CN105153733A - 一种具有大双光子荧光活性截面的膜通透性染料及其应用 - Google Patents

一种具有大双光子荧光活性截面的膜通透性染料及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有大双光子荧光活性截面的膜通透性染料，该染料是三苯胺杂环类化合物，其化学结构通式如式(I)所示。本发明还公开了所述染料在显示活细胞中细胞质双光子成像中的应用。实验证实本发明的染料具有比较大的双光子荧光活性吸收截面、优秀的细胞膜通透性和低毒性等特点，还具有适用范围广，价格低，能与已有的探针DAPI具有良好生物相容性的特点，在激光激发荧光生物标记领域具有广阔应用前景。

Description

一种具有大双光子荧光活性截面的膜通透性染料及其应用
技术领域
本发明涉及一种双光子染料及其应用，尤其涉及一种具有大双光子荧光活性截面的膜通透性染料及其应用。
背景技术
双光子显微镜的发展已经彻底改变了对器官和组织、特别是厚的或高散射的标本的观测。与单光子激光共聚焦显微镜相比，双光子显微镜具有诸如近红外光激发、避免荧光漂白和光致毒、高分辨率、减小组织吸光及降低组织自发荧光干扰等特点。但是，如果所用荧光探针的双光子吸收截面小(与生物样品的内源性发光物质相近)，那么双光子显微镜优势会被大打折扣。因为染料的单、双光子吸收服从不同的选律，所以优良的单光子染料不一定具有大的双光子吸收截面。目前用于激光共聚焦显微镜的单光子染料几乎都不具备大的双光子荧光活性吸收截面。因而，针对该技术的双子染料和探针的研究成为一个热门课题。
最近，许多课题组报道了大量的双光子染料和探针。虽然近期报道的双光子染料具有大的双光子荧光活性吸收截面，但是常用的双光子染料依旧是罗丹明(吸收截面只有200GM左右)。这是因为罗丹明具有良好的膜通透性。细胞膜通透性是一个优良生物荧光染料的重要参数。目前，生物荧光成像中所使用的染料很少同时具备大的双光子荧光活性吸收截面和良好的细胞膜通透性。这在很大程度上制约了利用双光子三维成像技术进行细胞生物成像与观测。因而开发、研制具有实际应用价值的双光子膜通透性荧光染料是当务之急。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种具有大双光子荧光活性截面的膜通透性染料及其应用。
本发明所述具有大双光子荧光活性截面的膜通透性染料，其特征在于：所述染料是三苯胺杂环类化合物，其化学结构通式如式(I)所示：
其中：上述式中R表示NH或S原子。
上述具有大双光子荧光活性截面的膜通透性染料通式(I)中所述R优选表示S原子。
上述具有大双光子荧光活性截面的膜通透性染料具体优选是4-[(E)-2-(1H-苯并噻唑-2-基)乙烯基]-N-{4-[(E)-2-(1H-苯并噻唑-2-基)乙烯基]苯基}-N-苯基苯胺。
本发明所述具有大双光子荧光活性截面的膜通透性染料(三苯胺杂环类化合物)的制备方法概述如下：
发明人首先通过wilsmeier反应在三苯胺上引入两个醛基，然后利用wittig反应再引入两个双键，最后利用与邻巯基苯胺、邻二苯胺、或邻羟基苯胺的扣环反应得到终产物——三苯胺杂环类化合物。
上述三苯胺杂环类化合物具体制备反应式如下：
本发明所述具有大双光子荧光活性截面的膜通透性染料在显示活细胞中细胞质双光子成像中的应用。
其中，所述活细胞优选为HeLa细胞或RBL-2H3细胞；在细胞质中无靶向性。
试验结果证实，本发明所述具有大双光子荧光活性截面的膜通透性染料(三苯胺杂环类化合物)能够很容易的通过细胞膜，在细胞质区域呈现出明显的荧光显微图像，这为应用双光子显微镜成像活细胞中细胞质的研究提供了有益的帮助，同时也为开发简捷、直观的荧光检测试剂提供了技术支持。
本发明的有益效果是：利用实验筛选，本发明确立了一类新型具有大双光子荧光活性截面的膜通透性染料，即三苯胺杂环类化合物。本发明所述三苯胺杂环类化合物具有价格低、激发能量低、显色强、生物相溶性较好的特点。进一步的试验证实，本发明的三苯胺杂环类化合物具有比较大的双光子荧光活性吸收截面、优秀的细胞膜通透性和低毒性等特点。并且本发明所述的染料和已有的探针DAPI具有良好生物相容性，在激光激发荧光生物标记领域具有潜在的应用价值。也预示本发明所述三苯胺杂环类化合物作为双光子荧光染料具有广阔应用前景。
