CN108504347B - 增强型双发射荧光复合材料及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种增强型双发射荧光复合材料，由谷胱甘肽包裹的金纳米团簇与发光金属有机框架MIL‑68(In)‑NH2通过酰胺键共价结合形成GSH‑AuNCs@MIL‑68(In)‑NH2，然后与半胱氨酸共孵育形成。本发明还公开了该增强型双发射荧光复合材料的制备方法和在双发射比率荧光法检测Hg2+中的应用。本发明的增强型双发射荧光复合材料在加入Hg2+后，能够淬灭Cys/GSH‑AuNCs处的荧光发射峰，而发光金属有机框架处的荧光发射峰强度几乎保持不变，不仅能够有效消除系统误差，而且具有检测限低，线性范围宽，准确性好，灵敏度高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及荧光检测领域，特别是双发射荧光复合材料及其制备方法和应用。
背景技术
汞以元素以及无机盐形式存在于环境中，对动物和水生生物十分有害。汞在环境中的这两种形式很容易被生活在水生系统中的一些细菌转化为更有毒的单甲基汞(II)阳离子形式。接触汞会破坏人体中枢神经系统和内分泌系统。暴露于较高水平的汞会造成严重的健康问题，如患水俣病、贫血和水肿。最近，世界卫生组织的指南严格限制饮用水中Hg2+的最大允许含量水平为0.001mg/L。随着科技发展，科研工作人员在Hg2+的定性和定量检测方面已经做了大量的工作，并正在逐步形成可靠和经济的检测方法。Hg2+的选择性荧光定量检测难道较大，目前仍在逐步发展更可靠、更经济的检测方法。
迄今为止，主要有三种荧光检测类型：荧光增强(″on″)、荧光猝灭(″off″)和比率荧光检测。在荧光″on″和″off″检测中，荧光强度会受到各种变量的影响，如探针分子的浓度、微环境条件或仪器之间光学元件的差异等。相比之下，使用比率荧光探针的比率荧光检测可以克服基于强度的探针的限制，并通过两个发射峰的自我校准提供准确的测量。
金属有机框架作为一种新型多孔材料，以金属离子或无机簇和多官能团有机配体为基本单元组装而成的，发光金属有机框架MIL-68(In)-NH2是一类孔隙率高、比表面积大、孔结构可控、化学性质稳定和制备过程简单的新型多孔晶态发光材料，其结构和性质在一定程度上具有可设计性和可调控性。作为一类新型多孔类沸石晶体材料，金属有机骨架材料在气体存储、分离、药物缓释、选择性催化、可逆主-客体交换、光电材料、磁性材料、分子识别和传感材料等新材料开发中具有广泛的应用。
荧光金属纳米团簇(NCs)作为一类新型的金属纳米材料，具有超小的尺寸(通常由几个到十几个原子构成且尺寸小于2nm)和独特的性质。其超小的尺寸接近于电子的费米级使其表现出能级分散性和分子相似性，如：HOMO-LUMO转换、可调节的发射波长、较大的斯托克峰位移、分子手征性和磁性等。荧光金属纳米团簇(NCs)具有易于合成，水溶性好，毒性较低，稳定性好和生物相容性好等优点。到目前为止，荧光金属纳米团簇(NCs)经被应用在包括生物分析和成像、环境监测、工业催化和电子器件等领域。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供一种能够高灵敏、高选择性检测Hg2+的增强型双发射荧光复合材料。
本发明的另一目的是提供上述增强型双发射荧光复合材料的制备方法。
本发明的另一目的是提供上述增强型双发射荧光复合材料在双发射比率荧光法检测Hg2+中的应用。
技术方案：本发明提供一种增强型双发射荧光复合材料，该增强型双发射荧光复合材料的制备方法包括以下步骤：
1)使谷胱甘肽包裹的金纳米团簇GSH-AuNCs与发光金属有机框架MIL-68(In)-NH2通过酰胺键共价结合形成GSH-AuNCs@MIL-68(In)-NH2；
2)将步骤1)制得的GSH-AuNCs@MIL-68(In)-NH2与半胱氨酸共孵育，形成所述增强型双发射荧光复合材料。。
上述增强型双发射荧光复合材料为金属有机框架包覆的金簇，利用荧光能量共振转移增强红光波长处的荧光，并且由氨基酸物质利用Au-S键和表面吸附进一步诱导其红光荧光增强。具体地，该增强型双发射荧光复合材料为MIL-68(In)-NH2包覆的GSH(谷胱甘肽)-AuNCs，并且由Cys(半胱氨酸)进一步诱导红光波长处的荧光增强。
上述双发射荧光复合材料GSH-AuNCs@MIL-68(In)-NH2由质量比为1∶50～150的金属有机框架MIL-68(In)-NH2与GSH-AuNCs通过酰胺键共价结合形成。
上述增强型双发射荧光复合材料由增强型双发射荧光复合材料是由质量比为1∶0.6～1的GSH-AuNCs@MIL-68(In)-NH2与半胱氨酸共孵育形成。
