CN113637004A - 一种基于双官能化有机小分子为母体的铝离子检测荧光探针及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于双官能化有机小分子为母体的铝离子检测荧光探针及其制备方法与应用，该荧光探针其结构式如下式Ⅰ所示。本发明以1，8‑萘酰亚胺和异喹啉酰肼或者2‑苯甲酰胺苯甲酰肼为荧光基团，通过缩合反应制备具有双官能化有机小分子荧光探针，所制备的希夫碱型探针NIQ或者NBP对溶液中Al3+表现出高灵敏度和高选择性，同时由于其具有结构稳定、毒性低以及细胞渗透能力强，又成功用于检测活体Hela细胞中的痕量金属铝离子；该荧光探针制备方法简单，原料易得，所得产品为固体粉末，易于存储，具有较高的应用发展前景。
Figure DDA0003251001920000011

Description

一种基于双官能化有机小分子为母体的铝离子检测荧光探针 及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种基于双官能化有机小分子为母体的铝离子检测荧光探针及其制备方法与应用。
背景技术
铝(Al)作为地壳中第三含量高的金属元素，约占总矿物成分的8％,而且由于其宝贵的固有特性，如低原子量、高抗渗性、耐久性和可回收性，其用途在世界范围内以各种形式得到极大提高，如食品包装、水净化系统、医疗设备、电子设备、建筑材料、运输、食品添加剂、药品、，和轻合金。但是，铝元素不是人体必需的微量元素，长期摄入过量的铝元素对人类的人体是有害的，尤其是对人类的大脑和神经系统，如阿尔茨海默症。同时高浓度的铝离子会使土壤酸化从而抑制植物的生长。因此，世界卫生组织已将铝离子列入食品污染源之一，同时中国的《食品添加剂卫生标准》中已做出规定，一般情况下铝残留量不得超过100mg/kg。
目前经典的铝离子检测方法有原子吸收光谱法(AAS)，原子发射光谱法(AES)，电感耦合等离子体质量探针以及电化学方法，但是这些方法需要昂贵的仪器，严谨的实验条件，样品预处理比较复杂以及测量时间相对较长。相比较而言，有机小分子荧光探针具有优异的选择性，高灵敏度，检测时间短，操作简单，检测成本低，毒性低以及细胞渗透性强等优点而备受关注。因此，设计开发高灵敏度、高选择性以及低检出限的Al3+荧光探针具有重要的使用价值。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于双官能化有机小分子为母体的铝离子检测荧光探针，该荧光探针化合物对铝离子具有很高的选择性，低检出限以及肉眼可见的颜色变化，可以有效地检测环境和生物系统中微量的铝离子。
本发明还提供了基于双官能化有机小分子的铝离子检测荧光探针的制备方法和应用。
技术方案：为实现上述发明目的，本发明所述一种基于双官能化有机小分子铝离子检测荧光探针(NIQ)和(NBP)，其结构式如下式I或者II所示：
Figure BDA0003251001900000021
本发明所述的基于双官能化有机小分子为母体的铝离子检测荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
先将4-溴-1，8-萘二甲酸酐和正丁胺通过亲和加成-消除反应得到中间体4-溴-1，8-萘酰亚胺；然后以4-溴-1，8-萘酰亚胺原料，硫酸铜(CuSO4)为催化剂，甲醇钠(CH3ONa)为碱，于有机溶剂中进行反应，得到中间体4-甲氧基-1，8-萘酰亚胺；再将中间体4-甲氧基-1，8-萘酰亚胺加入到HI水溶液中，水解得到中间体4-羟基-1，8-萘酰亚胺；最后将中间体4-羟基-1，8-萘酰亚胺通过甲酰化反应得到目标原料A：4-羟基-1，8-萘酰亚胺-3-醛；
以目标原料A：4-羟基-1，8-萘酰亚胺-3-醛和化合物B：异喹啉酰肼通过缩合反应得到双官能化有机小分子为母体的铝离子检测荧光探针I：NIQ；
其反应路线优选如下所示：
Figure BDA0003251001900000022
或者目标原料A：4-羟基-1，8-萘酰亚胺-3-醛和化合物C:2-苯甲酰胺-苯甲酰肼通过缩合反应得到荧光探针II：NBP，其反应路线如下所示：
其反应路线如下所示：
Figure BDA0003251001900000031
其中，所述4-溴-1，8-萘二甲酸酐加入并溶解到有机溶剂中，然后加入正丁胺，回流搅拌，待反应完全后，减压蒸馏除去有机溶剂，然后通过柱层析方法，得到中间体4-溴-1，8-萘酰亚胺。
其中，所述中间体4-溴-1，8-萘酰亚胺溶于甲醇中，然后加入甲醇钠和五水硫酸铜，加热回流搅拌，待反应完全后将反应液冷却至室温后，减压蒸馏除去有机溶剂，用二氯甲烷萃取，分液，无水硫酸镁干燥，减压蒸馏除去溶剂后，通过柱层析得到中间体4-甲氧基-1，8-萘酰亚胺。
其中，所述中间体4-甲氧基-1，8-萘酰亚胺溶于HI水溶液后，高温回流搅拌，待反应完全后，将反应物冷却至室温，然后将反应液缓慢倒入冰水中，有固体析出，抽滤，洗涤固体，得到中间体4-羟基-1，8-萘酰亚胺。
其中，在搅拌的三氟乙酸溶液中，加入中间体4-羟基-1，8-萘酰亚胺和乌洛托品，然后将混合反应体升温回流过夜，反应完成后，将反应物料冷却至室温，加入三氯甲烷和HCl混合溶液搅拌，用三氯甲烷萃取，饱和食盐水洗涤，分液，无水硫酸镁干燥，将粗产物通过柱层析纯化，得到目标原料A；4-羟基-1，8-萘酰亚胺-3-醛。
