CN109142304A - 一种基于双金属有机骨架纳米复合物的pH可视化比率荧光传感器及应用 - Google Patents
一种基于双金属有机骨架纳米复合物的pH可视化比率荧光传感器及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于双金属有机骨架纳米复合物的pH可视化比率荧光传感器及应用。该荧光材料包括氢离子浓度敏感的双金属有机框架基底以及pH稳定的内标荧光分子。基于荧光材料制备的pH荧光试纸传感器具有响应快、灵敏度高、操作简便等优点,实现了人工胃液、细胞等生物样本的pH快速比率荧光测定。进一步,基于pH荧光试纸传感器,结合紫外灯和拍照设备搭建的pH可视化测定装置,基于色度学差异化设计,实现了微量液体的pH可视化测定。本发明的传感器制备技术简单、成本低、适用于大批量生产,pH可视化测定装置操作简便,便于即时检测,同时传感器中氢离子浓度敏感的双金属有机骨架毒性低,在细胞等生物样本中的应用具有较好前景。
Description
技术领域
本发明属于荧光传感器领域,具体涉及一种基于双金属有机骨架纳米复合物的pH可视化比率荧光传感器及应用。
背景技术
pH稳态是维持细胞和生物体正常形态和功能稳定的重要前提,异常的pH值还和不适当的细胞功能和生长有关,例如,与正常细胞相比,癌细胞中的溶酶体pH(3.8-4.7)显示出比正常细胞pH(4.5-6.0)更高的酸度。而胃液pH可以反映胃肠疾病的状态及治疗效果,另外在药物合成反应过程中,反应体系pH的变化是反应过程控制的重要因素之一。因此,pH测定在疾病诊断、药物分析、药物合成反应控制等方面均有极为重要的作用。
传统pH测定法有吸收光谱法、NMR、电化学方法等等,它们具有操作繁琐、耗时长、仪器昂贵等缺点,和这些方法相比,基于荧光的测定技术不仅具有观察空间和时间分布方面的独特优势,而且操作简单,响应快,拥有更高的信噪比和灵敏度,并且大多数情况下对细胞是无破坏性的。
金属有机骨架材料(metal-organic frameworks,MOFs)是一类新兴的多孔晶体材料,其中发光MOFs用于pH传感时具有简单、直观、方便等特点,有望将其制成适用于准确测定小体积样品pH的传感器。然而,目前报道的MOFs的pH传感范围大多是在弱酸弱碱范围内,因此研究具有宽范围pH传感特性的新型MOFs,从而拓宽MOFs在pH测定领域的应用是非常有必要的。
目前已经报道的荧光pH传感器大多传感范围窄,并且多局限于弱酸、中性范围内,具有胃酸等强酸pH传感性能的宽范围pH传感材料尚未见报道。另一方面,目前报道的许多pH荧光传感材料为单荧光发射,其检测结果易受到检测环境和浓度的影响,而基于双荧光发射的比率荧光检测技术对于准确度的提高是非常有必要的。
发明内容
为了解决上述技术问题,本发明提供了一种基于双金属有机骨架纳米复合物的pH可视化比率荧光传感器及其应用,该传感器具有宽范围pH传感特性。
本发明提供的pH传感器的检测原理:所制备的双金属有机骨架材料对氢离子具有敏感性,或是对质子的掺杂程度有敏感性。当材料处于某一固定pH环境中,在固定光源激发下,有机配体的能量向Tb3+发生转移(天线效应),产生Tb3+的特征荧光,同时内标荧光分子也发出不同波长区域特定的荧光。当所处环境的pH发生变化时,双金属有机骨架的有机配体单元中吡啶N原子会发生不同程度的质子化,从而导致配体的电子云分布发生变化,改变了分子内电荷转移的程度,进而影响了配体向Tb3+的能量转移,导致荧光强度发生变化,而pH的变化不会影响内标荧光分子的荧光强度,从而能够通过二者荧光强度的比值反映pH的变化。另外,由于这种质子化的过程是可逆的,因此该复合材料的响应具有良好的可逆性和重现性。
本发明提供的方案如下:
一种基于双金属有机骨架纳米复合物的pH可视化比率荧光传感器,包括氢离子浓度敏感的双金属有机骨架材料和pH稳定的内标荧光材料,其中pH稳定的内标荧光材料掺杂在骨架材料中。
上述荧光传感器的粒径为20-450nm。
上述双金属有机骨架材料由两种金属盐与吡啶2,6-二甲酸通过水热法制成。
上述的金属盐包括三价铽盐和二价钴盐。
上述pH稳定的内标荧光材料,包括1-羟基芘。
上述双金属有机骨架材料和pH稳定的内标荧光材料的掺杂方法:将pH稳定的内标荧光材料添加于双金属有机骨架材料的分散液中,搅拌均匀后,减压浓缩、干燥而得。
本发明的另一目的之一在于提供一种利用上述的基于双金属有机骨架纳米复合物的pH可视化比率荧光传感器制备的pH荧光试纸。
