CN109796503B

CN109796503B - 一种双核茂型钌配合物的制备方法及其在抗肿瘤中的应用

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Publication number: CN109796503B
Application number: CN201811254818.0A
Authority: CN
Inventors: 高峰; 刘丹丹; 毕徐丹
Original assignee: Yunnan University YNU
Current assignee: Yunnan University YNU
Priority date: 2018-10-26
Filing date: 2018-10-26
Publication date: 2021-04-20
Anticipated expiration: 2038-10-26
Also published as: CN109796503A

Abstract

本发明属于抗肿瘤研发领域，公开了一种双核茂型钌配合物的制备方法及其在拓扑异构酶抑制和抗肿瘤中的应用。本发明的双核茂型钌配合物的阳离子部分的结构如式I所示。本发明优化了双核茂型钌配合物的制备工艺，原料成本低，反应时间短。所得到的配合物纯度高，具有良好的水溶性和优异的光谱性质。本发明的双核茂钌配合物具有很高的DNA插入结合能力，从而具有极高的拓扑异构酶抑制活性，以及较好的抗肿瘤作用，其中一个配合物诱导人前列腺癌细胞22Rv1晚期凋亡的能力强于顺铂，是极具应用价值得潜在的抗肿瘤药物。

Description

一种双核茂型钌配合物的制备方法及其在抗肿瘤中的应用

技术领域

本发明属于抗肿瘤药物和拓扑异构酶抑制剂研发领域，尤其涉及一种双核茂型钌配合物的制备方法及其在拓扑异构酶抑制和抗肿瘤中的应用。

背景技术

肿瘤是危害人类健康的常见疾病之一，近年来随着人类生活习惯的改变和环境日益污染等不利因素，恶性肿瘤的病死率逐年攀升。二十世纪以来，癌症已成为人类健康的主要杀手，是仅次于心血管病的人类第二大死因。化疗是治疗癌症的重要手段，但长期以来，用于肿瘤治疗的药物多为有机化合物。1969年发现顺铂具有抗肿瘤活性以来，铂类药物快速发展，所取得的成就充分证明了金属化合物具有巨大的药用价值和抗肿瘤潜力，从中可以产生利用单纯的有机合成手段难以得到的抗肿瘤剂（Dalton Trans.，2007，4929-4937）。但随着铂类抗癌药物在临床中的长期使用，毒副作用（神经毒性、肾毒性、骨髓毒性等）和耐药性严重制约了铂类药物的疗效和长期使用。近年来,基于非铂类金属抗癌药物的研究十分活跃，并得到了很大的发展。大多数报告认为钌的配合物是低毒性的而且易于被肿瘤组织吸收，国际上普遍认为,钌配合物将成为最有前途的抗癌药物之一。基于此，欧盟自1997年就成立了钌抗癌药物的研究和发展工作组，加强相应的研究。钌配合物能通过复杂的化学生物学过程跟生物大分子发生作用，利用这一点，设计让它们与特定的生物分子作用，从而达到进攻癌细胞的目的。

DNA拓扑异构酶（Topo）是细胞增殖所必需的一种酶，在DNA复制、转录、翻译和染色体离等过程中发挥着重要作用。Topo在肿瘤细胞中的活性及含量都远高于正常细胞，抑制其活性即能产生抗肿瘤作用，因此Topo是当前公认的重要的抗肿瘤药物的靶点之一。目前应用于临床治疗的抗肿瘤药物，如拓扑替康、喜树碱等，都是以拓扑异构酶为靶点，通过抑制拓扑异构酶的活性从而达到抑制肿瘤细胞增殖。研究表明，Topo抑制剂一般具有较好的DNA键合能力，能通过结合Topo-DNA断裂复合物来抑制拓扑异构酶的活性。Mishra课题组近期合成了一系列DMSO及Cl参与配位的钌配合物，该系列配合物抑制拓扑异构酶活性较好，其IC₅₀在18 μM左右。