其中，所述化合物B异喹啉酰肼的制备过程为：异喹啉酸溶解于甲醇溶剂中，加入浓硫酸作为催化剂，将混合物料加热回流搅拌，反应完成后，将反应物料冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，将粗产物通过用二氯甲烷进行萃取，分液，无水硫酸镁干燥，减压蒸馏除去溶剂，得到粗产物异喹啉酸甲酯；然后，将异喹啉酸甲酯和水合肼解于有机溶剂中，加热回流搅拌，反应完成后，将反应物料冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，通过柱层析得到异喹啉酰肼。
其中，所述化合物C 2-苯甲酰胺-苯甲酰肼的制备为：将2-氨基苯甲酸甲酯溶解于碱性溶液中，加热回流待反应体系冷却至室温后进行萃取，分液，干燥，除去溶剂，得到产物中间体邻氨基苯甲酸，将邻氨基苯甲酸，苯甲酰氯以及三乙胺加入有机溶剂中搅拌，随后加入乙酸酐继续搅拌，反应完成后，向反应体系中加入水合肼，继续搅拌回流，除去有机溶剂，进行萃取，分液，干燥，除去溶剂通过柱层析纯化得到目标原料2-苯甲酰胺苯甲酰肼。
其中，所述4-羟基-1，8-萘酰亚胺-3-醛和异喹啉酰肼或者2-苯甲酰胺-苯甲酰肼溶解于有机溶剂中，将混合物料回流搅拌，反应完成后，将反应物料冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，将粗产物通过重结晶纯化，得到荧光探针I：NIQ或者荧光探针II：NBP。
作为优选，合成路线如下图所示：
Figure BDA0003251001900000041
其中，中间体(A)为4-羟基-1，8-萘酰亚胺-3-醛；中间体(B)为异喹啉酰肼；(E)-N’-(2-丁基-6-羟基-1，3-二氧-2，3-二羟基-1H-苯并异喹啉5-甲烯基)异喹啉-1-酰肼(NIQ)为本发明所述检测铝离子荧光探针分子。
作为优选，合成路线如下图所示：
Figure BDA0003251001900000051
其中，中间体(A)为4-羟基-1，8-萘酰亚胺-3-醛；中间体(C)为2-苯甲酰胺苯甲酰肼；(E)-N-(2-(2-((2-丁基-6-羟基-1,3-二氧代-2,3-二氢-1H-苯并[de]异喹啉-5-基)亚甲基)肼-1-羰基)苯基)苯甲酰胺(NBP)为本发明所述铝离子检测荧光探针分子。
本发明所述的基于双官能化有机小分子为母体的铝离子检测荧光探针在检测溶液以及活体细胞中铝离子中的应用。
本发明设计了一种以基于萘酰亚胺和异喹啉酰肼或者2-苯甲酰胺苯甲酰肼为母体结构的席夫碱型荧光探针NIQ(NBP)。在此类Al离子检测的探针母体结构中，1，8-萘酰亚胺具有刚性平面结构和大π键共轭体系，是很好的发色团。苯甲酰肼衍生物(ArCONHNH2)作为荧光基团具有诸多优点，且具有很好的生物相容性以及生物毒性低。同时，本探针与现有技术中以嘌呤结构为母体的探针相比，不仅结构完全不同，同时合成路线短，产率高，原料成本低，而且对Al3+具有独特的灵敏度、检出限低，可以成功用于溶液和细胞中的微量Al3+。
由于Al3+由于其的配位能力低，水化能力高，并且没有光谱特性，所以Al3+的检测是一个巨大的挑战。本发明以1，8-萘酰亚胺为荧光基团，通过异喹啉酰肼或者2-苯甲酰胺苯甲酰肼缩合反应制备具有1，8-萘酰亚胺为母体的荧光探针；其中希夫碱类配体含有–C＝N–基团，本发明利用硬-硬相互作用以及N-和O-硬供体位点，N/O丰富的席夫碱配体对硬酸Al3+具有很强的络合作用，而且伴随着明显的荧光增强，N/O富有的希夫碱类配体可以作为Al3+荧光传感器最佳母体结构。同时，1，8-萘酰亚胺具有刚性平面结构和大π键共轭体系，可以作为很好的发色团，而且4号位点具有较高的化学活性，很容易和其他化合物反应，为该类荧光探针分子的多样化设计提供了保障，同时使用的异喹啉酰肼或者2-苯甲酰胺苯甲酰肼作为荧光基团具有诸多优点，且具有很好的生物相容性以及生物毒性低。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明通过利用一步法通过1,8-萘酰亚胺醛和异喹啉酰肼或者2-苯甲酰胺苯甲酰肼缩合制备具有1，8-萘酰亚胺为母体的荧光探针。该荧光探针对铝离子具有专一性识别，响应时间短，灵敏度高，对溶液中Al3+表现出高灵敏度和高选择性，同时由于其具有结构稳定、毒性低和细胞渗透能力强，又成功用于细胞成像，成功用于检测活性细胞中微量的铝离子。更重要的是该探针制备方法简单，所得产品为固体粉末，易于存储，稳定性好。
附图说明
图1为实施例1中制得的铝离子荧光探针在DMSO：H2O(v/v/v＝9:1)溶液中对不同浓度铝离子(Al3+)的紫外吸收光谱图以及颜色变化图(图1插图中左边为淡黄色，右边无色)；
图2为实施例1中制得的铝离子荧光探针在DMSO-H2O(v/v＝9:1)溶液中对不同金属离子选择性荧光光谱图；
图3为实施例1中制得的荧光探针在DMSO-H2O(v/v＝9:1)溶液中对不同浓度铝离子(Al3+)的荧光光谱响应图以及颜色变化图；
图4为实施例1中制得的荧光探针在DMSO-H2O(v/v＝9:1)溶液中对不同金属离子选择干扰性检测的荧光响应图；
图5为实施例1中制得的荧光探针在DMSO-H2O(v/v＝9:1)与铝离子(Al3+)络合比的Job-plot曲线；
图6为实施例1中制得的荧光探针检测铝离子时的响应时间图；
图7为实施例1中制得的荧光探针在DMSO-H2O(v/v＝9:1)与铝离子(Al3+)在不同pH值(2至12)范围内荧光响应图；
图8为实施例1中制得的荧光探针与铝离子结合前后在MTT细胞中的毒性图；
图9为实施例1中制得的荧光探针与铝离子结合前后在活体细胞HeLa cells荧光检测图；
图10为实施例1中制得的荧光探针与铝离子络合后与EDTA的重复性实验变化图；
图11为实施例1中制得的荧光探针与铝离子络合机理，并得到了DFT计算的验证；
图12为实施例1中制得的荧光探针的核磁共振1H-NMR谱图；
