CN104744453A - 用于检测线粒体极性的半菁类化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一类用于检测线粒体极性的半菁类化合物，具有通式Ⅰ的结构。其中，R1和R2各自独立地选自H，C1-18烷基、SO3R5和COOR5；R3和R4各自独立地选自H，C1-18烷基、SO3R5和COOR5；R5选自H和C1-18烷基；Y-为Cl-、Br-、I-或OTs-。所述化合物具有通式Ⅰ的结构。该探针对环境极性特别敏感，可以作为溶液极性的检测。该类探针可以定位于线粒体，能够通过荧光比例成像来检测处于不同状态细胞，正常细胞及癌变细胞内的线粒体极性。

Description

用于检测线粒体极性的半菁类化合物
技术领域
本发明涉及一类适用于精细化工领域中细胞内线粒体极性检测的荧光探针化合物。该类化合物可以通过荧光比例成像方法检测细胞内线粒体极性。
背景技术
极性是化学反应过程中的一个重要的参数。一些有机或无机反应速度明显依赖于反应周围环境的极性。在生物系统中，特别是在细胞水平上，极性的变化影响蛋白质，酶等的相互作用，并且在一定程度上反映出细胞膜的通透性。此外，它的异常变化与一些疾病密切相关，例如糖尿病、肝硬化等。
线粒体是细胞内的能量制造工厂，它对癌症，老年痴呆症，帕金森综合症等疾病都有着敏感的响应。线粒体极性变化会强烈的影响蛋白质和生物大分子的运输和交互作用。另一方面，线粒体极性在一定程度上反映了该种亚细胞器的位置、形态和组件的变化等。例如线粒体苹果酸脱氢酶的活性和稳定性会受到周围环境极性的强烈影响。
荧光探针由于其高灵敏度，好的选择性和非破坏性等特征近年来受到了广泛的关注。因此，对极性敏感的荧光探针被认为是一种理想的用于检测亚细胞器极性值的工具。几个研究小组已经开发出一些基于分子内电荷转移体系(ICT)对蛋白质周围环境，蛋白疏水空腔或研究生物大分子的疏水空腔的荧光探针。到目前为止，只有Nagano和Bizzarri课题组报道了两例具有细胞膜通透性的极性探针。然而，能够检测特定亚细胞器极性的荧光探针还未见报道，到目前为止，能够用于检测线粒体极性的荧光探针仍然是一个“空白区域”，没有文献报道。
因此研究和开发出能够用于检测线粒体极性的荧光探针具有重要意义。
发明内容
本发明的目的之一，在于提供一种用于检测线粒体极性的半菁类化合物，所述化合物具有通式Ⅰ的结构：
其中，
R1和R2各自独立地选自H，C1-18烷基、SO3R5和COOR5；
R3和R4各自独立地选自H，C1-18烷基、SO3R5和COOR5
R5选自H和C1-18烷基；
Y-为Cl-、Br-、I-或OTs-。
本发明另一目的，在于提供上述通式I的化合物的制备方法，采用以下合成路线：
所述合成方法包括如下步骤：
(1)式ii的化合物与式i的化合物在氮气保护下反应2-5h，冷却至室温；待固体完全沉降后，真空抽滤，所得固体用乙醚进行洗涤，最后将固体真空干燥，即得到白色中间体1a；
该步骤优选在惰性气体保护下进行反应，这样可以使产率更高；
该反应式ii的化合物与式i的化合物的投料摩尔比比为1:1.2～5；
(2)将式iii的化合物，丙二酸二乙酯和哌啶在乙醇溶液内搅拌回流6个小时；通过减压蒸馏出去乙醇后，紧接着将冰醋酸和浓盐酸加到圆底烧瓶内，接着搅拌8小时。反应完毕后，待溶液冷却至室温，加入适量冰水，然后利用氢氧化钠将溶液pH值调至～5，立即有大量的苍白的沉淀生成，紧接着真空抽滤，水洗，干燥后得到粗产品2a。
在冰水浴条件下，将三氯氧磷慢慢滴加到N,N-二甲基甲酰胺溶液内，滴加完毕后，持续0℃继续反应3h后，撤去冰浴，加入产品2a(溶解于DMF)，60℃搅拌12小时；反应完毕后，将溶液倒入冰水中，然后利用氢氧化钠将溶液pH值调至5～7，静置后有大量沉 淀生成，紧接着真空抽滤，水洗，干燥后得到粗产品2b；
(3)将中间体1a溶解于乙醇中，加入中间体2b，加热回流即有紫红色化合物生成；在反应结束后，蒸去溶剂，提纯产物，得通式I的化合物。
本发明所述的用于检测线粒体极性的半菁类化合物对环境极性特别敏感，可以作为溶液极性的检测。该类探针可以定位于线粒体，能够通过荧光比例成像来检测处于不同状态细胞，正常细胞及癌变细胞内的线粒体极性。
基于此，本发明的再一目的在于提供上述本发明的化合物在制备线粒体极性检测试剂中的应用。
