CN112300121B - 一种能专一性标记细胞膜的n-芳基取代咔唑类荧光探针及其制备方法 - Google Patents

一种能专一性标记细胞膜的n-芳基取代咔唑类荧光探针及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种能专一性标记细胞膜的N‑芳基取代咔唑类荧光探针及其制备方法，属于荧光探针技术领域，该能专一性标记细胞膜的N‑芳基取代咔唑类荧光探针具有强的分子内电荷转移效应，大的斯托克斯位移，表现出明显的聚集诱导发光现象，克服了传统荧光探针在细胞内因为聚集导致的荧光淬灭效应，在人宫颈癌细胞中能专一性标记细胞膜，实现高对比度的荧光成像。可有效解决传统的荧光探针标记细胞膜时专一性差且荧光成像的对比度低的问题。

Description

一种能专一性标记细胞膜的N-芳基取代咔唑类荧光探针及其 制备方法
技术领域
本发明涉及荧光探针技术领域，具体涉及到一种能专一性标记细胞膜的N-芳基取代咔唑类荧光探针及其制备方法。
背景技术
荧光生物成像技术凭借其快速响应性、出色的时间分辨率、极佳的灵敏度、原位可加工性、操作简单和良好的重现性被认为是一种用于生物学可视化的非侵入性分析工具。
细胞膜作为具有磷脂双分子层结构的重要细胞器，是活细胞及其周围环境之间的二维保护边界，被证明在各种细胞过程和生物功能如细信号传导、细胞粘附、内吞、胞吐和物质的选择性渗透起着重要的作用。由于细胞或生物体内基本表现为水溶液的环境以及复杂的细胞内环境，导致传统的荧光探针标记细胞膜时专一性差且荧光成像的对比度低。因此，开发能专一性标记细胞膜的荧光探针实现细胞膜状态的可视化也就显得十分的有意义。
发明内容
针对上述现有技术存在的不足或缺陷，本发明的目的是提供一种能专一性标记细胞膜的N-芳基取代咔唑类荧光探针及其制备方法，可有效解决传统的荧光探针标记细胞膜时专一性差且荧光成像的对比度低的问题。
为达上述目的，本发明采取如下的技术方案：
本发明提供一种能专一性标记细胞膜的N-芳基取代咔唑类荧光探针，其结构式如式(I)所示：
Figure BDA0002744367340000021
其中，X-为BF4 -或PF6 -。
本发明提供的能专一性标记细胞膜的N-芳基取代咔唑类荧光探针的制备方法如图1所示，具体包括以下步骤：
步骤(1)：向干燥的反应器中加入9-(4-溴苯基)-3,6-二叔丁基咔唑、4-(4-吡啶基)苯硼酸、催化剂、添加剂和溶剂，在氮气保护下，在-40～110℃条件下反应0.1～480小时，冷却至室温，加入二氯甲烷，过滤，减压移去溶剂，剩余物用硅胶柱层析分离纯化，真空干燥，得到N-芳基取代咔唑前体；
步骤(2)：向干燥的反应器中加入步骤(1)所得的N-芳基取代咔唑前体、碘甲烷和溶剂，在氮气保护下，在-40～70℃条件下搅拌0.1～240小时。冷却至室温后减压移去溶剂，加入银盐、二氯甲烷和甲醇后在-40～70℃条件下继续反应0.1～240小时。反应完后减压移去溶剂，剩余物用硅胶柱层析分离纯化，真空干燥得能专一性标记细胞膜的N-芳基取代咔唑类荧光探针；
其中，步骤(1)中9-(4-溴苯基)-3,6-二叔丁基咔唑的反应浓度为0.001～10mol/L，9-(4-溴苯基)-3,6-二叔丁基咔唑、4-(4-吡啶基)苯硼酸、添加剂和催化剂的摩尔比为1:0.01～50:0.01～10:0.001～100，9-(4-溴苯基)-3,6-二叔丁基咔唑、4-(4-吡啶基)苯硼酸、添加剂和催化剂的摩尔比优选为1:0.8～2:1～4:0.01～0.1；
步骤(2)中N-芳基取代咔唑前体的反应浓度为0.01～10mol/L，碘甲烷的反应浓度为0.001～10mol/L，N-芳基取代咔唑前体:碘甲烷的摩尔比为1:0.001～50，N-芳基取代咔唑前体:碘甲烷的摩尔比优选为1:1～15；
步骤(1)中的催化剂为四(三苯基膦)钯、醋酸钯、氯化钯、二(乙腈)二氯化钯、二(苯腈)二氯化钯、二(三苯基膦)二氯化钯、双(二亚苄基丙酮)钯、三(二亚苄基丙酮)二钯、氯化烯丙基钯(II)二聚物、(1,5-环辛二烯)二氯化钯(II)、三氯化铑、醋酸铑、乙酰丙酮三苯基膦羰基铑、双环辛烯氯化铑二聚体、二氯(五甲基环戊二烯基)合铑(III)二聚体、三苯基膦氯化铑、三氯化钌、三苯基膦氯化钌、二氯二羰基双(三苯基膦)钌和双(2-甲基烯丙基)(1,5-环辛二烯)钌(II)中的至少一种，优选为四(三苯基膦)钯或二(乙腈)二氯化钯；