图13为实施例1中制得的荧光探针的核磁共振13C-NMR谱图；
图14为实施例1中制得的荧光探针的质谱MS谱图；
图15为实施例2中制得的荧光探针在DMSO：H2O(v/v＝9:1)(DMSO:H2O:Hepes)(v/v/v＝9:1:0.1)溶液中对不同浓度铝离子(Al3+)的紫外吸收光谱图以及颜色变化图(图15插图中左边为黄色，右边为亮绿色)；
图16为实施例2中制得的荧光探针在不同溶剂中对铝离子的荧光相应强度；
图17为实施例2中制得的荧光探针在DMSO-H2O(v/v＝9:1)溶液中对不同金属离子选择性荧光光谱图；
图18为实施例2中制得的荧光探针在DMSO-H2O(v/v＝9:1)溶液中对不同金属离子选择干扰性检测的荧光响应图；
图19为实施例2中制得的荧光探针在DMSO-H2O(v/v＝9:1)溶液中对不同浓度铝离子(Al3+)的荧光光谱响应图以及颜色变化图；
图20为实施例2中制得的荧光探针在DMSO-H2O(v/v＝9:1)与铝离子(Al3+)络合比的Job-plot曲线；
图21为实施例2中制得的荧光探针检测铝离子时的响应时间图；
图22为实施例2中制得的荧光探针在DMSO-H2O(v/v＝9:1)与铝离子(Al3+)在不同pH值(2至12)范围内荧光响应图；
图23为实施例2中制得的荧光探针与铝离子结合前后在MTT细胞中的毒性图；
图24为实施例2中制得的荧光探针与铝离子结合前后在活体细胞HeLa cells荧光检测图；
图25为实施例2中制得的荧光探针与铝离子络合后与不同阴离子的选择性性实验变化图；
图26为实施例2中制得的荧光探针-铝离子络合物在DMSO-H2O(v/v＝9:1)溶液中对不同浓度磷酸氢根离子(HPO4 2-)的荧光光谱响应图以及颜色变化图；
图27为实施例2中制得的荧光探针与铝离子络合后与HPO4 2-离子重复性荧光变化图；
图28为实施例1中制得的荧光探针的核磁共振1H-NMR谱图；
图29为实施例1中制得的荧光探针的质谱MS谱图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
本发明中使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。实验所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中所选用的以下所有试剂皆为市售分析纯或化学纯。
其中，实施例中各种属离子溶液是由纯度为99％以上的氯化盐化学试剂如无水氯化铝、无水氯化铁、氯化锌等加去离子水配置而成的。
实施例1
基于双官能化有机小分子为母体的荧光探针，采用如下方法制备而成：
(1)制备中间体
将4-溴-1，8-萘二甲酸酐(2.77g,10mmol)加入并溶解到乙醇(50ml)中，然后加入正丁胺(20μL，10mmol)，80℃回流搅拌5小时，待反应完全后，减压蒸馏除去有机溶剂，然后粗产品通过柱层析(乙酸乙酯：石油醚＝1:10)得到淡黄色固体中间体4-溴-1，8-萘酰亚胺(2.38g,72％)。
所得中间体4-溴-1，8-萘酰亚胺的结构式为：
Figure BDA0003251001900000081
(2)制备中间体4-甲氧基-1，8-萘酰亚胺
将中间体4-溴-1，8-萘酰亚胺(0.33g，1mmol)溶于甲醇(20ml)中，然后加入甲醇钠(0.16g,3mmol)和五水硫酸铜(0.5g，20mmol％)70℃加热回流搅拌24小时后，将反应液冷却至室温后，减压蒸馏除去有机溶剂，用1M HCl水溶液洗涤，用二氯甲烷(3*50ml)萃取，分液，无水硫酸镁干燥，减压蒸馏除去溶剂后，得到黄色固体粗产品，粗产品通过柱层析(乙酸乙酯：石油醚＝1:10)，得到黄色固体中间体4-甲氧基-1，8-萘酰亚胺(0.17g,60％)。
所得中间体Ⅲ的结构式为：
Figure BDA0003251001900000091
(3)制备中间体4-羟基-1，8-萘酰亚胺
将中间体4-甲氧基-1，8-萘酰亚胺(0.28g,1mmol)溶于质量分数55％HI(30ml)水溶液后，在高温140℃条件下回流搅拌12小时后，将反应物冷却至室温，然后将反应液缓慢倒入冰水中，有固体析出，抽滤，用蒸馏水洗涤固体3次，得到棕色固体中间体4-羟基-1，8-萘酰亚胺(0.16g，60％)。
所得中间体4-羟基-1，8-萘酰亚胺的结构式为：
Figure BDA0003251001900000092
(4)制备中间体4-羟基-1，8-萘酰亚胺-3-醛
在搅拌的三氟乙酸(20mL)溶液中，加入中间体4-羟基-1，8-萘酰亚胺(0.54g,2mmol)和乌洛托品(0.84g,6mmol)，然后将混合反应体升温至120℃回流过夜后，冷却至室温，加入三氯甲烷(20mL)和1M HCl(20mL)搅拌12h，用三氯甲烷萃取(3×20mL)，无水硫酸镁干燥，将粗产物通过柱层析纯化(乙酸乙酯：石油醚＝1：3)或者用甲醇重结晶纯化，得到淡黄色目标原料4-羟基-1，8-萘酰亚胺-3-醛(0.401g，68％)。
所得到的中间体4-羟基-1，8-萘酰亚胺-3-醛结构式为：
Figure BDA0003251001900000093
(5)制备中间体异喹啉酰肼
