CN115991696B - 一种聚集诱导发光荧光染料MG-Rho及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种聚集诱导发光荧光染料MG‑Rho及其制备方法和应用，合成路线包括：将碳酸钾、MG‑B和Br‑Rho进行反应生成粗产物A，再将粗产物A溶解在溶剂中，加入四氯对苯醌，反应得到粗产物B，将粗产物B提纯后得到聚集诱导发光荧光染料MG‑Rho。由于所述聚集诱导发光荧光染料MG‑Rho结构中有两个季铵盐基团，使得分子具有优异的水溶性，能够成功地应用于活细胞的超快免洗低光毒性成像，这将极大的助力活细胞相关的生物研究。
Description
技术领域
本发明属于荧光染料技术领域，具体涉及一种聚集诱导发光荧光染料MG-Rho及其制备方法和应用。
背景技术
聚集诱导发光(AIE)现象是唐本忠院士2001年首次提出的概念。由于AIE分子(AIEgens)独特的聚集态高效发光特性,受到了国内外同行的广泛关注,现已有数十个国家的上百个课题组开展有关AIE的研究,在发展新AIE分子,AIE机理,AIE材料在光电器件、生物探针与成像、化学传感、智能材料应用等领域均取得了显著的成果。AIE已经成为发光材料和光物理等领域的一个研究热点,并被中国科学院文献情报中心和汤森路透联合发布的《2015研究前沿》报告列为化学领域的10大研究前沿的第二位。此外,2016年Nature的NewsFeature专栏以“The nanolight revolution is coming”(纳米光革命正在来临)为题重点介绍了AIE材料,并评价AIE材料的发现为当前常用的量子点与发光聚合物点存在的问题提供了解决方案,是新一代的纳米发光材料。
荧光生物成像作为一种强大的非创伤性成像技术在生物应用方面具有独特的优势，特别是超分辨显微技术的开发和应用近年来取得长足的发展，但一直受限于荧光染料的亮度和稳定性。相较于传统光学成像，超分辨荧光成像建立在更大规模的光子统计数据的基础上。为了进一步提升成像分辨率、改善成像质量，人们希望设计出具有更高亮度以及更好光稳定性的荧光染料。作为其中主要使用的一类荧光生色团，有机小分子荧光生色团化合物也获得了很大的发展。得益于合成简便，易于修饰，毒性较小等优势，有机小分子荧光探针的开发及应用尤其受到关注。开发具有长波长发射的聚集诱导发光(AIE)特性和低光毒性的水溶性AIEgen(具有AIE性质的分子)一直是人们追求的目标，但前进的道路依然极具挑战性。
发明内容
为了解决现有技术的存在的不足，本发明提出了一种聚集诱导发光荧光染料MG-Rho，得益于分子的两个季铵盐基团，聚集诱导发光荧光染料MG-Rho具有完全水溶性，使之能够成功应用于活细胞的超快免洗成像，且有良好的生物相容性，这将极大的助力活细胞相关的生物研究。
具体通过以下技术方案实现：
一种聚集诱导发光荧光染料MG-Rho，结构如下所示：
本发明还提供上述聚集诱导发光荧光染料MG-Rho的制备方法，包括以下步骤：
S1：将碳酸钾、MG-B和Br-Rho混合并加入到第一溶解中，通氮气后，加入催化剂，形成反应混合液；
S2：将步骤S1的反应混合液进行回流，然后进行萃取，取有机相进行浓缩，得到粗产物A；
S3：将S2得到的粗产物A溶解在第二溶剂中，加入四氯对苯醌，反应得到粗产物B，将粗产物B提纯后得到聚集诱导发光荧光染料MG-Rho；
其中，所述Br-Rho的结构式为：
所述MG-B的结构式为：
进一步地，MG-B和Br-Rho的摩尔比为(1-1.5)：1。
进一步地，步骤S1中，所述催化剂为四(三苯基膦)钯。
优选地，步骤S1中，所述第一溶剂为N,N-二甲基甲酰胺；步骤S2中，所述第二溶剂为二氯甲烷。
进一步地，步骤S2中，所述回流时间为8-12h。
优选地，步骤S2中，浓缩后加入洗脱剂进行洗涤纯化。
进一步地，步骤S3中，所述反应时长为0.5-1h。
优选地，步骤S3中使用硅胶柱进行提纯。
本发明还提供上述聚集诱导发光荧光染料MG-Rho作为线粒体靶向荧光染料的应用。
本发明的有益效果如下：
