CN113933274A - 基于铕掺杂碳点的比率荧光分子印迹壳聚糖凝胶球、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于铕掺杂碳点的比率荧光分子印迹壳聚糖凝胶球、其制备方法及应用，属于纳米材料与环境监测技术领域。本发明的基于铕掺杂碳点的比率荧光分子印迹壳聚糖凝胶球是以铕掺杂碳量子点为荧光信号，壳聚糖为分子印迹载体，环氧氯丙烷为交联剂，四环素为模板分子，结合分子印迹技术和凝胶球制备技术制得。该基于铕掺杂碳点的比率荧光分子印迹壳聚糖凝胶球随着四环素浓度的变化，会产生明显的比率荧光信号变化，在紫外灯下可用肉眼观察到比率荧光分子印迹壳聚糖凝胶球发光颜色的变化，结合安装在智能手机中的颜色扫描应用程序，实现对四环素的实时、现场视觉、高灵敏度、环保检测。

Description

基于铕掺杂碳点的比率荧光分子印迹壳聚糖凝胶球、其制备 方法及应用

技术领域

本发明属于纳米材料与环境监测技术领域，具体涉及一种基于铕掺杂碳点的比率荧光分子印迹壳聚糖凝胶球、其制备方法及应用。

背景技术

四环素作为一种重要的抗生素，由于其优良的抗菌性能和治疗效果，已广泛应用于动物养殖业和治疗由细菌和病原微生物感染引起的疾病。然而，由于TC产品的过度消费，对动物产品、水环境和土壤造成了严重的负面影响。此外，TC的滥用也会带来细菌耐药性，这已成为全世界公共卫生的一大威胁。许多国家已经降低了其产品中TC的最大残留限量(MRL)。随着人们对环境质量和公共卫生的日益关注，快速、充分地检测四环素的TC残留对于食品、药品和环境的简单应用具有重要意义。

迄今为止，各种分析方法，尤其是传统技术已被用于TC检测，包括高效液相色谱法、毛细管电泳、液相色谱-质谱、电化学分析和酶联免疫分析。这些方法在发挥自身优势的同时，也存在着仪器昂贵、复杂、样品提取过程繁琐等缺点，严重制约了它们的实际应用。因此，迫切需要一种快速、简便、实时的环境中TC残留检测方法。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种基于铕掺杂碳点的比率荧光分子印迹壳聚糖凝胶球的制备方法，步骤如下：

(1)将壳聚糖溶解在醋酸水溶液中同时加入四环素溶液，混合均匀后，添加铕掺杂碳量子点比率荧光探针和交联剂；30～40℃，搅拌反应8～10小时；反应结束后，获得水凝胶溶液；

(2)将水凝胶溶液逐滴滴加到NaOH水溶液中，获得壳聚糖凝胶球，反复洗涤除去四环素模板分子，即得基于铕掺杂碳点的比率荧光分子印迹壳聚糖凝胶球。

上述基于铕掺杂碳点的比率荧光分子印迹壳聚糖凝胶球的制备方法中，所述铕掺杂碳量子点比率荧光探针是以柠檬酸为碳源，三聚氰胺为氮源，加入Eu(NO₃)₃·6H₂O和甲醛，进行水热反应后制得，具体制备方法如下：

取8.0～12mmol柠檬酸和0.2～0.3mmol三聚氰胺溶解在水中，然后添加0～1000μL甲醛溶液和300～800mg Eu(NO₃)₃·6H₂O；溶液充分混合后，在180～220℃，反应5～10h；反应结束后冷却至室温，所得溶液通过过滤，透析，去除分子量小于1000Da的小分子；干燥，即得铕掺杂碳量子点比率荧光探针粉末。

所述交联剂为环氧氯丙烷或戊二醛。

上述基于铕掺杂碳点的比率荧光分子印迹壳聚糖凝胶球的制备方法，所述壳聚糖的用量为0.3～0.8g；所述铕掺杂碳量子点比率荧光探针的添加量为1.0～4.0mg；所述交联剂的添加量为400μL-800μL。

在一个具体的实施例中，所述的醋酸水溶液浓度为2％(v/v)。

在一个具体的实施例中，所述的NaOH水溶液的浓度为0.5M。

在一个具体的实施例中，所述的四环素模板分子的去除采用乙醇:乙腈体积比为8:2的混合溶液反复洗涤。

本发明的目的之二是在于提供上述方法制备的基于铕掺杂碳点的比率荧光分子印迹壳聚糖凝胶球。上述方法制备的基于铕掺杂碳点的比率荧光分子印迹壳聚糖凝胶球粒径约为0.2cm；具有更低的检测限，携带方便，特异识别四环素后具有丰富的颜色变化，可以实现对四环素的现场可视化检测。

