CN102260296A - 一种单核钌配合物及其制备方法和在活细胞染色中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种单核钌配合物及其制备方法和在活细胞染色中的应用。该配合物阳离子部分为[Ru(tdp)3]2+或[Ru(tdp)2dppz]2+，阴离子部分为(ClO4)－、Cl－或(PF6)－，其中阳离子为[Ru(tdp)3]2+的配合物制备方法是以tdp与Ru(DMSO)4Cl2反应得[Ru(DMSO)4tdp]2+，再和tdp加入到乙二醇中加热回流反应，冷却后过滤，滴加NaClO4饱和溶液到滤液中沉淀，经抽滤、洗涤、过柱得[Ru(tdp)3]2+的配合物。将tdp替换为dppz即得阳离子为[Ru(tdp)2dppz]2+的配合物。本发明的单核钌配合物无需细胞预处理即可对活细胞中细胞核着色，且培育时间短，染色灵敏度高，在生物标记和细胞成像方面将有极大的应用潜力。
Description
技术领域
本发明涉及细胞成像试剂技术领域，具体涉及一种单核钌配合物及其制备方法和在活细胞染色中的应用。
背景技术
随着激光共聚焦荧光显微镜技术的不断发展，人们对细胞的研究日益深入，适合的生物成像试剂的开发激起科学家们的极大兴趣。目前，应用于细胞成像领域的商用荧光染料大部分是一些有机小分子，如PI, DAPI，EB, Hoechst等。然而，这些有机分子存在一些缺点：水溶性比较低，容易产生沉淀或者与细胞作用后即刻析出，影响染色效果；具有比较高的细胞毒性，染料与细胞作用后，导致细胞的死亡，影响对细胞正常状态的观测；光稳定性低，因受空气中或介质中活性剂基团（单线态氧等）的作用，染料在激发波长照射后，荧光不断减弱，光漂泊现象严重，不利于成像稳定；激发和发射光谱的交叉严重（stoke shif小），一般在几十个纳米左右，不利于区分内源荧光和降低染料本身的自淬灭。基于有机染料存在的若干缺点，人们更多的把目光转向具有优良光电属性的过渡金属配合物上。
金属配合物凭借着其优良的光化学性质，用于细胞成像试剂方面具有其独特的优点。近年来，钌多吡啶配合物与DNA作用得到广泛的研究。钌多吡啶配合物在水溶液中不发射荧光，但与DNA作用后，荧光大大增强，具有明显的光开关效应。这种具有分子光开关效应的钌配合物具有背景荧光低、结构稳定、水溶性强、激发和发射光谱stoke位移大且在长波区的特点，可直接用于细胞内核酸的染色，是潜在的优良的DNA染色试剂（M. Matson, F. R. Svensson,
B. Norden and P. Lincoln. J. Phys. Chem. B 2011, 115, 1706-1711; ）。
这些具有分子光开关性质配合物的细胞吸收及其细胞染色研究已经初步开始。Barton J.K.工作组研究 [Ru(bpy)2dppz]2+和[Ru(phen)2dppz]2+的细胞吸收发现配合物穿越细胞膜比较困难。配合物进入细胞的能力与其疏水性成正比，配合物主要集中在细胞质部位，细胞核内荧光并没有发现增强（A. Puckett Cindy and K.
Barton Jacqueline. J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 46-47）。Palaniandavar M.工作组发现[Ru(phen)2dppz]2+可以快速进入死细胞，可以区别不同的细胞组分，是良好的死细胞染料（V. Rajendiran, M.
Palaniandavar, V. S. Periasamy and M. A. Akbarsha. J. Inorg. Biochem. 2010,
104, 217-220）。对dppz配体上修饰烷基醚后，可以加强其细胞膜渗透性（F. R. Svensson, M. Li, B.
Nordén and P. Lincoln. J. Phys. Chem. B 2008, 112, 10969-10975; F. R.
