CN112898965A - 一种可视化区分检测用比率荧光探针制备及使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可视化区分检测的比率荧光探针制备及使用方法，其制备方法具体包括以下步骤：Step 1，硅基碳量子点的制备；Step2，包裹硅基碳量子点的纳米介孔分子印迹材料的制备；Step3，纳米介孔分子印迹材料的表面修饰；Step4，基于纳米介孔分子印迹材料的比率荧光探针的制备；其使用方法包括：（1）将四环素或土霉素稀释呈不同梯度浓度的溶液；（2）取制备的基于纳米介孔分子印迹材料的比率荧光探针分散于超纯水中，（3）在石英比色皿中加入的pH=8的Tris‑HCl缓冲溶液和的溶液混匀之后分别滴加步骤（1）中的四环素溶液或土霉素溶液进行荧光测定；本发明的主体基质为具有介孔结构的二氧化硅分子印迹层，方法可靠，可以进行大量生产，并在社会中广泛应用。

Description

一种可视化区分检测用比率荧光探针制备及使用方法

技术领域

本发明涉及纳米复合材料制备技术领域，特别是一种可视化区分检测的比率荧光探针制备及使用方法。

背景技术

四环素和土霉素都是四环素类抗生素中使用最广泛的抗生素，常用于治疗由革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌引起的人和动物感染。由于其显著的抗菌作用，四环素类抗生素经常被用作饲料添加剂，在动物饲养过程中用于预防和治疗疾病，促进动物的生长发育。然而，四环素类抗生素的不合理使用，包括四环素(TC)和土霉素(OTC)，可能会导致四环素类抗生素的蓄积。虽然抗生素帮助人类战胜了许多由细菌引起的疾病，但超过10%的人也遭受着抗生素的副作用。研究发现，抗生素可以杀死有益微生物，直接损害人体组织，并导致抗药性细菌的增殖。对四环素残留的探究是科学界的一个热点，检测四环素的方法有很多种，有高效液相色谱法，比色分析法，比色法，毛细管电泳法，酶联免疫法和荧光分析法等。其中荧光分析法由于检测设备便宜简单便携，检测方便、快速而显现出优越的特性。

传统的荧光分析法通常采用稀土铕离子的荧光变化来检测四环素类抗生素。稀土离子自身的f-f跃迁是禁阻跃迁，导致其摩尔消光系数小，发光效率低。而TC/OTC因为含有β-二酮结构，可作为有机配体有效的将激发态能量通过无辐射跃迁的形式传递给配位中心的稀土铕离子，从而敏化稀土离子的发光，所得稀土配合物激发寿命长且荧光强度大大增强，因此可通过稀土铕离子与TC/OTC螯合时的荧光增强来实现对TC/OTC的检测。随着科学技术的发展，一些新的荧光材料如碳量子点也被应用于四环素的检测，碳量子点是一类具有良好稳定性和光致发光特性的零维碳基纳米材料，作为功能荧光探针引起了人们的极大兴趣。与严重危害环境和人体健康的传统有机染料和金属半导体量子点相比，荧光碳量子点的生物相容性好、毒性低。尽管目前碳量子点的淬灭机理还未得到完整的结论，但并不妨碍碳量子点作为四环素的荧光探针。

然而，基于碳量子点的探针选择性通常较差，且大多是基于荧光淬灭机制，可视化变色程度较差。因此，应当通过适当的方法对碳量子点基探针进行改性，以解决上述两个缺陷。同时，单一的铕离子对TC/OTC的检测会受到其他有机物质的干扰，特异性差；最重要的是，无法分辨具有相似结构的同一类四环素物质，且其化学和热稳定性一直是难以解决的问题；其次，产品往往无法大量生产，限制了其实际应用范围。分子印迹技术是一种简单易行解决分子识别问题的策略，通过分子印迹技术制备的分子印迹聚合物(MIPs)具有独特的识别和选择性吸附性能；基于荧光碳量子点的分子印迹材料应用于四环素的荧光检测，可提高荧光检测选择性。另一方面，将稀土配合物接枝于分子印迹材料基质表面，可以提高稀土配合物的稳定性和传感器的重复利用率，使基于分子印迹材料的荧光传感器在四环素可视化检测方面表现出更加优良的性能。将比率荧光探针用于荧光方法测定中更有助于消除了光漂白、探针负载和留存及设备因素引起的数据的失真，提高检测灵敏度。

