CN103709203B - 一类双核钌配合物及其制备方法和作为活细胞荧光染料的应用 - Google Patents
一类双核钌配合物及其制备方法和作为活细胞荧光染料的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一类双核钌（II）配合物及其制备方法和作为活细胞荧光染料的应用。本发明的双核钌（II）配合物的阳离子部分为[(phen)2Ru(L)Ru(phen)2]4+，结构式如I，阴离子部分为(ClO4)－或Cl－，其具有优良的荧光特性和良好细胞膜渗透能力，是良好的活细胞成像试剂，同时兼具有较大的双光子吸收界面，无需细胞预处理即可对活细胞中细胞质着色，抗漂白能力好，结构简单且稳定。细胞存活率实验结果表明配合物的细胞毒性比较低，对细胞损伤小，着色灵敏度高、细胞渗透能力强，在作为长时间，单、双光子细胞成像染料和生物探针方面将有极大的应用潜力。
Description
技术领域
本发明涉及细胞成像试剂技术领域，具体涉及一类双核钌配合物及其制备方法和作为单、双光子活细胞荧光染料的应用。
背景技术
近年来，活细胞成像成为科学家们关注的焦点，而随着激光共聚焦荧光显微镜技术的不断发展，人们对细胞的研究日益深入，适合的生物成像试剂的开发激起科学家们的极大兴趣。目前，应用于细胞成像领域的商用荧光染料大部分是一些有机小分子，如PI,DAPI，MitotrackerGreen等。然而，这些有机分子存在一些缺点：水溶性比较低，容易产生沉淀或者与细胞作用后即刻析出，影响染色效果；具有比较高的细胞毒性，染料与细胞作用后，导致细胞的死亡，影响对细胞正常状态的观测；光稳定性低，因受空气中或介质中活性剂基团（单线态氧等）的作用，染料在激发波长照射后，荧光不断减弱，光漂白现象严重，不利于成像稳定；激发和发射光谱的交叉严重（stokeshift小），一般在几十个纳米左右，不利于区分内源荧光和降低染料本身的自淬灭（G.P.Pfeifer,Y.H.YouandA.Besaratinia,Mutat.Res.,2005,571,19;W.R.Zipfel,R.M.WillamsandW.W.Webb,Nat.Biotechnol.,2003,21,1369.）。
使用双光子荧光探针则是解决以上问题的一个重要方法。由于这些分子发射波长在近红外或更长，且具有较低的毒性，较高的光稳定性，减弱了光漂白现象，越来越多的实验室将他们的眼光放在这类双光子染料上（U.K.TirlapurandK.Konig,Nature,2002,418,290.）。这些分子包括了有机染料、发光d6金属配合物（如Ir、Re的配合物）、d8铂金属配合物、d10锌（II）金属配合物和量子点等（H.M.Kim,B.R.Cho,Acc.Chem.Res.,2009,42,863;Q.Zhao,C.HuangandF.Li,Chem.Soc.Rev.,2011,40,2508;S.Botchway,M.Charnley,J.Haycock,A.Parker,D.Rochester,J.WeinsteinandJ.Williams,PNAS,2008,105,16071;Y.Hai,J.J.Chen,P.Zhao,H.Lv,Y.Yu,P.XuandJ.L.Zhang,Chem.Commun.,2011,47,2435;D.R.Larson,W.R.Zipfel,R.M.Williams,S.W.Clark,M.P.Bruchez,F.W.WiseandW.W.Webb,Science,2003,300,1434.）。然而，具有较大双光子吸收性、较高兼容性、光稳定性及膜穿透能力、低细胞毒性的双光子荧光探针仍报道很少。
钌（II）金属多吡啶配合物凭借其优良的光化学性质，如非线性光学性质明显、发光效率高、激发和发射光谱stoke位移大、光稳定性强、且发光寿命相对更长，用于细胞成像试剂方面具有其独特的优点。另外，这类配合物分子量较小，因此在活细胞染色过程中更容易穿透细胞膜（V.Fernández-Moreira,F.Thorp-GreenwoodandM.P.Coogan,Chem.Commun.,2010,46,186.）。目前，已有一部分钌（II）金属多吡啶配合物应用于活细胞成像的研究，但能成功作为双光子细胞成像染料的还较少（S.C.Boca,M.Four,A.Bonne,B.vanderSanden,S.Astilean,P.L.BaldeckandG.Lemercier,Chem.Commun.,2009,4590;H.Ke,H.Wang,W.