CN109705158B - 一种独立双中心Ag配合物及其制备方法和抗癌活性评价 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及金属配合物领域，具体涉及一种独立双中心Ag配合物及其制备方法和应用。所述的独立双中心Ag配合物的分子式为[PPh3Ag(L1)]·[PPh3Ag(L1)]，其中L1为5‑氟尿嘧啶‑1‑基乙酸，PPh3为三苯基膦；该配合物能够通过静电作用与DNA结合，具有良好的抗癌活性，在肿瘤疾病的临床治疗方面具有巨大的开发潜能和应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及金属配合物领域，具体涉及一种独立双中心Ag配合物及其制备方法和应用。
背景技术
癌症是最具挑战性的疾病之一，导致的全球死亡人数正在增加。癌症患者的治疗方法主要有手术治疗、化学药物治疗、放射治疗和生物免疫治疗，其中化疗是一种重要的癌症治疗方法。
在化疗领域，5-氟尿嘧啶(5-Fu)是主要的抗癌药物，对多种癌症特别是胃肠道肿瘤具有抑制作用，但是在临床应用上具有较为严重的副作用；另外金属配合物通过影响电子传递、金属离子中心对DNA复制的抑制、蛋白质和酶作用的扰动以及细胞内氧化还原平衡、活性氧(ROS)的产生和细胞膜的改变，从而体现出比游离配体更高的抗肿瘤活性；其中顺铂是一种仍被用于癌症治疗的化合物，其虽然有一些良好的疗效，但其功能仅局限于部分肿瘤，在临床应用中具有一定的毒性和耐药性。许多研究者将注意力集中在铸造金属(Au、Cu、Ag)上，因为这些金属的配合物具有广泛的抗癌活性，对非癌细胞的毒性较小。
因此，为了提高抗肿瘤药物的活性，同时降低对对正常细胞的毒性，开发新型抗癌化合物具有重要意义。
发明内容
针对现有技术中存在不足，本发明所提供的技术方案是：
一种独立双中心Ag配合物，其特征在于，所述独立双中心Ag配合物的分子式为：
[PPh3Ag(L1)]·[PPh3Ag(L1)]
其中：
L1为5-氟尿嘧啶-1-基乙酸；PPh3为三苯基膦。
所述独立双中心Ag配合物的晶胞参数为：
α＝75.622(4)°，β＝79.104(4)°，γ＝62.666(3)°。
本发明还包括一种独立双中心Ag配合物的制备方法，具体包括以下步骤：
将5-氟尿嘧啶溶于氢氧化钠水溶液中，升温至35-45℃，缓慢滴加溴乙酸并搅拌反应10-12h，获得第一反应产物，将所述第一反应产物经pH调节、除杂、冷却结晶干燥获得5-氟尿嘧啶-1-基乙酸；
在超声条件下，将四氟硼酸银加入到三苯基膦溶液中，并加入三乙胺，获得白色的浑浊溶液；
在超声条件下，将5-氟尿嘧啶-1-基乙酸加入至所述白色浑浊溶液并密封，在温度为50-100℃条件下反应10-12h，获得第二反应产物；
将所述第二反应产物冷却至室温后过滤，获得无色透明溶液，经缓慢挥发后获得无色透明晶体，即为独立双中心Ag配合物。
所述5-氟尿嘧啶与溴乙酸的质量比为1：1.2-1.8。
所述将所述第一反应产物经冷却、pH调节、除杂、冷却结晶干燥获得5-氟尿嘧啶-1-基乙酸的方法具体包括以下步骤：
将所述第一反应产物冷却至室温，用浓盐酸调节pH至5-6，置于温度为2-4℃条件下静置2-3h，并滤除沉淀物，获得第一澄清溶液；
在所述第一澄清溶液中加入浓盐酸，调节pH值为1.5-2.5，置于温度为-8—4℃条件下静置5.5-6.5h，获得沉淀物；
将所述沉淀物用水洗涤3-5次后干燥获得化合物5-氟尿嘧啶-1-基乙酸。
所述四氟硼酸银、三苯基膦和5-氟尿嘧啶-1-基乙酸的质量比为1：0.8-1.6：1-2。
所述三苯基膦溶液为三苯基膦的乙腈溶液。
本发明还包括一种药物组合物，其包上述所述的独立双中心Ag配合物；所述的独立双中心Ag配合物和独立双中心Ag配合物经近红外光照射后在制备治疗癌症的药物中的应用。
有益效果：