因此，设计并合成灵敏度高的比率多色荧光探针成为研究目标。

发明内容

为了克服上述不足，本发明的目的是要提供一种可视化区分检测的荧光探针制备及使用方法，以蓝色发光材料碳量子点作为分子印迹的荧光内核材料，再将柠檬酸酸（cit）共价嫁接在分子印迹聚合物上，并将稀土铕盐与之配位，形成分子印迹型的比率荧光探针；由于cit并不能很好的将能量传递给稀土铕离子，得到的分子印迹聚合物能发射出碳量子点所特有的蓝色荧光，且并没有出现铕的特征红色荧光。当有四环素和土霉素存在时，四环素上的β-二酮结构可以有效的将能量传递给稀土离子，铕的红色特征荧光将大大增强，但只有当待检测物质是四环素时，碳量子点的蓝色荧光才会被淬灭，最终形成纯的红色荧光。随着四环素浓度的不断增加，荧光会由蓝色经历粉红色，最终变为红色。本发明采用易制备成本低廉且性能优异的二氧化硅基分子印迹材料作为主体材料，通过荧光比率测定法，实现对四环素和土霉素的检测，以及对其同系物的识别，并消除了光漂白、探针负载和留存及设备因素引起的数据的失真；本发明实现了对四环素和土霉素的高灵敏性特异性区分检测，有效地防止了其它分子乃至于同类物质及离子的干扰；本发明实现了对四环素的可视化检测，通过荧光颜色的改变，可以初步确定四环素或土霉素的浓度，为实现实际应用奠定了基础。

为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：

一种可视化区分检测的比率荧光探针制备方法，包括以下步骤：

Step 1，硅基碳量子点的制备：将N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷与无水柠檬酸混配制备出硅掺杂的荧光碳量子点，利用分离工艺得到纯的硅基碳量子点；

Step2，包裹硅基碳量子点的纳米介孔分子印迹材料的制备：在致孔剂十六烷基三甲基溴化铵存在的情况下将硅基碳量子点包覆一层3-氨丙基三乙氧基硅烷和正硅酸四乙酯，形成包裹硅基碳量子点的纳米介孔分子印迹材料；

Step3，纳米介孔分子印迹材料的表面修饰：分别利用3-氨丙基三乙氧基硅烷和无水柠檬酸对Step2中得到的包裹硅基碳量子点的纳米介孔分子印迹材料进行表面修饰；

Step4，基于纳米介孔分子印迹材料的比率荧光探针的制备：将Step3中得到的经修饰过的纳米介孔分子印迹材料通过表面柔性羧酸官能团和六水合硝酸铕配位制得比率荧光探针。

Step 1中制备硅基碳量子点的具体步骤为：

Step 1.1，取N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷置于烧瓶中，并在氮气保护下冷凝回流搅拌加热至240℃；

Step 1.2，取无水柠檬酸，研磨至100目；

Step 1.3，将研磨好的无水柠檬酸快速加入到240℃的N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷中，所述无水柠檬酸与N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷的质量比为1:36.4，以高于600 rpm的转速进行搅拌并加热10 min后，自然冷却至室温；

Step 1.4，将所得固体研磨粉碎，将粉碎后的固定以1：32-33的比例加入石油醚，再将混合体系用600 W功率的超声机超声处理30 min，再以5000 rmp的转速离心3 min，除去悬浊液中的固体大颗粒；

Step 1.5，将所得上清液以1:1的比例，加入超纯水萃取石油醚中的物质，分离出水相后，先以0.22 μm的水系滤膜除去大颗粒，再以1000 Da的透析膜透析48 h，且需要每隔8 h换水一次，以除去未反应的可溶性小分子；最后通过冷冻干燥获得硅基碳量子点。

Step2中制备包裹硅基碳量子点的纳米介孔分子印迹材料的具体步骤为：

Step2.1，将十六烷基三甲基溴化铵加入超纯水中，所述十六烷基三甲基溴化铵与超纯水的质量比为1.322:500，以600 rmp的转速搅拌至白色固体消失，再加入氢氧化钠水溶液并加热至70℃，所述氢氧化钠水溶液的浓度为2 mol/L，所述氢氧化钠水溶液与超纯水的体积比为7:1000；