研究表明，茂型钌配合物能够与双螺旋DNA相互作用。例如，双核配合物[((η ⁶-Bip)RuCl(en))₂(CH₂)₆]²⁺能够优先选择在鸟嘌呤部位快速与CT-DNA结合，而且在体外实验中能够有效地抑制DNA转录为RNA。具有“琴凳”结构的茂型芳基钌配合物是以双功能方式与DNA发生相互作用，这是与顺铂完全不同的抗癌机理（Chem. Sci.，2010，1，258-270）。Sadler等研发的一组芳基钌化合物在体外和体内的抗癌活性都很高（J. Med. Chem.，2006，49，6858-6868；Chem. Cummun.，2005，4764-4776）。这类芳基钌配合物除了对DNA中鸟嘌呤碱基N7的直接配位结合外，还有配体的嵌入结合和特殊氢键作用。这些附加作用导致这类配合物能以独特方式与DNA双螺旋结合，使DNA产生不同的结构扭曲，这也许是它们与顺铂无交叉抗药性的原因（Angew. Chem. Int. Ed.，2006，45，8153-8156）。茂型芳基钌配合物中的芳基配体与DNA的疏水相互作用能促进其与DNA的结合。

本专利发明了一种具有良好水溶性和光谱性质的双核茂型钌配合物，利用两个钌配位中心与DNA发生协同作用，显著提高了其与DNA的结合能力，进而以很高的活性抑制DNA拓扑异构酶（IC₅₀低至0.1 μM）。该双核茂型钌配合物具有较高的抗肿瘤活性，其中Ru2诱导人前列腺癌细胞22Rv1晚期凋亡的能力强于顺铂。该配合物还能对DNA进行光谱响应，是潜在的抗肿瘤药物和光谱检测试剂。

发明内容

本发明的目的在于针对当前高效低副作用抗肿瘤药物研究，提供一种具有良好水溶性和光谱性质的双核茂型钌配合物，其能够以极高的活性抑制拓扑异构酶，并有效抑制肿瘤细胞生长。

本发明的第二个目的是提供所述双核茂型钌配合物的制备方法。

本发明的第三个目的是提供所述双核茂型钌配合物在高亲和力结合DNA中的应用。

本发明的第四个目的是提供所述双核茂型钌配合物在抑制拓扑异构酶活性的应用。

本发明的第五个目的是提供所述双核茂型钌配合物在抗肿瘤活性中的应用。

本发明的上述目的通过如下技术方案予以实现：

一种双核茂型钌配合物，由阳离子和阴离子组成，所述阳离子结构式如式I，所示：

式Ⅰ

本发明所述双核茂型钌配合物并不限定阴离子的种类，本领域常规阴离子均能实现本发明目的，尤其是无机盐阴离子，如PF₆ ^－，ClO₄ ^－、Cl^－等，作为一种最优选方案，本发明所述双核茂型钌配合物的阴离子为PF₆ ^－。

上述双核茂型钌配合物的制备方法，包括以下步骤：

S1. 将邻菲咯啉-5,6-二酮，乙酸铵分别和对苯二甲醛或间苯二甲醛溶于丙酸中，加热回流，冷至室温后抽滤，水洗数次后真空干燥，粗产物用丙酸重结晶，即得式II所示配体1,4-bis(1H-imidazo[4,5-f][1,10]phenanthrolin-2-yl)benzene (p-H₂bpib)、1,3-bis(1H-imidazo[4,5-f][1,10]phenanthrolin-2-yl)benzene (m-H₂bpib)。

式II

S2. 将邻菲咯啉-5,6-二酮和3,3'-二氨基联苯胺溶于丙酸中，加热回流，冷至室温后抽滤，水洗数次后真空干燥，即得式II所示配体11,11'-bidipyrido[3,2-a:2', 3'-c]phenazine (bidppz)。

S3. 前体配合物[(η ⁶-Ben)RuCl₂]₂或[(η ⁶-Cym)RuCl₂]₂分别与配体p-H₂bpib、m-H₂bpib或bidppz溶于甲醇中，加热回流，冷至室温后加入NH₄PF₆饱和水溶液析出沉淀，抽滤，固体用乙醚洗涤，真空干燥，即得到所述6个双核茂型钌配合物（式I）。

优选地，上述步骤所述加热回流反应的条件分别是配体的合成为在140℃下，回流3小时；配合物的合成为60℃，回流4小时。

优选地，所述前体配合物与配体反应摩尔比为1:1。

优选地，所述NH₄PF₆与前体配合物的摩尔比为2:1。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种新型的具有稳定结构和良好光谱性质的双核茂型钌配合物，该配合物能够以双功能方式与DNA发生高亲和力的相互作用，进而显著抑制拓扑异构酶的活性和肿瘤细胞生长，是新型的高活性拓扑异构酶抑制剂和潜在的抗肿瘤药物。