本发明的目的之三在于提供上述基于铕掺杂碳点的比率荧光分子印迹壳聚糖凝胶球在四环素和/或铝离子检测中的应用，具体是用于四环素和/或铝离子的检测方法或用于制备检测四环素和/或铝离子的试剂。

本发明的目的之四在于提供一种检测四环素的方法，步骤如下：

(1)将上述的基于铕掺杂碳点的比率荧光分子印迹壳聚糖凝胶球添加到不同浓度的四环素标准溶液中；

(2)采用荧光光谱法在380nm的激发下记录四环素不同浓度的标准溶液486nm和620nm处的荧光强度；

(3)将步骤(2)得到的实验数据整理作图，以I₆₂₀/I₄₈₆的强度比作为纵坐标，四环素浓度作为横坐标，获得四环素浓度与I₆₂₀/I₄₈₆强度比的线性方程；

(4)将待测样品溶液与上述的基于铕掺杂碳点的比率荧光分子印迹壳聚糖凝胶球混合；采用荧光光谱法在380nm的激发下，获得待测溶液的486nm和620nm处的荧光强度，计算I₆₂₀/I₄₈₆，代入步骤(3)获得的线性方程，计算获得待测样品溶液中四环素的含量。

在一个具体的实施例中，所述基于铕掺杂碳点的比率荧光分子印迹壳聚糖凝胶球与待测样品溶液的混合比例为1:1(g:mL)。

本发明的目的之五在于提供一种智能手机作为信号读取器的四环素检测方法，步骤如下：

1)将上述的基于铕掺杂碳点的比率荧光分子印迹壳聚糖凝胶球添加到不同浓度的四环素标准溶液中；

(2)在智能手机上下载安装颜色扫描应用程序；

(3)采用智能手机上的颜色扫描应用程序拍摄在紫外灯下不同四环素浓度的标准溶液中壳聚糖凝胶球的颜色，并对获得的荧光颜色进行数字化和输出，获得R G B值；用R/B作为纵坐标，四环素的浓度作为横坐标，获得四环素浓度与R/B的线性方程；

(4)将待测样品溶液与上述的基于铕掺杂碳点的比率荧光分子印迹壳聚糖凝胶球混合；用智能手机上的颜色扫描应用程序拍摄在紫外灯下壳聚糖凝胶球的颜色，并对获得的荧光颜色进行数字化和输出，获得R G B值；计算R/B；将R/B的数值代入步骤(3)获得的线性方程，计算获得待测样品溶液中四环素的含量。

值得说明的是，以上关于原料用量的表述，仅为实验室的操作用量，而不是对其用量的绝对限定，本领域技术人员应当理解，在实际生产中，可以根据生产规模，按照上述比例调整用量。

本发明用于检测四环素的方法适用于水溶液等基质样品，例如水体、牛奶；固态的样品可以制备成水溶液的形式，或经过滤去除不溶于水的成分后进行检测。

本发明技术方案的优点：

本发明通过将碳量子点与分子印迹技术相结合，研制了一种新型、便于携带、选择性高、检测限低、环境友好的四环素检测传感器。主要是以铕掺杂碳量子点为荧光信号，壳聚糖为分子印迹载体，环氧氯丙烷为交联剂，四环素为模板分子，结合分子印迹技术和凝胶球制备技术制得基于铕掺杂碳点的比率荧光分子印迹壳聚糖凝胶球，其粒径约为0.2cm。该基于铕掺杂碳点的比率荧光分子印迹壳聚糖凝胶球随着四环素浓度的变化，会产生明显的比率荧光信号变化，在紫外灯下可用肉眼观察到丰富的颜色变化，因而，可以将制备的凝胶球作为便携式产品，实现对四环素(TC)的实时、现场可视化、高灵敏度、高选择性、环保检测。

此外，可以通过使用带有易于访问的彩色扫描应用程序的智能手机实现TC的半定量分析。结合安装在智能手机中的Color Picker APP Colorimeter可以将荧光图像的红色、绿色和蓝色(RGB)通道转换为数字值，利用凝胶球在TC检测过程中丰富的颜色变化，不需要利用昂贵的仪器和熟练操作的人员，便可以快速方便的实现TC的现场可视化检测和半定量分析；本发明运用的主要原材料壳聚糖是一种从自然界提取的天然产物，既用作分子印迹凝胶球的主要材料，同时也可以作为四环素的吸附材料，可大幅降低四环素的检测限。这一体系的设计体现了从自然、为自然、融入自然的可持续发展理念，为四环素类抗生素污染源控制、环境规划与治理、公众健康与安全保护提供技术支持。