为了获得较高的灵敏性，使谷胱甘肽包裹的金纳米团簇GSH-AuNCs中，金纳米团簇的粒径为1.0～1.4nm。
本发明另一方面提供上述增强型双发射荧光复合材料的制备方法，包括以下步骤：
1)将活化羧基后的谷胱甘肽包裹的金纳米团簇与发光金属有机框架MIL-68(In)-NH2于室温下震荡混合12～18h，使谷胱甘肽包裹的金纳米团簇GSH-AuNCs与发光金属有机框架MIL-68(In)-NH2通过酰胺键共价结合形成GSH-AuNCs@MIL-68(In)-NH2；
2)将步骤1)制得的GSH-AuNCs@MIL-68(In)-NH2双发射荧光复合材料与半胱氨酸在pH为6.0～7.4的缓冲液中混合均匀，37～43℃下共孵育35～45min，制得增强型双发射荧光复合材料Cys/GSH-AuNCs@MIL-68(In)-NH2。
上述活化羧基后的谷胱甘肽包裹的金纳米团簇的制备方法包括以下步骤：
1)将谷胱甘肽与氯金酸在水中混合均匀，调节pH值至11～13，35～40℃搅拌反应15～24h，分离产物中的固体物质，洗涤，干燥，制得谷胱甘肽包裹的金纳米团簇GSH-AuNCs；
2)用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液震荡活化步骤1)制得的谷胱甘肽包裹的金纳米团簇GSH-AuNCs 30～40min，活化谷胱甘肽包裹金纳米团簇GSH-AuNCs表面的羧基。
上述发光金属有机框架MIL-68(In)-NH2的制备方法包括：将硝酸铟和2-氨基对苯二甲酸在有机溶剂N，N-二甲基甲酰胺或N，N-二乙基甲酰胺中溶解后，在反应釜中120～130℃水热反应5～24h。
本发明另一方面提供上述增强型双发射荧光复合材料在双发射比率荧光法检测Hg2+中的应用。
Hg2+能够有效淬灭Cys/GSH-AuNCs处的荧光发射峰(即红色的荧光)，而发光金属有机框架处的荧光发射峰(即蓝色的荧光)强度几乎保持不变。利用荧光信号强度的差值和Hg2+浓度对数值Log c(μM)之间的关系，实现对测试样品中Hg2+的检测。该增强型双发射荧光复合材料对Hg2+的检测范围为0-60μM，线性范围为5pM-2μM，最低检测限为1.7pM。
本发明首先通过酰胺键共价结合形成了一种双发射荧光复合材料，该材料在蓝光、红光处各有一个荧光发射峰，其制备方法简单高效，前后反应变化现象显著，易于观察，同时红色荧光信号比单一荧光信号强。不仅避免了受到各种变量的影响，同时也提高了荧光发光性能。其次，再利用半胱氨酸带有的巯基，进一步结合金簇表面未结合的位点，进一步增强GSH-AuNCs的荧光强度。最后，利用这种新型增强型双发射荧光复合材料检测Hg2+，具有较低的检测限和较宽的线性范围。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1)本发明引入了发光金属有机框架MIL-68(In)-NH2，利用其合适的孔径(开孔直径分别为
和
)、较大的比表面积和荧光性质，使其通过酰胺键与谷胱甘肽包裹的金簇共价结合形成双发射荧光复合材料，这种双发射荧光复合材料作为探针，由于发生FRET(荧光能量共振转移)，其红色荧光强度比单一荧光强度强。不仅避免了受到各种变量的影响，同时也提高了荧光发光性能。检测效果也相互不受干扰，且具有较高的灵敏度和选择性。
2)在紫外灯(365nm)下，MIL-68(In)-NH2呈现蓝色荧光，而GSH-AuNCs呈现深红色荧光，当它们组成多功能复合探针时，二者之间的荧光发射相互不受影响，两种荧光的颜色也发生了叠加，在365nm紫外激发下成为浅粉色荧光。由于两种荧光纳米探针MIL-68(In)-NH2和GSH-AuNCs分别呈现不同颜色的荧光发射，Hg2+作用前后反应变化现象显著，易于观察。
3)本发明进一步引入了半胱氨酸，利用半胱氨酸的巯基，进一步结合金簇表面未结合的位点，即Au-S键，以及表面静电吸附，从而形成新的复合材料Cys/GSH-AuNCs@MIL-68(In)-NH2，并且能够进一步增强GSH-AuNCs的荧光强度，在365nm紫外激发下成为亮粉色荧光。
4)最后，利用这种新型增强型双发射荧光复合材料检测Hg2+，由于Hg2+离子和Au+离子间的d10-d10金属键结合作用，从而改变Au NCs的电子结构，使得Hg2+可以有效地淬灭该纳米簇的荧光强度，同时，由于Hg2+和巯基间的强作用力，会进一步抑制该纳米簇的荧光强度。该复合材料检测Hg2+时，具有较低的检测限和较宽的线性范围，准确性好，灵敏度高。
附图说明