Step2.2，称取质量比为2:1的硅基碳量子点和四环素，分别溶于超纯水中，所述超纯水与硅基碳量子点的质量比为50:1，所述超纯水与四环素的质量比为100:1，分别利用600 W功率的超声机对硅基碳量子点水溶液和四环素水溶液超声分散3 min；

Step2.3分别将硅基碳量子点的水溶液和四环素的水溶液滴加至Step2.1的混合液中搅拌5 min，再滴加体积比为4:1的正硅酸四乙酯和3-氨丙基三乙氧基硅烷，继续加热搅拌3h，自然冷却至室温，离心收集沉淀，超纯水超声震荡洗涤2次并收集固体，无水乙醇超声震荡洗涤2次并收集固体；

Step2.4，将Step23所收集的固体分散在含有硝酸铵的无水乙醇中，超声分散3min，室温搅拌2 h，离心收集固体，再利用无水乙醇超声震荡洗涤2次收集固体，再利用含有5%醋酸的甲醇溶液反复超声震荡洗涤8次以上，脱除作为模板分子的四环素；最后真空60℃干燥得到包裹硅基碳量子点的纳米介孔分子印迹材料，并将所得固体研磨至100目。

Step3纳米介孔分子印迹材料表面修饰的具体步骤为：

Step3.1，将Step2得到的包裹硅基碳量子点的纳米介孔分子印迹材料分散于超纯水和N,N-二甲基甲酰胺的混合溶液中，形成悬浮液，所述超纯水和N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:1，所述包裹硅基碳量子点的纳米介孔分子印迹材料与超纯水的质量比为1:100，将悬浮液通过0.22 μm的有机系滤膜过滤，除去大颗粒；

Step3.2，经过滤的悬浮液在600 rmp的搅拌条件下滴加3-氨丙基三乙氧基硅烷，所述3-氨丙基三乙氧基硅烷与悬浮液的体积比为1:400，并在搅拌30 min后，逐滴加入浓度为 28%的浓氨水，所述浓氨水与3-氨丙基三乙氧基硅烷的体积比为2:1，搅拌反应12h后离心收集固体，并先用无水乙醇超声震荡洗涤三次，再用超纯水超声震荡洗涤两次收集固体；

Step3.3，将Step3.2中得到的固体分散于N,N-二甲基甲酰胺和超纯水的混合溶液中搅拌备用，所述N,N-二甲基甲酰胺和超纯水的体积比为1:1；

Step3.4，取无水柠檬酸溶于N,N-二甲基甲酰胺和超纯水的混合溶液中，所述N,N-二甲基甲酰胺和超纯水的体积比为1:1，所述无水柠檬与超纯水的质量比为1:200，超声分散，再加入同等质量的N，N'-二环己基碳二亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，所述N，N'-二环己基碳二亚胺与无水柠檬酸的质量比为1:5，在室温度下以600 rmp搅拌活化4 h；

Step3.5，将Step3.3中制得的混合溶液加入Step3.4中制得的混合溶液中，室温反应24h，离心收集固体，并用无水乙醇超声震荡洗涤3次，离心收集固体；

Step4中制备基于纳米介孔分子印迹材料的比率荧光探针的具体步骤为：

Step4.1，将Step3中经修饰的纳米介孔分子印迹材料加入到无水乙醇中超声分散1 h；

Step4.2，将六水硝酸铕加入到Step4.1中的混合溶液中，所述六水硝酸铕与无水乙醇的质量比为1:79，油浴搅拌冷凝回流8 h，自然冷却，离心收集固体；

Step4.3，利用无水乙醇以300W功率超声震荡洗涤3次，60℃真空干燥得到基于纳米介孔分子印迹材料的比率荧光探针。

一种如权利要求1所述的可视化区分检测的比率荧光探针的使用方法，包括以下步骤：

（1）首先将四环素或土霉素稀释呈不同梯度浓度的溶液；

（2）取制备的基于纳米介孔分子印迹材料的比率荧光探针分散于超纯水中，所述基于纳米介孔分子印迹材料的比率荧光探针与超纯水的质量比为1000:1；

（3）在石英比色皿中加入的pH = 8的Tris-HCl缓冲溶液和步骤（2）中的溶液，所述Tris-HCl缓冲溶液与步骤（2）中溶液的体积比为19:1，混匀之后分别滴加步骤（1）中的四环素溶液或土霉素溶液进行荧光测定。