本发明获得的独立双中心Ag配合物结构新颖，能够与CT-DNA通过静电作用结合，可以用于治疗肿瘤，且对人类癌细胞系的增殖抑制活性具有良好的活性。本发明独立双中心Ag配合物的制备方法操作简单，获得配合物的产率高，纯度高。
附图说明
图1为独立双中心Ag配合物在三斜晶系空间群中的结构图；
图2为pH为6.2时独立双中心Ag配合物溶液与CT-DNA的紫外吸收图谱；
图3为pH为7.2时独立双中心Ag配合物溶液与CT-DNA的紫外吸收图谱；
图4为pH为8.2时独立双中心Ag配合物溶液与CT-DNA的紫外吸收图谱；
图5为独立双中心Ag配合物在缓冲中EthBr与CT-DNA结合的发射荧光光谱；
图6为NIR+独立双中心Ag配合物、独立双中心Ag配合物和5-氟尿嘧啶加入到HCT116细胞系中时的细胞存活率；
图7为NIR+独立双中心Ag配合物、独立双中心Ag配合物和5-氟尿嘧啶加入到MB-231细胞系中时的细胞存活率。
具体实施方式
为了更加清楚阐述本发明的技术内容，在此结合具体实施例予以详细说明，显然，所列举的实施例只是本技术方案的优选实施方案，本领域的技术人员可以根据所公开的技术内容显而易见地得出的其他技术方案仍属于本发明的保护范围。
实施例1
5-氟尿嘧啶-1-基乙酸的合成
将31.2g5-氟尿嘧啶溶于51.28g氢氧化钠固体的160mL水溶液中；升温至40℃，缓慢滴加50g溴乙酸溶液80mL，滴加用时120min，并搅拌反应12h，获得第一反应产物；
将第一反应产物冷却至室温，用浓盐酸调节pH至5.5，置于温度为3℃条件下静置2h；若有沉淀析出，滤除沉淀物，获得第一澄清溶液；
在第一澄清溶液加浓盐酸将溶液pH值调至2，置于温度为-5℃条件下静置6h。过滤，沉淀物用冷水洗涤3次，获得化合物5-氟尿嘧啶-1-基乙酸。
实施例2
独立双中心Ag配合物的制备
在超声条件下，将0.05g四氟硼酸银溶解在已经溶有0.05g三苯基膦的5mL乙腈溶液中，接着再加入50μL三乙胺溶液，得到白色浑浊溶液；
在超声条件下，将实施例获得的5-氟尿嘧啶-1-基乙酸0.06g加入白色浑浊溶液并密封，在高于70℃的条件下反应12h，获得第二反应产物；
将所述第二反应产物冷却至室温后过滤，获得无色透明溶液，经缓慢挥发后获得无色透明晶体，即为独立双中心Ag配合物。
对比例1
将四氟硼酸银的加入量改为0.10g，其他试剂和条件均与实施例2完全相同，无配合物生成。
对比例2
将三苯基膦的加入量改为0.10g，其他试剂和条件均与实施例2完全相同，无配合物生成。
对比例3
将乙腈替换成乙腈：甲醇＝1：1，其他试剂和条件均与实施例2完全相同，无配合物生成。
对比例4
省略三乙胺溶液，其他试剂和条件均与实施例2完全相同，无配合物生成。
5-氟尿嘧啶-1-基乙酸和独立双中心Ag配合物的结构表征
对实施例1获得的5-氟尿嘧啶-1-基乙酸和实施例2获得的独立双中心Ag配合物进行称量，计算其产率；利用熔点仪测定二者的熔点；在EURO EA 3000元素分析仪上进行元素分析；并以四甲基硅烷(TMS)为内标，DMSO-d6为溶剂，在AVANCEⅢAV 500光谱仪上记录二者1H、13C、31P核磁共振(NMR)谱；在Nicolet IS10分光光度计上记录5-氟尿嘧啶-1-基乙酸红外光谱。获得的结果如下：
5-氟尿嘧啶-1-基乙酸产率为89％，熔点为241℃，其他结构参数为：
Anal.Calc.for C6H5N2FO4(％):C,38.45；H,2.48；N,13.85.Found(％):C,38.31；H,2.68；N,14.89；
1H NMR(500MHz,DMSO):δ/ppm,4.36(2H,s),8.07(1H,d,J＝8.5Hz),11.91(1H,d,J＝8.5Hz),13.22(1H,s)；
13C NMR(126MHz,DMSO)：δ130.70,139.52,149.85,157.65,169.45；
IR:3272.34，3414.80，1699.31，1377.31，1242.58cm-1。