本发明成功开发了一种聚集诱导发光荧光染料MG-Rho，得益于分子的两个季铵盐基团，聚集诱导发光荧光染料MG-Rho具有完全水溶性，使之能够成功应用于活细胞的超快免洗成像，且有良好的生物相容性，这将极大的助力活细胞相关的生物研究。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例中MG-Rho的氢谱图；
图2为实施例中MG-Rho的碳谱图；
图3为实施例中MG-Rho的高分辨质谱图；
图4为MG-Rho在甲醇中的吸收和光致发射光谱图；
图5为MG-Rho在不同比例的四氢呋喃/水混合物中的荧光光谱；
图6为MG-Rho的光致发射强度随四氢呋喃浓度的变化趋势图；
图7为MG-Rho(5uM)(lex＝560nm,lem＝570-750nm)和MITO tracker(lex＝488nm,lem＝500-560nm)孵育HPASMC细胞的CLSM图像；
图8为不同MG-Rho浓度对细胞活力的影响结果；
图9为MG-Rho(5uM)(lex＝560nm,lem＝570-750nm)孵育MCF7细胞的CLSM图像。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种聚集诱导发光荧光染料MG-Rho，结构如下所示：
本发明还提供上述聚集诱导发光荧光染料MG-Rho的制备方法，包括以下步骤：
S1：将碳酸钾、MG-B和Br-Rho混合并加入到N,N-二甲基甲酰胺中，通氮气后，加入催化剂，形成反应混合液；
S2：将步骤S1的反应混合液进行回流，加入溶剂进行萃取剂，取有机相进行浓缩，得到粗产物A；
S3：将S2得到的粗产物A溶解在溶剂中，加入四氯对苯醌，反应得到粗产物B，将粗产物B提纯后得到聚集诱导发光荧光染料MG-Rho；
其中，所述Br-Rho的结构式为：
所述MG-B的结构式为：
制备过程中涉及的合成路线为：
进一步地，MG-B和Br-Rho的摩尔比为(1-1.5)：1。
优选地，步骤S1中，所述催化剂为四(三苯基膦)钯。
优选地，步骤S2中，所述溶剂为二氯甲烷。
进一步地，步骤S2中，所述回流时间为8-12h。
进一步地，步骤S2中，浓缩后加入洗脱剂进行洗涤纯化。
进一步地，步骤S3中，所述反应时长为0.5-1h。
优选地，步骤S3中，使用硅胶柱进行提纯。
本发明还提供上述聚集诱导发光荧光染料MG-Rho作为线粒体靶向荧光染料的应用。
实施例1
MG-B的制备：
(1)将化合物4-溴苯甲醛(22.1mg,0.1mmol)、无水氯化锌(28.1mg,0.2mmol)、N,N-二甲基苯胺(36.2mg,0.3mmol)和无水乙醇(1mL)的混合物在100℃下搅拌过夜。冷却至室温后，将混合物浓缩以除去剩余的N,N-二甲基苯胺。用水(4mL)和乙酸乙酯(3-5mL)提取粗产物。合并有机相后用无水硫酸钠干燥，粗产物经硅胶柱纯化(正己烷与乙酸乙酯的体积比＝10:1)得到白色粉末状的溴代孔雀石绿(MG-Br)。
(2)将MG-Br(40.8mg,0.1mmol)、频哪硼酸酯(80mg,0.3mmol)和醋酸钾(49mg,0.125mmol)溶于N,N-二乙基甲酰胺(3mL)中。将[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯(II)(10mg,0.012mmol,10％)作为铃木偶联反应的催化剂溶于N,N-二乙基甲酰胺(1mL)中加入反应物混合物中，在80℃下搅拌12小时。后将混合物冷却，加入二氯甲烷(10mL)，用30mL的水在分液漏斗中萃取，收集有机相，用无水硫酸钠干燥，旋转蒸发干燥。粗产品经硅胶柱层析纯化，去除溶剂，真空干燥后得到MG-B白色固体。
MG-Rho的制备：
(1)、将碳酸钾(10mmol)、MG-B(54.7mg,0.12mmol)和Br-Rho(47.7mg,0.1mmol)的混合物中加到N,N-二甲基甲酰胺(3mL)中。通氮气保护后，加入四(三苯基膦)钯(10mg,0.008mmol)。