附图说明
本发明附图10幅，分别是：
图1是染料BOB在乙醇内的吸收和发射光谱。横坐标为波长(nm)，纵坐标为归一化强度。染料BOB的浓度为5.0μM，激发波长为405nm。
图2是本发明的荧光探针化合物BOB在不同溶剂内的荧光发射谱图(图2a)和荧光强度I467/I645的比率与溶液极性值的线性谱图(图2b)。该荧光探针化合物BOB的浓度为2.0μM，激发波长为405nm。
图3是对本发明的荧光探针化合物BOB在不同水-1，4-二氧六环混合溶液里面的荧光发射谱图(图3a)和荧光强度I467/I645的比率与溶液极性值的线性谱图(图3b)。该荧光探针化合物BOB的浓度为5.0μM，激发波长为405nm。
图4是对本发明的荧光探针化合物BOB及商品化线粒体荧光染料Mitotracker Deep Red FM分别在DMSO/H2O(V/V:1/1)混合溶液里面的光稳定性实验结果。
图5是本发明的探针化合物BOB在人乳腺癌细胞MCF-7细胞内的荧光成像。图5a为接收435-535nm区间的绿色荧光，图5b接收575-675nm区间的红色荧光，图5c为白光图，图5d为细胞内提取的染料BOB短波长处荧光谱图，图5e为细胞内提取的染料BOB长波长处荧光谱图，图5f为染料BOB在水里面的荧光谱图。荧光探针化合物BOB的浓度是2.0μM，激发波长是405nm。
图6是本发明的探针化合物BOB与商品化染料Mito Tracker Green FM在人乳腺癌细胞MCF-7细胞内的复染实验。图6a是Mito-Tracker Green FM在MCF-7中的活细胞染色图片；图6b是染料BOB在MCF-7中的活细胞染色照片；图6c是a和b的叠加照片；图6d是白光图；图6e是a和b的荧光强度提取图；图6f是a和b的叠加程度图。荧光探针化合物BOB 的浓度是2.0μM，Mito Tracker Green FM的浓度是2.0μM。
图7是本发明的探针化合物BOB和商品化染料Mito Tracker Green FM，Mito Tracker Red FM的线粒体膜电位干扰测试。
图7a,b,c,d分别为未加CCCP孵育前，探针化合物BOB的绿光通道,BOB的红光通道，Mito Tracker Green FM和Mito Tracker Red FM的荧光成像图，图7a1,b1,c1,d1分别为使用CCCP孵育后，探针化合物BOB的绿光通道,BOB的红光通道，Mito Tracker Green FM和Mito Tracker Red FM染色后的荧光成像图。
图8是本发明的探针化合物BOB的MTT细胞毒性测试。
图9是本发明的探针化合物BOB通过比率荧光成像方法检测处于不同状态的小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7细胞内线粒体极性值。图9内的1区域为处于正常状态的小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7细胞，2区域为濒临死亡状态的小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7细胞。荧光探针化合物BOB的浓度是2.0μM，激发波长是405nm。
图10是本发明的探针化合物BOB通过比率荧光成像方法检测不同种类细胞内线粒体极性值。
图10a，10b均为正常细胞，分别是非洲绿猴肾细胞cos–7细胞和小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞；图10c，10d，10e是三种癌细胞，分别为子宫颈癌细胞HeLa细胞，人肝癌HepG2细胞和人乳腺癌细胞MCF-7细胞。
图10a1,b1,c1,d1,e1分别是非洲绿猴肾细胞cos–7细胞，小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7细胞，子宫颈癌细胞HeLa细胞，人肝癌HepG2细胞和人乳腺癌细胞MCF-7细胞的红色通道荧光成像。
图10a2,b2,c2,d2,e2分别是非洲绿猴肾细胞cos–7细胞，小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7细胞，子宫颈癌细胞HeLa细胞，人肝癌HepG2细胞和人乳腺癌细胞MCF-7细胞的白光图。