图1为材料的电镜表征图；其中，图A为GSH-AuNCs(谷胱甘肽包裹的金纳米团簇)的透射电镜图，图B为带有氨基的发光金属有机框架MIL-68(In)-NH2的扫描电镜图。
图2为GSH-AuNCs的紫外可见光谱图和荧光光谱图；其中，曲线a为GSH-AuNCs的荧光发射曲线(Ex370nm)，曲线b为GSH-AuNCs的荧光激发曲线(Em679nm)，曲线c为GSH-AuNCs的紫外吸收曲线，插图为GSH-AuNCs在可见光(左)和紫外灯(右)下的荧光对比图。
图3为增强型双发射荧光复合材料制备中涉及的四种物质的荧光光谱图；其中，曲线a为GSH-AuNCs的荧光发射曲线(Ex370nm)；曲线b为增强型双发射荧光复合材料Cys/GSH-AuNCs@MIL-68(In)-NH2的荧光发射曲线(Ex370nm)；曲线c为双发射荧光复合材料GSH-AuNCs@MIL-68(In)-NH2的荧光发射曲线(Ex370nm)；d为MIL-68(In)-NH2的荧光发射曲线(Ex370nm)，插图是在紫外灯(365nm)照射下四种物质的荧光对比图，插图中自左向右四张图片，依次为GSH-AuNCs(深红色)，MIL-68(In)-NH2(蓝色)，GSH-AuNCs@MIL-68(In)-NH2(浅粉红色)，Cys/GSH-AuNCs@MIL-68(In)-NH2(亮粉红色)。
图4为增强型双发射荧光复合材料Cys/GSH-AuNCs@MIL-68(In)-NH2探针检测Hg2+离子选择性的直方图；插图为紫外灯(365nm)照射下的荧光对比图。
图5为增强型双发射荧光复合材料Cys/GSH-AuNCs@MIL-68(In)-NH2探针检测Hg2+灵敏度的荧光光谱图；A图为检测浓度0-60μM范围内Hg2+对探针响应的荧光光谱图；B图为检测浓度5pM-60μM范围内Hg2+对探针响应的曲线图，即荧光强度差值与Hg2+浓度对数值Log c(μM)之间的曲线关系，纵坐标为668nm处荧光强度值与438nm处荧光强度值的差值，横坐标为Log c(μM)；插图C为检测浓度5pM-2μM范围内，荧光强度差值与Hg2+浓度对数值Log c(μM)之间的线性关系，纵坐标为668nm处荧光强度值与438nm处荧光强度值的差值，横坐标为Logc(μM)。
图6为增强型双发射荧光复合材料Cys/GSH-AuNCs@MIL-68(In)-NH2探针的形成以及检测Hg2+的机理图；按照图6中的箭头顺序：发射蓝色荧光的MIL-68(In)-NH2金属有机框架与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)活化后的具有红色荧光的GSH-AuNCs通过酰胺键结合后，形成具有两个荧光发射峰的荧光复合材料GSH-AuNCs@MIL-68(In)-NH2，并且红光发射峰的强度明显增强，呈现浅粉红色荧光；进一步引入半胱氨酸后，形成Cys/GSH-AuNCs@MIL-68(In)-NH2增强型双发射荧光复合材料，Cys/GSH-AuNCs@MIL-68(In)-NH2的红光发射峰的强度进一步增强，呈现亮粉红色荧光，当加入一定浓度的Hg2+，红色荧光被淬灭，只呈现MIL-68(In)-NH2的蓝色荧光。
具体实施方式
下面通过实施例具体地说明本发明，本发明中使用的原料、试剂均可以通过市面上购买。
实验仪器：透射电子显微镜(JEM-2100，JEOL Ltd.)，桌面型扫描电子显微镜(Netherlands)，荧光光谱仪(Fluoromax-4，Horiba，USA)，紫外可见光谱仪(UV-2450，Tokyo，Japan)，DF-101SA-H集热式恒温加热磁力搅拌器(南京科尔仪器设备有限公司)，KH-250B型超声波清洗器(昆山市禾创超声仪器有限公司)，真空干燥箱(DZF-6050，上海精宏实验设备有限公司)，IKA数显型圆周振荡器(MS 3digital，Germany)，85-1型磁力搅拌器(上海志威电器有限公司)。
实验试剂：氯金酸(HAuCl4·4H2O，上海国药集团化学试剂有限公司)，谷胱甘肽(GSH，阿拉丁)，氢氧化钠(NaOH，上海国药集团化学试剂有限公司)，甲醇(上海国药集团化学试剂有限公司)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，阿拉丁)，磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH值为7.0，50mM，新鲜制备)，半胱氨酸(Cys，上海国药集团化学试剂有限公司)，硝酸铟(In(NO3)3·xH2O，分子量为300.83，阿拉丁)，N，N-二甲基甲酰胺(DMF，上海国药集团化学试剂有限公司)，2-氨基对苯二甲酸(安耐吉)，硝酸汞(Hg(NO3)2，江苏泰兴化学试剂有限公司)，硝酸(上海国药集团化学试剂有限公司)。