(2)、反应混合液回流12h，用二氯甲烷萃取，饱和氯化钠溶液洗涤3次。合并有机相无水硫酸钠干燥。粗产物A浓缩后，以(乙酸乙酯与己烷的体积比＝1:20-1:10)为洗脱剂，硅胶柱层析纯化。
(3)、然后将纯化后的粗产物A溶解在二氯甲烷里，加入四氯对苯醌(37mg,0.15mmol)一锅法室温搅拌30min。得到的粗产物B经硅胶柱层析纯化(甲醇/二氯甲烷＝1:10-1:5)得到最终目标产物MG-Rho为墨绿色固体。
对目标化合物MG-Rho进行了系统的表征，包括核磁氢谱，碳谱，和高分辨质谱。
MG-Rho的氢谱如图1所示，氢谱数据为：1H NMR(400MHz,MeOD-d4)δ(ppm)8.15(d,J＝8.2Hz,2H),8.08(d,J＝8.2Hz,2H),7.68(d,J＝8.2Hz,2H),7.57(d,J＝8.2Hz,2H),7.52(dd,J＝9.4,4.9Hz,6H),7.14(dd,J＝12.2,8.4Hz,6H),7.04(d,J＝2.3Hz,2H),3.73(q,J＝7.0Hz,8H),3.39(s,12H),1.36(m,12H).
MG-Rho的碳谱如图2所示，碳谱数据为：13C NMR(100MHz,MeOD-d4)δ(ppm)176.5,158.1,157.2,156.8,155.7,144.2,141.2,140.5,139.3,135.4,132.3,131.7,130.5,127.2,127.1,127.0,114.2,113.5,113.0,96.1,45.5,39.7,11.5.
MG-Rho的高分辨质谱如图3所示，质谱数据为：HRMS(ESI)calcd.for C50H54N4O2+[M]2+363.21433,found:363.21429.
实施例2光学性质实验
检测MG-Rho在甲醇中的吸收和光致发射(PL)光谱图，结果如图4所示，从图4中可以看出，MG-Rho的吸收波长(左峰)在550nm、光致发射波长(右峰)在600nm。研究MG-Rho在不同比例的水/四氢呋喃混合物中的AIE特征，参见图5，可以看到，随着水/四氢呋喃混合物中四氢呋喃浓度由0到90％的逐渐增加，MG-Rho的荧光发射强度也随着增加。由图5、6可以观察到，MG-Rho最强的荧光强度在四氢呋喃的比例为90％时，荧光强度提高到132倍。图6的右下角插图中表示MG-Rho的水溶液(左)和90四氢呋喃溶液(右)在紫外线照射下拍摄的照片。
实施例3免洗实验
分别将本发明的染料MG-Rho与市售的染料MITO tracker用于孵育HPASMC细胞后，不经过繁琐的染色再洗涤的操作，即免洗的情况下，进行激光扫描共聚焦显微镜成像(CLSM)，见图7，其中，(a)为用染料MG-Rho孵育的HPASMC细胞成像，(b)为用市售染料MITOtracker孵育的HPASMC细胞成像，(c)为不用染料孵育的HPASMC细胞成像。可以看出，在免洗的情况下，染料MG-Rho的成像几乎无背景信号，而市售染料MITO tracker的成像中有明显的背景信号，相比之下，本发明的MG-Rho染料在活细胞免洗成像方面展现了高信噪比的优势。
实施例4细胞毒性实验
使用CCK-8检测方法评估了MG-Rho的细胞毒性，见图8。结果表明，在培养基中加入低于2.5μM浓度的MG-Rho并孵育24小时后检测细胞活力，细胞活力无明显变化，细胞存活率可达到80％以上。
实施例5线粒体靶向实验
用MG-Rho以及市售的MITO tracker Green(线粒体荧光探针)、LysotrackerGreen(溶酶体荧光探针)以及ER tracker Blue(内质网荧光探针)分别对MCF7细胞的线粒体、溶酶体和内质网进行染色，如图9所示。在MG-Rho的红色荧光区域，线粒体的结构清晰可见(见图9.(a))，表明MG-Rho定位于活MCF7细胞的线粒体。皮尔逊相关系数(Rr；从+1到1)，表示两个变量之间的线性依赖程度，用于量化MG-Rho与市售染料之间的染色区域重叠。