与现有技术相比，本发明的一种可视化区分检测的比率荧光探针制备及使用方法具备以下有益效果:

1、本发明以发射蓝色荧光的硅基碳量子点为内标荧光，制备可特异性将四环素从其同类物质中识别出的纳米介孔分子印迹材料。再将纳米介孔分子印迹材料的表面进行改性修饰，最终将无水柠檬酸共价接枝在分子印迹材料的表面，并配位稀土铕离子，形成参比荧光；通过四环素的加入，引起荧光由蓝色向红色的改变，最终通过荧光的改变确定检测到的四环素的含量。

2、本发明以硅基荧光碳量子点作为该比率探针的内参比，既可以有效地消除由于方法及设备等原因引起的数据误差，提高检测灵敏度；更可以消除其他有机分子乃至无机离子对碳量子点荧光的干扰；最重要的是可以通过分子印迹这一特殊结构进而特异性的在四环素的同类物质中识别出四环素。

3、本发明的主体基质为具有介孔结构的二氧化硅分子印迹层，容易制备，方法可靠；硅基碳量子点的制备方法成熟，同时其他的药品的价格适中，本发明的产品可以进行大量生产，并在社会中广泛应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例中SiCDs@mMIPs的透射电子显微镜照片；

图2为本发明实施例中SiCDs@mMIPs-cit-Eu的 X射线光电子能谱全谱图；

图3为本发明实施例中SiCDs@mMIPs-cit-Eu对四环素识别的荧光变化图谱；

图4为本发明实施例中SiCDs@mMIPs-cit-Eu对TC的定量分析图；

图5为本发明实施例中SiCDs@mMIPs-cit-Eu对土霉素识别的荧光变化图谱；

图6为本发明实施例中SiCDs@mMIPs-cit-Eu对OTC的定量分析图。

具体实施方式

下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步描述，在此发明的示意性实施例以及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。

如图1-6所示的可视化区分检测的比率荧光探针制备方法包括以下步骤：

step1-硅基碳量子点(Si-CDs)的制备

首先量取20 mL的N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷(AEAPMS)置于50 mL的三口烧瓶中，并于氮气保护下冷凝回流搅拌加热至240℃。称取0.5 g无水柠檬酸，并研磨至100目左右。将研磨好的无水柠檬酸快速加入240℃的AEAPMS中，以超过600 rpm的转速进行搅拌并加热10 min后，自然冷却至室温。将所得黄色固体研磨粉碎，并以1 g固体加入50 mL石油醚的比例加入萃取剂，再将混合体系用600 W功率的超声机超声处理30 min。再以5000rmp的转速离心3 min，除去悬浊液中的固体大颗粒。将所得上清液以1:1的比例，加入超纯水萃取石油醚中的物质。分离出水相后，先以0.22 μm的水系滤膜除去大颗粒，再以1000 Da的透析膜透析48 h，且需要每隔8 h换水一次，以除去未反应的可溶性小分子。最后通过冷冻干燥获得硅基碳量子点。合适浓度的该硅基碳量子点水溶液会在365 nm的紫外灯下显示出蓝色荧光，且该蓝色荧光可被四环素淬灭。