实施例1
(1)制备发射红色荧光的谷胱甘肽包裹的金纳米团簇GSH-AuNCs：
在制备的过程中，所有玻璃器皿在使用前都用王水(HNO3∶HCl＝1∶3)进行彻底浸泡清洗，并用二次蒸馏水进一步冲洗后放入烘箱中干燥备用。在合成过程中，谷胱甘肽既是形成金纳米簇的保护剂又是还原剂。具体合成步骤如下：将0.02305g谷胱甘肽(GSH)溶解于5mL双蒸水中，在搅拌的同时加入2.06mL 1％HAuCl4·4H2O，剧烈搅拌2min后，用浓度为1M的NaOH水溶液缓慢调节pH至11，使其在37℃水浴条件下，缓慢搅拌反应24h，溶液变成深棕色，参阅图2中插图(左)。反应结束后，溶液中过量的谷胱甘肽可以利用甲醇反复洗涤，10000rpm离心7min除去。分离出的沉淀物室温下真空干燥18h，分散在双蒸水中，浓度为4mg/mL，并放在冰箱内保存备用。
GSH-AuNCs在紫外灯(365nm)下照射，呈现深红色荧光，参阅图2中插图(右)。通过透射电子显微镜图像(附图1A)中可以看出，GSH-AuNCs颗粒呈球形，分散性很好，平均半径在1.2nm左右。利用紫外可见分光光度计对GSH-AuNCs的紫外吸收进行检测：取50μL4mg/mL的谷胱甘肽包裹的金簇溶液，加入一定量的水，混合均匀后，置于两面透光的紫外可见石英比色皿中，将石英比色皿置于紫外可见分光光度计的样品槽内，开始检测紫外可见吸收强度和波长，得到紫外可见吸收光谱。紫外可见分光光度计参数设置为：紫外可见吸收范围为200nm-800nm，狭缝宽度为2nm。检测结束后，得到了图2中的c曲线，从曲线c中我们可以看出，在500nm左右不存在金纳米粒子的表面等离子体共振吸收峰，在500nm之前有一个宽广的吸收峰，表明所制备的金纳米簇中没有大颗粒的金纳米粒子或其它副产物的生成。
利用荧光光谱仪对产生的荧光信号进行检测：取50μL 4mg/mL的GSH-AuNCs，加入50μL 50mM的PBS(pH＝7)，再移取400μL的双蒸水，致总体积为500μL，混合均匀后，置于四面透光的荧光比色皿中，将荧光比色皿置于荧光光谱仪的样品槽内，开始检测其荧光强度和波长，得到荧光发射光谱。荧光光谱仪参数设置激发波长为370nm，得到了图2、3中的a曲线，从该曲线中，我们可以看出，GSH-AuNCs的最大发射峰位置为679nm。接着，将荧光光谱仪参数设置发射波长为679nm，得到了图2中的b曲线，从该曲线中，我们可以看出，GSH-AuNCs的最大激发波长为370nm。狭缝宽度皆为5nm。
(2)制备发射蓝色荧光的发光金属有机框架MIL-68(In)-NH2：
称取0.5776g In(NO3)3·xH2O和0.1168g 2-氨基对苯二甲酸，将两者一同溶解于6.2mLN，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，转移至反应釜中，磁力搅拌30min后，取出磁子，利用水热法，125℃下反应5h，得到MIL-68(In)-NH2粗产品。为了除去MIL-68(In)-NH2孔道中的客体分子，将合成后的样品在无水甲醇中于室温下搅拌3d，10000rpm离心5min后得到浅黄色粉末状的MIL-68(In)-NH2，倒掉上清液后，在100℃真空干燥12h，即得到MIL-68(In)-NH2。为了证明MIL-68(In)-NH2的合成，参阅图1B，显示一定的放大倍数的针状晶体。样品显示出宽1-2μm，长10-20μm的针状微晶。
称取0.002g的MIL-68(In)-NH2浅黄色粉末，超声均匀分散于2mL双蒸水中，即配制成1mg/mL的MIL-68(In)-NH2溶液，用移液枪移取200μL1mg/mL的MIL-68(In)-NH2溶液，移取4.8mL双蒸水，定容至5mL，混合均匀，即配制成0.04mg/mL的MIL-68(In)-NH2溶液。
MIL-68(In)-NH2在紫外灯(365nm)下照射，呈现蓝色荧光，参阅图3中插图(自左向右，第二张)。利用荧光光谱仪检测荧光信号：取50μL0.04mg/mL的MIL-68(In)-NH2溶液，加入50μL 50mM的PBS(pH＝7)，再移取400μL的双蒸水，致总体积为500μL，混合均匀后，置于四面透光的荧光比色皿中，将荧光比色皿置于荧光光谱仪的样品槽内，开始检测其荧光强度和波长，得到荧光发射光谱。荧光光谱仪参数设置激发波长为370nm，得到了图3中的d曲线，从该曲线中可以看出，MIL-68(In)-NH2的最大发射峰位置为428nm。狭缝宽度为5nm。
(3)制备双发射荧光复合材料GSH-AuNCs@MIL-68(In)-NH2：