附图说明

图1为本发明实施例2合成的Eu-CDs的透射电镜图(TEM)和高分辨图。

图2为本发明实施例2合成的Eu-CDs的荧光发射图(FL)；

图3为本发明实施例2合成的Eu-CDs的x射线光电子能谱图(XPS)；

图4为本发明实施例2合成的Eu-CDs@MIP的扫描电镜图(SEM)；

图5为不同壳聚糖的添加量对制备的Eu-CDs@MIP的形态的影响；

图6为实施例2合成的Eu-CDs@MIP检测不同浓度的四环素获得的荧光光谱图和线性关系图；

图7为Eu-CDs@MIP结合智能手机检测四环素的线性关系图；

图8为Eu-CDs@MIP对四环素的特异性检测图；

图9为Eu-CDs@MIP检测四环素及其类似物的线性对比图；

图10为Eu-CDs@MIP检测TC的发光原理图；

图11为TC诱导Eu-CDs猝灭的机理；

图12为金属阳离子对Eu-CDs@MIP+TC混合体系的影响。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

本发明提供的Eu-CDs@MIP的制备以及TC使其荧光发生改变的原理为：

以柠檬酸(C₆H₈O₇)为碳源，三聚氰胺(C₃H₆N₆)为氮源，加入钝化剂甲醛(HCHO)和稀土化合物Eu(NO₃)₃·6H₂O，采用一步水热法制备了蓝色发光的Eu³⁺掺杂CDs(Eu-CDs)。该碳量子点与四环素作用后，基于内部过滤效应(IFE)和Eu³⁺-TC的“天线效应”，使碳量子点的蓝色荧光逐渐淬灭，掺杂铕元素的特征红色荧光逐渐增强(λem＝620nm)，产生基于四环素含量的比率荧光信号变化。随后，以Eu-CDs为荧光信号，壳聚糖为分子印迹载体，环氧氯丙烷为交联剂，四环素为模板分子，在乙酸水溶液中进行预组织反应，形成分子印迹聚合物的混合凝胶体系。然后，将混合凝胶体系滴入NaOH溶液中固化构建Eu-CDs@MIP+TC壳聚糖凝胶球，洗脱除去模板分子TC后，得到基于铕掺杂碳点的比率荧光分子印迹壳聚糖凝胶球。该凝胶球具有与TC分子特异性匹配的识别空间，在识别TC后壳聚糖凝胶球在486nm(Eu-CDs结合四环素后荧光发生红移)处的蓝色荧光发射光谱逐渐淬灭，在620nm处的红色荧光逐渐增强，同时凝胶球在紫外灯下的颜色从蓝色逐渐变为红色。可实现四环素分子的高选择性可视化现场检测。

采用洗脱TC模板分子后的铕掺杂碳点的比率荧光分子印迹壳聚糖凝胶球检测牛奶等样品中四环素的含量，并通过应用商店，在智能手机上下载颜色扫描应用程序，在紫外灯下观察凝胶球的颜色变化，采集凝胶球的荧光颜色进行数字化和输出，获得R/B值，对照标准曲线，获得待测样品中四环素的含量。

实施例1

一种基于铕掺杂碳点的比率荧光分子印迹壳聚糖凝胶球的制备方法，步骤如下：

(1)称取1536mg(8.0mmol)柠檬酸和25.2mg(0.2mmol)三聚氰胺溶解在10mL超纯水中，然后添加560μL甲醛溶液(甲醛浓度为8.0mmol/L)和300mg Eu(NO₃)₃·6H₂O(99.99％)。将溶液充分混合，转移到25mL聚四氟乙烯内衬不锈钢高压釜中，并在220℃下保持10小时。冷却至室温后，所得深黄色溶液通过0.22μm的过滤膜过滤，滤液用透析袋(切断分子量为1000Da)在超纯水中进一步透析24小时，每隔6小时更新一次水以去除小分子。随后，通过蒸发透析袋内的溶液并在80℃下干燥，获得Eu-CDs粉末。

(2)称取0.3g壳聚糖溶解在15mL醋酸水溶液(2％，v/v)中同时加入4mL TC溶液(400mg·L^-1)，在室温下剧烈搅拌3小时。随后，添加1.0mg步骤(1)制备的Eu-CDs和400μL环氧氯丙烷。之后，密封圆底烧瓶，放置于40℃恒温控制油浴中，800r/min搅拌反应8小时。反应结束时，将水凝胶溶液逐滴添加到含有500mL NaOH(0.5M)水溶液的烧杯中，制备了以TC为印迹模板，Eu-CDs为荧光标记的壳聚糖凝胶球，用乙醇：乙腈体积比为8:2混合溶液反复洗涤除去TC模板分子，即得基于铕掺杂碳点的比率荧光分子印迹壳聚糖凝胶球。