步骤2-包裹硅基碳量子点的纳米介孔分子印迹材料(SiCDs@mMIPs)的制备

为了能够特异性区分出四环素和其相似抗生素，也为了能够消除其他有机物质甚至是无机离子的干扰，我们需要制作具有介孔结构的二氧化硅分子印迹层。首先称取0.2 g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)加入100 mL的超纯水中，以600 rmp的转速搅拌至白色固体消失，再加入0.7 mL的氢氧化钠水溶液(浓度为2 mol/L)并加热至70℃(油浴搅拌冷凝回流)。分别称取10.0 mg上述的硅基碳量子点和5 mg四环素，溶于5.0 mL的超纯水中，超声分散(600 W) 3 min即可见澄清溶液，并分别将硅基碳量子点的水溶液和四环素的水溶液滴加至CTAB和氢氧化钠的混合液中搅拌5 min，再向上述反应体系中滴加1.0 mL的正硅酸四乙酯(TEOS)和0.25 mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，继续加热搅拌3 h，自然冷却至室温，离心收集沉淀，超纯水超声震荡(300 W)洗涤2次收集固体，无水乙醇超声震荡(300 W)洗涤2次收集固体。再将以上实验所收集的固体分散在含有0.3 g硝酸铵的30 mL无水乙醇中，超声分散(600 W) 3 min，室温搅拌(600 rmp)2 h，离心收集固体，再以无水乙醇超声震荡(300 W)洗涤2次收集固体。再以含有5%醋酸的甲醇溶液反复超声震荡洗涤8次以上，脱除作为模板分子的四环素。最后真空60℃干燥至干，并将所得固体研磨至100目左右。该分子印迹聚合物为纳米材料，可均匀的分散于水中，形成较为稳定的胶体溶液。

步骤3-纳米介孔分子印迹材料的表面修饰(SiCDs@mMIPs-cit)

为了制备比率荧光探针，并实现对含有β-二酮官能团的四环素类抗生素的检测，我们对上述实验所制备的介孔纳米分子印迹聚合物进行改性修饰。首先称取100 mg上述的分子印迹材料超声(600 W)1 h分散于10 mL超纯水和10 mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的混合溶液中，形成悬浮液。然后将上述悬浮液通过0.22 μm的有机系滤膜过滤，除去大颗粒。然后，向所得的分散体系在600 rmp的搅拌条件下滴加0.5 mL APTES，并在搅拌30 min后，逐滴加入1.0 mL 28%的浓氨水，搅拌反应12 h。离心(6000 rmp，2 min)收集固体，并先用无水乙醇超声震荡洗涤三次，再用超纯水超声震荡洗涤两次收集固体。将所得湿固体分散于10mL DMF和10 mL超纯水的混合溶液中搅拌备用。另称取50 mg的无水柠檬酸溶于10 mL DMF和10 mL超纯水的混合溶液中，超声分散至无肉眼可见颗粒。再加入10 mg N，N'-二环己基碳二亚胺(DCC)，10 mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和10 mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，在室温下600 rmp搅拌活化柠檬酸4 h。然后再将备用的经APTES修饰过的分子印迹材料悬浮液加入反应体系中，室温反应24 h。离心收集固体，并用无水乙醇超声震荡洗涤3次，离心收集固体。

步骤4-基于纳米介孔分子印迹材料的比率荧光探针(SiCDs@mMIPs-cit-Eu)的制备

将上述经柠檬酸修饰的分子印迹材料(湿)加入30 mL无水乙醇中超声(300 W)分散1 h。再称取30 mg六水硝酸铕(Eu(NO₃)₃·6H₂O)加入其中，油浴搅拌冷凝回流8 h，自然冷却，离心收集固体。无水乙醇超声震荡(300 W)洗涤3次，60℃真空干燥至干。

本发明还提出了稀土铕离子配合物修饰的基于纳米介孔分子印迹材料能够实现对四环素的荧光比率检测，其中稀土铕离子配合物修饰的基于纳米介孔分子印迹材料为采用本发明中的方法制备的SiCDs@mMIPs-cit-Eu荧光探针。

实施例a:首先，取9.2 mg的四环素（TC）溶于2 mL的超纯水中，并稀释成不同梯度浓度的溶液。再称取所制备的SiCDs@mMIPs-cit-Eu荧光探针5 mg并分散在5 mL的超纯水中；然后在石英比色皿中加入1900 μL的pH = 8的Tris-HCl缓冲溶液、100 μL的SiCDs@mMIPs-cit-Eu荧光探针溶液，混匀之后滴加TC溶液进行荧光测定。利用荧光光谱说明该荧光探针的识别性能。如图3-4所示，结果表明，随着TC量的逐渐增加，Eu（III）在616 nm处增强的荧光发射峰与内标荧光硅基碳量子点位于450 nm处减弱的荧光发射峰的发光强度比值与TC的浓度呈线性关系。在紫外灯365 nm激发下，可见溶液颜色由蓝色到红色的变化，体系实现了对TC的荧光比率检测和肉眼可视化的检测。