-K.Wong,N.-K.Mak,D.W.J.Kwong,K.-L.WongandH.-L.Tam,Chem.Commun.,2010,46,6678;P.Zhang,L.Pei,Y.Chen,W.Xu,Q.Lin,J.Wang,J.Wu,Y.Shen,L.JiandH.Chao,Chem.Eur.J.,2013,19,15494.），因此钌（II）金属多吡啶配合物作为双光子荧光探针的巨大潜力仍待开发。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一类双核钌配合物，所述双核钌配合物具有较大的双光子吸收界面，无需细胞预处理即可对活细胞中细胞质着色，抗漂白能力好，在作为长时间双光子细胞成像染料和生物探针方面将有极大的应用潜力。
本发明的另一个目的是提供上述双核钌配合物的制备方法。
本发明还有一个目的是提供上述双核钌配合物作为活细胞荧光染料的应用。
本发明的上述目的通过如下技术方案予以实现：
一类双核钌配合物，由阳离子和阴离子组成，所述阳离子为[(phen)2Ru(L)Ru(phen)2]4+，简写为RuLx，结构式如I，
式I。
结构式I中，R为H、CH3、C（CH3）3、F、OCH3、N（CH3）2或、，分别对应RuL1~RuL7。
本发明所述双核钌配合物并不限定阴离子的种类，本领域常规阴离子均能实现本发明目的，尤其是无机盐阴离子，如(ClO4)－、氯离子、六氟磷酸根离子等，作为一种最优选方案，本发明所述双核钌配合物的阴离子为(ClO4)－或Cl－。
双核钌配合物的制备方法，制备步骤如下：
S1.将1,10-邻菲罗啉-5,6-二酮、乙酸铵、间苯乙醛、冰醋酸与相应苯胺类化合物在氩气保护下混合加热回流24小时，混合物冷却至室温后加入水，中和，抽滤，得到沉淀用水和乙醚洗涤、甲醇重结晶，得到相应中间产物（分别命名为L1~L7）；
S2.将步骤S1得到的中间产物与cis-[Ru(phen)2Cl2]·2H2O加入到乙二醇中，氩气保护下加热回流12小时，冷却至室温后滴加阴离子[如(ClO4)－或Cl－]无机盐的饱和溶液产生沉淀，抽滤，产物过柱用甲苯与乙腈体积比为1:3的混合液冲洗，真空干燥得终产物。
所述阴离子无机盐如NaClO4或NH4Cl等。
在反应过程中，步骤S2所述阴离子无机盐采用(ClO4)－或Cl－分别得到以(ClO4)－或Cl－为阴离子的配合物。
以RuL1为例，本发明RuL1的制备步骤如下：
（1）以1,10-邻菲罗啉-5,6-二酮、乙酸铵、间苯乙醛、苯胺、冰醋酸为原料，在氩气保护下混合加热回流24小时。混合物冷却至室温后加入水，用25%氨水中和，抽滤得到黄色沉淀，用水和乙醚洗涤，产物用甲醇重结晶，得到黄色粉末1,3-bis(1-phenyl-1H-imidazo[4,5-f][1,10]phenanthrolin-2-yl)benzene(即中间产物L1)；
（2）cis-[Ru(phen)2Cl2]·2H2O与中间产物L1加入到乙二醇中，氩气保护下加热回流12小时，得红色清液，冷却至室温后滴加NaClO4饱和溶液，产生棕红色沉淀。抽滤，产物过柱用甲苯与乙腈体积比为1:3的混合液冲洗，真空干燥，得终产物[(phen)2Ru(L1)Ru(phen)2](ClO4)4(即RuL1)。
双核钌配合物作为活细胞荧光染料的应用，包括双核钌配合物作为单、双光子活细胞荧光染料的应用。本发明的双核钌配合物具有较大的双光子吸收界面，无需细胞预处理即可对活细胞中细胞质着色，抗漂白能力好，在作为长时间双光子细胞成像染料和生物探针方面将有极大的应用潜力
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
（1）本发明的双核钌（II）配合物具有优良的荧光特性和良好细胞膜渗透能力，是良好的活细胞成像试剂。
（2）本发明的双核钌（II）配合物同时兼具有较大的双光子吸收界面，无需细胞预处理即可对活细胞中细胞质着色，抗漂白能力好。
（3）细胞存活率实验结果表明配合物的细胞毒性比较低，对细胞损伤小。
（4）本发明的双核钌（II）配合物结构简单且稳定，着色灵敏度高、细胞渗透能力强，在作为长时间，单、双光子细胞成像染料和生物探针方面将有极大的应用潜力。
附图说明