图10a3,b3,c3,d3,e3分别是非洲绿猴肾细胞cos–7细胞，小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7细胞，子宫颈癌细胞HeLa细胞，人肝癌HepG2细胞和人乳腺癌细胞MCF-7细胞所对应的荧光比率图。
荧光探针化合物BOB的浓度是2.0μM，激发波长是405nm。
具体实施方式
本发明所述的用于检测线粒体极性的半菁类化合物，具有通式Ⅰ的结构：
具体实施方式之一，所述的R1选自H，C1-18烷基、SO3R5和COOR5；优选H和C1-18烷基，更优选H和C1-4烷基，最优选H和甲基；
具体实施方式之一，所述的R2选自H、C1-18烷基、SO3R5和COOR5；优选H和C1-18烷基，更优选H和C1-4烷基，最优选H；
具体实施方式之一，所述的R3选自H，C1-18烷基、SO3R5和COOR5；优选H和C1-18烷基，更优选H和C1-4烷基，最优选C1-4烷基，尤其是甲基或乙基；
具体实施方式之一，所述的R4选自H，C1-18烷基、SO3R5和COOR5；优选H和C1-18烷基，更优选H和C1-4烷基，最优选C1-4烷基，尤其是甲基或乙基；
再一具体的实施方式中，所述的R5选自H和C1-18烷基；优选H和C1-4烷基；
所述的Y-选自Cl-、Br-、I-或OTs-；优选Br-。
更为具体的实施方式中，本发明所述的用于检测线粒体极性的半菁类化合物是BOB或BOB-1：
本发明进一步提供上述通式I的化合物的合成方法，所述的合成方法中使用的各种原料均可市售获得，或者可通过本领域技术人员公知的方法或现有技术中公开的方法由本领域公知的原料简单地制备得到。
所得荧光染料可通过本领域公知的分离和纯化技术回收，以达到需要的纯度。
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1.荧光探针化合物BOB的合成：
是本发明的代表化合物BOB的合成方法，其合成路线如下：
所述合成方法包括如下步骤
(1)将0.85g苄基溴与0.90g 2-甲基苯并噻唑在氮气保护下,65℃反应3h，冷却至室温。待固体完全沉降后，真空抽滤，所得固体用乙醚进行洗涤，最后将固体真空干燥，即得到白色中间体1a；
该步骤中，2-甲基苯并噻唑与苄基溴反应时不需要溶剂；
该步骤在惰性气体保护下进行反应；
(2)将0.97g 4-二乙基氨基水杨醛，1.6g丙二酸二乙酯和1.0mL哌啶在30mL乙醇溶液内搅拌回流6个小时(80℃)。通过减压蒸馏出去乙醇后，紧接着将20mL冰醋酸和20mL浓盐酸加到圆底烧瓶内，接着搅拌8小时(75℃)。反应完毕后，待溶液冷却至室温，加入50mL冰水，然后利用1.0mol/L的氢氧化钠将溶液pH值调至～5，立即有大量的苍白的沉淀生成，紧接着真空抽滤，水洗，干燥后得到0.77g的粗产品2a，产率为87％。
在冰水浴条件下，将三氯氧磷慢慢滴加到N,N-二甲基甲酰胺溶液内，滴加完毕后，持续0℃继续反应3h后，撤去冰浴，加入0.5g产品2a(溶解于10mL DMF)，60℃搅拌12小时。反应完毕后，将溶液倒入冰水中，然后利用1.0mol/L的氢氧化钠将溶液pH值调至5～7，静置后有大量沉淀生成，紧接着真空抽滤，水洗，干燥后得到0.37g的粗产品2b，产率为65％。
(3)将0.64g中间体1a溶解于乙醇中，加入0.23g中间体2b，加热回流即有紫红色染料BOB生成。在反应结束后，蒸去溶剂。优选用二氯甲烷/甲醇作为洗脱液进行色谱柱分离提纯产物。产物通过核磁和高分辨质谱进行表征。R1为H，R2为H：
1H NMR(400MHz,MeOD):8.29(s,2H),8.24(d,J＝7.3Hz,1H),8.16(d,J＝8.3Hz,1H),8.08(d,J＝15.0Hz,1H),7.82(t,J＝8.0Hz,1H),7.75(t,J＝7.2Hz,1H),7.53(s,1H),7.38(d,J＝10.8Hz,5H),6.88(dd,J＝9.1,2.4Hz,1H),6.62(d,J＝2.3Hz,1H),6.03(s,2H),3.58(q,J＝7.1Hz,4H),1.26(dd,J＝12.5,5.5Hz,10H).
