CN115677562A - 一种细胞膜靶向荧光探针及其合成方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种细胞膜靶向荧光探针及其合成方法和应用。所述细胞膜靶向荧光探针为NP‑TPA‑CM，通过在1,8‑萘内酰亚胺本体结构上修饰强吸电子性的三苯胺基团，得到荧光发射红移至橙色‑红色波长范围的荧光分子。三甲胺溴盐和己烷链部分与磷脂分子之间的相互作用有助于将荧光分子保留在磷脂双分子层内。该荧光探针具有优异的膜保留性、高的荧光亮度，良好的光稳定性和生物安全性，在细胞膜结构研究领域具有广阔应用前景。

Description

一种细胞膜靶向荧光探针及其合成方法和应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种细胞膜靶向荧光探针及其合成方法和应用。

背景技术

荧光显微成像由于其非侵入性和可实时成像性在生命科学领域受到广大关注，但是由于大部分传统荧光染料缺乏特异靶向性，无法研究亚细胞活性下特定细胞微观结构的行为变化(如有丝分裂过程中线粒体的变化)，限制了染料的进一步发展。

现如今，荧光染料发展迅速，种类众多(有机物、量子点、无机物等)，其中有机小分子荧光染料，由于具有优异的生物安全性，加上其确定的分子结构，很容易对其进行结构修饰，得到具有特异性细胞器靶向的生物探针，广泛应用在超分辨观察所感兴趣亚细胞结构的可视化动态信息研究领域。

传统的有机荧光探针具有大π共轭的特点的平面结构，在聚集态下表现出无发射现象，这种现象被称为聚合诱导淬灭(ACQ)效应。开发一种新兴的在聚集态或分散态均具有荧光发射的双态荧光团分子，可弥补ACQ分子的固有缺陷，并作为研究细胞膜结构及其动态变化过程的有力工具。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种细胞膜靶向荧光探针及其合成方法和应用，该荧光探针具有超高荧光亮度，成像浓度低，相同效果下较商用染料浓度低5倍左右，细胞渗透性好，8min的孵育时间便能达到标记细胞膜的效果。

为了解决本发明的上述技术问题，本发明提供采用以下技术方案：

本发明的第一目的是提供一种细胞膜靶向荧光探针，所述细胞膜靶向荧光探针为NP-TPA-CM，分子结构式如下：

本发明的第二目的是提供一种细胞膜靶向荧光探针的合成方法，包括如下步骤：

S1，以1,8-萘内酰亚胺为初始原料合成式(1)化合物，然后以式(1)和式(2)为反应物，碳酸铯作为碱，四(三苯基膦)钯为催化剂，以二氧六环、蒸馏水为溶剂，氮气保护条件下95℃反应12h，经萃取，柱层析纯化得式(3)化合物；

S2，以S1所得式(3)化合物和1，3二溴丙烷作为反应物，无水碳酸钾为碱，乙腈作为溶剂，在85℃下反应5h，经抽滤，柱层析纯化得式(4)化合物；

S3，以S2所得式(4)化合物和三甲胺作为反应物，四氢呋喃作为溶剂，在氮气保护下室温反应24h，经抽滤，柱层析纯化得荧光探针NP-TPA-CM；

其中反应式如下：

进一步地，S1中，所述式(1)、式(2)、碳酸铯和四(三苯基膦)钯的物质的量摩尔比为(0.5～1.5)：(1～2)：(4～6)：(0.05～0.15)。

进一步地，S1中，所述式(1)、式(2)、碳酸铯和四(三苯基膦)钯的物质的量摩尔比为1：1.5：5：0.1。

进一步地，S1中，所述二氧六环、蒸馏水的体积比为10：1。

进一步地，S2中，所述式(3)、无水碳酸钾和1，3二溴丙烷的物质的量摩尔比为(0.5～1.5)：(1～2)：(8～12)。

进一步地，S2中，所述式(3)、无水碳酸钾和1，3二溴丙烷的物质的量摩尔比为1：1.5：10。

进一步地，S3中，所述式(4)、和三甲胺的物质的量摩尔比为(0.5～1.5)：(1～3)。

进一步地，S3中，所述式(4)、和三甲胺的物质的量摩尔比为1：2。

本发明的第三目的是提供一种细胞膜靶向荧光探针在标记细胞膜中的应用，该荧光探针具有超高荧光亮度，成像浓度低，细胞渗透性好，8min的孵育时间便能达到标记细胞膜的效果。