图1为配合物[(phen)2Ru(L)Ru(phen)2]4+的化学结构式；
图2为配体L1-7和配合物RuL1-7的合成途径；
图3为配合物RuL1-7在激发波长750-1000nm下的双光子吸收截面图；
图4为配合物RuL1-7细胞存活率实验图；
图5为HeLa细胞与配合物RuL1培育2h后与OPM、TPM共染后细胞成像图；
图6为HeLa细胞与配合物RuL2培育2h后与OPM、TPM共染后细胞成像图；
图7为HeLa细胞与配合物RuL3培育2h后与OPM、TPM共染后细胞成像图；
图8为HeLa细胞与配合物RuL4培育2h后与OPM、TPM共染后细胞成像图；
图9为HeLa细胞与配合物RuL5培育2h后与OPM、TPM共染后细胞成像图；
图10为HeLa细胞与配合物RuL6培育2h后与OPM、TPM共染后细胞成像图；
图11为HeLa细胞与配合物RuL7培育2h后与OPM、TPM共染后细胞成像图；
图12为配合物RuL1-7光漂白实验图；
其中，图5~11中（a）为OPM，（b）为TPM；（A）为明场视野通道，（B）为荧光视野通道，（C）为（A）、（B）的叠加通道；单、双光子的激发波长分别为458和800nm。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的解释说明，但具体实施例并不对本发明作任何限定。除非特别说明，实施例中所涉及的试剂、方法均为本领域常用的试剂和方法。
实施例1双核钌配合物RuL
1
的制备
（1）以1,10-邻菲罗啉-5,6-二酮、乙酸铵、间苯乙醛、苯胺、冰醋酸为原料，在氩气保护下混合加热回流24小时。混合物冷却至室温后加入水，用25%氨水中和，抽滤，得到黄色沉淀用水和乙醚洗涤，产物用甲醇重结晶，得到黄色粉末1,3-bis(1-phenyl-1H-imidazo[4,5-f][1,10]phenanthrolin-2-yl)benzene(即L1)。产率：85%。Anal.Calcdfor（元素分析）C44H26N8：C,79.26;H,3.93;N,16.81.Found:C,79.12;H,3.45;N,24.39%。1HNMR(500MHz,DMSO-d6)ppm：9.11(d,J=5.0Hz,2H),9.03(d,J=5.0Hz,2H),8.97(d,J=5.0Hz,2H),8.17(s,1H),7.93(m,2H),7.76(m,8H),7.66(m,2H),7.56(d,J=5.0Hz,2H),7.48(d,J=5.0Hz,2H),7.36(t,J1=J2=5.0Hz,2H),7.28(t,J1=J2=5.0Hz,1H).FAB-MS:m/z=667[M+1]。
（2）cis-[Ru(phen)2Cl2]·2H2O和L1加入到乙二醇中，氩气保护下加热回流12小时，得红色清液，冷却至室温后滴加NaClO4饱和溶液，产生棕红色沉淀。抽滤，产物过柱用甲苯与乙腈体积比为1:3的混合液冲洗，真空干燥，得[(phen)2Ru(L1)Ru(phen)2](ClO4)4(即RuL1)。产率：63%。Anal.CalcdforC92H58Cl4N16O16Ru2:C,55.60;H,2.94;N,11.28.Found:C,55.83;H,2.91;N,11.39%.1HNMR(500MHz,DMSO-d6)ppm:9.14(d,J=10.0Hz,2H),8.78(m,8H),8.39(d,J=10.0Hz,8H),8.11(m,7H),8.08(d,J=5.0Hz,2H),8.04(t,J=5.0Hz,2H),7.98(d,J=10.0Hz,2H),7.88(d,J=15.0Hz,2H),7.78(m,12H),7.75(m,6H),7.59(d,J=10.0Hz,2H),7.51(d,J=15.0Hz,2H),7.41(m,3H).ES-MS[CH3CN,m/z]:397([M-4ClO4]4+),563([M-3ClO4]3+)。
实施例2双核钌配合物RuL
2
的制备
制备步骤同实施例1中RuL1的制备，不同点在于将步骤（1）中的苯胺替代为对甲基苯胺，其余步骤及操作不变。