移取3.5mL步骤(1)制得的4mg/mL的GSH-AuNCs，加入350μL的40mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液(EDC)，活化GSH-AuNCs表面的羧基，振荡器上震荡活化30min后，加入3.5mL 0.04mg/mL的MIL-68(In)-NH2，震荡混合15h，GSH-AuNCs与MIL-68(In)-NH2通过酰胺键共价结合，形成了双发射荧光复合材料GSH-AuNCs@MIL-68(In)-NH2分散液。
GSH-AuNCs@MIL-68(In)-NH2在紫外灯(365nm)下照射，呈现浅粉红色荧光，参阅图3中插图(自左向右，第三张)。利用荧光光谱仪检测荧光信号：取100μL的GSH-AuNCs@MIL-68(In)-NH2，加入50μL50mM的PBS(pH＝7)，再移取350μL的双蒸水，致总体积为500μL，并且此时，PBS终浓度为5mM，混合均匀后，置于四面透光的荧光比色皿中，将荧光比色皿置于荧光光谱仪的样品槽内，开始检测其荧光强度和波长，得到荧光发射光谱。荧光光谱仪参数设置激发波长为370nm，狭缝宽度为5nm。得到了图3中的c曲线，从该曲线中可以看出，形成双发射复合材料后，用370nm波长激发时，出现两个荧光发射峰，蓝光波长处的MIL-68(In)-NH2最大发射峰位置为438nm，红光波长处的GSH-AuNCs的最大发射峰位置为661nm。由图3中曲线a、c、d可以看出，形成双发射复合材料后，蓝光波长处的MIL-68(In)-NH2荧光发射峰从428nm红移至438nm，红光波长处的GSH-AuNCs荧光发射峰从679nm蓝移至661nm，证明MIL-68(In)-NH2转移了一部分的能量给了GSH-AuNCs，即在MIL-68(In)-NH2、GSH-AuNCs二者之间发生了荧光能量共振转移(FRET)，也证明了双发射荧光复合材料GSH-AuNCs@MIL-68(In)-NH2的成功制备。
(4)制备增强型双发射荧光复合材料Cys/GSH-AuNCs@MIL-68(In)-NH2：
取7mL步骤(3)中获得的GSH-AuNCs@MIL-68(In)-NH2分散液，加入7mL1.6mg/mL的半胱氨酸，加入3.5mL 50mM的PBS(pH＝7.0)，再移取14mL的双蒸水，混合均匀后，在40℃条件下，孵育40min，可以进一步增强GSH-AuNCs的荧光强度，形成Cys/GSH-AuNCs@MIL-68(In)-NH2增强型双发射荧光复合材料。
(5)Cys/GSH-AuNCs@MIL-68(In)-NH2在紫外灯(365nm)下照射，呈现亮粉红色荧光，参阅图3中插图(自左向右，第四张)。利用荧光光谱仪检测荧光信号：取450μL步骤4)中获得的Cys/GSH-AuNCs@MIL-68(In)-NH2复合材料于2mL塑料离心小管中，加入50μL双蒸水，致总体积为500μL，混合均匀后，将所得的500μL上述溶液置于四面透光的荧光比色皿中，将荧光比色皿置于荧光光谱仪的样品槽内，开始检测其荧光强度和波长，得到荧光发射光谱。荧光光谱仪参数设置激发波长为370nm，狭缝宽度为5nm。得到了图3中的b曲线，从该曲线可以看出，并且相比于图3中的c曲线，蓝光波长处的MIL-68(In)-NH2最大发射峰位置依旧为438nm不变，红光波长处的GSH-AuNCs的最大发射峰位置为668nm，证明了Cys和GSH-AuNCs之间发生了作用，致使发射峰位置从661nm红移至了668nm，证明成功合成了Cys/GSH-AuNCs@MIL-68(In)-NH2。
实施例2
(1)制备发射红色荧光的谷胱甘肽包裹的金纳米团簇GSH-AuNCs：
在制备的过程中，所有玻璃器皿在使用前都用王水(HNO3∶HCl＝1∶3)进行彻底浸泡清洗，并用二次蒸馏水进一步冲洗后放入烘箱中干燥备用。在合成过程中，谷胱甘肽既是形成金纳米簇的保护剂又是还原剂。具体合成步骤如下：将0.02295g谷胱甘肽(GSH)溶解于5mL双蒸水中，在搅拌的同时加入2.06mL 1％HAuCl4·4H2O，剧烈搅拌2min后，用浓度为1M的NaOH水溶液缓慢调节溶液pH值至11，使其在35℃水浴条件下，缓慢搅拌反应20h，溶液变成深棕色。反应结束后，溶液中过量的谷胱甘肽可以利用甲醇反复洗涤，10000rpm离心7min除去。分离出的沉淀物室温下真空干燥18h，分散在双蒸水中，浓度为4mg/mL，并放在冰箱内保存备用。
GSH-AuNCs在紫外灯(365nm)下照射，呈现深红色荧光，参阅图2中插图(右)。GSH-AuNCs颗粒呈球形，分散性很好，平均半径在1.2nm左右。