图9中，图(a)为MG-Rho对活MCF7细胞的线粒体进行染色，图(b)MITO trackerGreen为对活MCF7细胞的线粒体进行染色，图(c)为图(a)与图(b)的重叠图，可以看出，两种不同通道的Mito Tracker green(MTG)(lex＝488nm,lem＝500-560nm)和MG-Rho的荧光信号几乎完全重叠，图(d)表示的是MG-Rho与MITO tracker Green之间的染色区域重叠程度,皮尔逊相关系数高达90％。
图(e)为MG-Rho对活MCF7细胞的溶酶体进行染色，图(f)为Lysotracker Green为对活MCF7细胞的溶酶体进行染色，图(g)为图(e)与图(f)的重叠图，可以看出，两种不同通道的Lysotracker Green(LTG)(lex＝488nm,lem＝500-560nm)和MG-Rho的荧光信号重叠程度较低，图(h)表示其二者的皮尔逊相关系数仅为21％。
图(i)为MG-Rho对活MCF7细胞的内质网进行染色，图(j)为ER tracker Blue对活MCF7细胞的内质网进行染色，图(k)为图(i)与图(j)的重叠图，可以看出，两种不同通道的ER tracker Blue(ETG)(lex＝350nm,lem＝360-400nm)和MG-Rho的荧光信号重叠程度较低，图(l)表示其二者的皮尔逊相关系数仅为20％。
不同于溶酶体绿色荧光探针Rr＝0.21和内质网蓝色荧光探针Rr＝0.20的重叠程度，两种不同通道的Mito Tracker green(MTG)和MG-Rho的荧光信号几乎完全重叠，Rr＝0.90，表明MG-Rho对线粒体具有特异性靶向作用。
综上，本发明提供的聚集诱导发光荧光染料MG-Rho相比于现有的市售染料，具有免洗、低毒的特性，且对线粒体具有高度的特异性，将极大的助力活细胞相关的生物研究。此外，本发明提供的聚集诱导发光荧光染料MG-Rho的制备方法也简单可行、易操作。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种聚集诱导发光荧光染料MG-Rho，其特征在于，结构如下所示：
2.一种根据权利要求1所述的聚集诱导发光荧光染料MG-Rho的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将碳酸钾、MG-B和Br-Rho混合并加入到第一溶剂中，通氮气后，加入催化剂，形成反应混合液；
S2：将步骤S1的反应混合液进行回流，然后进行萃取，取有机相进行浓缩，得到粗产物A；
S3：将S2得到的粗产物A溶解在第二溶剂中，加入四氯对苯醌，反应得到粗产物B，将粗产物B提纯后得到线粒体靶向水溶性聚集诱导发光荧光染料MG-Rho；
其中，所述Br-Rho的结构式为：
所述MG-B的结构式为：
所述催化剂为四(三苯基膦)钯；
所述第一溶剂为N,N-二甲基甲酰胺；步骤S2中，所述第二溶剂为二氯甲烷。
3.根据权利要求2所述的聚集诱导发光荧光染料MG-Rho的制备方法，其特征在于，MG-B和Br-Rho的摩尔比为(1-1.5)：1。
4.根据权利要求2所述的聚集诱导发光荧光染料MG-Rho的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述回流时间为8-12h。
5.根据权利要求2所述的聚集诱导发光荧光染料MG-Rho的制备方法，其特征在于，步骤S2中，浓缩后加入洗脱剂进行洗涤纯化。
6.根据权利要求2所述的聚集诱导发光荧光染料MG-Rho的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述反应时长为0.5-1h。
7.根据权利要求2所述的聚集诱导发光荧光染料MG-Rho的制备方法，其特征在于，步骤S3中使用硅胶柱进行提纯。
8.根据权利要求1所述的聚集诱导发光荧光染料MG-Rho或根据权利要求2-7任一项所述方法制备得到的聚集诱导发光荧光染料MG-Rho作为线粒体靶向荧光染料的应用。
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