附图说明
图1：4-[(E)-2-(1H-苯并噻唑-2-基)乙烯基]-N-{4-[(E)-2-(1H-苯并噻唑-2-基)乙烯基]苯基}-N-苯基苯胺对活性Hela和RBL-2H3细胞进行染色在单光子共聚焦荧光显微镜下得到的荧光显微照片。
其中a图为用4-[(E)-2-(1H-苯并噻唑-2-基)乙烯基]-N-{4-[(E)-2-(1H-苯并噻唑-2-基)乙烯基]苯基}-N-苯基苯胺染色得到的荧光显微照片；b图为明场照片；c图为左中两图的合并图即共定位图。
图2：4-[(E)-2-(1H-苯并噻唑-2-基)乙烯基]-N-{4-[(E)-2-(1H-苯并噻唑-2-基)乙烯基]苯基}-N-苯基苯胺对活性Hela和RBL-2H3细胞进行染色后在800纳米激光辐照下得到的双光子荧光显微照片。
其中a图为用4-[(E)-2-(1H-苯并噻唑-2-基)乙烯基]-N-{4-[(E)-2-(1H-苯并噻唑-2-基)乙烯基]苯基}-N-苯基苯胺染色得到的双光子荧光显微照片；b图为明场激光扫描的微分显微照片；c图为左中两图的合并图。
图3：4-[(E)-2-(1H-苯并噻唑-2-基)乙烯基]-N-{4-[(E)-2-(1H-苯并噻唑-2-基)乙烯基]苯基}-N-苯基苯胺和碘化丙啶对活Hela细胞进行染色后，分别在405和561纳米激光辐照下分为两个通道收集得到的单光子共聚焦荧光显微照片。
其中a为405纳米激发绿色通道的照片，b为561纳米激发红色通道的照片，c为明场照片，d图为a、b、c三者合并图片。
图4：4-[(E)-2-(1H-苯并噻唑-2-基)乙烯基]-N-{4-[(E)-2-(1H-苯并噻唑-2-基)乙烯基]苯基}-N-苯基苯胺、DAPI分别依次对活性Hela细胞进行染色后在，分别在405和561纳米激光辐照下分为两个通道收集得到的单光子共聚焦荧光显微照片。
其中a为绿色通道的照片，b为蓝色通道的照片，c图为前两者合并图片。
具体实施方式
实施例1：
4,4-2甲酰基三苯胺的合成
将20ml的DMF加入到单口烧瓶中。在冰水浴搅拌下，向上述溶液中缓慢滴加三氯氧磷20ml，室温搅拌1h，得到黄色浑浊液。称取三苯胺5g(20.4mmol)，用10ml三氯甲烷将其溶解，然后再逐渐加入上述搅拌的溶液中，加热回流反应10小时。将反应液倾入到1000mL水中，用CH2Cl2萃取。有机层用饱和氯化钠溶液洗涤，无水MgSO4干燥，过滤，蒸除溶剂。粗产品用柱色谱分离，石油醚/乙酸乙酯(10∶1)作淋洗液，得到浅黄色固体，即为4,4-2甲酰基三苯胺。产率：55％。
1HNMR(400MHz,d6-DMSO):δ(ppm)9.88(s,2H),7.85(d,J＝8.64Hz,4H),7.49(t,J＝7.84Hz,2H),7.33(t,J＝7.4Hz,1H),7.22(d,J＝8.4Hz,2H),7.17(d,J＝8.56Hz,4H).
(2E，2E)-3,3(苯基苯胺)2(1,4-亚苯基)丙烯醛的合成
将(2.41g,8mmol)4,4-2甲酰基三苯胺和(8.24g,19.2mmol)(1，3-二氧戊环-2甲基)-三苯基溴化膦加入到三口烧瓶，加入100ml三氯甲烷将其溶解。在室温和氮气保护下搅拌30分钟。然后再加入(12.68g,112mmol)叔丁醇钾。再继续反应24小时。将反应液倾入到1000mL水中并在其中搅拌6小时，用CH2Cl2萃取。有机层用饱和氯化钠溶液洗涤，无水MgSO4干燥，过滤，蒸除溶剂。粗产品用柱色谱分离，石油醚/乙酸乙酯(4∶1)作淋洗液，得到黄色固体，即为(2E，2E)-3,3(苯基苯胺)2(1,4-亚苯基)丙烯醛。产率：57％。
1HNMR(400MHz,d6-DMSO):δ(ppm)9.64(d,J＝7.8Hz,2H),7.7(t,J＝9.08Hz,6H),7.44(t,J＝7.78Hz,2H),7.26(t,J＝7.36Hz,1H),7.17(d,J＝7.75Hz,2H),7.06(d,J＝8.56Hz,4H),6.77(dd,J1＝J2＝7.8Hz,2H).
