600,700,800,900,1000μM的溶液，在37℃下搅拌2h得到反应液。将反应液进行时间分辨荧光光谱测定。
测定用仪器为Perkin Elmer LS 50B荧光分光光度计。
测定条件为：延迟时间，0.2ms；记数窗口时间，0.4ms；循环时间，20ms；激发狭缝，10nm；发射狭缝，10nm；激发波长，330nm。
图4为探针Ni2+-DATP-Eu3+/Tb3+(Ni2+/DATP/Eu3+/Tb3+＝3/3/1/2,Ctotal＝10μM)在pH＝7.4的10mmol/L PBS缓冲溶液中与不同浓度组氨酸反应后其产物荧光光谱的变化情况。伴随着组氨酸浓度的增加，探针在610nm处Eu3+的荧光强度逐渐增加，而在540nm处Tb3+的荧光强度基本不变，表明探针Ni2+-DATP-Eu3+/Tb3+的I610/I540比值也随组氨酸浓度增加而逐渐增加，并且可以用于定量测定溶液中组氨酸的浓度。
图5是使用探针Ni2+-DATP-Eu3+/Tb3+检测组氨酸的工作曲线。如图5所示，在0～4mol/L范围内组氨酸的浓度与荧光强度的比值I610/I540具有很好的线性关系，用本底信号标准偏差的3倍计算最低检出限，得到最低检出限为0.12mol/L，表明使用Ni2+-DATP-Eu3+/Tb3+定量测定组氨酸具有非常高的灵敏度。
(2)溶液pH值对探针Ni2+-DATP-Eu3+/Tb3+和探针与组氨酸的反应产物DATP-Eu3+/Tb3+荧光性质的影响：
A组：将Ni2+-DATP-Eu3+/Tb3+(Ni2+/DATP/Eu3+/Tb3+＝3/3/1/2,Ctotal＝10μM)加入到pH分别为在3、4、5、6、7、8、9、10的10mmol/L PBS缓冲溶液中，在37℃下搅拌2h，考察探针Ni2 +-DATP-Eu3+/Tb3+在不同pH环境中荧光强度比值(I610/I540)的影响。
B组：将Ni2+-DATP-Eu3+/Tb3+(Ni2+/DATP/Eu3+/Tb3+＝3/3/1/2,Ctotal＝10μM)和组氨酸加入到pH分别为在3、4、5、6、7、8、9、10的10mmol/L PBS缓冲溶液中，在37℃下搅拌2h得到产物DATP-Eu3+/Tb3+。分别将将反应液进行时间分辨荧光光谱测定。考察产物DATP-Eu3+/Tb3+溶液在不同pH环境中荧光强度比值(I610/I540)的影响。
其结果见图6，图6中■表示探针Ni2+-DATP-Eu3+/Tb3+，●表示DATP-Eu3+/Tb3+。由图6可见，在pH值在6～8的范围内，Ni2+-DATP-Eu3+/Tb3+和DATP-Eu3+/Tb3+溶液荧光强度比值(I610/I540)变化不大，表明该探针可以用于生理条件下组氨酸的定量测定。
(3)探针Ni2+-DATP-Eu3+/Tb3+对组氨酸荧光响应的选择性
未加组氨酸：分别将维生素C(Vc)，谷氨酸(Glu)，精氨酸(Arg)，丝氨酸(Ser)，亮氨酸(Leu)，丙氨酸(Ala)，甘氨酸(Gly)，苏氨酸(Thr)，冬氨酸(Asp)，谷胱甘肽(GSH)，半胱氨酸(Cys)，高半胱氨酸(Hcy)，缬氨酸(Val)，脯氨酸(Pro)以及组氨酸(His)在pH＝7.4的10mmol/L PBS缓冲溶液中与Ni2+-DATP-Eu3+/Tb3+(Ni2+/DATP/Eu3+/Tb3+＝3/3/1/2,Ctotal＝10μM)反应，考察荧光强度的比值(I610/I540)。分别考察了活性氧物种ONOO-，·OH，O2 -·，H2O2及1O2与Ni2+-DATP-Eu3+/Tb3+的反应情况。