独立双中心Ag配合物产率为85.23％，熔点为171.1℃-173.7℃，其他结构参数为：
Anal.Calc.for C102H83O4N4F2P5Ag2(％):C,64.38；H,4.37；N,2.95.Found(％):C,64.45；H,4.32；N,2.95；
1H NMR(500MHz,DMSO)δ7.46(t,J＝7.1Hz,15H),7.40–7.29(m,60H),4.10(s,4H)；
13C NMR(126MHz,DMSO)δ133.45(d,J＝16.7Hz),132.05(s),131.85(s),130.45(s),128.98(d,J＝9.5Hz)；
31P NMR(202MHz,DMSO)δ7.89(s).IR:1763,1377.95,1057,444.05,428.14,408.85cm-1。
在独立双中心Ag配合物的FT-IR光谱中可以观察到配体PPh3和L1的特征吸收带，配合物中羟基(3414cm-1)作为o-给体的配位键，除了与羧基有关的OH(3414cm-1)的吸收带发生了一定程度的转移外，还发生了一定程度的转移。
对实施例2获得的独立双中心Ag配合物类单晶、取向矩阵和细胞尺寸进行X射线晶体学测定，并进行洛伦兹偏振和吸收校正。通过SADABS程序获得了经验吸收校正。大多数非氢原子是用直接法测定的，其余的则用傅立叶合成法测定。利用SHELXS-97、SHELXL-97和SHELXTL程序包，对所有非氢原子进行各向异性细化，所有氢原子保持静止，进入基于F2的全矩阵最小二乘细化的最后阶段。衍射实验的结构数据和描述如表1所示。
表1独立双中心Ag配合物的衍射实验的结构数据
由单晶X衍射可获得独立双中心Ag配合物在三斜晶系空间群中的结构如图1所示。单晶X射线分析显示，AgOP3和AgO2P2是两种配位环境不同的Ag(I)离子。Ag1由羧基的1个O原子和PPh3分子的3个P原子进行配位，Ag2的配位包括两个属于羧基的O原子和两个PPh3分子的P原子，形成4个配位独立双中心配合物。
独立双中心Ag配合物的性能测试
1、独立双中心Ag配合物与DNA的相互作用
电子吸收光谱分析
用固定浓度的独立双中心Ag配合物溶液与变量的CT-DNA(小牛胸腺DNA)浓度(0–0.045mg·mL-1)在KH2PO4/NaOH(at pH＝6.2,7.2,and 8.2)的缓冲溶液中进行紫外可见吸收实验，每次加入CT-DNA溶液后在UV-6100双光束分光光度计上记录紫外可见吸收光谱。测试结果详见附图1-3，其中附图2-4分别为pH为6.2、7.2、8.2的紫外吸收图谱。
由图2-4可知随着CT-DNA浓度的增加而得到的配合物的吸收光谱，配合物的吸收带在摩尔吸收率上呈现高色度，说明配合物的金属离子与DNA的磷酸基之间的静电相互作用，图3中的Kb值高于图2和图4，说明配合物在中性环境中对DNA的相互作用能力强于酸性和碱性环境。
荧光光谱分析
溴化乙锭，3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基溴化乙锭(EtBr)与DNA结合时具有高荧光性，用F-2700FL分光光度计进行荧光测量，在缓冲液KH2PO4/NaOH(pH＝7.2)中，独立双中心Ag配合物在浓度范围0-0.1mM之间时，EtBr(0.05mM)与CT-DNA(0.12mg·mL-1)结合，进行发射光谱分析，具体结果详见图5。
如图5所示，随着配合物浓度的增加，EtBr-DNA系统中发射带的强度降低，说明EtBr在DNA结合位点被配合物取代。
由电子吸收光谱分析、荧光光谱分析可知，该配合物能够与DNA通过静电作用相互，从而阻止DNA的合成。
2、体外抗肿瘤活性试验
将实施例2获得的独立双中心Ag配合物与在近红外光照射获得NIR+独立双中心Ag配合物加入到细胞培养体系中，采用细胞计数kit-8(CCK-8)检测HCT 116(人结直肠癌细胞)和MDA-MB-231(MD Anderson-Metastatic Breast细胞)的存活率。