实施例2

一种基于铕掺杂碳点的比率荧光分子印迹壳聚糖凝胶球的制备方法，步骤如下：

(1)称取1920mg(10.0mmol)柠檬酸和31.5mg(0.25mmol)三聚氰胺溶解在10mL超纯水中，然后添加560μL甲醛溶液(甲醛浓度为8.0mmol/L)和500mg Eu(NO₃)₃·6H₂O(99.99％)。将溶液充分混合，转移到25mL聚四氟乙烯内衬不锈钢高压釜中，在220℃的温度下反应10h小时冷却至室温后，所得深黄色溶液通过0.22μm的过滤膜过滤，滤液用透析袋(切断分子量为1000Da)在超纯水中进一步透析24小时，每隔6小时更新一次水以去除小分子。随后，通过蒸发透析袋内的溶液并在80℃下干燥，获得Eu-CDs粉末。

上述步骤(1)合成的Eu-CDs的透射电镜图(TEM)和高分辨图如图1所示：用TEM对上述步骤(1)合成的Eu-CDs的形貌和微观结构进行了表征，如图1中a可以看出，Eu-CDs为均匀分布的球形纳米颗粒，直径范围为1.0-3.0nm，平均粒径为2.0nm。从HRTEM图像(图1中b)进一步仔细观察表明，Eu-CDs呈现明显的晶格条纹，晶格间距为0.20nm。

为了探究Eu-CDs的荧光性质，用荧光光谱法测试了Eu-CDs在300～410nm不同激发波长下的荧光发射光谱，如图2所示，可以观察到Eu-CDs在350nm激发下，在420nm处获得最强荧光发射。分别在自然光和紫外灯照射下(图2右上方小图)观察，在365nm紫外灯照射下，Eu-CDs显示出明亮的蓝色发光。

为了进一步确认Eu-CDs的元素组成和化学键，进行了XPS测量，如图3所示。图3中a所示，XPS全扫描光谱在281.08,398.08,537.08和1131.08eV处显示四个明显的峰，归因于C1s、N1s、O1s和Eu3d，元素含量分别为60.11％,2.99％,33.03％和3.87％。高含量的Eu证实了Eu在CDs中的成功掺杂。在高分辨率光谱中(图3b-e)，C1s波段可以在284.7,285.7和288.4eV处反褶积成三个峰值，分别对应于C-C/C＝C，C-N/C-O和C＝O基团；在N1s光谱中，399.9和401.5eV处的峰对应于N-C和N-H基团；O1s波段在531.2，532.0和532.9eV，可以反褶积成三个峰值，分别归属于C＝O和C-OH基团。Eu3d在1134.0和1164.0eV分别归因于3d_5/2和3d_3/2结构的光电发射。高分辨率Eu3d光谱由四个峰组成，分别为Eu³⁺(1165.0和1135.4eV)和Eu²⁺(1155.0和1125.5eV)。

(2)称取0.5g壳聚糖溶解在15mL醋酸水溶液(2％，v/v)中同时加入5mL TC溶液(400mg·L^-1)，在室温下剧烈搅拌3小时。随后，添加2.0mg步骤(1)制备的Eu-CDs和400μL环氧氯丙烷。之后，密封圆底烧瓶，放置于40℃恒温控制油浴中，800r/min搅拌反应8小时。反应结束时，将水凝胶溶液逐滴添加到含有500mL NaOH(0.5M)水溶液的烧杯中，制备了以TC为印迹模板，Eu-CDs为荧光标记的壳聚糖凝胶球，用乙醇：乙腈体积比为8:2混合溶液反复洗涤除去TC模板分子，即得基于铕掺杂碳点的比率荧光分子印迹壳聚糖凝胶球(Eu-CDs@MIP)。

对比例1

一种基于铕掺杂碳点的比率荧光分子非印迹壳聚糖凝胶球的制备方法，步骤如下：

称取0.5g壳聚糖溶解在15mL醋酸水溶液(2％，v/v)中，在室温下剧烈搅拌3小时。随后，添加2.0mg Eu-CDs(实施例2步骤(1)制备的Eu-CDs)和2mL环氧氯丙烷。之后，密封圆底烧瓶，放置于40℃恒温控制油浴中，800r/min搅拌反应8小时。反应结束时，将水凝胶溶液逐滴添加到含有500mL NaOH(0.5M)水溶液的烧杯中，制备了非印记壳聚糖凝胶球(Eu-CDs@NIP)。