中间产物1,3-bis(1-p-tolyl-1H-imidazo[4,5-f][1,10]phenanthrolin-2-yl)benzene(即L2)产率：83%。Anal.CalcdforC46H30N8：C,79.52;H,4.35;N,16.13.Found:C,79.48;H,4.42;N,16.10%.1HNMR(500MHz,DMSO-d6)ppm：9.10(d,J=5.0Hz,2H),9.01(d,J=5.0Hz,2H),8.96(d,J=5.0Hz,2H),8.25(s,1H),7.91(m,2H),7.63(d,J=5.0Hz,4H),7.53(d,J=5.0Hz,4H),7.51(m,2H),7.47(d,J=5.0Hz,2H),7.40(d,J=5.0Hz,2H),7.30(t,J1=J2=5.0Hz,1H),2.52(s,6H).FAB-MS:m/z=695[M+1]。
终产物[(phen)2Ru(L2)Ru(phen)2](ClO4)4(即RuL2)产率：66%。Anal.CalcdforC94H62Cl4N16O16Ru2：C,56.01;H,3.10;N,11.12.Found:C,55.93;H,3.13;N,11.20%。1HNMR(500MHz,DMSO-d6)ppm：9.14(d,J=10.0Hz,2H),8.78(m,8H),8.39(d,J=10.0Hz,8H),8.24(s,1H),8.11(m,6H),8.08(d,J=5.0Hz,2H),8.04(t,J=5.0Hz,2H),7.98(d,J=10.0Hz,2H),7.88(d,J=15.0Hz,2H),7.76(m,8H),7.66(d,J=5.0Hz,2H),7.60(m,4H),7.53(m,6H),7.45(d,J=5.0Hz,2H),7.42(t,J1=J2=10.0Hz,1H),2.08(s,6H).ES-MS[CH3CN,m/z]:404.5([M-4ClO4]4+),573([M-3ClO4]3+)。
实施例3双核钌配合物RuL
3
的制备
制备步骤同实施例1中RuL1的制备，不同点在于将步骤（1）中的苯胺替代为4-叔丁基苯胺，其余步骤及操作不变。
中间产物1,3-bis(1-(4-tert-butylphenyl)-1H-imidazo[4,5-f][1,10]phenanthrolin-2-yl)benzene(即L3)产率：80%。Anal.CalcdforC52H42N8：C,80.18;H,5.43;N,14.39.Found:C,80.09;H,5.48;N,14.43%.1HNMR(500MHz,DMSO-d6)ppm:9.11(d,J=5.0Hz,2H),9.03(d,J=5.0Hz,2H),8.97(d,J=5.0Hz,2H),8.00(s,1H),7.91(m,2H),7.72(d,J=5.0Hz,4H),7.62(d,J=5.0Hz,2H),7.52(m,2H),7.46(d,J=5.0Hz,2H),7.39(d,J=5.0Hz,1H),7.33(t,J1=J2=5.0Hz,1H),7.29(d,J=5.0Hz,3H),1.25(s,18H).FAB-MS:m/z=779[M+1]。
终产物[(phen)2Ru(L3)Ru(phen)2](ClO4)4(即RuL3)产率：65%。Anal.CalcdforC100H74Cl4N16O16Ru2:C,57.20;H,3.55;N,10.67.Found:C,57.08;H,3.60;N,10.72%.1HNMR(500MHz,DMSO-d6)ppm:9.14(d,J=10.0Hz,2H),8.78(m,8H),8.39(d,J=10.0Hz,8H),8.11(m,6H),8.06(d,J=5.0Hz,4H),7.99(t,J=5.0Hz,3H),7.88(d,J=15.0Hz,2H),7.80(m,4H),7.76(m,6H),7.68(m,4H),7.63(d,J=10.0Hz,2H),7.56(d,J=5.0Hz,2H),7.50(d,J=5.0Hz,2H),7.47(d,J=5.0Hz,2H),7.38(t,J1=J2=10.0Hz,1H),1.25(s,18H).ES-MS[CH3CN,m/z]:425.5([M-4ClO4]4+),600.5([M-3ClO4]3+),950([M-2ClO4]2+)。
实施例4双核钌配合物RuL
4
的制备
制备步骤同实施例1中RuL1的制备，不同点在于将步骤（1）中的苯胺替代为4-氟基苯胺，其余步骤及操作不变。