上述pH荧光试纸通过将滤纸浸泡于上述的荧光传感器的溶液中制备而成。
本发明的另一目的之二在于提供利用上述的pH荧光试纸搭建的pH可视化测定装置,包括上述的pH荧光试纸、暗箱(1),平铺装置(2),紫外灯(3)和拍照设备(4);所述暗箱(1)底部设置有96孔板(2)以放置pH荧光试纸,暗箱(1)顶部设置有紫外灯(3),拍照设备(4)用于感光后拍照。
本发明提供的荧光传感器、pH荧光试纸和pH可视化测定装置在常量液体、微量液体和细胞pH检测中的应用。
本发明的有益效果:
(1)本发明提供的荧光传感器具有较宽范围的pH传感特性,同时具有低毒性和良好的相容性;
(2)基于本发明提供的荧光传感器可制备pH荧光试纸和搭建pH可视化测定装置,以提供多种基于色度分析的检测技术;
(3)基于本发明提供的传感器的检测技术具有观察空间和时间分布方面的独特优势,同时具有操作简单、响应快、高信噪比和高灵敏度的优点;
(4)具有良好的可逆性,可重复使用;
(5)可应用于常量、微量液体pH检测、细胞成像和癌症诊断等方面。
附图说明
图1是双金属有机骨架材料的透射电镜图;
图2是pH荧光试纸;
图3是pH可视化测定的建议装置;
图4是荧光传感器对常量液体pH的响应标准曲线;
图5是微量液体可视化测定的标准曲线;
图6是双金属有机骨架材料的细胞毒性实验结果(MTT法);
图7是双金属有机骨架材料的细胞荧光成像结果;
图8是双金属有机骨架材料的细胞荧光成像色度分析结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步说明,本发明的内容完全不限于此。
实施例1
基于双金属有机骨架的纳米复合物的pH可视化比率荧光传感器的制备
制备方法如下:
步骤一:首先将吡啶2,6-二甲酸的DMF溶液(100mM,20mL)和TbCl3·6H2O的DMF溶液(100mM,10mL)、COCl2·2H2O的DMF溶液(100mM,10mL)混匀,然后转移至具有内衬管的高压反应釜,160℃油浴3h,然后自然冷却至室温,离心得沉淀,用DMF和无水乙醇各洗2次,离心、真空干燥得到双金属有机骨架材料。图1为该双金属有机骨架材料的透射电镜图,从图中可以看出所制备的材料为矩形块状结晶,直径在200nm左右。
步骤二:取步骤一得到的材料100mg分散于20mL丙酮,添加1mg/mL的1-羟基芘1mL,室温下磁力搅拌3h后,减压蒸馏去除溶剂,真空干燥得到pH可视化比率荧光传感器。
实施例2
利用实施例1的荧光传感器制备pH荧光试纸及pH可视化装置的搭建
制备方法如下:
取复合材料母液,用一级水稀释得1mg/mL的分散液,将whatman滤纸置于分散液中浸泡10min,然后取出室温避光干燥24h,再用打孔器将其裁剪为直径为6mm的圆片,置于96孔板内储存备用,荧光试纸如附图2所示。
pH可视化装置的搭建:
进行pH可视化测定时,需搭建如图3所示的可视化测定装置。暗箱1底部放置有96孔板2,暗箱顶部设置有紫外灯3,暗箱1外设置有拍照设备4。
应用实施例1
应用实施例1制备的pH可视化比率荧光传感器测试人工胃液的pH
人工胃液的配制:1mM氯化钠,2mM葡萄糖和0.1mM胃蛋白酶,用盐酸和氢氧化钠调至所需的pH。
测试方法:取制备的pH可视化比率荧光传感器,配制为母液(5mg/mL)备用,使用时用样品溶液稀释至50ug/mL进行pH荧光测定。首先利用普通水样进行了标准曲线绘制,结果如图4所示,荧光信号和pH值之间具有良好的线性关系(pH0.7-5.0,pH5.0-7.8)。在实际样本测试中,采用的样品溶液为人工胃液。
人工胃液的检测结果用传统的pH玻璃电极法进行校正,结果如表1所示。结果显示本方法测得的结果和传统pH电极法测得的结果基本一致,表明本方法准确性好,且不需要进行校正,更加便捷。
表1.人工胃液pH测定结果与传统玻璃电极法测定结果的比较(n=3)
应用实施例2
实施例1所制备的双金属有机骨架材料在细胞成像的应用
方法如下:
(1)取实施例1所制备的双金属有机骨架材料,配制成5mg/mL的水分散液备用。以L929细胞为例,培养至贴壁后,用胰酶消化重悬,在共聚焦小皿内接种细胞,后转移至37℃的CO2培养箱内孵育24h至贴壁;
(2)取出共聚焦小皿,去除上层培养基,加双金属有机骨架材料(200μg/mL)1mL,继续在37℃的CO2培养箱内孵育2h;