添加组氨酸组：分别将维生素C(Vc)，谷氨酸(Glu)，精氨酸(Arg)，丝氨酸(Ser)，亮氨酸(Leu)，丙氨酸(Ala)，甘氨酸(Gly)，苏氨酸(Thr)，冬氨酸(Asp)，谷胱甘肽(GSH),半胱氨酸(Cys)，高半胱氨酸(Hcy)，缬氨酸(Val)，脯氨酸(Pro)在pH＝7.4的10mmol/L PBS缓冲溶液中与Ni2+-DATP-Eu3+/Tb3+(Ni2+/DATP/Eu3+/Tb3+＝3/3/1/2,Ctotal＝10μM)和组氨酸(His)反应，考察荧光强度的比值(I610/I540)。
图7是未加组氨酸(空白柱)与组氨酸存在(带网格柱)条件下，在pH＝7.4的10mmol/L PBS缓冲溶液中Ni2+-DATP-Eu3+/Tb3+(Ni2+/DATP/Eu3+/Tb3+＝3/3/1/2,Ctotal＝10M)与不同反应活性物种反应后荧光强度的比值(I610/I540)。由图7可见，其他干扰活性物种反应后不会导致Ni2+-DATP-Eu3+/Tb3+的荧光强度比值(I610/I540)发生明显变化。此外，竞争实验结果表明，其他组分与组氨酸的共存也不会影响Ni2+-DATP-Eu3+/Tb3+对组氨酸的荧光响应。该结果表明探针Ni2+-DATP-Eu3+/Tb3+对组氨酸的荧光响应具有很好的选择性。
实施例3
一种实施例2的荧光探针Ni2+-DATP-Eu3+/Tb3+用于Hela细胞中组氨酸时间分辨荧光成像测定中的应用：
(1)制备AM-DATP-Eu3+/Tb3+：将Ni2+-DATP-Eu3+/Tb3+用于Hela细胞中组氨酸时间分辨荧光成像测定之前，先将DATP-Eu3+/Tb3+与溴甲基乙酸酯反应生成AM-DATP-Eu3+/Tb3+，使得探针更容易进入到活细胞中。具体步骤为：将15.5μmol DATP溶于210μL无水DMSO中，然后分别加入282μmol(40μL)三乙胺和618μmol(61μL)溴甲基乙酸酯。室温搅拌20小时后，离心除去微量不溶物，然后向其中加入5.17μmol EuCl3·6H2O固体和10.3μmol TbCl3·6H2O，所制得的该溶液为AM-DATP-Eu3+/Tb3+，浓度约为50mmol/L。直接用等渗盐稀释后用于细胞培养。
(2)将含有200M AM-DATP-Eu3+/Tb3+(DATP/Eu3+/Tb3+＝3/1/2)的等渗盐培养Hela细胞1h后，充分洗涤细胞，再用100μM Ni2+培养30min，充分洗涤细胞，再加入1mM组氨酸培养2h后，充分洗涤细胞并在时间分辨荧光显微镜上进行荧光成像测定。
图8是探针用于Hela细胞中组氨酸的比率型时间分辨荧光成像测定结果。如图8所示，加入Ni2+后，探针的红色荧光减弱，绿色荧光不变，当加入组氨酸后，探针的红色荧光增强，而绿色荧光不变。表明探针Ni2+-DATP-Eu3+/Tb3+可用于细胞中组氨酸的时间分辨荧光成像测定。
实施例4
探针Ni2+-DATP-Eu3+/Tb3+用于大型蚤体内组氨酸的时间分辨荧光成像测定中的应用：
大型蚤用200M实施例2的DATP-Eu3+/Tb3+(DATP/Eu3+/Tb3+＝3/1/2)培养30min后，再加入100μM Ni2+培养30min，然后再加入1mM组氨酸培养1h，得到培养液。将培养液用于时间分辨荧光成像测定，结果如图9所示。
从图9中可知，加入Ni2+后，探针的红色荧光减弱，绿色荧光不变，当加入组氨酸后，探针的红色荧光增强，而绿色荧光不变。表明DATP-Eu3+/Tb3+可用于大型蚤中组氨酸的时间分辨荧光成像测定。
实施例5
探针Ni2+-DATP-Eu3+/Tb3+用于斑马鱼体内组氨酸的时间分辨荧光成像测定中的应用：
斑马鱼用200M实施例2的DATP-Eu3+/Tb3+(DATP/Eu3+/Tb3+＝3/1/2)培养2.5h后，再加入100μM Ni2+培养30min，然后再加入1mM组氨酸培养2h，，得到培养液。将培养液用于时间分辨荧光成像测定，结果如图10所示。