将实施例2制备的Eu-CDs@MIP与对比例1制备的Eu-CDs@NIP进行扫描电镜观察，如图4所示，利用SEM对Eu-CDs@MIP和Eu-CDs@NIP进行了形态结构表征。很明显，它们的表面形态是完全不同的。Eu-CDs@MIP表面的在洗脱过程中留下纳米级孔，并且纳米结构排列较松散(图4左)。然而，由于没有添加印迹分子，Eu-CDs@NIP表面光滑，没有观察到表面的纳米结构(图4右)。

实施例3

一种基于铕掺杂碳点的比率荧光分子印迹壳聚糖凝胶球的制备方法，步骤如下：

(1)称取2304mg(12.0mmol)柠檬酸和37.8mg(0.3mmol)三聚氰胺溶解在10mL超纯水中，然后添加560μL甲醛溶液(甲醛浓度为8.0mmol/L)和800mg Eu(NO₃)₃·6H₂O(99.99％)。将溶液充分混合，转移到25mL聚四氟乙烯内衬不锈钢高压釜中，在220℃的温度下反应10h小时冷却至室温后，所得深黄色溶液通过0.22μm的过滤膜过滤，滤液用透析袋(切断分子量为1000Da)在超纯水中进一步透析24小时，每隔6小时更新一次水以去除小分子。随后，通过蒸发透析袋内的溶液并在80℃下干燥，获得Eu-CDs粉末。

(2)称取0.8g壳聚糖溶解在15mL醋酸水溶液(2％，v/v)中同时加入5mL TC溶液(400mg·L^-1)，在室温下剧烈搅拌3小时。随后，添加2.0mg步骤(1)制备的Eu-CDs和400μL环氧氯丙烷。之后，密封圆底烧瓶，放置于40℃恒温控制油浴中，800r/min搅拌反应8小时。反应结束时，将水凝胶溶液逐滴添加到含有500mL NaOH(0.5M)水溶液的烧杯中，制备了以TC为印迹模板，Eu-CDs为荧光标记的壳聚糖凝胶球，用乙醇：乙腈体积比为8:2混合溶液反复洗涤除去TC模板分子，即得基于铕掺杂碳点的比率荧光分子印迹壳聚糖凝胶球。

实施例4

不同壳聚糖用量对制备的基于铕掺杂碳点的比率荧光分子印迹壳聚糖凝胶球的形态的影响。

分别将不同质量(0.4g、0.5g、0.6g、0.7g)壳聚糖溶解在15mL醋酸水溶液中(2％,v/v)，并加入5mL的TC溶液(400mg·L^-1)，然后在室温下搅拌，使TC和壳聚糖预组装3h。随后，加入实施例2步骤(1)制备的2.0mg Eu-CDs，在搅拌下加入400μL环氧氯丙烷。将圆底烧瓶密封，置于40℃恒温控制油浴中8h。交联反应结束后，将Eu-CDs@MIP水凝胶溶液滴加到含有500mL NaOH水溶液(0.5M)的容器中。获得以TC为印迹模板，以Eu-CDs为比值荧光信号的MIP壳聚糖凝胶球，用乙腈和乙醇(v/v＝8/2)反复洗涤，去除TC模板。最后用去离子水冲洗，冷冻干燥至恒重。获得不同壳聚糖添加量的Eu-CDs@MIP；其形态如图5所示(从左到右壳聚糖添加量依次为0.4g、0.5g、0.6g、0.7g)，当壳聚糖添加量为0.4g时，得到的壳聚糖凝胶球为椭圆形，用量增加到0.5g时，可以得到圆形稳定的凝胶球，继续增加壳聚糖用量，凝胶球的形状逐渐变为蝌蚪状。

实施例5

一种检测四环素的方法，步骤如下：

(1)将1.0g实施例2制备好的Eu-CDs@MIP添加到1mL不同浓度(0-200nM)的四环素水溶液中，并在室温下搅拌30min。

(2)将步骤(1)的混合溶液转移到石英皿中，以380nm的激发波长测量发射强度，记录混合物的发射光谱。发射和激发的狭缝宽度均为5nm。

(3)系统的记录实验数据作图获得线性方程。

用实施例2合成的Eu-CDs@MIP检测不同浓度梯度的四环素水溶液获得的荧光光谱图和线性关系图分别如图6中的(a)和(b)所示，由图6中(a)可以看出，随着四环素浓度的增加，Eu-CDs@MIP体系在486nm处的荧光强度明显下降，而在620nm处的荧光强度逐渐增加。(a)中上方的小图从左到右分别是相同质量的Eu-CDs@MIP(2.0g)分别加入5nM、20nM、40nM、80nM、120nM、160nM、200nM浓度的TC溶液的荧光颜色变化，可以看出随着四环素浓度的增加，Eu-CDs@MIP体系的荧光由蓝色变为蓝绿色、粉红色再变为红色。以I₆₂₀/I₄₈₆的强度比作为纵坐标，TC浓度作为横坐标，获得线性方程如图6中(b)所示，线性关系式为Y＝0.0459x-0.0964；线性相关系数R²＝0.999。