本发明的有益效果：

1、相比于传统的细胞膜靶向荧光探针，本发明所合成的基于1,8-萘内酰亚胺的细胞膜靶向荧光探针，该探针具有良好的生物相容性和两亲性，标记细胞膜后显现超高荧光亮度，因此较低的成像浓度低便能清晰显现细胞轮廓，类似效果下较商用染料浓度低5倍左右，能有效避免高染料浓度对细胞的潜在毒性问题。同时细胞渗透性好，相对HepG-2细胞来说，8min的孵育时间便能达到有效标记细胞膜的效果。

2、通过在1,8-萘内酰亚胺本体结构上修饰强吸电子性的三苯胺基团，得到荧光发射红移至橙色-红色波长范围的荧光分子。三甲胺溴盐和己烷链部分与磷脂分子之间的相互作用有助于将荧光分子保留在磷脂双分子层内。该荧光探针具有优异的膜保留性、高的荧光亮度，良好的光稳定性和生物安全性，在细胞膜结构研究领域具有广阔应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为实施例1所制备的荧光探针NP-TPA-CM的核磁共振氢谱；

图2为实施例1所制备的荧光探针NP-TPA-CM的核磁共振碳谱；

图3为实施例1所制备的荧光探针NP-TPA-CM的质谱；

图4为实施例1所制备的荧光探针NP-TPA-CM在甲苯溶液中和固态下的荧光发射谱图；

图5为实施例1所制备的细胞膜靶向荧光探针NP-TPA-CM对HEPG-2和HUVEC细胞的细胞毒性图；

图6为实施例1所制备的亚细胞靶向荧光探针NP-TPA-CM与商用染料DiO在HEPG-2细胞中的光稳定性对比图；

图7是实施例1所制备的亚细胞靶向荧光探针NP-TPA-CM与相应的商用染料的共定位图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和有点更加清楚，下面将结合说明书附图和具体实施方式对本发明技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1：细胞膜靶向荧光探针NP-TPA-CM的合成

S1，取式(1)(1.24g，5mmol)、式(2)(3.42g，6mmol)、碳酸铯(5.13g，25mmol)、四(三苯基膦)钯(0.56g，0.5mmol)溶于50mL二氧六环中，加入5mL蒸馏水，在95℃氮气气氛下搅拌反应12h。然后减压去除溶剂，用乙酸乙酯和水萃取，有机层被保留并用无水硫酸钠干燥。然后减压蒸馏除去溶剂，粗品以石油醚/乙酸乙酯(体积比为20:1)为洗脱剂，经硅胶柱层析纯化得到淡红色固体状态的式(3)(2.20g，72％)。

式(1)的合成方法见文献[1]，式(2)的合成方法见文献[2]，具体参考文献如下：

[1]GuiguiYe,Yigang Wang,Liming Hong,Fuqing Yu,Guomin Xia and HongmingWang.Journal ofMaterials Chemistry C,2021,9,9142.

[2]Md Faiz Shah,Antoine Mirloup,Towhid H.Chowdhury,Alexandra Sutter,Abdulkader S.Hanbazazah,Anas Ahmed,Jae-Joon Lee,M.Abdel-Shakour,NicolasLeclerc,Ryuji Kaneko,Ashraful Islam.Sustainable Energy Fuels,2020,4,1908-1914.

S2，在100mL单口反应瓶加入式(3)(1.84g，3mmol)和碳酸钾(0.62g，4.5mmol)和50mL乙腈。升温至回流后加入1，3-二溴丙烷(6.03g，30mmol)，并在85℃反应5h。冷却至室温，将反应液抽滤除去碳酸钾，减压除去溶剂，然后以石油醚/乙酸乙酯(体积比为50:1)为洗脱剂，经硅胶柱层析纯化得到橙色油状式(4)(1.14g，52％)。

S3，在一个100mL二口瓶中将式(4)(0.73g，1mmol)溶于20mL四氢呋喃中，体系抽真空并氮气保护，将1mL的三甲胺溶液(2M，2mmol，THF溶液)通过橡胶塞注射进反应体系内，并置于室温下搅拌反应24h。反应结束后，将反应液通过减压蒸馏除去溶剂，以二氯甲烷/甲醇(体积比为10:1)为洗脱剂，经硅胶柱层析纯化得到橙色固体的荧光探针NP-TPA-CM(0.70g，88％)。

