CN105693590A - 一种pH控制识别肿瘤细胞的光热试剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于光热试剂技术领域，具体涉及一种光热试剂及其合成，以及作为在近红外808 nm激光激发下的光热治疗试剂的应用。本发明所设计的化合物具有pH敏感的性质，可以通过对细胞微环境的响应，实现对肿瘤细胞的识别。在肿瘤细胞中，化合物在弱酸性环境中可以作为光热试剂在近红外光诱导下实现光热疗法。而在正常的细胞中，由于正常细胞是弱碱性，在近红外光的诱导下几乎没有光热反应。

Description

一种pH控制识别肿瘤细胞的光热试剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于光热试剂技术领域，具体涉及一种光热试剂及其合成，以及作为在近红外808nm激光激发下的光热治疗试剂的应用。
背景技术
光热治疗是利用具有较高光热转换效率的材料，将其注入人体内，利用靶向识别技术使其聚集在肿瘤部位，并在外部近红外光的照射下将光能转化为热能，通过局部产生的高温来杀死肿瘤细胞的一种治疗手段。光热治疗的优点有:(1)减少患者所经受的疼痛；(2)治疗时间短，大约只要几分钟，治疗效果明显；(3)材料无毒无害，对人体毒副作用小。
目前，已报道的光热试剂大概可以分为四类：(1)贵金属纳米颗粒，如：纳米金、纳米银和纳米铂，它们具有较高的光热转换效率和稳定性，但是该光热材料的成本造价比较高。(2)碳类材料光热试剂，如：石墨烯和碳纳米棒，它们具有较高的光热转换面积，不过该类材料在近红外处的吸收系数比较小。(3)金属与非金属化合物，如：硫化铜、硫化锌等纳米粒子，该类光热试剂合成成本较低，而且具有比较高的光热转换效率。(4)有机染料物质，如：吲哚菁绿、普鲁士蓝、聚苯胺等，其优点是结构多变，目前发现的确定是光热转换效率较低和光稳定性不好。光热治疗是一种新兴的治疗肿瘤的新方法，具有很大的发展潜力。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的光热试剂，该光热试剂在pH控制下特异性识别肿瘤细胞。
本发明的另一目的是提供了该光热试剂的合成方法。
本发明的另一目的是提供该光热试剂的应用，在普通细胞和肿瘤细胞pH值的不同可以识别肿瘤细胞并在近红外激光下实现光热治疗。
本发明所涉及的光热试剂记为PTT-pH，其结构式如下：
。
其中R1为羟基、氯原子或甲氧基，R2为羧酸类(n=1-8)、磺酸类(n=1-8)、烷基类(n=1-8)，R3和R4为苯环、萘环或其他芳香环。
pH控制识别肿瘤细胞的光热试剂的合成如下：
。
(1)制备2-氯-3-羟甲基-环己-1-烯甲醛：
A、配制体积比为1-1:1.5的冰的N,N-二甲基甲酰胺和二氯甲烷的混合溶液；
B、氮气保护下，慢慢滴加体积约1-1:1.5的三氯氧磷溶液，反应30-60分钟；
C、加入环己酮1-1:1.5当量，剧烈搅拌冰升温至80-100oC反应;
D、待反应完成后，倒入大量冰水中，静置一夜，有大量黄色固体产生，过滤洗涤得到产物。
(2)制备化合物2
A、量取1,2-二氯苯80-100mL；
B、加入摩尔比为1-1:1.5的化合物1和化合物R2-Br，混合液搅拌加热至80-100oC，反应20-30小时；
C、反应完成后，过滤得到固体，用乙醚洗涤，烘干得到固体备用；
(3)制备化合物3
A、将一定量的2-氯-3-羟甲基-环己-1-烯甲醛溶解于适量的乙酸酐中；
B、加入摩尔比1-1:1.5当量的化合物2和化合物1；
C、加热至70-80oC，反应24-48小时；
D、用二氯甲烷，多次萃取水相，合并有机相，有机相用无水硫酸镁干燥。
E、过滤上述溶液，去滤液，真空除去溶剂，得粗产物，薄层层析得纯品。
(4)制备化合物4，即为PTT-pH
A、将一定量的化合物3溶解于适量的甲醇中；
B、加入摩尔比1-1:1.5当量的化合物R1-Na；