(4)将待测样品溶液与实施例2合成的Eu-CDs@MIP溶液按照1:1(g:mL)比例混合，混合均匀后；采用荧光光谱法在380nm的激发下，获得待测溶液中凝胶球的486nm和620nm处的荧光强度，计算I₆₂₀/I₄₈₆的强度比，对照步骤(3)获得的线性方程，计算获得待测样品溶液中四环素的含量。

用方程式LOD＝3Sb/s计算Eu-CDs@MIP对TC的检出限(LOD)，其中SB代表空白样品10次连续扫描的标准误差，S表示校准曲线的斜率。结果测得上述方法的检出限为6.3nM。

实施例6

一种基于铕掺杂碳点的比率荧光分子印迹壳聚糖凝胶球结合智能手机的四环素检测方法，步骤如下：

(1)将1.0g实施例2制备好的Eu-CDs@MIP添加到不同浓度(0-200nM)的四环素水溶液中，并在室温下搅拌30min。

(2)将步骤(1)的混合溶液转移到石英皿中，通过应用商店在智能手机上下载获得的颜色扫描应用程序(APP:colorimeter)，拍摄在紫外灯下不同四环素浓度的标准溶液中凝胶球的颜色，并对获得的荧光颜色进行数字化和输出，获得R G B值；用得到实验数据(R/B)整理作图(图7)，获得线性方程，线性关系式为Y＝0.0284x+0.352；线性相关系数R²＝0.998。

(3)将待测样品溶液与实施例2合成的Eu-CDs@MIP溶液按照1:1(g:mL)比例混合，混合均匀后；采用智能手机的颜色扫描应用程序对待测溶液中凝胶球在紫外灯下的荧光颜色进行拍照，并进行数字化和输出，获得R/B值；对照步骤(2)获得的线性方程，计算获得待测样品溶液中四环素的含量。

结果测得上述方法的检出限为6.8nM。

综上所述，本发明制备的基于铕掺杂碳点的比率荧光分子印迹壳聚糖凝胶球，随着四环素浓度的增加，产生明显的比率荧光信号变化，凝胶球颜色由蓝色变为蓝绿色、粉红色再变为红色。因此，采用该Eu-CDs@MIP检测四环素的方法具有实时、高效的视觉检测优势，对TC具有较高的识别能力。通过集成安装在智能手机上的颜色选择器应用程序进行检测，这使得四环素的半定量检测成为可能，从而实现实时和视觉的半定量检测。具有成本低，稳定性好，不仅在环境和食品安全监测中，而且在生物分析中具有很高的应用潜力。

实施例7

本发明制备的Eu-CDs@MIP对四环素的特异性检测：

(1)相同质量的实施例2制备好的Eu-CDs@MIP(2.0g)加入2mL相同浓度的(200nM.L^-1)四环素(Tetracycline)及其类似物(红霉素，土霉素，金霉素，四环素)的溶液；混合均匀后，在380nm的激发波长下检测其荧光强度和荧光视觉图，如图8所示，加入土霉素(Oxytetracycline)，金霉素(Chlortetracycline)，红霉素(Erythromycin)的壳聚糖凝胶球均显示蓝色荧光，发射波长为420nm，且在620nm处没有发射。而加入四环素的凝胶球则为红色荧光，发射波长为620nm。

(2)取2.0g实施例2制备好的Eu-CDs@MIP分别添加到2mL不同浓度(0-200nM)的四环素及其类似物(土霉素，金霉素，红霉素)水溶液中，并在室温下搅拌30min。将溶液转移到石英皿中，以380nm的激发波长测量发射强度，记录混合物的发射光谱。发射和激发的狭缝宽度均为5nm。Eu-CDs@MIP检测四环素及其类似物(红霉素，金霉素，土霉素)的线性对比结果如图9和表1所示，由图9可知Eu-CDs@MIP对只四环素有响应，并且有良好的线性关系，对四环素类似物(土霉素，金霉素，红霉素)几乎没有响应。