Svensson, M. Matson, M. Li and P. Lincoln. Biophys. Chem. 2010, 149, 102-106）。将dppz的苯环末端修饰不同长度的烷基醚(-OC2H5,
-OC4H9, -OC6H13)，其表现不同的染色效果。对甲醇固定后的细胞，亲脂性最强的配合物(-OC6H13)倾向于染细胞膜，中等亲脂性的配合物(-OC4H9)
富集在核仁的RNA区域，而亲脂性最弱的(-OC2H5)专染核仁的DNA区域。其细胞内定域的选择性与键合的选择性有关（M. Ardhammar, P. Lincoln
and B. Norden. J. Phys. Chem. B 2001, 105, 11363-11368）。
由于钌多吡啶配合物因其较弱的细胞迁移率，很难超越完整的细胞膜，因此限制其在活细胞生物成像领域的研究，目前发现双核Ru-dppz配合物作为DNA的双插入试剂在电穿孔的条件下可以对V79 Chinese hamster cells活细胞的细胞质染色（M. E. Jiménez-Hernández, G. Orellana, F.
Montero and M. T. Portolés. Photochem. Photobiol. 2000, 72, 28-34; B. Onfelt, L. Gostring, P.
Lincoln, B. Norden and A. Onfelt. Mutagenesis 2002, 17, 317-320）。dppz衍生物桥连的双核[Ru(phen)2tpphz]
(tpphz = tetrapyrido[3,2-a:2',3'-c:3'',2''-h:2''',3'''-j] phenazine) ，可以作为活细胞DNA染料（M. R. Gill, J.
Garcia-Lara, S. J. Foster, C. Smythe, G. Battaglia and J. A. Thomas. Nat. Chem.
2009, 1, 662-667），是优良的活细胞成像试剂。单核钌多吡啶配合物作为活细胞染色则很少有报道。
发明内容
本发明的目的在于根据现有技术中的上述不足，提供一种具有良好分子光开关性能的噻二唑配体的钌多吡啶配合物，在无需细胞预处理（电穿孔或溶剂固定）的条件下，可以成功的对活细胞中细胞核着色，且具有培育时间短，染色灵敏度高的特点，在生物标记和细胞成像方面将有极大的应用潜力。
本发明通过以下技术方案实现上述目的：
一种单核钌配合物，其阳离子部分为[Ru(tdp)3]
2+或[Ru(tdp)2dppz]2+，[Ru(tdp)3]
2+结构式如Ⅰ，[Ru(tdp)2dppz]2+结构式如Ⅱ，阴离子部分为(ClO4)－、Cl－或(PF6)－，
式Ⅰ
式Ⅱ。
tdp为1,2,5-噻二唑并-[3,4-f]-1,10-邻菲罗啉的简称， dppz为二吡啶[3,2-a:2',3'-c]并吩嗪的简称。
上述单核钌配合物，优选化合物 [Ru(tdp)3](ClO4)2或[Ru(tdp)2dppz](ClO4)2。
单核钌配合物的制备方法，当单核钌配合物阳离子部分为[Ru(tdp)3]
2+时，制备步骤如下：
（1）以1,10-邻菲罗啉为原料，合成5, 6-二氨基-邻菲罗啉，产物溶于CH2Cl2中，加入三乙胺搅拌、溶解，缓慢滴加SOCl2，继续回流4小时，减压浓缩除掉溶剂后再加入水中，加入盐酸调至酸性（pH值优选为2），混合液用CH2Cl2萃取3次，再用水洗涤两次，再用无水Na2SO4干燥过夜，过滤，得到tdp；
（2）以RuCl3·nH2O和DMSO为原料，合成Ru(DMSO)4Cl2，再与tdp溶于甲醇中，加热搅拌回流反应6小时，旋转蒸发除掉甲醇，剩余产物溶于丙酮，再加入乙醚，过滤后用乙醚洗涤，干燥，得[Ru(DMSO)4tdp]
2+；
（3）[Ru(DMSO)4tdp]
2+和tdp加入到乙二醇中，氩气保护下120℃加热回流6小时，得紫红色清液，冷却至室温后过滤去除不溶物，将滤液浓缩至原体积的一半，再加水稀释至原体积，然后缓慢滴加阴离子[如 (ClO4)－、Cl－或(PF6)－]无机盐的饱和溶液产生大量沉淀，抽滤，先后用水、乙醇和乙醚洗涤，过柱用甲苯与乙腈体积比为1:2的混合液冲洗，真空干燥，得[Ru(tdp)3]