(2)制备发射蓝色荧光的带有氨基的发光金属有机框架MIL-68(In)-NH2：
称取0.5786g In(NO3)3·xH2O和0.1172g 2-氨基对苯二甲酸，将两者一同溶解于6.2mL N，N-二乙基甲酰胺中，转移至反应釜中，磁力搅拌30min后，取出磁子，利用水热法，120℃下反应24h，得到MIL-68(In)-NH2粗产品。为了除去MIL-68(In)-NH2孔道中的客体分子，将合成后的样品在无水甲醇中于室温下搅拌3d，10000rpm离心5min后得到浅黄色粉末状的MIL-68(In)-NH2，倒掉上清液后，在100℃真空干燥12h，即得到MIL-68(In)-NH2。为了证明MIL-68(In)-NH2的合成，参阅图1B，显示一定的放大倍数的针状晶体。样品显示出宽1-2μm，长10-20μm的针状微晶。
(3)制备双发射荧光复合材料GSH-AuNCs@MIL-68(In)-NH2：
移取3.5mL步骤(1)制得的4mg/mL的GSH-AuNCs，加入350μL的40mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液(EDC)，活化GSH-AuNCs表面的羧基，振荡器上震荡活化30min后，加入3.5mL0.08mg/mL的MIL-68(In)-NH2，震荡混合18h，GSH-AuNCs与MIL-68(In)-NH2通过酰胺键共价结合，形成了双发射荧光复合材料GSH-AuNCs@MIL-68(In)-NH2分散液。
(4)制备增强型双发射荧光复合材料Cys/GSH-AuNCs@MIL-68(In)-NH2：
取7mL步骤(3)中获得的GSH-AuNCs@MIL-68(In)-NH2分散液，加入7mL2.0mg/mL的半胱氨酸，加入3.5mL 50mM的PBS(pH＝7.0)，再移取14mL的双蒸水，混合均匀后，在40℃条件下，孵育40min，可以进一步增强GSH-AuNCs的荧光强度，形成Cys/GSH-AuNCs@MIL-68(In)-NH2增强型双发射荧光复合材料。
实施例3
(1)制备发射红色荧光的谷胱甘肽包裹的金纳米团簇GSH-AuNCs：
在制备的过程中，所有玻璃器皿在使用前都用王水(HNO3∶HCl＝1∶3)进行彻底浸泡清洗，并用二次蒸馏水进一步冲洗后放入烘箱中干燥备用。在合成过程中，谷胱甘肽既是形成金纳米簇的保护剂又是还原剂。具体合成步骤如下：将0.02309g谷胱甘肽(GSH)溶解于5mL双蒸水中，在搅拌的同时加入2.06mL 1％HAuCl4·4H2O，剧烈搅拌2min后，用浓度为1M的NaOH水溶液缓慢调节溶液pH值至13，使其在40℃水浴条件下，缓慢搅拌反应15h，溶液变成深棕色。反应结束后，溶液中过量的谷胱甘肽可以利用甲醇反复洗涤，10000rpm离心7min除去。分离出的沉淀物室温下真空干燥18h，分散在双蒸水中，浓度为4mg/mL，并放在冰箱内保存备用。
GSH-AuNCs在紫外灯(365nm)下照射，呈现深红色荧光，参阅图2中插图(右)。GSH-AuNCs颗粒呈球形，分散性很好，平均半径在1.4nm左右。
(2)制备发射蓝色荧光的带有氨基的发光金属有机框架MIL-68(In)-NH2：
称取0.5776g In(NO3)3·xH2O和0.1168g 2-氨基对苯二甲酸，将两者一同溶解于6.2mL N，N-二乙基甲酰胺中，转移至反应釜中，磁力搅拌30min后，取出磁子，利用水热法，130℃下反应5h，得到MIL-68(In)-NH2粗产品。为了除去MIL-68(In)-NH2孔道中的客体分子，将合成后的样品在无水甲醇中于室温下搅拌3d，10000rpm离心5min后得到浅黄色粉末状的MIL-68(In)-NH2，倒掉上清液后，在100℃真空干燥12h，即得到MIL-68(In)-NH2。为了证明MIL-68(In)-NH2的合成，参阅图1B，显示一定的放大倍数的针状晶体。样品显示出宽1-2μm，长10-20μm的针状微晶。
(3)制备双发射荧光复合材料GSH-AuNCs@MIL-68(In)-NH2：
移取3.5mL步骤(1)获得的4mg/mL的GSH-AuNCs，加入350μL的40mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液(EDC)，活化GSH-AuNCs表面的羧基，振荡器上震荡活化40min后，加入3.5mL 0.027mg/mL的MIL-68(In)-NH2，震荡混合12h，GSH-AuNCs与MIL-68(In)-NH2通过酰胺键共价结合，形成了双发射荧光复合材料GSH-AuNCs@MIL-68(In)-NH2分散液。