中间产物1,3-bis(1-(4-fluorophenyl)-1H-imidazo[4,5-f][1,10]phenanthrolin-2-yl)benzene(即L4)产率：73%。Anal.CalcdforC44H24N8F2:C,75.20;H,3.44;N,15.95.Found:C,75.18;H,3.48;N,15.93%.1HNMR(500MHz,DMSO-d6)ppm:9.98(d,J=25.0Hz,2H),9.06(m,4H),8.13(s,1H),7.96(d,J=5.0Hz,2H),7.90(d,J=5.0Hz,2H),7.85(d,J=5.0Hz,2H),7.63(t,J1=J2=5.0Hz,1H),7.58(m,4H),7.45(d,J=5.0Hz,2H),7.11(m,4H).FAB-MS:m/z=703[M+1]。
终产物[(phen)2Ru(L4)Ru(phen)2](ClO4)4(即RuL4)产率：68%。Anal.CalcdforC92H56Cl4F2N16O16Ru2:C,54.61;H,2.79;N,11.08.Found:C,54.58;H,2.73;N,11.22%.1HNMR(500MHz,DMSO-d6)ppm:9.14(d,J=10.0Hz,2H),8.78(m,8H),8.40(d,J=10.0Hz,8H),8.10(m,6H),8.08(d,J=5.0Hz,2H),8.05(t,J=5.0Hz,3H),8.01(d,J=5.0Hz,2H),7.89(d,J=5.0Hz,2H),7.87(m,4H),7.80(m,4H),7.76(m,4H),7.63(m,6H),7.56(d,J=10.0Hz,2H),7.50(m,3H).ES-MS[CH3CN,m/z]:407([M-4ClO4]4+),576([M-3ClO4]3+)。
实施例5双核钌配合物RuL
5
的制备
制备步骤同实施例1中RuL1的制备，不同点在于将步骤（1）中的苯胺替代为4-甲氧基苯胺，其余步骤及操作不变。
中间产物1,3-bis(1-(4-methoxyphenyl)-1H-imidazo[4,5-f][1,10]phenanthrolin-2-yl)benzene(即L5)产率：75%。Anal.CalcdforC46H30N8O2:C,76.02;H,4.16;N,15.42.Found:C,76.06;H,4.12;N,15.38%.1HNMR(500MHz,DMSO-d6)ppm:9.10(d,J=5.0Hz,2H),9.01(d,J=5.0Hz,2H),8.96(d,J=5.0Hz,2H),8.25(s,1H),7.91(m,2H),7.68(d,J=10.0Hz,4H),7.53(m,4H),7.44(d,J=5.0Hz,2H),7.34(t,J1=J2=5.0Hz,1H),7.28(m,4H),3.92(s,6H).FAB-MS:m/z=727[M+1]。
终产物[(phen)2Ru(L5)Ru(phen)2](ClO4)4(即RuL5)产率：60%。Anal.CalcdforC94H62Cl4N16O18Ru2:C,55.14;H,3.05;N,10.95.Found:C,55.11;H,3.08;N,10.89%.1HNMR(500MHz,DMSO-d6)ppm:9.14(d,J=10.0Hz,2H),8.78(m,8H),8.40(d,J=10.0Hz,8H),8.24(s,1H),8.09(m,6H),8.08(d,J=5.0Hz,2H),8.05(t,J=10.0Hz,2H),7.99(d,J=10.0Hz,2H),7.88(d,J=15.0Hz,2H),7.77(m,8H),7.69(m,4H),7.62(d,J=10.0Hz,2H),7.55(d,J=5.0Hz,2H),7.50(d,J=10.0Hz,2H),7.45(t,J1=J2=10.0Hz,1H),7.28(m,4H),3.88(s,6H).ES-MS[CH3CN,m/z]:413([M-4ClO4]4+),583([M-3ClO4]3+)。
实施例6双核钌配合物RuL
6
的制备
制备步骤同实施例1中RuL1的制备，不同点在于将步骤（1）中的苯胺替代为N1,N1-二甲苯-1,4-联氨，其余步骤及操作不变。