2+。所述阴离子无机盐如NaClO4或NH4PF6等。
当单核钌配合物阳离子部分为[Ru(tdp)2dppz]2+时，制备步骤如下：
（1）以RuCl3·nH2O和DMSO为原料，合成Ru(DMSO)4Cl2，再与dppz溶于甲醇中，加热搅拌回流反应30分钟，旋转蒸发除掉甲醇，剩余产物溶于丙酮，再加入乙醚，过滤后用乙醚洗涤，干燥，得[Ru(DMSO)4dppz]
2+；
（2）将[Ru(DMSO)4dppz]
2+和dppz加入到乙二醇中，氩气保护下120℃加热回流6 小时，得紫红色清液，冷却至室温，过滤去除不溶物，将滤液浓缩至原体积的一半，再加水稀释至原体积，滴加阴离子[ 如(ClO4)－、Cl－或(PF6)－]无机盐的饱和溶液产生沉淀，抽滤，先后用水、乙醇和乙醚洗涤，过柱用甲苯与乙腈体积比为1:3的混合液冲洗，真空干燥，得[Ru(tdp)2dppz]
2+。所述阴离子无机盐如NaClO4或NH4PF6等。
在反应过程中直接把NaClO4换成NH4PF6即可得到(PF6)－为阴离子的配合物；配合物可由高氯酸盐直接转换成相应的氯盐，方法为将高氯酸阴离子的配合物溶于无水丙酮，滴加四丁基氯化铵（tetrabutylammonium
chloride）的丙酮溶液，立即会有深红色沉淀生成。过滤，沉淀用适量丙酮洗涤至滤液无色。干燥，即得到配合物对应的氯盐。
单核钌配合物在活细胞染色中的应用。本发明的单核钌配合物具有优良的荧光特性和良好细胞膜渗透能力，是良好的活细胞成像试剂。同时具有良好分子光开关性能，在无需细胞预处理（电穿孔或溶剂固定）的条件下即可对活细胞中细胞核着色，培育时间短，染色灵敏度高，在生物标记和细胞成像方面将有极大的应用潜力。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:
本发明合成了含三个噻二唑配体的配合物 [Ru(tdp)3]2+，研究表明其与DNA的作用能力很弱，属于静电结合或部分插入结合的作用模式范畴。但其在水溶液条件下却具有同类钌多吡啶配合物的荧光强度的10-1000倍的荧光发射能力，这说明噻二唑配体是良好的生色基团,且与DNA作用后其荧光变化不大。
模拟DNA经典插入试剂[Ru(L)2dppz]2+(L=bpy,
phen)，设计了具有DNA插入能力的[Ru(tdp)2dppz]2+。研究表明配合物在噻二唑配体的基础上引入dppz作为主配体，与DNA的作用能力大大增强。配合物本身在水溶液中没有荧光，与DNA作用后荧光增强200多倍，是优良的DNA分子光开关试剂。
将两个具有良好荧光特性的钌配合物用于对HeLa细胞的成像研究发现配合物均可以顺利穿越完整的细胞膜，并对核仁区域成功着色。实时分析结果表明配合物的细胞毒性比较低，对细胞损伤小。
本发明所涉及的单核钌(II)配合物，结构简单且稳定、着色灵敏度高、细胞渗透能力强、大的stoke位移及低细胞毒性的优点可以作为活细胞核成像潜在试剂。
附图说明
图1. 配合物[Ru(tdp)3]
2+和[Ru(tdp)2dppz]2+的化学结构式；
图2. 配体tdp和dppz的合成途径；
图3. 配合物[Ru(tdp)3]
2+和[Ru(tdp)2dppz]2+的合成途径；
图4. 配合物与DNA作用的荧光光谱，其中(a)为[Ru(tdp)3]2+，(b)为[Ru (tdp)2dppz]2+；
图5. HeLa 细胞与配合物培育1 h后与DAPI共染后细胞成像，(A)为 [Ru(tdp)3]2+，(B) 为[Ru (tdp)2dppz]2+；(a)染料对细胞着色后的荧光图；(b) 配合物对细胞着色后的荧光图；(c)明视野可见光细胞着色图；(d) a,b,c的叠加；
图6. 实时细胞分析系统监测配合物[Ru(tdp)3]2+(a)，[Ru (tdp)2dppz]2+
(b)对HeLa细胞增殖曲线的影响，箭头表示开始加药点(24 h)。
具体实施方式
实施例
1
单核钌配合物的制备
1．配体1,2,5-噻二唑并-[3,4-f]-1,10-邻菲罗啉 (tdp) 的制法：
配体dppz是一个得到广泛研究的多吡啶配体，技术成熟，可参照文献方法 （A. Greguric, I. D. Greguric, T. W.