13C NMR(101MHz,MeOD):δ195.60,137.40,123.98,122.67,121.29,116.29,93.76,82.22,80.91,28.35,26.27,19.50. 
HRMS-ESI:m/z calcd M+for C29H27N2O2S+,467.1793；found,467.1791
实施例2.荧光探针化合物BOB-1的合成：
将0.67g中间体1a溶解于乙醇中，加入0.23g中间体2b，加热回流即有紫红色染料BOB-1生成。在反应结束后，蒸去溶剂。优选用二氯甲烷/甲醇作为洗脱液进行色谱柱分离提纯产物。产物通过核磁和高分辨质谱进行表征。R1为H，R2为对位-CH3：1H NMR(400MHz,MeOD):8.29(s,2H),8.24(d,J＝7.3Hz,1H),8.16(d,J＝8.3Hz,1H),8.08(d,J＝15.0Hz,1H),7.75(t,J＝7.2Hz,1H),7.53(s,1H),7.38(d,J＝10.8Hz,5H),6.88(dd,J＝9.1,2.4Hz,1H),6.62 (d,J＝2.3Hz,1H),6.03(s,2H),3.58(q,J＝7.1Hz,4H),2.34,(s,3H),1.26(dd,J＝12.5,5.5Hz,10H).
13C NMR(101MHz,MeOD):δ195.60,137.40,123.98,122.67,121.29,116.29,93.76,82.22,80.91,28.35,26.27,21.47,19.50. 
HRMS-ESI:m/z calcd M+for C30H29N2O2S+,481.1944；found,481.1940.
实施例3.染料BOB在乙醇中的吸收和发射光谱
分别将染料BOB溶解在乙醇中，配制终浓度为5.0μM的溶液。
检测结果如附图1所示，染料BOB在乙醇中的最大吸收在425/560nm，最大发射光谱在467/645nm。
所用仪器为紫外可见分光光度计，型号：Perkin Elmer Lambda 35UV/VIS；荧光分光光度计，型号：FL0812M018。
实施例4.染料BOB在不同溶剂内的吸收和发射光谱
使用上述合成的化合物BOB评价对不同溶液极性值的响应。将5.0μM的化合物BOB加到不同溶液中，405nm进行激发，测试结果显示于图2中。从图中可以看到，荧光探针化合物BOB对不同溶液的极性值有很好的线性响应。随着溶液极性的增加，467nm处的荧光强度均快速降低，而645nm处荧光强度变化不大。467nm与645nm处荧光强度的比值与溶液的极性值呈现很好的线性关系。
实施例5.荧光探针化合物BOB在水-1,4-二氧六环体系内，对不同极性值的响应：
使用上述合成的化合物BOB评价在水-1,4-二氧六环体系内，对不同极性值的的响应。将5.0μM的化合物BOB加到不同比例的水-1,4-二氧六环体系内，405nm进行激发，测试结果显示于图3中。从图中可以看到，荧光探针化合物BOB对不同溶液的极性值有很好的线性响应。随着溶液极性的增加，467nm处的荧光强度快速降低，而645nm处荧光强度变化不大。467nm与645nm处荧光强度的比值与溶液的极性值呈现很好的线性关系。
实施例6.荧光探针化合物BOB的光稳定性测试：
使用上述合成的化合物BOB评价其光稳定性。将5.0μM的化合物BOB加到DMSO/H2O(V/V:1/1)的混合溶液中，利用500w碘钨灯进行照射，测试结果显示于图4中。从图中可以看到，碘钨灯照射10个小时，染料仍保存89％的吸光度。
实施例7.荧光探针化合物BOB在细胞内成像：
MCF-7细胞在DEME(invitrogen)中用10％的FCS(invitrogen)培养。共聚焦荧光成 像实验前一天，细胞种在专用的细胞共聚焦培养皿中。第二天，向其中加入2.0μM的探针化合物BOB，保持在37℃及5％CO2条件下，孵育15分钟，然后用磷酸缓冲溶液冲洗3遍后，进行共聚焦成像。
细胞的培养密度为2×105cells/mL。成像所用仪器为Olympus FV1000-IX81倒置显微镜，100倍油镜。激发光为405nm激发，结果见图5。
实施例8.荧光显微镜下观察探针化合物BOB与Mito Tracker Green FM在细胞的复染：