将异喹啉酸(1.73g,10mmol)溶解于甲醇溶剂(50mL)中，加入浓硫酸(1mL)作为催化剂，将混合物料70℃回流搅拌12h，反应完成后，将反应物料冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，将粗产物通过用二氯甲烷进行萃取，分液，无水硫酸镁干燥，减压蒸馏除去溶剂，得到粗产物异喹啉酸甲酯(1.71g,91％)。然后，将粗产品异喹啉酸甲酯和水合肼(0.1g,20mmol)解于甲醇溶剂(30mL)中，70℃回流搅拌3h，反应完成后，将反应物料冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，粗产物通过柱层析(乙酸乙酯：石油醚＝1:3)得到目标原料异喹啉酰肼(1.40g，85％)。
所得到的中间体异喹啉酰肼结构式为：
Figure BDA0003251001900000101
(6)制备基于双官能化有机小分子为母体的铝离子荧光探针NIQ
将4-羟基-1，8-萘酰亚胺-3-醛(A)(0.297g,1mmol)和异喹啉酰肼(B)(0.187g,1mmol)溶解于甲醇溶剂(20mL)中，在N2保护下，将反应体系于80℃下回流搅拌2h，反应完成后，将反应体系冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，将粗产物通过重结晶(DMSO：MeOH＝1:20)纯化，得到荧光探针分子NIQ(0.26g,65％)。
所得到的荧光探针化合物结构式为：
Figure BDA0003251001900000102
本发明制得的铝离子荧光探针化合物1H NMR(400MHz,CDCl3)1H NMR(400MHz,CDCl3)δ13.52(s,1H),11.58(s,1H),9.58(s,1H),8.67–8.62(m,2H),8.56–8.55(m,1H),8.42–8.39(m,2H),7.80–7.70(m,5H),4.16–4.12(m,2H),1.73–1.69(m,2H),1.47–1.44(m,2H),0.99(t,J＝8.4Hz,3H).13C(100MHz,CDCl3)163.12,162.54,160.59,159.86,147.62,144.59,138.97,136.37,132.18,131.69,129.84,128.87,128.50,128.33,126.30,126.13,125.93,125.16,124.45,122.15,121.34,112.91,111.37,39.04,29.15,19.28,12.74.ESI-MS m/z:[M+H]+calcd for C27H27N4O4 467.1,found 467.0.IR(KBr cm-1):3236,2962,1694,1657,1599,1521,1317.
实施例1中制得的荧光探针的质谱MS谱图、核磁共振1H-NMR谱图、核磁共振13C-NMR谱图分别如图12、图13和图14所示，说明本发明的荧光探针成功制备。
实施例2
实施例2中4-羟基-1，8-萘酰亚胺-3-醛的制备同实施例1。
(1)制备中间体2-苯甲酰胺苯甲酰肼
2-氨基苯甲酸甲酯(2g,13mmol)溶解于氢氧化钠(质量分数20％)水溶液中，加热至100℃回流搅拌2h。待反应体系冷却至室温后，向反应体系中加入1M HCl水溶液，中和过量的NaOH成中性。然后用二氯甲烷(3×20mL)进行萃取，分液，无水硫酸镁干燥，减压蒸馏除去溶剂，得到产物中间体邻氨基苯甲酸。将上述的邻氨基苯甲酸(600mg,4mmol)，苯甲酰氯(618mg,4.4mol)以及三乙胺(606mg,6mmol)加入到50mL含有10mL乙醇溶剂的圆底烧瓶中，室温搅拌12h。随后，在向反应瓶中继续加入乙酸酐(530mg,5.2mmol)搅拌12h。反应完成后，直接向反应体系中加入水合肼(0.1g,20mmol)，继续80℃加热搅拌回流4h。待反应体系冷却至室温后，减压蒸馏除去乙醇溶液。然后向反应体系中加入二氯甲烷(3×50mL)和水(3×50mL)进行萃取，分液，无水硫酸镁干燥，减压蒸馏除去溶剂得到粗产物。最后，粗产物通过柱层析纯化(乙酸乙酯：石油醚＝1：4)得到目标原料2-苯甲酰胺苯甲酰肼(B)(0.401g，68％)。
所得到的中间体2-苯甲酰胺苯甲酰肼结构式为：
Figure BDA0003251001900000111
(2)制备基于1，8-萘酰亚胺为母体的高选择性铝离子荧光探针NBP
将4-羟基-1，8-萘酰亚胺-3-醛(A)(0.297g,1mmol)和2-苯甲酰胺苯甲酰肼(C)(0.255g,1mmol)溶解于甲醇溶剂(20mL)中，在N2保护下，将反应体系于80℃下回流搅拌2h，反应完成后，将反应体系冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，将粗产物通过重结晶(DMSO/H2O＝1：10)纯化，得到荧光探针分子NBP(0.41g,75％)。
所得到的荧光探针化合物结构式为：
Figure BDA0003251001900000121
本发明制得的铝离子荧光探针化合物1H NMR(400MHz,DMSO-d6)1H NMR(400MHz,CDCl3)δ14.14(s,1H),12.82(s,1H),11.77(s,1H),8.89–8.86(m,1H),8.70–8.67(m,1H),8.60(s,1H),8.53–8.50(m,2H),7.99–7.94(m,3H),7.89–7.84(m,1H),7.70–7.64(m,3H),7.35–7.31(m,1H),4.06–4.02(m,2H),1.65–1.58(m,2H),1.40–1.32(m,2H),0.93(t,J＝8.4Hz,3H).ESI-MS m/z:[M-H]+calcd for C31H26N4O5 534.1,found 532.9.IR(KBr cm-1):3433,3243,2955,2350,1690,1654,1598,1324.