实施例b:首先，取9.2 mg的土霉素（OTC）溶于10 mL蒸馏水中，分散均匀，再将悬浊液(土霉素的溶解性没有四环素的溶解性大)稀释成不同梯度浓度的溶液；然后在石英比色皿中加入1900 μL的pH = 8的Tris-HCl缓冲溶液、100 μL的SiCDs@mMIPs-cit-Eu荧光探针溶液，混匀之后滴加OTC溶液进行荧光测定。利用荧光光谱说明该荧光探针的识别性能。如图5-6所示，结果表明，随着OTC量的逐渐增加，Eu（III）在616 nm处增强的荧光发射峰与内标荧光硅基碳量子点位于450 nm处不变的荧光发射峰的发光强度比值与OTC的浓度呈线性关系。在紫外灯365 nm激发下，可见溶液颜色由蓝色到粉红色的变化，体系实现了对OTC的荧光比率检测和肉眼可视化的检测。

本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种可视化区分检测的比率荧光探针制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

Step 1，硅基碳量子点的制备：将N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷与无水柠檬酸混配制备出硅掺杂的荧光碳量子点，利用分离工艺得到纯的硅基碳量子点；

Step2，包裹硅基碳量子点的纳米介孔分子印迹材料的制备：在致孔剂十六烷基三甲基溴化铵存在的情况下将硅基碳量子点包覆一层3-氨丙基三乙氧基硅烷和正硅酸四乙酯，形成包裹硅基碳量子点的纳米介孔分子印迹材料；

Step3，纳米介孔分子印迹材料的表面修饰：分别利用3-氨丙基三乙氧基硅烷和无水柠檬酸对Step2中得到的包裹硅基碳量子点的纳米介孔分子印迹材料进行表面修饰；

Step4，基于纳米介孔分子印迹材料的比率荧光探针的制备：将Step3中得到的经修饰过的纳米介孔分子印迹材料通过表面柔性羧酸官能团和六水合硝酸铕配位制得比率荧光探针。

2.根据权利要求1所述的可视化区分检测的比率荧光探针制备方法，其特征在于，Step1中制备硅基碳量子点的具体步骤为：

Step 1.1，取N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷置于烧瓶中，并在氮气保护下冷凝回流搅拌加热至240℃；

Step 1.2，取无水柠檬酸，研磨至100目；

Step 1.3，将研磨好的无水柠檬酸快速加入到240℃的N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷中，所述无水柠檬酸与N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷的质量比为1:36.4，以高于600 rpm的转速进行搅拌并加热10 min后，自然冷却至室温；

Step 1.4，将所得固体研磨粉碎，将粉碎后的固体以1：32-33的比例加入石油醚，再将混合体系用600 W功率的超声机超声处理30 min，再以5000 rmp的转速离心3 min，除去悬浊液中的固体大颗粒；

Step 1.5，将所得上清液以1:1的比例，加入超纯水萃取石油醚中的物质，分离出水相后，先以0.22 μm的水系滤膜除去大颗粒，再以1000 Da的透析膜透析48 h，且需要每隔8 h换水一次，以除去未反应的可溶性小分子；最后通过冷冻干燥获得硅基碳量子点。

3.根据权利要求1所述的可视化区分检测的比率荧光探针制备方法，其特征在于，Step2中制备包裹硅基碳量子点的纳米介孔分子印迹材料的具体步骤为：

Step2.1，将十六烷基三甲基溴化铵加入超纯水中，所述十六烷基三甲基溴化铵与超纯水的质量比为1.322:500，以600 rmp的转速搅拌至白色固体消失，再加入氢氧化钠水溶液并加热至70℃，所述氢氧化钠水溶液的浓度为2 mol/L，所述氢氧化钠水溶液与超纯水的体积比为7:1000；

Step2.2，称取质量比为2:1的硅基碳量子点和四环素，分别溶于超纯水中，所述超纯水与硅基碳量子点的质量比为50:1，所述超纯水与四环素的质量比为100:1，分别利用600 W功率的超声机对硅基碳量子点水溶液和四环素水溶液超声分散3 min；