Mito Tracker Green FM是一种商品化线粒体绿色荧光探针，可以用于细胞内线粒体特异性荧光染色。将探针化合物BOB与Mito Tracker Green FM分别对MCF-7细胞进行细胞染色，比较它们对细胞的染色位置，能够进一步确定BOB对线粒体的特异性荧光标记。
MCF-7细胞在DEME(invitrogen)中用10％的FCS(invitrogen)培养。共聚焦荧光成像实验前一天，细胞种在专用的细胞共聚焦培养皿中。第二天，向其中加入2.0μM的探针化合物BOB，保持在37℃及5％CO2条件下，孵育15分钟，然后用磷酸缓冲溶液冲洗3遍。再加入2μM的市售染料Mito Tracker Green FM，保持在37℃及5％CO2条件下，孵育15分钟，然后用磷酸缓冲溶液冲洗3遍后，进行共聚焦成像。
细胞的培养密度为2×105cells/mL。成像所用仪器为Olympus FV1000-IX81倒置显微镜，100倍油镜。BOB的激发光为515nm激发，收集575-675nm波段；Mito Tracker Green FM的激发波长为488nm，收集495-500nm波段。
从图6中可以看出，在MCF-7细胞中，探针化合物BOB和Mito Tracker Green FM的染色位置基本吻合，表明BOB很好地定位于线粒体这类亚细胞器中。
实施例9.探针化合物BOB的线粒体膜电位干扰测试
MCF-7细胞在DEME(invitrogen)中用10％的FCS(invitrogen)培养。共聚焦荧光成像实验前一天，细胞种在专用的细胞共聚焦培养皿中。第二天，向其中分别加入2.0μM的Mito Tracker Green FM，2.0μM的Mito Tracker Red FM和2.0μM的探针化合物BOB，保持在37℃及5％CO2条件下，孵育15分钟，然后用磷酸缓冲溶液冲洗3遍后，进行共聚焦成像；先向培养皿内加入10.0μM的CCCP，保持在37℃及5％CO2条件下，孵育30分钟，然后用磷酸缓冲溶液冲洗3遍后，加入DEME(invitrogen)培养基，再分别加入2.0μM的MitoTracker Green FM，2.0μM的Mito Tracker Red FM和2.0μM的探针化合物BOB，保持在37℃及5％CO2条件下，孵育15分钟，然后用磷酸缓冲溶液冲洗3遍后，进行共聚焦成像。
细胞的培养密度为2×105cells/mL。成像所用仪器为Olympus FV1000-IX81倒置显微镜， 100倍油镜。激发光分别为488nm、488nm和515nm激发，分别收集450-500nm、450-500nm和575-675nm波段，结果见图7。
图7c,d,a和b,分别为未加CCCP孵育前，Mito Tracker Green FM，Mito Tracker Red FM和探针化合物BOB的荧光成像图，图7c1,d1,a1和b1分别为使用CCCP孵育后，Mito Tracker Green FM，Mito Tracker Red FM和探针化合物BOB染色后的荧光成像图。商品化染料Mito Tracker Green FM不受线粒体膜电位干扰，因此其荧光强度没有明显的变弱；而Mito Tracker Red FM受线粒体膜电位干扰，因此其荧光强度有比较明显的变弱。从结果中可以看出，在CCCP孵育的前后，探针化合物BOB的染色强度没有明显的变弱，因此探针化合物BOB不受线粒体膜电位干扰。
实施例10.探针化合物BOB的细胞毒性测试
将要检测的cos-7细胞用0.25％胰蛋白酶消化，用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液配成单个细胞悬液，以每孔103～104个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200μL；将培养板移入孵育箱中，37℃，5％CO2及饱和湿度下培育24小时后，加入染料浓度为0,2.0,5.0,10.0μM，继续培养12小时；每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20μL，孵育4小时，终止培养，小心吸掉孔内培养上清液。然后，每孔加入150μL的DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分溶解；在酶标仪上测定各孔550nm处的吸光度，计算细胞存活率：试验组光吸光度/对照组吸光度值×100％。