实施例1中制得的荧光探针的核磁共振1H-NMR谱图质谱和MS谱图分别如图28和图29所示，说明本发明的荧光探针成功制备。
实施例3
本实施例全部使用的是荧光探针NIQ。
将实施例1制得的铝离子检测荧光探针NIQ用DMSO配置成1mM的探针储备液，各金属离子用去离子水配置成3mM的金属离子储备液，向3mL的空白溶液DMSO-H2O(v/v＝9：1)中加入30μL的探针储备液和50μL的金属离子储备液并用荧光光谱仪和紫外分光光度计进行检测，测试得知荧光探针的最大激发波长为394nm，最大发射波长为510nm，具体测试结果如下：
取两个比色皿，分别加入3mL的空白溶液DMSO-H2O(v/v＝9：1)中和30μL的探针储备液，向其中一个比色皿加入50μL的铝离子储备液，另外一个比色皿不加铝离子储备液，进行紫外光谱测试。如图1所示，荧光探针本身在波长λ＝366nm处有较强的紫外吸收，当往溶液中加入铝离子后，紫外吸收峰渐渐的减弱；除此之外，荧光探针在波长λ＝475nm处几乎没有紫外吸收，当往溶液中增加铝离子浓度后，紫外吸收峰渐渐的增强。此外，添加铝离子导致探针溶液的荧光颜色分别从黄色为无色。结果表明探针对Al3+具有很高的灵敏度，肉眼可见的颜色变化可能是由于探针和Al3+之间形成了新的配合物。
如图2所示，铝离子检测荧光探针加入各种金属离子后的荧光光谱图。向3mL的空白溶液DMSO-H2O(v/v＝9：1)中加入30μL的探针储备液和50μL的各种金属离子储备液，结果表明加入铝离子时，荧光光谱在510nm处荧光强度发生了明显的增强。值得注意的是加入其他金属离子，荧光无明显变化，即本发明的荧光探针对铝离子有很好的选择性。
如图3所示，铝离子检测荧光探针对不同浓度铝离子(Al3+)的荧光光谱响应图。向3mL的空白溶液DMSO-H2O(v/v＝9：1)中加入30μL的探针储备液和0～100μL(0、1、2、3……90、95、100μL)的铝离子溶液(3mM的铝离子储备液)，该荧光探针在溶液中本身几乎无荧光，但随着铝离子浓度的增加，在510nm处荧光随着铝离子浓度的增加也不断的增强，说明荧光强度随着铝离子浓度的增加而增加。
如图4所示，铝离子检测荧光探针在不同干扰金属离子存在的情况下与铝离子反应后的荧光强度柱状图。向3mL的空白溶液DMSO-H2O(v/v＝9：1)中加入30μL的探针储备液和50μL的其他任意一种金属离子(Zn2+，Co2+，Pd2+，Ni2+，Cu2+，Cr3+，Cu+，Mn2+，Mg2+，Ba2+，Pd2+，Sn2+，Fe2+，K+，Ca2+，Na+，Ag+和Cd2+)储备液，最后向空白液加入50μL的Al3+储备液，测试其荧光强度。结果表明，其它金属离子，基本对本发明铝离子荧光探针化合物识别铝离子无明显干扰。
如图5所示，通过Job's plot方法研究了探针与Al3+的结合率，向3mL的空白溶液DMSO-H2O(v/v＝9：1)中加入一定体积探针储备液(1mM)和Al3+储备液(3mM)，使得铝离子检测荧光探针和铝离子的浓度总和为50μM，通过改变二者的浓度比(铝离子检测荧光探针和铝离子物质的量比依次为1∶9，2∶8，3∶7，4∶6，5∶5，6∶4，7∶3，8∶2，9∶1)得到510nm处的荧光强度与该浓度下铝离子荧光探针化合自身荧光强度的差值，与离子占总浓度的比例作图。通过此图5可知，当铝离子所占比例为0.5时纵坐标达到最高值，可以确定该荧光探针化合物与铝离子之间主要以1∶1形式结合形成稳定的络合物。
如图6所示，向3mL的空白缓冲液DMSO-H2O(v/v＝9：1)中加入30μL的探针储备液和50μL的Al3+储备液，探针的荧光强度迅速增强到最高，并且在10分钟内达到稳定值。此外，在加入Al3+响应60分钟后，探针的荧光强度保持不变，这说明探针对于Al3+检测足够稳定。
如图7所示，向3mL的空白缓冲液DMSO-H2O(v/v＝9：1)中加入30μL的探针储备液和50μL的Al3+储备液，然后用1M HCl和1M NaOH调节不同pH(2.0至12.0)值的探针储备液。测试，探针NIQ(10μM)以及NIQ(10μM)-Al3+(5当量，50μM)配合物在2.0至12.0的可变pH值范围内的荧光响应强度变化。探针NIQ本身在pH值从2到10的范围内几乎没有荧光强度，但是NIQ-Al3+配合物在510nm处，pH为6.0-11.0的范围内，荧光强度大大增强，且在pH＝8时荧光强度达到最大值。NIQ-Al3+在酸性条件下(pH<6.0)，没有观察到明显的荧光信号，可能原因是脱质子化比较难。NIQ-Al3+在碱性条件下(pH>12.0)，荧光信号明显减弱，可能原因是Al3+形成沉淀，NIQ-Al3+浓度降低。因此，NIQ最适合的pH范围是6-11，NIQ具有可在生物环境中具有检测Al3+的能力。
如图8所示，对不同浓度(0-10μM)的铝离子检测荧光探针进行了标准MTT分析，以确定本发明的荧光探针的细胞毒性。在96孔板中接种含有10μM的铝离子溶液(100μL/孔)，并将10μL 0-10μM(0、2、4、6、8、10μM)的探针的细胞悬液接种到孔板中。将培养板放在培养箱预培养(在37℃，5％CO2的条件下)。然后向每孔注射10μL的MTT溶液，将培养板在培养箱内孵育2h，用酶标仪测定在450nm处的吸光度，所获得的细胞生存力结果表明24小时后，仍然有大于90％的细胞存活，这表明本发明的铝离子探针在实验环境中具有较低的细胞毒性。这可以说明探针在检测活细胞中的Al3+具有潜在应用。