步骤(1)中的添加剂为碳酸铯、醋酸铯、特戊酸铯、碳酸钠、醋酸钠、碳酸钾、焦磷酸钾、磷酸钠、醋酸钾、焦磷酸钠和碳酸氢钠中的至少一种，优选为碳酸钠或碳酸钾；
步骤(2)中银盐为四氟硼酸银或六氟锑酸银；
步骤(1)中反应温度优选为90～110℃，反应时间优选为20～24小时；
步骤(2)中反应温度优选为60～80℃，反应时间优选为10～14小时；
步骤(1)和(2)中溶剂均为甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、四氢呋喃、二氯甲烷、三氯甲烷、乙醚、二甲基亚砜、苯、邻二氯苯、氯苯、甲苯、二甲苯、均三甲苯、环己烷、石油醚、叔戊醇、1,4-二氧六环、1,2-二氯乙烷、N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二甲基乙酰胺中的至少一种，步骤(1)中溶剂优选为水与乙醇体积比为1:2～4的混合溶剂，步骤(2)中溶剂优选为二氯甲烷或三氯甲烷。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、本发明提供的能专一性标记细胞膜的N-芳基取代咔唑类荧光探针以富电的咔唑基团和缺电的吡啶鎓盐分别作电子供体和电子受体，形成苯环为π桥的D-π-A型推拉电子结构，增强分子内电荷转移效应，使其具有强的分子内电荷转移效应，大的斯托克斯位移，在DMSO/H2O的混合溶剂中最大荧光发射波长达到580nm的红光区域，有效地减少荧光染料的自吸收，提高荧光显影的灵敏度；
2、本发明提供的能专一性标记细胞膜的N-芳基取代咔唑类荧光探针表现出明显的聚集诱导发光现象，克服了传统荧光探针在细胞内因为聚集导致的荧光淬灭效应；
3、本发明提供的能专一性标记细胞膜的N-芳基取代咔唑类荧光探针在人宫颈癌细胞中能专一性标记细胞膜，实现高对比度的荧光成像。
附图说明
图1为本发明能专一性标记细胞膜的N-芳基取代咔唑类荧光探针合成步骤的示意图；
图2为本发明实施例1荧光探针CZDPPy的核磁氢谱；
图3为本发明实施例1荧光探针CZDPPy在含有不同比例水的DMSO/H2O体系中的荧光发射光谱；
图4为本发明实施例1荧光探针CZDPPy和市售细胞膜染色剂DiO在人宫颈癌细胞内的共聚焦荧光成像图。
具体实施方式
下面结合具体实施案例对本发明作进一步描述，将有助于对本发明的理解。但并不能以此来限制本发明的权利范围，而本发明的权利范围应以权利要求书阐述的为准。
实施例1
能专一性标记细胞膜的N-芳基取代咔唑类荧光探针CZDPPy的合成，包括以下步骤：
步骤(1)：向干燥的反应器中加入9-(4-溴苯基)-3,6-二叔丁基咔唑(1.04g,2.4mmol)，4-(4-吡啶基)苯硼酸(398mg,2.0mmol)，Pd(PPh3)4(116mg，0.1mmol)，Na2CO3(636mg，6.0mmol)，甲苯(20mL)，乙醇(6mL)，水(2mL)，氮气保护下，在110℃下反应24小时。冷却至室温，加入20mL乙酸乙酯稀释，饱和氯化钠溶液洗涤，无水Na2SO4干燥。收集有机相后减压移去溶剂，剩余物用硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝2/1,v/v)分离纯化，真空干燥后得N-芳基取代咔唑前体(814mg，产率80％)；
步骤(2)：向干燥的反应器中加入步骤(1)所得N-芳基取代咔唑前体(200mg，0.4mmol)、碘甲烷(252μL，4.0mmol)和三氯甲烷(10mL)，氮气保护下在70℃条件下回流24小时。冷却至室温后减压移去溶剂，加入AgBF4(156mg,0.8mmol)、二氯甲烷(6mL)和甲醇(10mL)后在室温条件下继续反应24小时。反应完后减压移去溶剂，剩余物用硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝20/1,v/v)分离纯化，真空干燥后得黄色固体目标产物CZDPPy(210mg，产率86％)。
N-芳基取代咔唑前体和能专一性标记细胞膜的N-芳基取代咔唑类荧光探针CZDPPy的表征数据如下：
N-芳基取代咔唑前体
Figure BDA0002744367340000051