中间产物4,4'-(2,2'-(1,3-phenylene)bis(1H-imidazo[4,5-f][1,10]phenanthroline-2,1-diyl))-bis(N,N-dimethylaniline)(L6)产率：72%。Anal.CalcdforC48H36N10:C,76.58;H,4.82;N,18.60.Found:C,76.66;H,4.78;N,18.56%.1HNMR(500MHz,DMSO-d6)ppm:9.10(d,J=5.0Hz,2H),9.01(d,J=5.0Hz,2H),8.96(d,J=5.0Hz,2H),8.38(s,1H),7.90(m,2H),7.56(m,8H),7.47(d,J=10.0Hz,2H),7.34(t,J1=J2=5.0Hz,1H),6.95(m,4H),3.06(s,12H).FAB-MS:m/z=753[M+1]。
终产物[(phen)2Ru(L6)Ru(phen)2](ClO4)4(即RuL6)产率：56%。Anal.CalcdforC96H68Cl4N18O16Ru2:C,55.60;H,3.31;N,12.16.Found:C,55.52;H,3.38;N,12.18%.1HNMR(500MHz,DMSO-d6)ppm:9.14(d,J=10.0Hz,2H),8.78(m,8H),8.40(d,J=15.0Hz,8H),8.09(m,10H),7.98(d,J=5.0Hz,2H),7.87(d,J=10.0Hz,2H),7.77(m,8H),7.62(d,J=10.0Hz,2H),7.57(d,J=5.0Hz,2H),7.52(m,2H),7.46(m,3H),7.24(s,1H),6.95(m,4H),3.03(s,12H).ES-MS[CH3CN,m/z]:419([M-4ClO4]4+),592([M-3ClO4]3+)。
实施例7双核钌配合物RuL
7
的制备
制备步骤同实施例1中RuL1的制备，不同点在于将步骤（1）中的苯胺替代为4-氧基苯胺，其余步骤及操作不变。
中间产物1,3-bis(1-(4-phenoxyphenyl)-1H-imidazo[4,5-f][1,10]phenanthrolin-2-yl)benzene(即L7)产率：70%。Anal.CalcdforC56H34N8O2:C,79.04;H,4.03;N,13.17.Found:C,79.01;H,4.11;N,13.12%.FAB-MS:m/z=851[M+1]。1HNMR(500MHz,DMSO-d6)ppm:9.10(d,J=5.0Hz,2H),9.06(d,J=5.0Hz,2H),9.01(d,J=5.0Hz,2H),7.99(s,1H),7.86(m,2H),7.75(d,J=5.0Hz,2H),7.69(t,J1=J2=5.0Hz,1H),7.62(m,4H),7.58(t,J1=J2=5.0Hz,2H),7.48(m,2H),7.33(m,4H),7.26(m,4H),7.07(m,4H),6.96(m,2H)。
终产物[(phen)2Ru(L7)Ru(phen)2](ClO4)4(即RuL7)产率：58%。Anal.CalcdforC104H66Cl4N16O18Ru2:C,57.52;H,3.06;N,10.32.Found:C,57.48;H,3.12;N,10.29%.1HNMR(500MHz,DMSO-d6)ppm:9.14(d,J=10.0Hz,2H),8.78(m,8H),8.40(d,J=10.0Hz,8H),8.10(m,10H),8.02(d,J=5.0Hz,2H),7.84(d,J=10.0Hz,2H),7.77(m,11H),7.68(d,J=5.0Hz,2H),7.63(m,4H),7.55(d,J1=J2=10.0Hz,1H),7.35(m,4H),7.25(m,6H),7.06(m,6H).ES-MS[CH3CN,m/z]:444([M-4ClO4]4+),625([M-3ClO4]3+)。
实施例8双核钌（II）配合物的双光子吸收截面测定实验
本实施例双核钌Ru(II)配合物的双光子吸收截面测定用的是经典的双光子诱导荧光法（上转换荧光法），使用罗丹明B的甲醇溶液作为参比标准（G.A.CrosbyandJ.N.Demas,J.Phys.Chem.,1971,75,991）。配制钌配合物（实施例1~7中七种钌配合物）水溶液（二甲基亚砜/水,体积比v/v=1:99，200μM）放置于测定荧光专用的石英比色皿中，然后用OpoletteTM355II激光器测定该系列钌配合物的双光子荧光数据，根据下面算式（1）（C.XuandW.W.Webb,J.Opt.Soc.Am.B,1996,13,481）计算出双光子吸收截面。