(3)取出共聚焦小皿,用PBS缓冲液清洗3次,加1mL的4%多聚甲醛固定液,静置15min后用PBS缓冲液清洗3次,再添加细胞核荧光染料DAPI 5μg/mL(200μL)静置5min;
(4)去除上清液,用PBS缓冲液洗3次,再添加1mL PBS缓冲液,进行共聚焦荧光显微成像。
共聚焦荧光显微镜参数:双金属有机骨架材料的激发波长为285nm,检测通道(绿光通道)520-570nm;DAPI的激发波长为358nm,检测通道(蓝光通道)为410-460nm。细胞成像结果利用LAS X软件进行色度分析。
细胞成像结果显示,双金属有机骨架材料可以进入细胞质,并发出特征绿色荧光,但其无法进入细胞核;而DAPI是细胞核荧光染料,其可以在细胞核内发出蓝色特征荧光。因此可以将细胞和外的绿色荧光色度和细胞核内的蓝色荧光色度比值(G/B)作为定量指标,衡量细胞核外的pH。结果如图8所示,可以发现正常细胞L929cell和癌细胞HepG2cell的绿色荧光色度存在显著性差异(癌细胞HepG2cell的绿色荧光色度值更低),蓝色荧光色度无显著性差异。该结果展示出双金属有机骨架材料具有细胞核外pH传感的能力,如背景知识所述,癌细胞溶酶体pH更低,因此理论上癌细胞的绿色荧光色度值应低于正常细胞,这和实验结果一致。以上结果表明,本专利报道的生物相容性好(图6)、毒性低(图7)的双金属有机骨架材料具有基于pH差异进行癌细胞体外诊断的应用潜力。
应用实施例3
应用实施例2制备的pH荧光试纸及pH可视化装置进行可视化pH测定
过程如下:用移液枪取5μL样品加到96孔板中的荧光试纸圆片上,静置5min后,在紫外灯3照射下,用拍照设备4进行拍照,利用World of color软件进行G/B色度分析(记录用于样品测试的圆片的色度值即可)。结果如图5所示,所记录的色度值G和色度值B的比值和样本pH呈现出良好的线性关系。该方法可以应用于小体积液体样品的快速pH测定。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明保护的范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内所做的任何修改,等同替换和改进等,均应包含在发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种基于双金属有机骨架纳米复合物的pH可视化比率荧光传感器,其特征在于:包括氢离子浓度敏感的双金属有机骨架材料和pH稳定的内标荧光材料,其中pH稳定的内标荧光材料掺杂在骨架材料中。
2.根据权利要求1所述的基于双金属有机骨架纳米复合物的pH可视化比率荧光传感器,其特征在于:所述荧光传感器的粒径为20-450nm。
3.根据权利要求1所述的基于双金属有机骨架纳米复合物的pH可视化比率荧光传感器,其特征在于:所述双金属有机骨架材料由两种金属盐与吡啶-2,6-二甲酸通过水热法制成。
4.根据权利要求3所述的基于双金属有机骨架纳米复合物的pH可视化比率荧光传感器,其特征在于:所述的金属盐包括三价铽盐和二价钴盐。
5.根据权利要求1所述的基于双金属有机骨架纳米复合物的pH可视化比率荧光传感器,其特征在于:所述pH稳定的内标荧光材料,包括1-羟基芘。
6.根据权利要求1所述的基于双金属有机骨架纳米复合物的pH可视化比率荧光传感器,其特征在于,所述双金属有机金属有机骨架材料和pH稳定的内标荧光材料的掺杂方法:将pH稳定的内标荧光材料添加于双金属有机骨架材料的分散液中,搅拌均匀后,减压浓缩、干燥而得。
7.一种利用权利要求1所述的基于双金属有机骨架纳米复合物的pH可视化比率荧光传感器制备的pH荧光试纸。
8.根据权利要求7所述的pH荧光试纸,其特征在于:所述pH荧光试纸通过将滤纸浸泡于权利要求1所述的荧光传感器的溶液中制备而成。
9.一种利用权利要求7所述的荧光传感器搭建的pH可视化测定装置,其特征在于:所述传感器包括权利要求7所述的pH荧光试纸、暗箱(1),平铺装置(2),紫外灯(3)和拍照设备(4);所述暗箱(1)底部设置有96孔板(2)以放置pH荧光试纸,暗箱(1)顶部设置有紫外灯(3),拍照设备(4)用于感光后拍照。
10.权利要求1所述的荧光传感器、权利要求7所述的pH荧光试纸及权利要求9所述的pH可视化测定装置在常量液体、微量液体和细胞pH检测的应用。
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