本发明合成的双核茂型钌配合物在拓扑异构酶抑制剂和抗肿瘤药物中的应用，具有以下优势：（1）具有良好的水溶性和稳定性；（2）具有良好的光谱性质，能够对DNA进行光谱响应；（3）与传统的芳基钌配合物相比，具有更强的拓扑异构酶抑制能力。

附图说明

图1为配体p-H₂bpib、m-H₂bpib和bidppz的合成途径；

图2为本发明所制备的双核茂型钌配合物Ru1、Ru3和Ru5的合成途径；

图3为本发明所制备的双核茂型钌配合物Ru2、Ru4和Ru6的合成途径；

图4为双核茂型钌配合物水解动力反应的电子吸收光谱图；

图5为双核茂型钌配合物与DNA作用的紫外可见光谱滴定图及其拟合曲线；

图6为双核茂型钌配合物与DNA作用粘度实验图；

图7为双核茂型钌配合物抑制拓扑异构酶活性实验的电泳图；

图8为双核茂型钌配合物与22Rv1细胞作用流式细胞术图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明。实施例仅用以解释本发明，而不用于对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备，所用试剂和材料均为市购。

实施例1 双核茂型钌配合物的制备

1、配体p-H₂bpib、m-H₂bpib、bidppz的制备：

配体的制备如图1所示。

a. 1,4-bis(1H-imidazo[4,5-f][1,10]phenanthrolin-2-yl)benzene (p-H₂bpib)的合成：将邻菲咯啉-5,6-二酮（0.63 g，3 mmol），乙酸铵（4.62 g，60 mmol）和对苯二甲醛（0.201 g，1.5 mmol）溶于50 mL丙酸中，加热至140^oC，回流2小时，溶液呈橙黄色透明状，冷至室温后，抽滤，水洗数次后真空干燥，粗产物用丙酸重结晶，得黄色晶体，0.316g，产率41%。

b. 1,3-bis(1H-imidazo[4,5-f][1,10]phenanthrolin-2-yl)benzene (m-H₂bpib)的合成：将邻菲咯啉-5,6-二酮（0.63 g，3 mmol），乙酸铵（4.62 g，60 mmol）和间苯二甲醛（0.201 g，1.5 mmo）溶于50 mL丙酸中，加热至140^oC，回流2小时，溶液呈橙黄色透明状，冷至室温后，抽滤，水洗数次后真空干燥，粗产物用丙酸重结晶，得黄色晶体，0.284 g，产率37%。

c. 11,11'-bidipyrido[3,2-a:2',3'-c]phenazine (bidppz)的合成：将邻菲咯啉-5,6-二酮（0.168 g，0.8 mmol）和3,3'-二氨基联苯胺(0.0857 g，0.4 mmol)溶于10 mL丙酸中，加热至140^oC，回流2 h，溶液呈橙黄色透明状，冷至室温后，抽滤，水洗数次后真空干燥，得黄绿色晶体，0.169 g，产率：75%。

2、配合物[(η ⁶-Ben)₂Ru₂Cl₂(p-H₂bpib)](PF₆)₂（Ru1）的制备：

按照图2所示的途径合成。将[(η ⁶-Ben)RuCl₂]₂（0.05 g，0.1mmol）和配体p-H₂bpib（0.051 g，0.1 mmol）溶于10ml甲醇中，加热回流4小时，冷却至室温，加入0.2 mmol NH₄PF₆的饱和水溶液，抽滤，固体用乙醚洗涤，真空干燥，得到黄绿色固体0.113 g，产率92%。¹H-NMR(ppm, DMSO-d ⁶): δ 10.12 (t, J = 5.8 Hz, 4H), 9.71 (dd, J = 18.1, 7.6 Hz,4H), 9.09 (s, 4H), 8.35 (dd, J = 16.6, 8.3 Hz, 4H), 6.38 (d, J = 1.6 Hz,12H)。