表1四环素及其类似物浓度与I₆₂₀/I₄₈₆的拟合线性关系的斜率

	四环素	红霉素	土霉素	金霉素
					斜率(K)	0.0459	-0.000216	-0.000376	-0.00028

实施例8

分别检测CDs、CDs+TC、Eu-CDs、Eu-CDs+TC的荧光发射光谱，以此来解释Eu-CDs@MIP检测TC的原理，结果如图10所示，其中，CDs代表没有掺杂Eu(NO₃)₃·6H₂O的碳点的荧光光谱；CDs+TC指的是没有掺杂Eu(NO₃)₃·6H₂O的碳点与四环素混合后的荧光光谱；Eu-CDs指的是实施例2步骤(1)所述方法制备的Eu-CDs的荧光光谱；Eu-CDs+TC指的是Eu-CDs与四环素混合后的荧光光谱。

由图10可知，铕离子可以与四环素结合，并通过能量转移吸收TC的能量，导致Eu³⁺离子的特征红色发光增强。此外，单纯的CDs加入TC只是荧光猝灭，然而Eu-CDs加入四环素后420nm处的荧光发射减弱，620nm处出现强的荧光发射峰。表明四环素和Eu-CDs形成了相互识别的络合物，并在620nm处产生强烈的红色荧光。图10左上角小图中的蓝色代表Eu-CDs在紫外灯下观察的视觉图(左)，红色代表Eu-CDs+TC在紫外灯下的观察的视觉图(右)。

为了阐明TC诱导Eu-CDs猝灭的机理，检测Eu-CDs的激发光谱(Ex of Eu-CDs)、Eu-CDs的发射光谱(Em of Eu-CDs)与TC的紫外-可见吸收光谱。如图11所示，位于357nm处的TC吸收带部分与Eu-CDs的激发光谱重叠，结果表明，TC诱导的Eu-CDs荧光猝灭是基于内滤效应(IFE)的稳定猝灭机制。

实施例9

检测牛奶中四环素的方法，步骤如下：

(1)样品前处理

实验前对牛奶进行了蛋白质沉淀程序：将等体积(5mL)的牛奶和1％(v/v)三氯乙酸溶液完全混合，然后对混合样品进行40℃超声处理20分钟，并将其转移到离心管中。以12000rpm的速度离心8分钟后，获得牛奶提取上清液。用氢氧化钠水溶液将pH调节到中性。

(2)向步骤(1)的牛奶提取上清液中加入四环素，并制备成一系列含有不同浓度TC(0-200nM)的标准牛奶样品溶液；

(3)分别取步骤(2)含有不同浓度四环素的标准牛奶样品溶液，按照1:1(g:mL)的比例向其中加入实施例2制备好的Eu-CDs@MIP；混合均匀后；室温培养30分钟，用380nm的激发强度测量凝胶球的发射光谱，并在紫外灯下观察凝胶球的颜色变化；

(4)通过手机应用商店下载获得的颜色扫描应用程序(APP:colorimeter)对步骤(3)凝胶球的荧光颜色进行数字化和输出，获得R G B值；用得到实验数据(R/B)整理作图，获得线性方程。

(5)将待测牛奶样品溶液经步骤(1)的样品前处理后，与实施例2合成的Eu-CDs@MIP溶液按照1:1(g:mL)比例混合，混合均匀后；室温培养30分钟，在紫外灯下观察凝胶球的颜色变化，采用智能手机的颜色扫描应用程序在紫外光下对凝胶球的荧光颜色进行拍摄并进行数字化和输出，获得R/B值；对照步骤(4)获得的线性方程，计算获得待测牛奶样品溶液中四环素的含量。

采用上述方法对牛奶样品进行加标回收，结果如表2所示：

表2牛奶样品的加标回收结果

由表2可知，采用实施例8的方法进行牛奶中四环素的检测，稳定性好，灵敏性高。

实施例10

金属阳离子对Eu-CDs@MIP+TC混合体系的影响

(1)将1.0g实施例2制备好的Eu-CDs@MIP添加到1mL浓度为100nM的四环素水溶液中，并在室温下搅拌30min，并分别加入2000μL的不同金属离子(Co²⁺、Cu²⁺、Hg⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、Al³⁺)水溶液(浓度50μM)，并以未添加任何金属阳离子的Eu-CDs@MIP+TC混合体系作为对照(Blank)；

(2)将步骤(1)的混合溶液转移到石英皿中，以380nm的激发波长测量发射强度，记录混合物的发射光谱。发射和激发的狭缝宽度均为5nm。

(3)系统的记录实验数据计算I₆₂₀/I₄₈₆，并作柱状图。由图12可以看出只有铝离子会微弱干扰620nm处的荧光发射强度导致其略有减弱。其他金属离子在对混合体系没有影响。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (10)