Hambley, J. R. Aldrich-Wright and J. G. Collins. Dalton Trans. 2002, 849-855;）制备。tdp配体的合成经过四步，前三步都是常见的合成多吡啶配体的技术成熟的反应，第四步反应本发明作了一些修改，具体合成步骤如下：
(1)合成5-硝基-邻菲罗啉
称取1,10-邻菲罗啉10 g于50 mL浓硫酸置于圆底烧瓶中，加热到150℃，再滴加27.5 mL浓硝酸，反应物继续回流2 h后停止反应，混合物为橙黄色澄清液，冷却至室温。将反应混合物倒入盛有800 g冰的烧杯中(冰的量可酌情增加)，用浓NaOH溶液（85g NaOH固体溶于适量水）调节反应液至中性。冷却后，抽滤得浅黄色固体。用冰水洗涤多次至无色，所得产品真空干燥后备用。产率：81.2%。
(2) 合成5-硝基-6-氨基-邻菲罗啉
将5-硝基-邻菲罗啉(8 g, 33.3 mmol）与200 mL无水乙醇的混合物加热搅拌至回流，待5-硝基-邻菲罗啉全部溶解后，再加入盐酸羟胺（16 g，237.8 mmol），溶液立即析出浅黄色悬浮沉淀，往上述溶液中逐渐滴加KOH的无水乙醇溶液（18 g KOH溶于200 mL无水乙醇），约45分钟内加完。此时反应混合物渐渐变成棕色。继续回流30分钟后停止反应，溶液冷却至室温，将反应物倒入600 mL冰水中，静置一夜之后，抽滤，分别用水、甲醇和氯仿多次洗涤，50℃干燥，得棕色固体2.1 g。产率：26.3%。
(3) 合成5, 6-二氨基-邻菲罗啉
将5-氨基-6-硝基-邻菲罗啉(0.4 g, 1.67 mmol) 于400 mL 无水乙醇的混合物加热回流至5-氨基-6-硝基-邻菲罗啉全部溶解后，加入0.2 g Pd/C 催化剂（10% Pd）和 2 mL (80%) 的水合肼。继续回流1 h后停止反应，并趁热过滤，减压浓缩滤液，冷却至室温，再往其中加入过量的石油醚（沸程 40-60℃）后，析出黄色絮状沉淀，抽滤、用石油醚洗涤产物，50℃干燥，得0.262 g。产率：74.8%。
(4) 合成1,2,5-噻二唑并-[3,4-f]-1,10-邻菲罗啉 (tdp)
tdp的合成参考文献（G. Conte, A. J. Bortoluzzi
and H. Gallardo. Synthesis 2006, 3945-3947）的方法，并做了少许修改。将5, 6-二氨基-邻菲罗啉 (1.0g 4.76 mmol) 溶于30 mL CH2Cl2中，然后再加入三乙胺 (1.92 g, 19.04 mmol) 搅拌待混合物溶解后，逐滴滴加亚硫酰氯SOCl2 (1.13 g,
9.5 mmol)，继续回流4 h，减压浓缩除掉溶剂后再加入70 mL H2O中，加入盐酸调至酸性 (pH值= 2)。混合液用CH2Cl2萃取三次，再用H2O洗涤两次，萃取后用无水Na2SO4干燥过夜，过滤，旋出溶剂得棕色固体。产品极易溶于CH2Cl2。产率: 0.906 g (80%); EI-MS (CH3OH)
m/z: 239 [M+H]+. Anal. Calcd for C12H6N4S
(%): C, 60.49; H, 2.54; N, 23.51; S, 13.46. Found: C, 60.56; H, 2.68; N, 22.71;