。
算式中I代表积分荧光强度，C代表浓度，n代表折射率，Ф代表荧光量子产率，下标1代表参比标准，下标2代表钌配合物。
配合物RuL1-7在激发波长750-1000nm下的双光子吸收截面图见图3。从图3可以见到，配合物RuL1-7双光子吸收截面最大值在322-386GM(1GM=1×10-50cm4·s-1·photon-1)，是现在商用的双光子荧光染料DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)(DAPI双光子吸收截面最大值为0.16GM)的两千倍，也明显比最近报道出来的双光子有机金属分子探针(Q.Zhao,C.HuangandF.Li,Chem.Soc.Rev.,2011,40,2508;S.Botchway,M.Charnley,J.Haycock,A.Parker,D.Rochester,J.WeinsteinandJ.Williams,PNAS,2008,105,16071;C.K.Koo,K.L.Wong,C.W.Y.Man,Y.W.Lam,K.Y.So,H.L.Tam,S.W.Tsao,K.W.Cheah,K.C.Lau,Y.Y.Yang,J.C.ChenandM.H.W.Lam,Inorg.Chem.,2009,48,872;C.K.Koo,L.K.Y.So,K.L.Wong,Y.M.Ho,Y.W.Lam,M.H.W.Lam,K.W.Cheah,C.C.W.ChengandW.M.Kwok,Chem.Eur.J.,2010,16,3942;Y.Hai,J.J.Chen,P.Zhao,H.Lv,Y.Yu,P.XuandJ.L.Zhang,Chem.Commun.,2011,47,2435;J.Jing,J.Chen,Y.Hai,J.Zhan,P.XuandJ.L.Zhang,Chem.Sci.,2012,3,3315)的双光子吸收截面最大值大得多。这充分说明，配合物RuL1-7具有作为双光子活细胞荧光染料的先决条件。
实施例9双核钌（II）配合物的细胞存活率实验
通过MTT法（Mosmann,T.,J.Immunol.Methods1983,65,55-63），来测定配合物对细胞存活率的影响。
将处于对数生长期的细胞，以1×104个/孔接种于96孔培养板中，每孔加细胞悬液150μL。细胞培养24小时后，加入不同浓度的配合物，培养液补至200μL，混合均匀。细胞加药孵育24小时后，小心吸去上清液，每孔加180μL含血清的新鲜DMEM培养液，再加入浓度为5mg/mL的MTT溶液20μL。继续培养4小时后，吸去上清液，每孔加150μLDMSO，置摇床上低速振荡10分钟，使结晶物充分溶解。通过TecanInfiniteF200多功能酶标仪检测，测定波长为590nm，测量各孔的吸光度（OD值）。同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定5复孔。
计算：细胞存活率%=用药组OD值/对照组OD值×100%。检测结果见图4。
如图4所示，当配合物RuL1-7浓度为5μM的时候，细胞存活率都在90%以上，当配合物RuL1-7浓度为10μM的时候，也就是我们进行细胞成像实验时所采用的浓度，存活率都在80%以上，即使当配合物浓度达到较高的20μM的时候，细胞存活率还能保持在60%左右。这充分说明，在足够的浓度和时间范围内，配合物RuL1-7对细胞的毒性很低，对细胞存活率的影响很小，作为单、双光子活细胞荧光染料具有应用性的潜力。
实施例10双核钌（II）配合物的单双光子激光共聚焦显微镜成像实验
细胞培养：Hela细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养，细胞(5×l08/L)接种在共聚焦显微镜专用玻底培养皿中，培养皿直径35mm，其中盖玻片厚度0.085~0.13mm，皿中心微孔直径10mm，5%CO2和95%空气条件下，37℃培养，贴壁生长24小时。
单双光子激光共聚焦显微镜-细胞成像：Hela细胞分别与配合物RuL1-7(10μM)培育2h,吸出培养液，然后用PBS缓冲液洗涤3-4次，在ZeissLSM710NLO激光扫描共聚焦显微镜上成像，使用63×/1.4油镜，分别用458nm和800nm(RuL4激发光为830nm)作为单光子和双光子的激发光源，收集560-630nm范围内的荧光。钌配合物单光子激发、发射波长分别为458,603nm。钌配合物双光子激发、发射波长分别为800(RuL4激发光为830nm),603nm。