1.一种基于铕掺杂碳点的比率荧光分子印迹壳聚糖凝胶球的制备方法，其特征在于，步骤如下：

(1)将壳聚糖溶解在醋酸水溶液中同时加入四环素溶液，混合均匀后，添加铕掺杂碳量子点比率荧光探针和交联剂；30～40℃，搅拌反应8～10小时；反应结束后，获得水凝胶溶液；

(2)将水凝胶溶液逐滴滴加到NaOH水溶液中，获得壳聚糖凝胶球，反复洗涤除去四环素模板分子，即得基于铕掺杂碳点的比率荧光分子印迹壳聚糖凝胶球。

2.根据权利要求1所述基于铕掺杂碳点的比率荧光分子印迹壳聚糖凝胶球的制备方法，其特征在于，所述铕掺杂碳量子点比率荧光探针是以柠檬酸为碳源，三聚氰胺为氮源，加入Eu(NO₃)₃·6H₂O和甲醛，进行水热反应后制得。

3.根据权利要求2所述基于铕掺杂碳点的比率荧光分子印迹壳聚糖凝胶球的制备方法，其特征在于，所述铕掺杂碳量子点比率荧光探针的制备方法，步骤如下：

取8.0～12.0mmol柠檬酸和0.2～0.3mmol三聚氰胺溶解在水中，然后添加0～1000μL甲醛溶液和300～800mg Eu(NO₃)₃·6H₂O；溶液充分混合后，在180～220℃，反应5～10h；反应结束后冷却至室温，所得溶液通过过滤，透析，去除分子量小于1000Da的小分子；干燥，即得铕掺杂碳量子点比率荧光探针粉末。

4.根据权利要求1所述基于铕掺杂碳点的比率荧光分子印迹壳聚糖凝胶球的制备方法，其特征在于，所述交联剂为环氧氯丙烷或戊二醛。

5.根据权利要求1所述基于铕掺杂碳点的比率荧光分子印迹壳聚糖凝胶球的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖的用量为0.3～0.8g；所述铕掺杂碳量子点比率荧光探针的添加量为1.0～4.0mg；所述交联剂的添加量为400μL-800μL。

6.权利要求1～5任一项所述方法制备的基于铕掺杂碳点的比率荧光分子印迹壳聚糖凝胶球。

7.权利要求6所述基于铕掺杂碳点的比率荧光分子印迹壳聚糖凝胶球在四环素和/或铝离子检测中的应用。

8.一种检测四环素的方法，其特征在于，步骤如下：

(1)将权利要求6所述的基于铕掺杂碳点的比率荧光分子印迹壳聚糖凝胶球添加到不同浓度梯度的四环素标准溶液中；

(2)采用荧光光谱法在380nm的激发下记录四环素不同浓度的标准溶液486nm和620nm处的荧光强度；

(3)将步骤(2)得到的实验数据整理作图，以I₆₂₀/I₄₈₆的强度比作为纵坐标，四环素浓度作为横坐标，获得四环素浓度与I₆₂₀/I₄₈₆强度比的线性方程；

(4)将待测样品溶液与权利要求6所述的基于铕掺杂碳点的比率荧光分子印迹壳聚糖凝胶球混合；采用荧光光谱法在380nm的激发下，获得待测溶液的486nm和620nm处的荧光强度，计算I₆₂₀/I₄₈₆，代入步骤(3)获得的线性方程，计算获得待测样品溶液中四环素的含量。

9.根据权利要求8所述检测四环素的方法，其特征在于，所述基于铕掺杂碳点的比率荧光分子印迹壳聚糖凝胶球与待测样品溶液的混合比例为1:1。

10.一种智能手机作为信号读取器的四环素检测方法，其特征在于，步骤如下：

1)将权利要求6所述的基于铕掺杂碳点的比率荧光分子印迹壳聚糖凝胶球添加到不同浓度梯度的四环素标准溶液中；

(2)在智能手机上下载安装颜色扫描应用程序；

(3)采用智能手机上的颜色扫描应用程序拍摄在紫外灯下不同四环素浓度的标准溶液中壳聚糖凝胶球的颜色，并对获得的荧光颜色进行数字化和输出，获得R G B值；用R/B作为纵坐标，四环素的浓度作为横坐标，获得四环素浓度与R/B的线性方程；

(4)将待测样品溶液与上述的基于铕掺杂碳点的比率荧光分子印迹壳聚糖凝胶球混合；用智能手机上的颜色扫描应用程序拍摄在紫外灯下壳聚糖凝胶球的颜色，并对获得的荧光颜色进行数字化和输出，获得R G B值；计算R/B；将R/B的数值代入步骤(3)获得的线性方程，计算获得待测样品溶液中四环素的含量。

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