如图9所示，荧光探针与铝离子结合前后在HeLa细胞中的成像图。将1×105HeLa细胞接种到35毫米玻璃底组织培养皿中。当细胞密度达到60％时，将DMEM培养基替换为等体积包含20μM氯化铝的无血清培养基。在37℃下培育30分钟后，将细胞用PBS洗涤3次。然后，将探针加入新的DMEM培养基中(探针终浓度为8μM)。作为对照，将未经氯化铝处理的HeLa细胞与8μM探针直接孵育。进一步孵育30分钟后，将细胞用PBS洗涤3次，并立即通过激光共聚焦显微镜成像。结果显示，加入探针和Al3+的细胞可以观察到细胞的蓝色荧光显着增加，归因于探针NIQ-Al3+配合物的形成。因此，活细胞内部的细胞成像表明探针是可透过细胞膜的，可以有效地用于活细胞中Al3+的细胞内成像，进一步表明铝离子荧光探针可以应用于生物体实验。
如图10所示，荧光探针NIQ的化学重复性实验通过交替加入Al3+和ETDA，并且伴随着明显的颜色变化。EDTA是一个很强的螯合基团，可以与Al3+络合生成稳定化合物。EDTA可以通过取代反应取代荧光探针-铝离子络合物中的Al3+，释放出自由的荧光探针，发生荧光猝灭。本实验中加入Al3+离子后荧光明显增强，有黄色变成亮绿色，但是继续加入EDTA荧光明显淬灭，且体系颜色变淡，说明EDTA可以与NIQ-Al3+中铝离子结合能力更强，说明本发明探针的化学可逆性。如图11所示，荧光探针NIQ中的N,O原子与Al3+络合。为了阐明NIQ和NIQ-Al3+的优化几何结构以及NIQ和Al3+之间的结合模式，在Gaussian 16程序的基础上进行了B3LYP/6-31G(d，p)水平的密度泛函理论(DFT)计算。NIQ和NIQ-Al3+络合物的HOMO和LUMO能级分别计算为-5.7820eV、-6.0560eV、-2.4232eV和-3.1751eV。Al3+-O(–CH–O)键长、Al3+-O(–C＝O)键长和Al3+-N(–C＝N)键长的计算距离分别为1.86、2.02和
Figure BDA0003251001900000151
从DFT图可知，探针NIQ的HOMO轨道主要集中在萘酰亚胺部分和C＝N官能团上，而LUMO轨道分散在异喹啉环上。这种空间隔离分布表明探针NIQ参与了一个PET过程，其中C＝N的孤对电子是潜在的电子供体。NIQ-Al3+络合物的电子密度在HOMO中位于探针NIQ的Al3+中心和萘酰亚胺单元上，而在LUMO中观察到NIQ-Al3+络合物的电子密度穿过Al3+中心和异喹啉部分。此外，探针NIQ(ΔE＝3.3588eV)的带隙能量(ΔEHOMO-LUMO)高于Al3+络合物(ΔE＝2.8809eV)，说明NIQ-Al3+络合物很稳定，可以用于后期制备试纸探针和细胞实验。
实施例4
本实施例全部使用的是荧光探针NBP。
将实施例2制得的荧光探针NBP用DMSO配置成1mM的探针储备液，各金属离子用去离子水配置成3mM的金属离子储备液，向3mL的空白溶液DMSO-H2O(v/v＝9：1)(DMSO:H2O:Hepes)(v/v/v＝9:1:0.1)中加入30μL的探针储备液和50μL的金属离子储备液并用荧光光谱仪和紫外分光光度计进行检测，测试得知荧光探针的最大激发波长为403nm，最大发射波长为513nm，具体测试结果如下：
取两个比色皿，分别加入3mL的空白溶液DMSO-H2O(v/v＝9：1)中和30μL的探针储备液，向其中一个比色皿加入50μL的铝离子储备液，另外一个比色皿不加铝离子储备液，进行紫外光谱测试。如图15所示，荧光探针本身在波长λ＝355nm和λ＝405nm两处有较强的紫外吸收，当往溶液中加入铝离子后，紫外吸收峰渐渐的减弱；而且往溶液中增加铝离子浓度后，紫外吸收波长λ＝470nm处峰渐渐的增强。此外，添加铝离子导致探针溶液的荧光颜色分别从黄色变为亮绿色。结果表明探针对Al3+具有很高的灵敏度，肉眼可见的颜色变化可能是由于探针和Al3+之间形成了新的配合物(图15插图)。
如图16所示，铝离子检测荧光探针在不同溶液中对铝离子荧光强度相应谱图。向3mL不同溶剂(DMSO,MeOH,EtOH,Toluene,MeCN,THF)中分别加入30μL的探针储备液和50μL的铝离子储备液，结果表明，铝离子检测荧光探针在DMSO溶液中对铝离子荧光强度最强，DMSO是反应体系最佳溶剂。
如图17所示，铝离子检测荧光探针加入各种金属离子后的荧光光谱图。向3mL的缓冲溶液DMSO-H2O(v/v＝9：1，pH＝7.4)中加入30μL的探针储备液和50μL的各种金属离子储备液，结果表明加入铝离子时，荧光光谱在508nm处荧光强度发生了明显的增强。其他金属离子，尤其是Ca2+荧光光谱在523nm处荧光强度有稍微的增强，但相对于铝离子引起的荧光强度变化，其可以忽略。即本发明的荧光探针对铝离子有很好的选择性，而且荧光强度发生明显的偏移。
如图18所示，铝离子检测荧光探针在不同干扰金属离子存在的情况下与铝离子反应后的荧光强度柱状图。向3mL的空白溶液DMSO-H2O(v/v＝9：1)中加入探针和铝离子(10uL+50uL)混合储备液和50μL的其他任意一种金属离子(Zn2+，Co2+，Pd2+，Ni2+，Cu2+，Cr3+，Cu+，Mn2 +，Mg2+，Ba2+，Pd2+，Sn2+，Fe2+，K+，Ca2+，Na+，Ag+和Cd2+)储备液，测试其荧光强度变化。结果表明，其它金属离子的存在对本发明铝离子荧光探针识别铝离子无明显干扰，说明该铝离子荧光探针具有很强的抗干扰特性。