癌细胞HCT 116、MDA-MB-231在细胞密度为10000细胞/孔的96孔板中播种，并在5％CO2/95％空气的37℃加湿型培养箱中培养。24h后,独立双中心Ag配合物和NIR+独立双中心Ag配合物(处理参数为：近红外光波长808nm的激光,0.2W/cm2，时间1h)被稀释到0.5，1，2，4，6μM,分别添加到孔板中。作为对照组，稀释浓度相同的5-氟尿嘧啶加入到其他孔板中。培养24小时后处理,每口孔的培养基用新鲜培养基代替(200μL with 10μL CCK-8reagent)，2h后，在450nm处测量每口孔的吸光度(A)。
上述检测结果以细胞增殖抑制率表示，相对细胞存活率计算公式如下式：
细胞活性(％)＝(Atreatment-Ablank)/(Acontrol-Ablank)×100％
其中Ablank表示不加CCK-8试剂的孔的吸光度，Acontrol表示不加任何药物的盐缓冲液的孔的吸光度，Atreatment表示加入CCK-8试剂和药物的孔的吸光度。
不同浓度的独立双中心Ag配合物和NIR+独立双中心Ag配合物在不同浓度下的癌细胞抑制活性如图6、7，二者在不同浓度下均表现出良好的抑制活性，随着浓度的增加，化合物活性增强，且独立双中心Ag配合物和NIR+独立双中心Ag配合物的活性存在一定的差异。
由IBM SPSS统计软件基于CCK-8结果进行计算各化合物的半存活抑制浓度IC50s，如表2所示。
根据表2的IC50s可知，化合物的抗癌活性比较为:NIR+独立双中心Ag配合物＞独立双中心Ag配合物＞5-氟尿嘧啶，结果表明，银配合物对抗癌活性有显著影响。
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。
Claims (4)
1.一种独立双中心Ag配合物，其特征在于，所述独立双中心Ag配合物的分子式为：
[PPh3Ag(L1)]·[PPh3Ag(L1)]
其中：
L1为5-氟尿嘧啶-1-基乙酸；
PPh3为三苯基膦；
所述独立双中心Ag配合物的晶胞参数为：
α＝75.622(4)°，β＝79.104(4)°，γ＝62.666(3)°；
所述独立双中心Ag配合物的制备方法具体包括以下步骤：
将31.2g的5-氟尿嘧啶溶于51.28g氢氧化钠固体的160mL水溶液中；升温至40℃，缓慢滴加50g溴乙酸溶液80mL，滴加用时120min，并搅拌反应12h，获得第一反应产物；
将第一反应产物冷却至室温，用浓盐酸调节pH至5.5，置于温度为3℃条件下静置2h；若有沉淀析出，滤除沉淀物，获得第一澄清溶液；
在第一澄清溶液加浓盐酸将溶液pH值调至2，置于温度为-5℃条件下静置6h，过滤，沉淀物用冷水洗涤3次，获得化合物5-氟尿嘧啶-1-基乙酸；
在超声条件下，将0.05g四氟硼酸银溶解在已经溶有0.05g三苯基膦的5mL乙腈溶液中，接着再加入50μL三乙胺溶液，得到白色浑浊溶液；
在超声条件下，将所述5-氟尿嘧啶-1-基乙酸加入白色浑浊溶液并密封，在高于70℃的条件下反应12h，获得第二反应产物；
将所述第二反应产物冷却至室温后过滤，获得无色透明溶液，经缓慢挥发后获得无色透明晶体，即为独立双中心Ag配合物。
2.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的独立双中心Ag配合物。
3.权利要求1所述的独立双中心Ag配合物在制备用于抑制HCT 116细胞与MDA-MB-231细胞的药物中的应用。
4.权利要求1所述的独立双中心Ag配合物经近红外光照射后在制备用于抑制HCT 116细胞与MDA-MB-231细胞的药物中的应用。
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