CN101555253A - 诱导dna缩合的钌多吡啶配合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了诱导DNA缩合的钌多吡啶配合物及其制备方法与应用,所述配合物是由钌与辅助配体和主配体配合而成,所述辅助配体为2,2-联吡啶,所述主配体为1,2-二(咪唑并[4,5-f][1,10-邻菲咯啉])苯或1,2-二(咪唑并[4,5-f][1,10-邻菲咯啉])萘;所述配合物中的阴离子部分为高氯酸根离子;所述制备方法是将钌和辅助配体的配合物二(2,2′-联吡啶)-二氯-二水合钌(II)和主配体化合物溶解于乙二醇,加热反应,冷却后加水稀释,再NaClO4饱和溶液即产生沉淀,过滤后沉淀依次用水、乙醚洗涤后干燥,即得。本发明还提供所述配合物在基因药物载体制备中的应用。本发明的钌多吡啶配合物具有高稳定性、低毒性、光物理性质丰富、容易吸收并在体内很快排泄等特点,应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明涉及诱导DNA缩合的钌多吡啶配合物及其制备方法和应用。
背景技术
DNA分子从伸展态到紧缩态的构象转变称为DNA缩合。在病毒和真核细胞的细胞核内,高度缩合且高度有序排列的DNA结构保持了基因组的稳定性,使复制得以顺利完成。细胞中聚胺(polyamine)通过静电相互作用与DNA结合,促使了这种紧密堆积状态的形成。DNA缩合不仅是自然界常见的生理现象,也是介导基因转染的关键步骤。病毒基因载体虽然是较有效的DNA传递工具,传递效率一般在90%以上,约有75%的基因治疗应用了病毒载体介导系统,但该系统存在局限性:即病毒性和免疫原性限制其广泛应用,其次,该系统的DNA装载量有限,载体组装难度大,花费高。和病毒载体相比,非病毒载体具有安全、有效、无免疫原性等优点。从上世纪60年代中期开始,由多价阳离子和聚阳离子诱发的DNA体外缩合就受到了广泛的关注。据报道,聚胺、阳离子脂质体、带正电的多肽、蛋白质、阳离子表面活性剂以及无机阳离子都可以引起DNA缩合。迄今为止,多数化合物主要是通过所带正电荷与DNA骨架上的负电荷之间的静电作用导致DNA缩合。近来研究发现,通过链接一些具有刚性平面结构的有机基团到载体,利用基团与DNA双螺旋结构的嵌插作用,可以有效地促进载体诱导DNA缩合的形成效率。但是已知的非病毒载体如聚胺、阳离子脂质体和阳离子表面活性剂具有不易被吸收及难排泄等缺点。
发明内容
本发明的目的是针对已有技术的不足,提供了高稳定性、低毒性、光物理性质丰富、容易吸收并在体内能很快排泄的钌多吡啶配合物。
本发明的另一目的是提供上述配合物的制备方法。
本发明还有一个目的是提供上述配合物的应用。
诱导DNA缩合的钌多吡啶配合物,是由钌与辅助配体和主配体配合而成,所述辅助配体为2,2-联吡啶(用英文表示为bpy),所述主配体为1,2-二(咪唑并[4,5-f][1,10-邻菲咯啉])苯(用英文表示为obpibH2)或1,2-二(咪唑并[4,5-f][1,10-邻菲咯啉])萘(用英文表示为obnibH2)。
本发明钌与bpy和obpibH2的配合物的阳离子部分的化学结构如式I所示:
本发明钌与bpy和obnibH2的配合物的阳离子部分的化学结构如式II所示:
本发明的配合物的阴离子部分优选为高氯酸根离子,也可以是不影响本发明配合物化学性质的其他阴离子。
本发明的钌多吡啶配合物是含咪唑和1,10-邻菲咯啉基团的多吡啶类衍生物配体的双核钌多吡啶配合物,和单核金属配合物相比,双核金属配合物具有更大的电荷数,构型和大小也更具可变性,可以进一步增强配合物对DNA的亲和力和诱导DNA缩合。
本发明还提供所述钌多吡啶配合物的制备方法,步骤如下:
将钌和辅助配体的配合物二(2,2′-联吡啶)-二氯-二水合钌(II)和主配体化合物溶解于乙二醇,加热反应,冷却后加水稀释,再NaClO4饱和溶液即产生沉淀,过滤后沉淀依次用水、乙醚洗涤后干燥,即得。
干燥后的粗产品可经氧化铝柱色谱分离提纯。
所述加热反应的优选温度为120~160℃,同时用氩气保护更有利于配合物的制备,反应时间8~12小时反应进行较为充分。
本发明的钌配合物能应用于新型基因药物载体的设计或制备领域中。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明的钌多吡啶配合物具有高稳定性、低毒性、光物理性质丰富、容易吸收并在体内很快排泄等特点,本发明提供的双核钌多吡啶配合物,通过静电结合和嵌插结合共同作用导致DNA缩合,并且在较强的盐离子浓度(如人体生理盐浓度:150mM NaCl)下依然能诱导DNA缩合,该类化合物目前在国内外还未见相关文献报道,为设计、制备非病毒基因载体提供了一种新的方法和途径。与现有技术中典型的无机阳离子[Co(NH3)6]3+相比,本发明的化合物诱导DNA缩合的能力大大增强([Co(NH3)6]3+诱导DNA缩合的浓度大约为1mM,本发明的化合物诱导DNA缩合的浓度大约为10μM)。