如图19所示，铝离子检测荧光探针对不同浓度铝离子(Al3+)的荧光光谱响应图。向3mL的空白溶液DMSO-H2O(v/v＝9：1)中加入30μL的探针储备液和0～100μL(0、1、2、3……90、95、100μL)的铝离子溶液(3mM的铝离子储备液)，该荧光探针在溶液中本身几乎无荧光，但在510nm处荧光随着铝离子浓度的增加也不断的增强，说明荧光强度随着铝离子浓度的增加而增加。
如图20所示，通过Job's plot方法研究了探针(NBP)与Al3+的络合比例。向3mL的空白溶液DMSO-H2O(v/v＝9：1)中加入一定体积探针储备液(1mM)和Al3+储备液(3mM)，使得铝离子检测荧光探针和铝离子的浓度总和为50μM，通过改变二者的浓度比(铝离子检测荧光探针和铝离子物质的量比依次为1∶9，2∶8，3∶7，4∶6，5∶5，6∶4，7∶3，8∶2，9∶1)得到510nm处的荧光强度与该浓度下铝离子荧光探针化合自身荧光强度的差值，与离子占总浓度的比例作图。通过此图6可知，当铝离子所占比例为0.33时纵坐标达到最高值，可以确定该荧光探针化合物与铝离子之间主要以2∶1形式结合形成稳定的络合物。
如图21所示，向3mL的空白缓冲液DMSO-H2O(v/v＝9：1)中加入30μL的探针储备液和50μL的Al3+储备液，探针的荧光强度迅速增强到最高，并且在8分钟内达到稳定值。此外，在加入Al3+响应60分钟后，探针的荧光强度保持不变，这说明探针对于Al3+检测足够稳定。
如图22所示，向3mL的空白缓冲液DMSO-H2O(v/v＝9：1)中加入30μL的探针储备液和50μL的Al3+储备液，然后用1M HCl和1M NaOH调节不同pH(2.0至12.0)值的探针储备液。测试，探针NBP(10μM)以及NBP(10μM)-Al3+(5当量，50μM)配合物在2.0至12.0的可变pH值范围内的荧光响应强度变化。探针NBP本身在pH值从2到10的范围内荧光强度浮动比较小，但是NBP-Al3+配合物在508nm处，pH为6.0-10.0的范围内，荧光强度大大增强，且在pH＝8时荧光强度达到最大值。NBP-Al3+在酸性条件下(pH<4.0)，没有观察到明显的荧光信号，是因为强酸条件下不容易脱质子。同时NBP-Al3+在强碱性条件下，荧光信号逐渐减弱是由于铝离子沉淀，铝离子浓度降低，不利于形成NBP-Al3+络合物。因此，NBP最适合的pH范围是6-11，可以有效地检测生物体系中的痕量Al3+。
如图23所示，荧光探针与铝离子络合后检测不同阴离子的荧光光谱响应图。向3mL的空白缓冲液DMSO-H2O(v/v＝9：1)中加入30μL的探针储备液和50μL的Al3+储备液，分别加入50μL的不同阴离子储备液(详见图23)，测试其荧光强度变化。结果表明，其它阴离子离子的存在对本发明铝离子荧光探针识别铝离子无明显干扰，但是HPO4 2-和F-离子储备液的加入使NBP-Al3+络合物在508nm处的荧光强度发生了明显的淬灭。
如图24所示，NBP-Al3+络合物对不同浓度H2PO4 -的荧光光谱响应图。向3mL的空白溶液DMSO-H2O(v/v＝9：1)中加入30μL NBP-Al3+络合物储备液(探针、AlCl3溶于二次蒸馏水分别配成浓度10uM、30uM)和0～3当量的HPO4 2-储备液，该荧光探针溶液在508nm处荧光随着HPO4 2-离子浓度的增加不断的猝灭，实验结果表明HPO4 2-离子可以有效地使NBP-Al3+络合物分解，释放出自由的探针和铝离子，说明该探针具有化学可逆性。
如图25所示，在探针NBP溶液中加入Al3+，荧光明显增强，接着在反应体系中继续加入HPO4 2-，反应体系荧光强度发生淬灭，通过交替加入Al3+储备液和HPO4 2-储备液，形成探针NBP关-开-关荧光光谱响应图，以及循环实验中荧光强度变化和颜色变化，进一步说明NBP具有化学可逆性。
如图26所示，对不同浓度(0-10μM)的铝离子检测荧光探针进行了标准MTT分析，以确定本发明的荧光探针的细胞毒性。在96孔板中接种含有10μM的铝离子溶液(100μL/孔)，并将10μL 0-10μM(0、2、4、6、8、10μM)的探针的细胞悬液接种到孔板中。将培养板放在培养箱预培养12个小时(在37℃，5％CO2的条件下)。然后向每孔注射10μL的MTT溶液，将培养板继续在培养箱内孵育3h，然后用酶标仪测定在450nm处的吸光度，所获得的细胞生存力。实验结果表明24小时后，仍然有大于90％的细胞存活，这表明本发明的铝离子探针在实验环境中具有较低的细胞毒性。这可以说明探针在检测活细胞中的Al3+具有潜在应用。
如图27所示，荧光探针与铝离子结合前后在HeLa细胞中的成像图。将1×105HeLa细胞接种到35毫米玻璃底组织培养皿中。当细胞密度达到60％时，将DMEM培养基替换为等体积包含20μM氯化铝的无血清培养基。在37℃下培育30分钟后，将细胞用PBS洗涤3次。然后，将探针加入新的DMEM培养基中(探针终浓度为10μM)。作为对照，将HeLa细胞在含有8μM探针NBP培养液中孵育30分钟，然后用PBS洗涤细胞3次，除去多余的NBP，并立即通过激光共聚焦显微镜成像。结果显示，没有明显的荧光变化。将探针预处理的细胞继续在含有Al3+的培养液中培养30min，可以观察到细胞的蓝色荧光显着增加，由于探针NBP-Al3+配合物的形成。因此，活细胞内部的细胞成像表明探针是可透过细胞膜的，可以有效地用于活细胞中Al3+的细胞内成像，进一步表明铝离子荧光探针可以应用于生物系统实验。