C、加热至70-80oC，反应24-48小时；
D、用二氯甲烷，多次萃取水相，合并有机相，有机相用无水硫酸镁干燥。
E、过滤上述溶液，去滤液，真空除去溶剂，得粗产物，薄层层析得纯品。
本发明涉及的光热试剂PTT-pH用于pH控制识别的肿瘤细胞的光热治疗研究。首先，考察了该化合物在紫外吸收光谱(图1)和近红外激光下光热试剂PTT-pH在不同pH值下的光热研究(图2)，发现该PTT-pH光热试剂的紫外吸收光谱对pH有响应，且在pH为5.6的酸性条件下具有光热效果。然后考察了光热试剂PTT-pH的细胞毒性(图3)，最后通过对正常细胞和肿瘤细胞的pH的识别进行光热治疗(图4)，发现化合物本身没有毒性并且在弱酸性环境中可以在近红外光诱导下实现光热治疗。
本发明的优点是：该化合物具有pH敏感性质，可以通过对细胞微环境的响应，实现对肿瘤细胞的识别。在肿瘤细胞中，化合物在弱酸性环境中可以在近红外光诱导下实现光热治疗。而在正常的细胞中，由于正常细胞是弱碱性，在近红外光诱导下几乎没有光热反应。
附图说明
图1为配置PTT-pH在乙醇和PBS缓冲液体积比为2:1的不同pH的溶液（pH=4.124.975.375.505.926.216.717.12）的紫外可见吸收光谱，发现该PTT-pH的吸收光谱随着pH值得减小在820nm处的吸收峰增强，这说明PTT-pH光热试剂对不同的pH值有响应。
图2为用光热成像系统测试了PTT-pH在pH为5.60和7.46下的光热效应，PTT-pH的浓度为10μM，照射激光为808nm，激光功率为1W/cm2。发现pTT-pH在pH为7.46的弱碱环境下光热效应比较弱，温度只升高了3oC，而在pH为5.60的弱酸性环境中光热效应较强，温度升高了17oC。
图3为用MTT法测试PTT-pH在宫颈癌细胞（HeLa，肿瘤细胞）和人牙龈表皮细胞（HGF-1，正常细胞）中12小时和24小时的细胞毒性。分别测试了PTT-pH浓度为0，2.5,5,10,12.5和25μM的细胞细胞毒性，发现PTT-pH在没有光照下与细胞共孵育，细胞的存活率在90%以上，这说明PTT-pH对这两种细胞基本没有毒性。
图4为PTT-pH在HeLa细胞和HGF-1的光照毒性。选用激光为808nm，激光功率密度为1W/cm2。实验分组为纯空白组（C），激光对照组（L），材料对照组（0），光照15分钟（15），光照30分钟（30），光照45分钟（45），光照60分钟（60），实验结果表明光照对正常细胞HGF-1几乎没有光热治疗效果，而在肿瘤细胞HeLa具有光热治疗效果而且随着光照时间的延长光热治疗效果越好。
具体实施方式
实施例1：
制备2-氯-3-羟甲基-环己-1-烯甲醛：配制体积比为1:1的冰的N,N-二甲基甲酰胺和二氯甲烷的混合溶液40mL，氮气保护下，慢慢滴加20mL的三氯氧磷溶液，反应30分钟，加入环己酮20mL，剧烈搅拌冰升温至80oC反应。待反应完成后，导入倒入大量冰水中，静置一夜，有大量黄色固体产生，过滤洗涤得到产物。1H-NMR(300MHz,CDCl3):1.57(m,2H),2.35(t,4H,J=6.3Hz),2.5(s,1H),10.10(s,1H).
实施例2：
制备1-(2-羧乙基)-2,3,3-三甲基-4,5-苯基吲哚：量取1,2-二氯苯80毫升，加入10mmol的2,3,3-三甲基-4,5-苯基吲哚和10mmol的3-溴丙酸，混合液搅拌加热至80oC，反应20-30小时，反应完成后，过滤得到固体，用乙醚洗涤，烘干得到固体备用；1HNMR(DMSO-d6,400MHz):δ8.36(d,1H,J=8.37),8.273(d,1H,J=8.28),8.206(dd,2H,J=8.20),7.765(t,1H,J=7.78),7.706(t,2H,J=7.72),4.761(t,2H,4.78),3.029(t,2H,3.05),2.97(s,3H),1.75(s,6H).