S, 13.36. 1H NMR (400 MHz, d6-DMSO) ppm: 7.99 (dd, J =
8.0 Hz, 4.6 Hz, 2 H), 9.08 (dd, J = 8.0 Hz, 1.7 Hz, 2 H), 9.20 (dd, J = 4.4 Hz,
1.6 Hz, 2 H). IR (KBr): 3401, 1635, 1561, 1480, 1396, 1079, 842, 809, 735 cm– 1.
合成tdp的常规方法是按照文献的反应物计量比，将5, 6-二氨基-邻菲罗啉溶于CH2Cl2中，然后再加入三乙胺搅拌待混合物溶解后，逐滴滴加亚硫酰氯SOCl2，40℃条件下搅拌过夜（或6-8小时），减压浓缩除掉溶剂后再加入H2O中，混合液用CH2Cl2萃取三次，再用H2O洗涤三次，取下层CH2Cl2相，Na2SO4干燥过夜，过滤，减压旋出溶剂，得到棕色固体。
文献中用HCl调节pH值则反应时间较短，远少于6小时，但pH调节过程比较麻烦，非常不容易控制，因此实际操作不用HCl调pH值，但要适当的延长反应时间，便于反应物能够充分的反应，因SOCl2极易吸收水分并生成HCl，加入至反应液中，与空气中的水及其溶剂中的水反应会冒出大量的白烟并放出大量的热，因此，加入SOCl2一定要慢，保证给热量留出扩散的时间，同时应尽量避免与任何形式的水的接触。SOCl2的除水率越高时产品产率越高。因此两种方法各有所短。
采用本发明的方法是在减压浓缩除掉溶剂后再加入H2O，同时加入HCl调pH值，这样做的好处是既能够使溶液体系比较稳定，易于控制，又可以在较短的时间内使反应物能够充分反应。
2．配合物 [Ru(tdp)3]·(ClO4)2和 [Ru(tdp)2(dppz)]·(ClO4)2的合成方法：
(1) Ru(DMSO)4Cl2
的合成
称取2 g RuCl3·nH2O，加入10 mL DMSO中, 氩气保护，加热回流12 min，待溶液冷却后，加入40 mL丙酮， 静置一会，有大量黄色沉淀产生，过滤，用丙酮、乙醚洗，得淡黄色微晶。产率82%。
(2) [Ru(DMSO)4dppz]2+的合成
将Ru(DMSO)4Cl2
(0.2 g, 0.414 mmol) 和dppz (0.116 g, 0.41 mmol) 溶于15 mL CH3OH中，加热搅拌回流30 min，旋掉甲醇，将残余物溶于丙酮，再加入乙醚。得到橙黄色配合物，过滤后用乙醚洗涤，干燥，备用。产率80%。
(3) [Ru(DMSO)4tdp]Cl2的合成
合成方法同[Ru(DMSO)4dppz]2+，将tdp (0.098g, 0.41 mmol) 取代dppz，其他步骤相同。产率74%。
(4) [Ru(tdp)3](ClO4)2
的合成
将[Ru(DMSO)4tdp]Cl2
0.14 g (0.2 mmol) 和tdp 0.129 g (0.5 mmol)，加入到15 mL乙二醇中，氩气保护、120℃加热回流6 小时，得紫红色清液。冷却至室温，过滤去除不溶物后，体积浓缩至原来的一半，再加水稀释到原体积，慢慢滴加NaClO4 (0.5 g) 的饱和溶液即产生大量深红色沉淀。抽滤，先后用水、乙醇、乙醚洗涤。过柱用V(甲苯):V(乙腈) = 1:2冲下。真空干燥，得深红色固体0.12 g，产率60%。Anal. Calcd. for C36H18Cl2N12O8S3Ru
(%): C, 42.61; H, 1.79; N, 16.56. Found (%): C, 42.55; H, 1.81; N, 16.50. ES-MS
(CH3OH) m/z: 408.95 [M-2ClO4]2+, 915.90
[M-ClO4]+. 1H NMR (400 MHz, d6-DMSO)
ppm: 9.18 (d, J=6.9 Hz, 6H); 8.25 (d, J = 0.9 Hz, 6H); 7.87 (d, J = 13.6 Hz,
6H).