4-[(E)-2-(1H-苯并噻唑-2-基)乙烯基]-N-{4-[(E)-2-(1H-苯并噻唑-2-基)乙烯基]苯基}-N-苯基苯胺的合成
将(0.71g,2mmol)(2E，2E)-3,3(苯基苯胺)2(1,4-亚苯基)丙烯醛，(0.63g,5mmol)2-巯基苯胺和(0.136g,0.8mmol)对甲基苯磺酸加入到烧瓶中，用DMF作溶剂加热到120℃，搅拌16小时。将反应液倾入到1000mL水中并在其中搅拌6小时，用CH2Cl2萃取。有机层用饱和氯化钠溶液洗涤，无水MgSO4干燥，过滤，蒸除溶剂。粗产品用柱色谱分离，石油醚/乙酸乙酯(2∶1)作淋洗液，得到棕黄色固体，即为4-[(E)-2-(1H-苯并噻唑-2-基)乙烯基]-N-{4-[(E)-2-(1H-苯并噻唑-2-基)乙烯基]苯基}-N-苯基苯胺。产率：21％。
1HNMR(400MHz,d6-DMSO):δ(ppm):8.08(d,J＝7.84Hz,2H),7.96(d,J＝8Hz,2H),7.73(d,J＝8.48Hz,4H),7.63(d,J＝8.08Hz,2H),7.51(t,J＝8.04Hz,4H),7.43(dd,J1＝7.28Hz,J2＝7.56Hz,4H),7.21(t,J＝7.48Hz,1H),7.16(d,J＝7.72Hz,2H).7.05(d,J＝8.48Hz,4H).
实施例2
4-[(E)-2-(1H-苯并咪唑-2-基)乙烯基]-N-{4-[(E)-2-(1H-苯并咪唑-2-基)乙烯基]苯基}-N-苯基苯胺的合成
合成工艺同实施例1，合成获得4-[(E)-2-(1H-苯并咪唑-2-基)乙烯基]-N-{4-[(E)-2-(1H-苯并咪唑-2-基)乙烯基]苯基}-N-苯基苯胺，产率：17％。
1HNMR(400MHz,d6-DMSO):δ(ppm):12.55(s,2H),7.65(m,J＝7.67Hz,6H),7.55(d,J＝7.64Hz,4H),7.41(t,J＝7.84Hz,2H),7.16(t,J＝7.76Hz,5H),7.11(d,J＝7.68Hz,4H),7.07(d,J＝8.24Hz,4H).
实施例3
RBL-2H3和Hela细胞培养
RBL-2H3或HeLa细胞株贴壁培养于内含10％胎牛血清培养液中，在37℃，5％CO2的饱和湿度孵箱中培养，每2～3d换液传代1次。待细胞生长到对数期，接片培养：①将盖玻片于无水乙醇中浸泡30min，酒精灯烘干后放入一次性35mm培养皿中；②将100ml细胞瓶中的细胞用PBS洗三遍，用1ml0.25％胰酶消化3-5分钟，小心地倒出培养基，加入少量新鲜培养基吹打均匀，细胞计数后，留下合适密度的细胞，将培养基加至所需体积(控制细胞终浓度为1x105)，接种至内含盖玻片的培养皿中，放入CO2培养箱中培养，使细胞爬片生长。
实施例4
4-[(E)-2-(1H-苯并噻唑-2-基)乙烯基]-N-{4-[(E)-2-(1H-苯并噻唑-2-基)乙烯基]苯基}-N-苯基苯胺染色RBL-2H3和Hela细胞
将4-[(E)-2-(1H-苯并噻唑-2-基)乙烯基]-N-{4-[(E)-2-(1H-苯并噻唑-2-基)乙烯基]苯基}-N-苯基苯胺稀释至浓度为的5μM的染料溶液，在CO2培养箱中对细胞染色30min。染色后的玻片取出，洗去未结合的多余染液，细胞生长面朝下盖在载玻片上，在单光子共聚焦显微镜和双光子荧光显微镜下观察细胞着色部位，荧光分布及亮度变化等，结果见图1-图2。
图1：4-[(E)-2-(1H-苯并噻唑-2-基)乙烯基]-N-{4-[(E)-2-(1H-苯并噻唑-2-基)乙烯基]苯基}-N-苯基苯胺对活性RBL-2H3和Hela细胞进行染色得到单光子共聚焦荧光显微照片。其中a图为用4-[(E)-2-(1H-苯并噻唑-2-基)乙烯基]-N-{4-[(E)-2-(1H-苯并噻唑-2-基)乙烯基]苯基}-N-苯基苯胺染色得到的荧光显微照片；b图为明场照片；c图为左中两图的合并图即共定位图。