Step2.3分别将硅基碳量子点的水溶液和四环素的水溶液滴加至Step2.1的混合液中搅拌5 min，再滴加体积比为4:1的正硅酸四乙酯和3-氨丙基三乙氧基硅烷，继续加热搅拌3h，自然冷却至室温，离心收集沉淀，超纯水超声震荡洗涤2次并收集固体，无水乙醇超声震荡洗涤2次并收集固体；

Step2.4，将Step23所收集的固体分散在含有硝酸铵的无水乙醇中，超声分散3 min，室温搅拌2 h，离心收集固体，再利用无水乙醇超声震荡洗涤2次收集固体，再利用含有5%醋酸的甲醇溶液反复超声震荡洗涤8次以上，脱除作为模板分子的四环素；最后真空60℃干燥得到包裹硅基碳量子点的纳米介孔分子印迹材料，并将所得固体研磨至100目。

4.根据权利要求1所述的可视化区分检测的比率荧光探针制备方法，其特征在于，Step3纳米介孔分子印迹材料表面修饰的具体步骤为：

Step3.1，将Step2得到的包裹硅基碳量子点的纳米介孔分子印迹材料分散于超纯水和N,N-二甲基甲酰胺的混合溶液中，形成悬浮液，所述超纯水和N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:1，所述包裹硅基碳量子点的纳米介孔分子印迹材料与超纯水的质量比为1:100，将悬浮液通过0.22 μm的有机系滤膜过滤，除去大颗粒；

Step3.2，经过滤的悬浮液在600 rmp的搅拌条件下滴加3-氨丙基三乙氧基硅烷，所述3-氨丙基三乙氧基硅烷与悬浮液的体积比为1:400，并在搅拌30 min后，逐滴加入浓度为28%的浓氨水，所述浓氨水与3-氨丙基三乙氧基硅烷的体积比为2:1，搅拌反应12h后离心收集固体，并先用无水乙醇超声震荡洗涤三次，再用超纯水超声震荡洗涤两次收集固体；

Step3.3，将Step3.2中得到的固体分散于N,N-二甲基甲酰胺和超纯水的混合溶液中搅拌备用，所述N,N-二甲基甲酰胺和超纯水的体积比为1:1；

Step3.4，取无水柠檬酸溶于N,N-二甲基甲酰胺和超纯水的混合溶液中，所述N,N-二甲基甲酰胺和超纯水的体积比为1:1，所述无水柠檬与超纯水的质量比为1:200，超声分散，再加入同等质量的N，N'-二环己基碳二亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，所述N，N'-二环己基碳二亚胺与无水柠檬酸的质量比为1:5，在室温度下以600 rmp搅拌活化4 h；

Step3.5，将Step3.3中制得的混合溶液加入Step3.4中制得的混合溶液中，室温反应24h，离心收集固体，并用无水乙醇超声震荡洗涤3次，离心收集固体。

5.根据权利要求1所述的可视化区分检测的比率荧光探针制备方法，其特征在于，Step4中制备基于纳米介孔分子印迹材料的比率荧光探针的具体步骤为：

Step4.1，将Step3中经修饰的纳米介孔分子印迹材料加入到无水乙醇中超声分散1 h；

Step4.2，将六水硝酸铕加入到Step4.1中的混合溶液中，所述六水硝酸铕与无水乙醇的质量比为1:79，油浴搅拌冷凝回流8 h，自然冷却，离心收集固体；

Step4.3，利用无水乙醇以300W功率超声震荡洗涤3次，60℃真空干燥得到基于纳米介孔分子印迹材料的比率荧光探针。

6.一种如权利要求1所述的可视化区分检测的比率荧光探针的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）首先将四环素或土霉素稀释呈不同梯度浓度的溶液；

（2）取制备的基于纳米介孔分子印迹材料的比率荧光探针分散于超纯水中，所述基于纳米介孔分子印迹材料的比率荧光探针与超纯水的质量比为1000:1；

（3）在石英比色皿中加入的pH = 8的Tris-HCl缓冲溶液和步骤（2）中的溶液，所述Tris-HCl缓冲溶液与步骤（2）中溶液的体积比为19:1，混匀之后分别滴加步骤（1）中的四环素溶液或土霉素溶液进行荧光测定。

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