从图8中可以看出，探针化合物BOB对cos-7细胞无明显细胞毒性，孵育2小时后，细胞存活率可以达到96％以上。
实施例11.探针化合物BOB通过荧光比率方法检测处于不同细胞状态的线粒体极性值：
RAW 264.7细胞在DEME(invitrogen)中用10％的FCS(invitrogen)培养。共聚焦荧光成像实验前一天，细胞种在专用的细胞共聚焦培养皿中。第二天，向其中加入2.0μM的探针化合物BOB，保持在37℃及5％CO2条件下，孵育15分钟，然后用磷酸缓冲溶液冲洗3遍，进行共聚焦成像。
细胞的培养密度为2×105cells/mL。成像所用仪器为Olympus FV1000-IX81倒置显微镜，100倍油镜。BOB的激发光为405nm激发，分别收集435-535nm和575-675nm波段，所得结果如图9所示。
从图9中可以看出，当细胞处于正常状态时，代表高线粒体极性的绿色区域处于主导地位，而当细胞趋向于凋亡时，代表低线粒体极性的紫红色区域越来越多，说明细胞在凋亡过 程中，线粒体极性不断降低。
实施例12.探针化合物BOB通过荧光比率方法检测正常/癌变细胞内线粒体极性
cos-7细胞，RAW 264.7细胞，HeLa细胞，HepG2细胞和MCF-7细胞在DEME(invitrogen)中用10％的FCS(invitrogen)培养。共聚焦荧光成像实验前一天，细胞种在专用的细胞共聚焦培养皿中。第二天，向其中加入2.0μM的探针化合物BOB，保持在37℃及5％CO2条件下，孵育15分钟，然后用磷酸缓冲溶液冲洗3遍，进行共聚焦成像。
细胞的培养密度为2×105cells/mL。成像所用仪器为Olympus FV1000-IX81倒置显微镜，100倍油镜。BOB的激发光为405nm激发，分别收集435-535nm和575-675nm波段，所得结果如图10所示。
图10a，10b均为正常细胞，分别是非洲绿猴肾细胞cos–7细胞和小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞；图10c，10d，10e是三种癌细胞，分别为子宫颈癌细胞HeLa细胞，人肝癌HepG2细胞和人乳腺癌细胞MCF-7细胞。荧光探针化合物BOB的浓度是2.0μM，激发波长是405nm，从图10可以看出，正常细胞中代表高线粒体极性的绿色区域处于主导地位，而在癌细胞中，代表低线粒体极性的紫红色区域较多。癌变细胞内的线粒体极性大致与乙二醇相似，小于正常细胞的线粒体极性(极性值与乙腈相似)。

Claims (8)

1.用于检测线粒体极性的半菁类化合物，具有通式Ⅰ的结构：
其中，
R1和R2各自独立地选自H，C1-18烷基、SO3R5和COOR5；
R3和R4各自独立地选自H，C1-18烷基、SO3R5和COOR5；
R5选自H和C1-18烷基；
Y-为Cl-、Br-、I-或OTs -。
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述的R1和R2各自独立地选自H和C1-18烷基。
3.根据权利要求2所述的化合物，其特征在于，所述的R1和R2各自独立地选自H和C1-4烷基。
4.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述的R3和R4各自独立地选自H和C1-18烷基。
5.根据权利要求4所述的化合物，其特征在于，所述的R3和R4各自独立地选自C1-4烷基。
6.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述的R5选自H和C1-4烷基。
7.根据权利要求1所述的化合物，是BOB或BOB-1：
8.权利要求1所述的用于检测线粒体极性的半菁类化合物在制备线粒体极性检测试剂中的应用。
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