上述实验说明以1，8-萘酰亚胺和异喹啉酰肼或者2-苯甲酰胺苯甲酰肼为荧光基团，通过缩合反应制备具有双官能化有机小分子荧光探针，所制备的席夫碱型探针对溶液中Al3+表现出高灵敏度和高选择性，同时由于其具有结构稳定、毒性低以及细胞渗透能力强，又成功用于检测活体Hela细胞中的痕量金属铝离子；该荧光探针制备方法简单，原料易得，所得产品为固体粉末，易于存储，具有较高的应用发展前景。

Claims (10)

1.一种基于双官能化有机小分子为母体的铝离子检测荧光探针，其结构式如下式I或者II所示：
Figure FDA0003251001890000011
2.一种权利要求1所述的基于双官能化有机小分子为母体的铝离子检测荧光探针的制备方法，其特征在于，优选包括如下步骤：
先将4-溴-1，8-萘二甲酸酐和正丁胺通过亲和加成-消除反应得到中间体4-溴-1，8-萘酰亚胺；然后以4-溴-1，8-萘酰亚胺原料，硫酸铜为催化剂，甲醇钠为碱，于有机溶剂中进行反应，得到中间体4-甲氧基-1，8-萘酰亚胺；再将中间体4-甲氧基-1，8-萘酰亚胺加入到HI水溶液中，水解得到中间体4-羟基-1，8-萘酰亚胺；最后将中间体4-羟基-1，8-萘酰亚胺通过甲酰化反应得到目标原料A：4-羟基-1，8-萘酰亚胺-3-醛；
以目标原料A：4-羟基-1，8-萘酰亚胺-3-醛和化合物B：异喹啉酰肼通过缩合反应得到荧光探针I：NIQ；
其反应路线如下所示：
Figure FDA0003251001890000012
或者目标原料A：4-羟基-1，8-萘酰亚胺-3-醛和化合物C:2-苯甲酰胺-苯甲酰肼通过缩合反应得到荧光探针II：NBP，其反应路线如下所示：
其反应路线如下所示：
Figure FDA0003251001890000021
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述4-溴-1，8-萘二甲酸酐加入并溶解到有机溶剂中，然后加入正丁胺，回流搅拌，待反应完全后，除去有机溶剂，然后通过柱层析得到中间体4-溴-1，8-萘酰亚胺。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述中间体4-溴-1，8-萘酰亚胺溶于有机溶剂中，然后加入甲醇钠和五水硫酸铜，加热回流搅拌，待反应完全后将反应液冷却至室温后，减压蒸馏除去有机溶剂，萃取，分液，干燥，除去溶剂后，通过柱层析得到中间体4-甲氧基-1，8-萘酰亚胺。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述中间体4-甲氧基-1，8-萘酰亚胺溶于HI水溶液后，高温回流搅拌，待反应完全后，将反应物冷却至室温，然后将反应液缓慢倒入冰水中，有固体析出，抽滤，洗涤，得到中间体4-羟基-1，8-萘酰亚胺。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在搅拌的三氟乙酸溶液中，加入中间体4-羟基-1，8-萘酰亚胺和乌洛托品，然后将混合反应体系升温回流过夜，反应完成后，将反应物料冷却至室温，加入三氯甲烷和HCl混合溶液搅拌，萃取，洗涤，分液，干燥，将粗产物通过柱层析纯化，得到目标原料A；4-羟基-1，8-萘酰亚胺-3-醛。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述化合物B异喹啉酰肼的制备过程为：异喹啉酸溶解于甲醇溶剂中，加入浓硫酸作为催化剂，将混合物料加热回流搅拌，反应完成后，将反应物料冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，将粗产物通过用二氯甲烷进行萃取，分液，无水硫酸镁干燥，减压蒸馏除去溶剂，得到粗产物异喹啉酸甲酯；然后，将异喹啉酸甲酯和水合肼解于有机溶剂中，加热回流搅拌，反应完成后，将反应物料冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，通过柱层析得到异喹啉酰肼。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述化合物C 2-苯甲酰胺-苯甲酰肼的制备为：将2-氨基苯甲酸甲酯溶解于碱性溶液中，加热回流待反应体系冷却至室温后进行萃取，分液，干燥，除去溶剂，得到产物中间体邻氨基苯甲酸，将邻氨基苯甲酸，苯甲酰氯以及三乙胺加入有机溶剂中搅拌，随后加入乙酸酐继续搅拌，反应完成后，向反应体系中加入水合肼，继续搅拌回流，除去有机溶剂，进行萃取，分液，干燥，除去溶剂通过柱层析纯化得到目标原料2-苯甲酰胺苯甲酰肼。
9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述4-羟基-1，8-萘酰亚胺-3-醛和异喹啉酰肼或者2-苯甲酰胺苯甲酰肼溶解于有机溶剂中，将混合物料回流搅拌，反应完成后，将反应物料冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，将粗产物通过重结晶纯化，得到荧光探针NIQ或者NBP。
10.一种权利要求1所述的基于双官能化有机小分子为母体的铝离子检测荧光探针在检测溶液以及活体细胞中铝离子中的应用。
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