对本实施例所合成的荧光探针NP-TPA-CM进行结构分析，其核磁共振氢谱见图1，核磁共振碳谱见图2，质谱见图3。

试验例1

对本实施例所合成的荧光探针NP-TPA-CM在甲苯溶液中和固态下进行荧光光谱测试，如图4所示，可以看到，在荧光光谱仪的狭缝设置都为2nm下它们的荧光强度都接近2M，显示了其在分散和聚集状态下均具有强的荧光发射行为，表明了其优异的双态性能。

试验例2

对本实施例所合成的荧光探针NP-TPA-CM通过体外MTT法评估它的细胞毒性，将HEPG-2、HUVEC细胞分别培养在DMEM培养基中，相对湿度为90％，含5％的CO₂，温度为37℃。将密度为每孔1×10⁴个HEPG-2、HUVEC细胞接种在96孔板中，设置不同的探针浓度组(0、2、4、6、8、10μM)并培养过夜。实验结果如图5所示，可以看到孵育24h后，荧光探针NP-TPA-CM在各浓度下孵育的两种细胞情况下都保持着正常的生理状态，具有良好的生物安全性。

试验例3

对本实施例所合成的荧光探针NP-TPA-CM进行了细胞内光稳定性实验，如图6(a)所示，记录了荧光探针NP-TPA-CM在HEPG-2细胞中连续激发20min过程中每五分钟的成像图片，图6(b)为图6(a)中标注方框内的在每分钟下的平均荧光强度变化图，可以看到，荧光探针NP-TPA-CM在20min的激发下其荧光强度值都保持原始的80％以上，明显优于商用染料DiO，说明荧光探针NP-TPA-CM具有优异的光稳定性。

试验例4

对本实施例所合成的荧光探针NP-TPA-CM与商用染料DiO进行共定位实验，用5μM荧光探针NP-TPA-CM孵育HepG-2细胞15min，同时用商用染料DiO进行共定位标记，如图7所示，可以看到，荧光探针NP-TPA-CM与商用染料的共定位系数达到0.85，表明该荧光探针NP-TPA-CM具有良好的细胞膜靶向性。

上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明，但是本专利并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种细胞膜靶向荧光探针，其特征在于，所述细胞膜靶向荧光探针为NP-TPA-CM，分子结构式如下：

2.根据权利要求1所述的细胞膜靶向荧光探针的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1，以1,8-萘内酰亚胺为初始原料合成式(1)化合物，然后以式(1)和式(2)为反应物，碳酸铯作为碱，四(三苯基膦)钯为催化剂，以二氧六环、蒸馏水为溶剂，氮气保护条件下95℃反应12h，经萃取，柱层析纯化得式(3)化合物；

S2，以S1所得式(3)化合物和1，3二溴丙烷作为反应物，无水碳酸钾为碱，乙腈作为溶剂，在85℃下反应5h，经抽滤，柱层析纯化得式(4)化合物；

S3，以S2所得式(4)化合物和三甲胺作为反应物，四氢呋喃作为溶剂，在氮气保护下室温反应24h，经抽滤，柱层析纯化得荧光探针NP-TPA-CM；

其中反应式如下：

3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，S1中，所述式(1)、式(2)、碳酸铯和四(三苯基膦)钯的物质的量摩尔比为(0.5～1.5)：(1～2)：(4～6)：(0.05～0.15)。

4.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，S1中，所述式(1)、式(2)、碳酸铯和四(三苯基膦)钯的物质的量摩尔比为1：1.5：5：0.1。

5.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，S1中，所述二氧六环、蒸馏水的体积比为10：1。

6.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，S2中，所述式(3)、无水碳酸钾和1，3二溴丙烷的物质的量摩尔比为(0.5～1.5)：(1～2)：(8～12)。

7.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，S2中，所述式(3)、无水碳酸钾和1，3二溴丙烷的物质的量摩尔比为1：1.5：10。

8.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，S3中，所述式(4)、和三甲胺的物质的量摩尔比为(0.5～1.5)：(1～3)。

9.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，S3中，所述式(4)、和三甲胺的物质的量摩尔比为1：2。

10.一种由权利要求1所述的细胞膜靶向荧光探针在标记细胞膜中的应用。

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