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ＝8.72-8.70(m,2H),8.16(d,J＝1.6Hz,2H),7.85(d,J＝8.4Hz,2H),7.82-7.73(m,4H),7.67(d,J＝8.4Hz,2H),7.60-7.59(m,2H),7.51-7.49(m,2H),7.43(d,J＝8.8Hz,2H),1.48(s,18H)ppm.13C NMR(100MHz,CDCl3):δ＝150.5,147.9,143.1,141.2,139.2,138.8,138.0,137.3,128.5,127.7,127.1,123.8,123.6,121.6,116.4,109.4,34.9,32.2ppm.HRMS(ESI+):计算值C37H37N2[M+H]+：509.2951,实测值：509.2960。
能专一性标记细胞膜的N-芳基取代咔唑类荧光探针CZDPPy
Figure BDA0002744367340000061
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝9.03(d,J＝6.8Hz,2H),8.61(d,J＝7.2Hz,2H),8.33(d,J＝2.0Hz,2H),8.26(d,J＝8.4Hz,2H),8.10(d,J＝8.4Hz,4H),7.78(d,J＝8.4Hz,2H),7.52-7.49(m,2H),7.41(d,J＝8.4Hz,2H),4.35(s,3H),1.43(s,18H)ppm.13C NMR(100MHz,DMSO-d6):δ＝153.6,145.6,142.8,142.7,138.3,137.7,137.0,132.5,128.9,128.6,127.8,126.7,123.9,123.8,123.1,116.9,109.2,47.1,34.6,31.9ppm.HRMS(ESI+):计算值C38H39N2[M]+：523.3108,实测值：523.3112。
通过核磁共振氢谱、核磁共振碳谱以及高分辨质谱证实了本发明中能专一性标记细胞膜的N-芳基取代咔唑类荧光探针CZDPPy的结构，其中能专一性标记细胞膜的N-芳基取代咔唑类荧光探针CZDPPy核磁氢谱如图2所示。检测所用仪器为：Bruker AV II-400MHz型核磁共振仪，其中TMS为内标，溶剂CDCl3和DMSO-d6为氘代溶剂；Waters-Q-TOF-Premier(ESI)型高分辨质谱仪。
实验例1：荧光探针CZDPPy在DMSO/H2O体系中的聚集诱导发光现象
配制浓度为10μM且含有水的体积百分比依次为10％、30％、50％、60％、70％、80％和90％的CZDPPy的DMSO/H2O溶液，然后分别测试各溶液的荧光发射光谱并比较最大发射波长处荧光强度的变化，测试结果如图3所示。其中，光谱表征所用仪器为：HITACHI U-2910型紫外－可见分光光度计(扫描范围250～1100nm)，堀场Fluoromax-4型荧光光谱仪。
由图3可知，荧光探针CZDPPy具有强的分子内电荷转移效应，大的斯托克斯位移，在DMSO/H2O的混合溶剂中最大荧光发射波长达到580nm的红光区域，有效地减少荧光染料的自吸收，提高荧光显影的灵敏度；表现出明显的聚集诱导发光现象，克服了传统荧光探针在细胞内因为聚集导致的荧光淬灭效应。
对比例1：荧光探针CZDPPy和市售细胞膜染色剂DiO在人宫颈癌细胞中的荧光共聚焦成像
首先，向含有10％胎牛血清的DMEM(H)培养基中通入5％CO2，将人宫颈癌细胞于37℃下培养24小时。将培养基去除，加入5μM荧光探针CZDPPy和1μM市售细胞膜染色剂DiO于37℃下共同培养30分钟。待培养结束后，取出培养玻底皿，用磷酸盐缓冲液清洗2～3次后，将培养玻底皿经荧光共聚焦显微镜成像，结果如图4所示。其中，细胞内荧光成像所用仪器为Nikon A1R MP+荧光共聚焦显微镜。
实验结果可以看出，荧光探针CZDPPy在细胞膜的荧光成像和市售细胞膜染色剂DiO染料基本重叠，说明荧光探针CZDPPy具有优异的细胞膜示踪效果，在人宫颈癌细胞中能专一性标记细胞膜，实现高对比度的荧光成像。
以上内容仅仅是对本发明结构所作的举例和说明，所属本领域的技术人员不经创造性劳动即对所描述的具体实施例做的修改或补充或采用类似的方式替代仍属本专利的保护范围。

Claims (9)

1.一种能专一性标记细胞膜的N-芳基取代咔唑类荧光探针，其特征在于，所述能专一性标记细胞膜的N-芳基取代咔唑类荧光探针结构式如式(I)所示：