从图10中可知，加入Ni2+后，探针的红色荧光减弱，绿色荧光不变，当加入组氨酸后，探针的红色荧光增强，而绿色荧光不变。表明Ni2+-DATP-Eu3+/Tb3+可用于斑马鱼体内组氨酸的时间分辨荧光成像测定。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种配位体，其特征在于，所述配位体为DATP；所述DATP具有以下式I的结构式：
2.一种权利要求1所述的配位体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
S1、将化合物1、NaN3和四丁基硫酸氢铵在惰性气氛下反应得到化合物2；
S2、将二(2-吡啶甲基)胺、炔丙基溴反应得到中间产物；将所述中间产物与所述化合物2和CuI在惰性气氛下反应得到化合物3；
S3、将所述化合物3在含有CH2Cl2和CF3COOH的混合溶剂中反应得到DATP；
所述化合物1具有以下式III的结构式：
所述化合物2具有以下式IV的结构式：
所述化合物3具有以下式V的结构式：
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述S1中，所述化合物1、NaN3和四丁基硫酸氢铵的质量比为2︰20～30︰1～1.5；
和/或，所述S2中，所述二(2-吡啶甲基)胺、炔丙基溴的摩尔质量比为1︰1.1～1.5；所述中间产物、化合物2和CuI的摩尔质量比为1︰1︰0.4～0.6；
和/或，所述S3中，所述含有CH2Cl2和CF3COOH的混合溶剂中，CH2Cl2与CF3COOH的体积比为0.9～1.1︰0.9～1.1。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，
所述S1具体为：将DMF、化合物1、NaN3和四丁基硫酸氢铵在氩气保护下，于100～125℃反应24～36h得到化合物2；
和/或，所述S2具体为：
S2-1、将二(2-吡啶甲基)胺、炔丙基溴和K2CO3溶于无水DMF中，在20～35℃下搅拌12～24h得到中间产物；
S2-2、将所述中间产物、CuI和化合物2加入到无水乙腈溶液中，氩气保护下在20～35℃下搅拌2～3h，再回流12～24h得到化合物3；
和/或，所述S3具体为：将化合物3溶于CH2Cl2-CF3COOH的混合溶剂中，在20～35℃搅拌反应10～24h，得到DATP。
5.一种荧光探针，其特征在于，所述荧光探针以权利要求1所述的配位体和Ni2+为核心，Eu3+和Ni2+通过Ni-N配位键与配位体连接，Tb3通过Tb-O和Tb-N配位键与配位体连接；所述荧光探针具有以下式II的结构式：
6.一种权利要求5所述荧光探针的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：将DATP、EuCl3﹒6H2O和TbCl3﹒6H2O于PBS缓冲溶液中混匀，加入Ni2+得到Ni2+-DATP-Eu3+/Tb3+，即为荧光探针。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，Ni2+︰DATP︰Eu3+︰Tb3+的摩尔浓度比为3︰3︰1︰2。
8.一种权利要求5所述荧光探针在组氨酸测定中的应用。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用的具体过程为：将所述Ni2+-DATP-Eu3+/Tb3+在PBS缓冲溶液中与组氨酸反应，通过测定I610/I540的比值测定组氨酸的含量。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述PBS缓冲溶液的pH为6～8；
和/或，所述PBS缓冲溶液的浓度为8～20mmol/L。
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