3、配合物[(η ⁶-Cym)₂Ru₂Cl₂(p-H₂bpib)](PF₆)₂（Ru2）的制备：

按照图3所示的途径合成。将[(η ⁶-Cym)RuCl₂]₂（0.061 g,0.1 mmol）和配体p-H₂bpib（0.051 g，0.1 mmol）溶于10ml甲醇中，加热回流4小时，冷却至室温，加入0.2 mmolNH₄PF₆的饱和水溶液，抽滤，固体用乙醚洗涤，真空干燥，得到黄绿色固体0.112 g，产率83%。¹H-NMR(ppm, DMSO-d ⁶): δ 9.87 (d, J = 4.5 Hz, 4H), 9.30 – 9.21 (m, 4H), 8.56(s, 4H), 8.23 (d, J = 21.3 Hz, 4H), 6.34 (d, J = 6.3 Hz, 4H), 6.11 (d, J =6.2 Hz, 4H), 2.68 – 2.58 (m, 2H), 2.21 (s, 6H), 0.92 (d, J = 6.9 Hz, 12H)。

4、配合物[(η ⁶-Ben)₂Ru₂Cl₂(m-H₂bpib)](PF₆)₂（Ru3）的制备：

按照图2所示的途径合成。制备步骤同配合物Ru1，不同点在于将其中的配体p-H₂bpib替代为配体m-H₂bpib（0.0514 g，0.1 mmol），其余步骤及操作不变，产量0.107g，产率87%。¹H-NMR(ppm, DMSO-d ⁶):δ 9.96 (d, J = 5.2 Hz, 4H), 9.30 (s, 4H), 8.48 (d, J= 7.8 Hz, 2H), 8.23 (s, 5H), 7.93 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 6.32 (s, 12H)。

5、配合物[(η ⁶-Cym)₂Ru₂Cl₂(m-H₂bpib)](PF₆)₂（Ru4）的制备：

按照图3所示的途径合成。制备步骤同配合物Ru2，不同点在于将其中的配体p-H₂bpib替代为配体m-H₂bpib(0.0514 g，0.1mmol)，其余步骤及操作不变，产量0.118 g，产率88%。¹H-NMR(ppm, DMSO-d ₆): δ 9.88 (d, J = 4.8 Hz, 4H), 9.35 (d, J = 8.0 Hz,2H), 9.27 (d, J = 12.1 Hz, 2H), 8.51 – 8.46 (m, 2H), 8.22 (dd, J = 14.2, 9.0Hz, 5H), 7.94 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 6.35 (d, J = 6.4 Hz, 4H), 6.12 (d, J = 6.4Hz, 4H), 2.63 (dt, J = 13.7, 6.7 Hz, 2H), 2.21 (s, 6H), 0.92 (d, J = 6.9 Hz,12H)。

6、配合物[(η ⁶-Ben)₂Ru₂Cl₂(bidppz)](PF₆)₂（Ru5）的制备：

按照图2所示的途径合成。制备步骤同配合物Ru1，不同点在于将其中的配体p-H₂bpib替代为配体bidppz（0.057 g，0.1 mmol），其余步骤及操作不变，产量0.072 g，产率56%。¹H-NMR(ppm, DMSO-d ₆): δ 10.17 (t, J = 5.6 Hz, 4H), 9.80 (d, J = 8.1 Hz,4H), 9.16 (s, 2H), 8.93 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 8.72 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 8.42 –8.35 (m, 4H), 6.41 (s, 12H)。

7、配合物[(η ⁶-Cym)₂Ru₂Cl₂(bidppz)](PF₆)₂（Ru6）的制备：

按照图3所示的途径合成。制备步骤同配合物Ru2，不同点在于将其中的配体p-H₂bpib替代为配体bidppz（0.057 g，0.1 mmol），其余步骤及操作不变，产量0.098 g，产率70%。¹H-NMR(ppm, DMSO-d ₆): δ 10.02 (t, J = 5.2 Hz, 4H), 9.73 (dd, J = 11.9, 8.2Hz, 4H), 9.11 (s, 2H), 8.89 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 8.65 (dd, J = 9.0, 5.6 Hz,2H), 8.39 – 8.28 (m, 4H), 6.40 (d, J = 6.3 Hz, 4H), 6.17 (d, J = 6.2 Hz, 4H),2.76 – 2.66 (m, 2H), 2.22 (s, 6H), 1.01 (d, J = 6.9 Hz, 12H)。