Figure FDA0003069919750000011
其中，X-为BF4 -或PF6 -。
2.权利要求1所述的能专一性标记细胞膜的N-芳基取代咔唑类荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)：将9-(4-溴苯基)-3,6-二叔丁基咔唑、4-(4-吡啶基)苯硼酸、催化剂、添加剂和溶剂混合，在氮气保护下，于-40～110℃下反应0.1～480小时，得到N-芳基取代咔唑前体；
步骤(2)：将步骤(1)所得的N-芳基取代咔唑前体、碘甲烷和溶剂混合，在氮气保护下，于-40～70℃下搅拌0.1～240小时，冷却至室温后减压移去溶剂，加入银盐、二氯甲烷和甲醇混合，于-40～70℃下继续反应0.1～240小时，得到能专一性标记细胞膜的N-芳基取代咔唑类荧光探针；
其中，所述步骤(1)中的添加剂为碳酸铯、醋酸铯、特戊酸铯、碳酸钠、醋酸钠、碳酸钾、焦磷酸钾、磷酸钠、醋酸钾、焦磷酸钠和碳酸氢钠中的至少一种。
3.如权利要求2所述的能专一性标记细胞膜的N-芳基取代咔唑类荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中9-(4-溴苯基)-3,6-二叔丁基咔唑、4-(4-吡啶基)苯硼酸、添加剂和催化剂的摩尔比为1:0.01～50:0.01～10:0.001～100。
4.如权利要求2所述的能专一性标记细胞膜的N-芳基取代咔唑类荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的催化剂为四(三苯基膦)钯、醋酸钯、氯化钯、二(乙腈)二氯化钯、二(苯腈)二氯化钯、二(三苯基膦)二氯化钯、双(二亚苄基丙酮)钯、三(二亚苄基丙酮)二钯、氯化烯丙基钯(II)二聚物、(1,5-环辛二烯)二氯化钯(II)、三氯化铑、醋酸铑、乙酰丙酮三苯基膦羰基铑、双环辛烯氯化铑二聚体、二氯(五甲基环戊二烯基)合铑(III)二聚体、三苯基膦氯化铑、三氯化钌、三苯基膦氯化钌、二氯二羰基双(三苯基膦)钌和双(2-甲基烯丙基)(1,5-环辛二烯)钌(II)中的至少一种。
5.如权利要求2所述的能专一性标记细胞膜的N-芳基取代咔唑类荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中N-芳基取代咔唑前体和碘甲烷的摩尔比为1:0.001～50。
6.如权利要求2所述的能专一性标记细胞膜的N-芳基取代咔唑类荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中银盐为四氟硼酸银或六氟锑酸银。
7.如权利要求2所述的能专一性标记细胞膜的N-芳基取代咔唑类荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)和所述步骤(2)中溶剂均为甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、四氢呋喃、二氯甲烷、三氯甲烷、乙醚、二甲基亚砜、苯、邻二氯苯、氯苯、甲苯、二甲苯、均三甲苯、环己烷、石油醚、叔戊醇、1,4-二氧六环、1,2-二氯乙烷、N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二甲基乙酰胺中的至少一种。
8.如权利要求2所述的能专一性标记细胞膜的N-芳基取代咔唑类荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中9-(4-溴苯基)-3,6-二叔丁基咔唑、4-(4-吡啶基)苯硼酸、添加剂和催化剂的摩尔比为1:0.8～2:1～4:0.01～0.1，所述步骤(1)中溶剂为水与乙醇体积比为1:2～4的混合溶剂，所述步骤(2)中N-芳基取代咔唑前体和碘甲烷的摩尔比为1:1～15，所述步骤(2)中溶剂为二氯甲烷或三氯甲烷。
9.如权利要求2所述的能专一性标记细胞膜的N-芳基取代咔唑类荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中反应温度为90～110℃，反应时间为20～24小时，所述步骤(2)中反应温度为60～80℃，反应时间为10～14小时。
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