(5) [Ru(tdp)2dppz](ClO4)2
的合成
原料为[Ru(DMSO)4dppz]Cl2
0.15 g (0.2 mmol) 和dppz 0.129 g (0.5 mmol)，其他步骤同步骤（4）[Ru(tdp)3](ClO4)2的合成方法。过柱用V(甲苯):V(乙腈) = 1:3冲下。得红色固体0.088 g，产率42 %。Anal. Calcd. for C42H22Cl2N12O8S2Ru
(%):C, 47.64; H, 2.09; N, 15.87. Found (%): C, 47.58; H, 2.14; N, 1.75. ES-MS
(CH3OH) m/z: 429.75 [M-2ClO4]2+, 960.00
[M-ClO4]+. 1H NMR (400 MHz, d6-DMSO)
ppm: 9.65 (s, 2H); 9.18 (s, 4H); 8.52 (s, 2H); 8.29 (s, 4H); 8.25 (s, 2H); 8.20
(s, 2H); 7.94 (s, 2H); 7.88 (s, 4H).
实施例
2
单核钌
Ru(II)
配合物的应用
1. 单核钌Ru(II)配合物的分子光开关实验
配制钌配合物（实施例1中两种钌配合物）溶液（10 μM），用微量加样器每次往样品池中加入相同体积的DNA储液，使DNA与配合物浓度比值（CDNA/CRu =
0～12）按比例递增，达到饱和时荧光停止变化。每次混和均匀约3分钟后，在500~750 nm范围监测配合物的荧光光谱变化。用紫外吸收MLCT峰值作为激发光源，记录发射光波峰和发光强度。
配合物[Ru(tdp)3]
2+和[Ru(tdp)2dppz]
2+与DNA作用的荧光光谱见图4。（图4为配合物与DNA作用前后荧光强度的变化。配合物[Ru(tdp)3]
2+本身具有强烈的荧光，与DNA作用后，荧光强度变化不大。这一方面由于在水溶液中配合物MLCT跃迁过程能量损失比较小；另一方面说明配合物与DNA的键合作用很弱，没有得到DNA碱基的更多保护而阻止溶剂的淬灭作用。与同类钌多吡啶配合物相比，其荧光强度明显增强，说明了噻二唑配体是良好的荧光生色基团。
配合物[Ru(tdp)2dppz]
2+与DNA的作用后，荧光前后变化非常显著。dppz配体在溶液中荧光容易被水淬灭，进而配合物自身没有荧光；与DNA作用后荧光急剧增加至数百倍，相同实验条件下荧光增加数值是经典的DNA光开关试剂[Ru(bpy)2dppz]2+和 [Ru(phen)2dppz]2+的10倍，显示出配合物[Ru (tdp)2dppz]2+优越的荧光特性。配合物的DNA分子光开关的特性来源于配合物与DNA的强烈的键合作用，配体dppz插入到DNA碱基对中，受到DNA输水保护，大大降低了溶剂对其荧光的淬灭。配合物在缓冲体系下没有荧光，避免了生物实验荧光检测的背景干扰；与DNA作用后表现出强烈的荧光性质，该特性非常适合于做细胞染料的研究。
2. Ru(II)配合物的激光共聚焦实验
细胞培养：Hela细胞在含10%胎牛血清的MEM培养基中培养，细胞(5 ´ l08/L) 接种在共聚焦显微镜专用玻底培养皿中，培养皿直径35 mm，其中盖玻片厚度0.085-0.13 mm，皿中心微孔直径10 mm，5% CO2和95%空气条件下，37℃培养，贴壁生长24小时。
共聚焦显微镜-细胞成像：Hela细胞分别与配合物[Ru(tdp)3]2+,