本发明的钌多吡啶配合物,合成简单,结构稳定,具有良好的光电性质和强的DNA的亲和力,可以诱导DNA缩合成纳米粒子。本申请书中的化合物属于首例能诱导DNA缩合的双核钌多吡啶配合物。与以往的经典的阳离子缩合剂相比,该新型DNA缩合试剂具有更强的缩合能力,及生理盐浓度下(150mM NaCl)该新型DNA缩合试剂缩合能力不受盐离子浓度效应影响。
附图说明
图1为配合物[(bpy)2Ru(obpibH2)Ru(bpy)2]4+诱导pBR322 DNA缩合的凝胶电泳实验图;
图2为配合物[(bpy)2Ru(obnibH2)Ru(bpy)2]4+诱导pBR322 DNA缩合的凝胶电泳实验图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。
实施例1
1.配体1,2-二(咪唑并[4,5-f][1,10-邻菲咯啉])苯(obpibH2)的制备:
将0.34g,2.0mM计量摩尔比的1,2-邻苯二甲酸(o-phthalic acid)和0.86g,4.1mM的1,10-菲咯啉-5,6-二胺(1,10-phenanthroline-5,6-diamine)混合溶解于多聚磷酸,在氩气保护条件下和200℃加热回流6小时。冷却到室温,用水稀释并加25%氨水中和,得深绿色沉淀,收集沉淀,真空干燥,产率62%。元素分析C32H18N8,实验值:C,74.54;H,3.27;N,22.24%;理论值:C,74.70;H,3.53;N,21.78。FAB-MS:m/z=516(M+1).
2.配体1,2-二(咪唑并[4,5-f][1,10-邻菲咯啉])萘(obnibH2)的制备:
方法如1,用0.43g,2.0mM的1,2-邻萘二甲酸与0.86g,4.1mM的1,10-菲咯啉-5,6-二胺反应,得绿色固体,产率52%。元素分析C36H20N8,实验值:C,76.82;H,3.27;N,19.62%。理论值:C,76.58;H,3.57;N,19.85。FAB-MS:m/z=566(M+1).
3.诱导DNA缩合的钌多吡啶配合物的制备:
(1)[(bpy)2Ru(obpibH2)Ru(bpy)2](ClO4)2的制备
钌和辅助配体的配合物二(2,2′-联吡啶)-二氯-二水合钌(II)(0.31g,0.58mM)和主配体obpibH2(0.15g,0.29mM)溶解于乙二醇,加热至120℃氩气保护下反应12小时后,得到暗红色清夜,冷却至室温,加水稀释后,加入NaClO4饱和溶液即产生大量红色沉淀,抽滤,用水,乙醚洗涤数次后干燥。将干燥后的粗产品经氧化铝柱色谱分离提纯,产率及元素分析如下:
[(bpy)2Ru(obpibH2)Ru(bpy)2](ClO4)2:产率70%。
元素分析C72H50N16Cl4O16Ru2,实验值:C,50.05;H,3.0;N,12.60%,计算值C,49.72;H,2.90;N,12.89,1H NMR(DMSO-d6):9.18(s,2H),9.02(d,4H),8.87(d,4H),8.83(d,4H),8.20(t,4H),8.08(t,4H),7.98(d,4H),7.85(d,4H),7.81(t,4H),7.61(d,4H),7.60(t,4H),7.52(t,2H),7.38(t,4H),ES-MS[CH3CN,m/z]:771.5([M-2ClO4]2+),480.7([M-3ClO4]3+),720.5([M-3ClO4-H]2+),447.7([M-4ClO4-H]3+),335.8([M-4ClO4]4+)。
(2)[(bpy)2Ru(obnibH2)Ru(bpy)2](ClO4)2的制备
钌和辅助配体的配合物二(2,2′-联吡啶)-二氯-二水合钌(II)(0.31g,0.58mM)和主配体obnibH2(0.16g,0.29mM)溶解于乙二醇,加热至120℃氩气保护下反应12小时后,得到暗红色清夜。冷却至室温,加水稀释后,加入NaClO4饱和溶液即产生大量红色沉淀。抽滤,用水,乙醚洗涤数次后干燥。将干燥后的粗产品经氧化铝柱色谱分离提纯,产率及元素分析如下:
[(bpy)2Ru(obnibH2)Ru(bpy)2](ClO4)2:产率68%。