(4)制备增强型双发射荧光复合材料Cys/GSH-AuNCs@MIL-68(In)-NH2：
取7mL步骤(3)中获得的GSH-AuNCs@MIL-68(In)-NH2分散液，加入7mL1.2mg/mL的半胱氨酸，加入3.5mL 50mM的PBS(pH＝7.0)，再移取14mL的双蒸水，混合均匀后，在40℃条件下，孵育40min，可以进一步增强GSH-AuNCs的荧光强度，形成Cys/GSH-AuNCs@MIL-68(In)-NH2增强型双发射荧光复合材料。
实施例4
利用本发明的Cys/GSH-AuNCs@MIL-68(In)-NH2增强型双发射复合材料进行Hg2+离子的检测，方法如下：
1)配置Hg2+浓度分别为0.1nM、1nM、0.01μM、0.1μM、1μM、0.01mM、0.1mM、1mM的汞离子溶液。
2)取多份450μL实施例1步骤4)中获得的增强型双发射荧光复合材料Cys/GSH-AuNCs@MIL-68(In)-NH2，分装置于多个2mL塑料离心小管中，每次测量前，从低浓度至高浓度依次加入不同浓度的Hg2+离子及双蒸水，终体积为500μL，溶液混匀后，在室温下反应60s，然后，利用荧光光谱仪检测荧光信号：将所得的500μL上述溶液置于四面透光的荧光比色皿中，将荧光比色皿置于荧光光谱仪的样品槽内，开始检测其荧光强度和波长，得到荧光发射光谱。荧光光谱仪参数设置激发波长为370nm，狭缝宽度为5nm。其最终检测结果可参阅附图5A，增强型双发射荧光复合材料探针检测Hg2+灵敏度的荧光光谱图，从图5A中可以看出，在0-60μM范围内，随着Hg2+浓度的增加，发光金属有机框架处的荧光发射峰(即蓝色的荧光)强度几乎保持不变，而，由于Hg2+和Au+间的d10-d10金属键结合作用以及Hg2+和巯基间的强作用力，Cys/GSH-AuNCs处的荧光发射峰(即红色的荧光)强度逐渐降低，直至淬灭。
4)Hg2+能够有效淬灭Cys/GSH-AuNCs处的荧光发射峰(即红色的荧光)，而发光金属有机框架处的荧光发射峰(即蓝色的荧光)强度几乎保持不变。利用红色和蓝色荧光强度的差值和Hg2+浓度对数值Log c(μM)之间的关系，实现对测试样品中汞离子的检测。其最终检测结果可参阅附图5B，图5B中纵坐标为红色荧光发射峰强度(FL668nm)与蓝色荧光发射峰强度(FL438nm)的差值，该复合材料的检测范围为0-60μM，并且，在浓度范围为5pM-2μM内，荧光信号强度的差值和Hg2+浓度对数值Log c(μM)之间有很好的线性关系，检测结果可参阅附图5B，Hg2+浓度在5pM-2μM时，最低检测限为1.7pM(信噪比为3)，这一实验结果同样比世界健康组织(WHO)和美国环境保护部门(U.S.EPA)分别对Hg2+在饮用水中规定的MCL(WHO，6ppb)和(U.S.EPA，2ppb)都要低得多。荧光信号强度的差值与Hg2+浓度的对数值Log c(μM)呈良好的线性关系，其线性方程为：FL＝50975.58782-44160.04686logc(Hg2+)(μM)，线性相关系数为0.99406，可以看出，该复合荧光材料对Hg2+具有很好的灵敏度，并且具有较宽的线性范围以及较低的检测限。
5)另外，参照步骤1)-4)的操作及基本相同的反应条件，还对其它金属离子Cd2+、Zn2+、Hg2+、Cu2+、Fe3+、Co2+、pb2+、Cr3+、Fe3+、Mg2+、Sn2+、Ni2+十二种离子进行比对性的检测，其最终检测结果可参阅附图4，图4为该双发射荧光复合材料探针检测Hg2+离子选择性的直方图，其中纵坐标为蓝色荧光发射峰强度(FL438nm)与红色荧光发射峰强度(FL668nm)的比值；插图为紫外灯(365nm)照射下的荧光对比图。其中，Hg2+采取最大浓度60μM、Cu2+、Pb2+的浓度为100μM，其它金属离子浓度为200μM，从图4可以看出，Hg2+相对于其它离子具有不同的荧光发射峰强度的比值，从插图可以看出，只有Hg2+可以淬灭红光处的荧光，只呈现出蓝色的荧光，证明该复合材料对Hg2+具有很好的选择性。
图6为增强型双发射荧光复合材料Cys/GSH-AuNCs@MIL-68(In)-NH2探针的形成以及检测Hg2+的机理图。按照图6中的箭头顺序：发射蓝色荧光的MIL-68(In)-NH2金属有机框架与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)活化后的具有红色荧光的GSH-AuNCs通过酰胺键结合后，形成具有两个荧光发射峰的荧光复合材料GSH-AuNCs@MIL-68(In)-NH2，并且红光发射峰的强度明显增强，呈现浅粉红色荧光；进一步引入半胱氨酸后，形成Cys/GSH-AuNCs@MIL-68(In)-NH2增强型双发射荧光复合材料，Cys/GSH-AuNCs@MIL-68(In)-NH2的红光发射峰的强度进一步增强，呈现亮粉红色荧光，当加入一定浓度的Hg2+，红色荧光被淬灭，只呈现MIL-68(In)-NH2的蓝色荧光。