实施例3：
制备化合物PTT-pH：将10mmol的2-氯-3-羟甲基-环己-1-烯甲醛溶解于20mL的乙酸酐中，加入10mmol的1-(2-羧乙基)-2,3,3-三甲基-4,5-苯基吲哚和10mmol的2,3,3-三甲基-4,5-苯基吲哚，加热至70oC，反应24小时，用二氯甲烷，多次萃取水相，合并有机相，有机相用无水硫酸镁干燥。过滤上述溶液，去滤液，真空除去溶剂，得粗产物，薄层层析得纯品。1HNMR(DMSO-d6,400MHz):δ8.42(d,1H,J=8.37),8.26(m,3H),8.05(t,4H,J=8.20),7.72(d,1H,J=7.78),7.62(t,3H,J=7.72),7.50(t,3H,J=7.78),6.43(d,1H,J=7.05),6.29(d,1H,J=7.56),4.49(s,2H),2.74(s,6H),1.95(s,8H),1.78(t,6H,J=8.05),ESIm/z(C41H40ClN2O2 +):calc:627.2772;found:627.2773.
实施例4：
配置PTT-pH在乙醇和PBS缓冲液体积比为2:1的不同pH的溶液（pH=4.124.975.375.505.926.216.717.12），并测试紫外可见吸收光谱。
实施例5：
用光热成像系统测试PTT-pH在pH为5.60和7.46下的光热效应，PTT-pH的浓度为10μM，照射激光为808nm，激光功率为1W/cm2。
实施例6：
我们用MTT法测试PTT-pH在宫颈癌细胞（HeLa，肿瘤细胞）和人牙龈表皮细胞（HGF-1，正常细胞）中12小时和24小时的细胞毒性。分别测试了PTT-pH浓度为0，2.5,5,10,12.5和25μM的细胞细胞毒性。
实施例7：
我们在细胞层次测试了PTT-pH在HeLa细胞和HGF-1的光照毒性。选用PTT-pH的浓度为25μM，激光为808nm，激光功率密度为1W/cm2。我们对实验进行分组纯空白组（C），激光对照组（L），材料对照组（0），光照15分钟（15），光照30分钟（30），光照45分钟（45），光照60分钟（60），用MTT法测试细胞的毒性。
由实施例合成出的化合物PTT-pH具有pH敏感性质，在pH在4.12-7.46范围呈线性变化。pTT-pH在pH为7.46的弱碱环境下光热效应比较弱，温度只升高了3oC，而在pH为5.60的弱酸性环境中光热效应较强，温度升高了17oC。在肿瘤细胞中，化合物在弱酸性环境中可以在近红外光诱导下实现光热治疗。而在正常的细胞中，由于正常细胞是弱碱性，在近红外光诱导下几乎没有光热反应。
上述实施例为本发明的优选例，并不用来限制本发明，凡在本发明的原则之内，所做的任何修改、变化、变通或替换方案，均在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种pH控制识别肿瘤细胞的光热试剂，其特征在于结构式如下：
，
其中，R1为羟基、氯原子和甲氧基，R2为碳原子为1-8的羧酸类、碳原子为1-8的磺酸类或碳原子为1-8的烷基类基团，R3和R4为苯环、萘环或其他芳香环基团。
2.一种如权利要求1所述的pH控制识别肿瘤细胞的光热试剂的合成方法，其合成路线为：
，
具体步骤为：
(1)制备化合物2：
量取1,2-二氯苯80-100mL；加入摩尔比为1-1:1.5的化合物1和化合物R2-Br，混合液搅拌加热至80-100oC，反应20-30小时；反应完成后，过滤得到固体，用乙醚洗涤，烘干得到固体备用；
(2)制备化合物3：
将一定量的2-氯-3-羟甲基-环己-1-烯甲醛溶解于适量的乙酸酐中；加入摩尔比1-1:1.5当量的化合物2和化合物1；加热至70-80oC，反应24-48小时；用二氯甲烷，多次萃取水相，合并有机相，有机相用无水硫酸镁干燥；过滤上述溶液，去滤液，真空除去溶剂，得粗产物，薄层层析得纯品；
(3)制备化合物4，即为PTT-pH：
将一定量的化合物3溶解于适量的甲醇中；加入摩尔比1-1:1.5当量的化合物R1-Na；加热至70-80oC，反应24-48小时；用二氯甲烷，多次萃取水相，合并有机相，有机相用无水硫酸镁干燥；过滤上述溶液，去滤液，真空除去溶剂，得粗产物，薄层层析得纯品。
3.一种如权利要求1或2所述的pH控制识别肿瘤细胞的光热试剂的应用，具体为PTT-pH光热试剂通过pH的不同识别正常细胞与肿瘤细胞，从而对肿瘤细胞具有近红外激光诱导下的光热治疗作用。
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