[Ru (tdp)2dppz]2+ (5 μM) 培育1 h ,再和DAPI (5 μM)培育30分钟，吸出培养液，然后用PBS缓冲液洗涤3-4次，在Leica TCS SP5 激光扫描共聚焦显微镜上成像，使用63´/1.4油镜，用458 nm光作为激发光源，收集560-630nm范围内的荧光。DAPI 激发和发射波长分别为405, 460 nm，钌配合物激发、发射波长分别为458, 600 nm。
实验结果见图5（图像中的1cm代表实际图像大小为50 mm，表明实际图像被放大200倍）。图5为目标配合物与商用有机细胞染料DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)共染的结果。DAPI是一种活细胞荧光染料，专染核仁区域，对细胞着色后呈现明亮的蓝色，见图5A(a)。配合物[Ru(tdp)2dppz]2+着色后的细胞呈现明亮的红色，见图5B(b)；配合物[Ru(tdp)3]2+与细胞培养后因荧光强度较弱，图像整体较暗，见图5A(b)。从明视野的荧光显微镜照片，可以看到HeLa细胞呈现细胞膜边缘规则完整，形态饱满，密度均匀，呈长梭形，说明细胞为活细胞，明显不同于细胞体积变小变圆，细胞膜紧缩的凋亡的细胞形态学特点（见图5c Brightfield）。
图5AB(d)为配合物与DAPI对照组图像叠加图。DAPI与配合物[Ru(tdp)3]2+共染的图片为红色和蓝色的叠加，很明显最终颜色是以DAPI荧光为主的蓝色，说明配合物[Ru(tdp)3]2+的染色能力较DAPI弱；同样，DAPI与配合物[Ru(tdp)2dppz]2+共染的后细胞的颜色为红色和蓝色的叠加，但最终颜色却是以配合物的红色为主，说明了在相同浓度下的配合物与DAPI，配合物的染色效果比DAPI好，细胞染色的灵敏度比DAPI高。这与其DNA键合能力密切相关，DAPI与DNA作用后荧光增强20倍，而配合物[Ru(tdp)2dppz]2+与DNA作用后，荧光增200多倍，因而染色能力更强、更灵敏。配合物与DAPI的叠加图可以明显的发现，配合物与DAPI着色区域基本相同，主要集中在细胞核部位。
目标配合物[Ru(tdp)3]2+和[Ru(tdp)2dppz]2+细胞成像能力的差别源于其与DNA键合能力的差异。噻二唑配体的引入不仅增强了配合物发射荧光的能力，而且增强了配合物整体的跨膜能力；配合物荧光光开关特性是配合物作为细胞成像试剂研究的基础。
3. 细胞实时分析实验
取80 mL的培养基加入16孔板中，连接到实时细胞分析系统上以后检测背景值需约24 s。然后加入100 mL细胞浓度为10000个/ml的 Hela细胞。在37℃，5% CO2的饱和湿度培养箱中培养约24小时后，此时细胞处于生长指数期，再加入20 mL不同浓度的配合物，使配合物最终浓度分别为 6.25、12.5、25和50mM。在60-120小时内每隔15分钟检测。数据用RTCA Software 1.2进行分析。
检测结果见图6，图6为分别加入配合物[Ru(tdp)3]2+（图6a）和[Ru(tdp)2dppz]2+（图6b）对细胞增殖曲线的影响。HeLa细胞的生长状态增殖曲线的形状与以DNA为作用靶点的药物的特征曲线相符，即药物加入后，细胞的增殖会出现一个先增加后减少的“波状”图谱，推测配合物对细胞的作用是以DNA为作用靶点。配合物[Ru(tdp)3]2+在小于12.5mM下，对细胞的正常生长基本没有干扰，浓度增加到50 mM，则明显抑制细胞的增殖，直接导致细胞死亡，说明配合物[Ru(tdp)3]2+在高浓度下具有细胞毒性。我们的研究表明，配合物[Ru(tdp)2dppz]2+在浓度小于15 mM，对细胞的正常生长没有明显的影响，100 mM以上才表现出细胞毒性，说明配合物[Ru(tdp)2dppz]2+较配合物[Ru(tdp)3]2+的细胞毒性小。双核钌配合物用于细胞成像研究在100 mM浓度下，对细胞生长有一定的影响类似。但同有机染料EB, Hoechst的致癌毒性相比，金属配合物的细胞毒性较小。