实验结果见图5~11（图像中的1cm代表实际图像大小为50μm，表明实际图像被放大200倍）。图5~11为目标配合物在单双光子激光激发下在共聚焦显微镜中的细胞成像结果。配合物RuL1-7着色后的细胞呈现明亮的红色，并均匀分布在细胞质内，没有呈现特殊的染色位置，而且配合物RuL1-7染色效果跟位置都很好，从成像效果的层面看没有太大差别，见图5~11中（B）所示；从明视野的荧光显微镜照片，可以看到HeLa细胞呈现细胞膜边缘规则完整，形态饱满，密度均匀，呈长梭形，说明细胞为活细胞并状态正常，说明在染色成像的过程中，配合物RuL1-7对细胞的毒性很小，见图5~11中（A）所示。
图5~11中(a)，(b)分别为配合物RuL1-7在单光子，双光子激光激发下在共聚焦显微镜中的细胞成像结果。从图5~11中(a)，(b)可以看到，配合物RuL1-7在单光子，双光子激光激发下，配合物RuL1-7着色后的细胞都是呈现明亮的红色，并均匀分布在细胞质内，但明显可以看到双光子激发下，背景荧光可以被很好的抑制，成像无论从颜色的鲜明程度还有细胞成像的细致程度都具有更好的效果，这说明用双光子成像，可以获得更高的分辨率和更好的信噪比对比。
实施例11双核钌（II）配合物的抗光漂白能力实验
HeLa细胞分别和配合物RuL1-7(10μM)，MitotrackerGreen(1μgmL-1)在37oC孵育120/30分钟，然后将样品放到共聚焦显微镜（型号：ZeissLSM710NLO）上，在64倍油镜下观察，分别用458nm波段持续照射RuL1-7染色的HeLa细胞，用488nm波段持续照射MitotrackerGreen染色的HeLa细胞，对配合物收集590-630nm的发射信号，对MitotrackerGreen收集500-530nm的发射信号。实验结果见图12。
抗光漂白能力（光稳定性）对用于长时间活细胞成像的染料来说是非常重要的。我们通过光漂白实验测试，考察了配合物RuL1-7是否比商用有机染料具有更好的抗光漂白能力。图12为在各自的激发波长持续光照300秒中，配合物RuL1-7和商用有机染料MitotrackerGreen的荧光强度被综合的标准化的记录下来。从图12可见，商用有机染料MitotrackerGreen的荧光在80s内就迅速地下降到初始荧光值的20%，到300s的时候就下降到初始荧光值的7%。相对于商用有机染料MitotrackerGreen几乎被完全漂白的荧光，配合物RuL1-7在300s内荧光只减弱到60%左右，说明了配合物RuL1-7具有比商用有机染料MitotrackerGreen更强的光稳定性，抗光漂白能力很强，作为长时间活细胞荧光染料具有极大的应用潜力。
Claims (6)
1.一类双核钌配合物，由阳离子和阴离子组成，其特征在于，所述阳离子为[(phen)2Ru(L)Ru(phen)2]4+，结构式如式I，
式I；
所述阴离子为无机盐离子。
2.根据权利要求1所述双核钌配合物，其特征在于，所述阴离子无机盐中的阴离子为(ClO4)－或Cl－。
3.权利要求1所述双核钌配合物的制备方法，其特征在于，制备步骤如下：
S1.将1,10-邻菲罗啉-5,6-二酮、乙酸铵、间苯乙醛、冰醋酸与相应苯胺类化合物在氩气保护下混合加热回流24小时，混合物冷却至室温后加入水，中和，抽滤，得到沉淀用水和乙醚洗涤、甲醇重结晶，得到相应中间产物；
S2.将步骤S1得到的中间产物与cis-[Ru(phen)2Cl2]·2H2O加入到乙二醇中，氩气保护下加热回流12小时，冷却至室温后滴加阴离子无机盐的饱和溶液产生沉淀，抽滤，产物过柱用甲苯与乙腈体积比为1:3的混合液冲洗，真空干燥得终产物。
4.根据权利要求3所述双核钌配合物的制备方法，其特征在于，所述阴离子无机盐中的阴离子为(ClO4)－或Cl－。
5.权利要求1所述双核钌配合物在制备活细胞荧光染料方面的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述活细胞荧光染料为活细胞的细胞质荧光染料。
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