图2：4-[(E)-2-(1H-苯并噻唑-2-基)乙烯基]-N-{4-[(E)-2-(1H-苯并噻唑-2-基)乙烯基]苯基}-N-苯基苯胺对活性RBL-2H3和Hela细胞进行染色在800纳米激光辐照下得到的双光子荧光显微照片。其中a图为用4-[(E)-2-(1H-苯并噻唑-2-基)乙烯基]-N-{4-[(E)-2-(1H-苯并噻唑-2-基)乙烯基]苯基}-N-苯基苯胺染色得到的双光子荧光显微照片；b图为明场激光扫描的微分显微照片；c图为左中两图的合并图。
实施例5
4-[(E)-2-(1H-苯并噻唑-2-基)乙烯基]-N-{4-[(E)-2-(1H-苯并噻唑-2-基)乙烯基]苯基}-N-苯基苯胺和碘化丙啶共染实验
将接种好的HeLa细胞爬片，用PBS洗三遍，分别用血清稀释和DMSO:PBS(1:50)混合溶液稀释的5μM的染料溶液在CO2培养箱中染色细胞30min。PBS洗去未结合的多余染液，再用PBS稀释的5μM的碘化丙啶溶液在CO2培养箱中染色细胞30min。
将染色后的玻片取出，洗去未结合的多余染液，细胞生长面朝下盖在载玻片上，在单光子共聚焦显微镜下观察细胞着色部位，荧光分布及亮度变化等，结果见图3。
图3：4-[(E)-2-(1H-苯并噻唑-2-基)乙烯基]-N-{4-[(E)-2-(1H-苯并噻唑-2-基)乙烯基]苯基}-N-苯基苯胺和碘化丙啶对活Hela细胞进行染色后，分别在405和561纳米激光辐照下分为两个通道收集得到的单光子共聚焦荧光显微照片。其中a为405纳米激发绿色通道的照片，b为561纳米激发红色通道的照片，c为明场照片，d图为a、b、c三者合并图片。
实施例6
4-[(E)-2-(1H-苯并噻唑-2-基)乙烯基]-N-{4-[(E)-2-(1H-苯并噻唑-2-基)乙烯基]苯基}-N-苯基苯胺和DAPI共染实验
将接种好的HeLa细胞爬片，用PBS洗三遍，分别用血清稀释和DMSO:PBS(1:50)混合溶液稀释的5μM的探针溶液在CO2培养箱中染色细胞30min。PBS洗去未结合的多余染液，再用PBS稀释的5μM的DAPI溶液在CO2培养箱中染色细胞30min。
将染色后的玻片取出，洗去未结合的多余染液，细胞生长面朝下盖在载玻片上，在单光子共聚焦显微镜下观察细胞着色部位，荧光分布及亮度变化等，结果见图4。
图4：4-[(E)-2-(1H-苯并噻唑-2-基)乙烯基]-N-{4-[(E)-2-(1H-苯并噻唑-2-基)乙烯基]苯基}-N-苯基苯胺、DAPI分别依次对活性Hela细胞进行染色后，分别在405和561纳米激光辐照下分为两个通道收集得到的单光子共聚焦荧光显微照片。其中a为绿色通道的照片，b为蓝色通道的照片，c图为前两者合并图片。

Claims (5)

1.一种具有大双光子荧光活性截面的膜通透性染料，其特征在于：所述染料是三苯胺杂环类化合物，其化学结构通式如式(I)所示：
其中：上述式中R表示NH或S原子。
2.如权利要求1所述具有大双光子荧光活性截面的膜通透性染料，其特征在于：所述R表示S原子。
3.如权利要求1所述具有大双光子荧光活性截面的膜通透性染料，其特征在于：所述染料是4-[(E)-2-(1H-苯并噻唑-2-基)乙烯基]-N-{4-[(E)-2-(1H-苯并噻唑-2-基)乙烯基]苯基}-N-苯基苯胺。
4.权利要求1-3之一所述具有大双光子荧光活性截面的膜通透性染料在显示活细胞中细胞质双光子成像中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述活细胞为HeLa细胞或RBL-2H3细胞。
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