实施例2 双核茂型钌配合物水解动力学研究

对于茂型钌配合物来说，能够接受π电子的螯合配体能够降低Ru中心的电子密度，从而能使Ru与Cl^－的结合更加紧密，降低了Cl^－的水解活性，表现为水解速率减慢和半衰期增长。采用紫外可见吸收光谱来对双核茂型钌配合物进行水解动力学研究。将配合物溶于少量无水甲醇，再用纯水配成一定浓度的水溶液，在310 K下每隔5 min记录一次配合物的紫外可见吸收光谱（图4）。各个配合物的吸光度和时间数据符合一级速率方程A=C₀+C₁e^-kt（C₀和C₁都是常数，而k是水解速率常数，A则是随时间t变化的吸光度）。据上式可求得配合物的水解速率常数和半衰期数据（表1）。由图4和表1可以看出，配合物吸光度随时间变化明显，都出现了较为明显的减色或红移现象，说明了配合物结构中的配位Cl^－离子能够以较快的速率水解。

表1：配合物的水解速率常数和半衰期数据。

配合物	<i>k</i> (min<sup>-1</sup>)	<i>t</i><sub>1/2</sub> (min)
			Ru1	0.0454	15.3
Ru2	0.0113	61.3
			Ru3	0.0213	32.5
Ru4	0.0337	20.6
			Ru5	0.1200	5.8
Ru6	0.0236	29.4

实施例3 双核茂型钌配合物与DNA相互作用的紫外可见光谱滴定

溶液的配置均采用称量法。溶剂为二次蒸馏水，缓冲体系为Tris-NaCl，pH 7.0。双核茂型钌配合物的浓度为20 μM，DNA浓度范围约为5×10^-6～5×10^-5 mol/L，向固定浓度的双核茂型钌配合物的溶液中逐渐增加DNA的浓度，分别记录配合物本身和不同DNA浓度下的紫外可见光谱。如图5及表2所示，可以看出在350 nm~450 nm处，双核茂型钌配合物的光谱均随DNA的逐渐加入出现了明显的减色效应和一定的红移现象，并且它们都具有较大的结合常数，可以推测配合物与DNA之间存在较强的相互作用，插入结合的可能性比较大。

表2：茂型钌配合物与DNA作用的实验数据。

配合物	减色率(%)	红移(nm)	结合常数<i>K</i>(M<sup>-1</sup>)
				Ru1	24.9	4	（5.34±1.21）×10<sup>5</sup>
Ru2	51.9	0	（8.89±2.73）×10<sup>5</sup>
				Ru3	--	--	（7.14±2.44）×10<sup>5</sup>
Ru4	--	--	（2.39±0.95）×10<sup>5</sup>
				Ru5	3.7	0.5	（5.27±3.04）×10<sup>5</sup>
Ru6	26.7	3	（1.84±0.54）×10<sup>6</sup>

实施例4 双核茂型钌配合物与DNA作用的粘度实验

采用乌氏粘度计测量DNA与配合物溶液的粘度。测量粘度时，温度恒定在(28±0.1)°C。配合物溶液用缓冲溶液Tris-NaCl，pH 7.0配制。其中DNA浓度固定为100 μM，配合物浓度依次为 0、20、40、60、80μM。相对粘度按下式计算：η= ( t - t ₀ )/ t ₀，其中t ₀为缓冲液流经毛细管所需的时间，t为DNA溶液（含不同浓度的配合物）流经毛细管所需的时间。η是DNA-配合物体系溶液的相对粘度，η ₀为未加配合物时DNA溶液的相对粘度。以(η/η ₀ ) ^1/3对[Complex]/[DNA]作图，得到配合物对DNA粘度变化的影响（图6）。随着配合物浓度的增加，CT-DNA的粘度明显增大，说明配合物与DNA作用是通过插入方式结合。

实施例5 双核茂型钌配合物对拓扑异构酶活性的抑制实验

采用凝胶电泳法测试双核茂型钌配合物对拓扑异构酶活性的抑制实验。在0.2 mL的PCR管中，配置一系列20 μL溶液，其中包含10 mM Tris- HCl(pH 7.9)，5 mM MgCl₂，50mM KCl，50 mM NaCl，15 μg /mL BSA，0.1 mM Na₂EDTA，1.0 mM ATP，0.25 μg pBR322 DNA，2U TopoII和0～5×10^-5 mol/L钌配合物。该反应混合液在30°C孵育15分钟，加入4 μL上样缓冲液（45% 甘油、4.5% SDS和0.25% 溴酚蓝）终止反应。在1% 琼脂糖凝胶电泳1.5小时（80V），胶洗涤后用溴化乙锭（1μg /mL）溶液染色，用凝胶成像系统拍照成像分析（图7）。在不同浓度的配合物存在下，拓扑异构酶使负超螺旋的pBR322质粒DNA发生双螺旋松弛的能力明显下降。将抑制半数拓扑异构酶活性的配合物浓度记为半数作用浓度（IC₅₀），列于表3。与经典的拓扑异构酶抑制剂（Novobiocin IC₅₀ =32 μM，Etoposide IC₅₀=35 μM，Hoechst 33258IC₅₀ =35 μM，Topostatin IC₅₀ =4 μM）相比，本发明的双核茂型钌配合物对拓扑异构酶都具有更高的抑制活性（IC₅₀均不超过2.0 μM）。