本发明所制备的Cys/GSH-AuNCs@MIL-68(In)-NH2增强型双发射荧光复合材料具有很好的荧光性质，并且该增强型双发射荧光材料应用于Hg2+检测时，具有高的选择性，可以实现Hg2+高灵敏度的快速检测，而且具有较宽的线性范围以及较低的检测限。
以上描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种变型，这些变型均属于本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种增强型双发射荧光复合材料，其特征在于，该增强型双发射荧光复合材料由谷胱甘肽包裹的金纳米团簇GSH-AuNCs与发光金属有机框架MIL-68(In)-NH2通过酰胺键共价结合形成GSH-AuNCs@MIL-68(In)-NH2，然后将GSH-AuNCs@MIL-68(In)-NH2与半胱氨酸共孵育形成，所述GSH-AuNCs@MIL-68(In)-NH2的制备方法包括以下步骤：
1）将活化羧基后的谷胱甘肽包裹的金纳米团簇与发光金属有机框架MIL-68(In)-NH2于室温下震荡混合12-18h，使GSH-AuNCs与MIL-68(In)-NH2通过酰胺键共价结合形成双发射荧光复合材料GSH-AuNCs@MIL-68(In)-NH2；
2）将步骤1）制得的GSH-AuNCs@MIL-68(In)-NH2与半胱氨酸在pH为6.0~7.4的缓冲液中混合均匀，37~43 ℃下共孵育35~45min，制得增强型双发射荧光复合材料Cys/GSH-AuNCs@MIL-68(In)-NH2。
2.根据权利要求1所述的增强型双发射荧光复合材料，其特征在于，所述GSH-AuNCs@MIL-68(In)-NH2由质量比为1：50~150的MIL-68(In)-NH2与GSH-AuNCs通过酰胺键共价结合形成。
3.根据权利要求1所述的增强型双发射荧光复合材料，其特征在于，所述增强型双发射荧光复合材料是由质量比为1：0.6~1的GSH-AuNCs@MIL-68(In)-NH2与半胱氨酸共孵育形成。
4.根据权利要求1所述的增强型双发射荧光复合材料，其特征在于，所述谷胱甘肽包裹的金纳米团簇中，金纳米团簇的粒径为1.0~1.4nm。
5.一种权利要求1~4中任意一项所述的增强型双发射荧光复合材料的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤：
1）将活化羧基后的谷胱甘肽包裹的金纳米团簇与发光金属有机框架MIL-68(In)-NH2于室温下震荡混合12-18h，使GSH-AuNCs与MIL-68(In)-NH2通过酰胺键共价结合形成双发射荧光复合材料GSH-AuNCs@MIL-68(In)-NH2；
2）将步骤1）制得的GSH-AuNCs@MIL-68(In)-NH2与半胱氨酸在pH为6.0~7.4的缓冲液中混合均匀，37~43 ℃下共孵育35~45min，制得增强型双发射荧光复合材料Cys/GSH-AuNCs@MIL-68(In)-NH2。
6.根据权利要求5所述的增强型双发射荧光复合材料的制备方法，其特征在于，所述活化羧基后的谷胱甘肽包裹的金纳米团簇的制备方法包括以下步骤：
1）将谷胱甘肽与氯金酸在水中混合均匀，调节pH值至11~13，35~40℃搅拌反应15~24h，分离产物中的固体物质，洗涤，干燥，制得谷胱甘肽包裹的金纳米团簇GSH-AuNCs；
2）用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液震荡活化步骤1）制得的谷胱甘肽包裹的金纳米团簇GSH-AuNCs 30~40min，活化谷胱甘肽包裹金纳米团簇GSH-AuNCs表面的羧基。
7.根据权利要求5所述的增强型双发射荧光复合材料的制备方法，其特征在于，所述带有氨基的发光金属有机框架MIL-68(In)-NH2的制备方法包括：将In(NO3)3•xH2O和2-氨基对苯二甲酸在N,N-二甲基甲酰胺或N,N-二乙基甲酰胺中溶解后，在反应釜中120~130℃水热反应5~24h。
8.权利要求1~4中任意一项所述的增强型双发射荧光复合材料在双发射比率荧光法检测Hg2+中的应用。
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