Claims (7)
1.一种单核钌配合物，其特征在于阳离子部分为[Ru(tdp)3]
2+或[Ru(tdp)2dppz]2+，[Ru(tdp)3] 2+结构式如Ⅰ，[Ru(tdp)2dppz]2+结构式如Ⅱ，阴离子部分为(ClO4)－、Cl－或(PF6)－，
式Ⅰ
式Ⅱ。
2.根据权利要求1所述的单核钌配合物，其特征在于该配合物化学式为[Ru(tdp)3](ClO4)2或[Ru(tdp)2dppz](ClO4)2。
3.权利要求1所述单核钌配合物的制备方法，其特征在于当单核钌配合物阳离子部分为[Ru(tdp)3] 2+时，制备步骤如下：
（1）以1,10-邻菲罗啉为原料，合成5, 6-二氨基-邻菲罗啉，产物溶于CH2Cl2中，加入三乙胺搅拌、溶解，滴加SOCl2，继续回流4小时，减压浓缩除掉溶剂后再加入水中，加入盐酸调至酸性，混合液用CH2Cl2萃取3次，再用水洗涤两次，再用无水Na2SO4干燥过夜，过滤，得到tdp；
（2）以RuCl3·nH2O和DMSO为原料，合成Ru(DMSO)4Cl2，再与tdp溶于甲醇中，加热搅拌回流反应6小时，旋转蒸发除掉甲醇，剩余产物溶于丙酮，再加入乙醚，过滤后用乙醚洗涤，干燥，得[Ru(DMSO)4tdp] 2+；
（3）[Ru(DMSO)4tdp] 2+和tdp加入到乙二醇中，氩气保护下120℃加热回流6小时，得紫红色清液，冷却至室温后过滤去除不溶物，将滤液浓缩至原体积的一半，再加水稀释至原体积，然后滴加权利要求1所述阴离子无机盐的饱和溶液产生沉淀，抽滤，先后用水、乙醇和乙醚洗涤，过柱用甲苯与乙腈体积比为1:2的混合液冲洗，真空干燥，得[Ru(tdp)3]
2+。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤（1）所述酸性是pH值为2。
5.权利要求1所述单核钌配合物的制备方法，其特征在于当单核钌配合物阳离子部分为[Ru(tdp)2dppz] 2+时，制备步骤如下：
（1）以RuCl3·nH2O和DMSO为原料，合成Ru(DMSO)4Cl2，再与dppz溶于甲醇中，加热搅拌回流反应30分钟，旋转蒸发除掉甲醇，剩余产物溶于丙酮，再加入乙醚，过滤后用乙醚洗涤，干燥，得[Ru(DMSO)4dppz] 2+；
（2）将[Ru(DMSO)4dppz] 2+和dppz加入到乙二醇中，氩气保护下120℃加热回流6 小时，得紫红色清液，冷却至室温，过滤去除不溶物，将滤液浓缩至原体积的一半，再加水稀释至原体积，滴加权利要求1所述阴离子无机盐的饱和溶液产生沉淀，抽滤，先后用水、乙醇和乙醚洗涤，过柱用甲苯与乙腈体积比为1:3的混合液冲洗，真空干燥，得[Ru(tdp)2dppz]
2+。
6.权利要求1所述单核钌配合物在活细胞染色中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述活细胞染色为活细胞的细胞核染色。
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