表3：双核茂型钌配合物抑制拓扑异构酶的IC₅₀（μM）。

配合物	IC<sub>50</sub>	配合物	IC<sub>50</sub>
				Ru1	0.5	Ru2	2.0
Ru3	0.1	Ru4	0.5
				Ru5	0.5	Ru6	1.0

实施例6 双核茂型钌配合物对肿瘤细胞生长的抑制作用

利用CCK-8试剂盒，分别测试不同浓度的双核茂型钌配合物对人乳腺癌细胞MCF-7、人前列腺癌细胞22Rv1和人肺癌细胞A549三种不同肿瘤细胞生长的抑制作用，拟合出IC₅₀。如表4所示，本发明合成的六种茂型钌配合物对三种肿瘤细胞都表现出较好的抑制能力，是很具潜力的潜在抗肿瘤化合物。

表4：双核茂型钌配合物抑制三种肿瘤细胞的IC₅₀（μM）。

配合物	MCF-7	22Rv1	A549
				Ru1	2.14±0.24	1.14±0.12	12.16±1.72
Ru2	1.48±0.09	2.99±0.33	2.99±0.12
				Ru3	2.60±0.18	1.94±0.13	11.79±0.10
Ru4	3.51±0.24	5.42±0.11	3.94±0.08
				Ru5	3.67±0.10	2.58±0.19	13.06±1.60
Ru6	1.49±0.39	3.40±0.18	2.65±0.18

实施例7 双核茂型钌配合物与肿瘤细胞的流式细胞分析

采用Annexin V FITC/PI染色和流式细胞术分析研究茂型钌配合物的抗肿瘤活性。将人细胞以每孔2×10⁵个细胞的密度接种在六孔板中，并在37℃，含5％CO₂的湿润培养箱中保持过夜。用40 μM不同浓度的双核茂型钌配合物分别处理细胞72小时，收集细胞，用Annexin V-FITC/PI染色之后使用BD FACSCalibur流式细胞仪进行凋亡测定。如图8所示，本发明合成的六种茂型钌配合物都能同时有效诱导人前列腺癌细胞22Rv1的早期凋亡和晚期凋亡，其中Ru2诱导22Rv1晚期凋亡的能力强于顺铂。

Claims

1.一种双核茂型钌配位化合物，该类化合物由阳离子和阴离子两部分组成其特征在于，所述阳离子为[((η⁶-arene)RuCl))₂L]²⁺，其结构式如式Ⅰ所示：

所述阴离子为无机盐离子。

2.根据权利要求1所述的双核茂型钌配位化合物，其特征在于，所述无机盐离子为PF₆ ^－，ClO₄ ^－或Cl^－。

3.根据权利要求1所述的双核茂型钌配位化合物的制备方法，制备步骤如下：

S1.将邻菲咯啉-5,6-二酮，乙酸铵分别和对苯二甲醛，间苯二甲醛溶于丙酸中，加热回流，冷至室温，抽滤，水洗数次真空干燥，粗产物用丙酸重结晶，析出晶体，即得配体1,4-bis(1H-imidazo[4,5-f][1,10]phenanthrolin-2-yl)benzene(p-H₂bpib)和1，3-bis(1H-imidazo[4,5-f][1,10]phenanthrolin-2-yl)benzene(m-H₂bpib)，如式II所示：

S2.将邻菲咯啉-5,6-二酮和3,3'-二氨基联苯胺溶于丙酸中，加热回流，冷至室温后，抽滤，水洗数次真空干燥，即得配体bidppz，如式II所示；

S3.前体配合物[(η⁶-Ben)RuCl₂]₂或[(η⁶-Cym)RuCl₂]₂分别与配体p-H₂bpib、m-H₂bpib或bidppz溶于甲醇中，加热回流，冷却至室温，加入NH₄PF₆的饱和水溶液，抽滤，固体用乙醚洗涤，真空干燥，即得到所述目标双核茂型钌配合物。