元素分析C76H52N16Cl4O16Ru2,实验值:C,51.25;H,3.0;N,12.20%,计算值:C,51.02;H,2.93;N,12.53,1H NMR(DMSO-d6):9.18(s,2H),9.02(d,4H),8.87(d,4H),8.83(d,4H),8.20(d,4H),8.08(t,4H),7.98(d,4H),7.91(t,2H),7.85(d,4H),7.83(d,4H),7.61(d,4H),7.60(t,4H),7.52(t,2H),7.38(t,4H),ES-MS[CH3CN,m/z]:795.2([M-2ClO4]2+),497.0([M-3ClO4]3+),744.9([M-3ClO4-H]2+),463.5[M-4ClO4-H]3+),347.9([M-4ClO4]4+)。
实施例2钌多吡啶配合物诱导DNA缩合的表征:
(1)琼脂糖凝胶电泳实验:
向含有相同量的pBR322DNA(5ng/μL)的溶液中加入不同量的钌多吡啶配合物的溶液(0,9,13,18,27,36,45,54 or 63ng/μL),混合均匀,加入缓冲液(50mM Tris,18mM NaCl buffer,pH 7.2)使反应液的最终体积保持在10μL。将反应混合物静置于黑暗的环境中30分钟,然后加入2μL溴酚蓝缓冲终止液。上样至1%琼脂糖凝胶板。在TBE中以90V电泳1.5小时。以1μg/mL的EB染色液染色30分钟,用Alpha Innotech IS-5500化学荧光成像分析系统记录电泳图片,见图1、图2。
图1和图2分别为配合物[(bpy)2Ru(obpibH2)Ru(bpy)2]4+诱导pBR322 DNA缩合的凝胶电泳实验图和[(bpy)2Ru(obnibH2)Ru(bpy)2]4+诱导pBR322 DNA缩合的凝胶电泳实验图。图1和图2中附图标记均表示为:0泳道:DNA空白,1-8泳道:DNA+Ru配合物。每个泳道DNA的浓度是5ng/μL,从第1泳道到第8泳道配合物的浓度依次分别为:9,13,18,27,36,45,54 and 63ng/μL。从电泳图片中得出[(bpy)2Ru(obpibH2)Ru(bpy)2](ClO4)2诱导DNA缩合的浓度为36ng/μL,[(bpy)2Ru(obpibH2)Ru(bpy)2](ClO4)2诱导DNA缩合的浓度为27ng/μL。
(2)原子力显微镜(AFM)实验:
①云母片(1cm×1cm)新鲜解离后,滴加20μL的二次水溶液于其上,10秒钟后,移去溶液。②滴加20μL 1mM MgCl2溶液于云母片,10秒钟后,移去溶液。③将DNA溶液(5μL)或DNA和钌多吡啶配合物的混合溶液滴在云母片的基底上,10分钟后,移去溶液,用二次水充分淋洗,进行AFM扫描。AFM扫描结果表明:
不加入本发明诱导DNA缩合的钌多吡啶配合物的单纯DNA呈现的是松弛的环形;当加入本发明诱导DNA缩合的钌多吡啶配合物时,环形的DNA均呈现出不同大小纳米颗粒。加入的[(bpy)2Ru(obpibH2)Ru(bpy)2](ClO4)2的浓度为140ng/μL,颗粒直径为176nm;加入的[(bpy)2Ru(obnibH2)Ru(bpy)2](ClO4)2的浓度为140ng/μL,颗粒直径为128nm。
(3)激光动态光散射(DLS)实验:
含有相同量的pBR322DNA(1ng/μL)的溶液中加入不同量的Ru(II)配合物的溶液,混合均匀,加入缓冲液(50mM Tris,18mM NaCl buffer,pH 7.2)使反应液的最终体积保持在50μL。样品溶液被转移到石英池中,在测量前静置2分钟。设定激光角度为90°,激发波长为660nm。每份样品平行测量三次,取其平均值。测量条件为:配合物[(bpy)2Ru(obpibH2)Ru(bpy)2]4+浓度为140ng/μL,配合物[(bpy)2Ru(obnibH2)Ru(bpy)2]4+浓度为140ng/μL;激光角度为90°,DNA的浓度是1ng/μL;测得的诱导pBR322DNA缩合形成的纳米颗粒直径分布结果为:当[(bpy)2Ru(obpibH2)Ru(bpy)2](ClO4)2的浓度为140ng/μL时,诱导pBR322DNA缩合纳米颗粒直径为261nm,[(bpy)2Ru(obnibH2)Ru(bpy)2](ClO4)2的浓度为140ng/μL时,诱导pBR322DNA缩合纳米颗粒直径分别为216nm。
实施例3钌多吡啶配合物介导的基因转染实验:
将生长良好的HeLa细胞接种到24孔培养板中,在37℃,5%CO2条件下孵育18~24h后至细胞融合度为60%□80%,转染质粒pEGFP。转染前2h,将完全培养基吸去,用无血清培养基洗涤两次,加入不同比例的钌配合物/DNA复合物(每孔含1μg DNA)孵育5h后,将无血清培养基换成完全培养基.48h后检验转染结果。采用倒置荧光显微镜进行观察拍照,采用流式细胞仪进行定量分析。基因转染实验证实,以配合物[(bpy)2Ru(obpibH2)Ru(bpy)2]4+和[(bpy)2Ru(obnibH2)Ru(bpy)2]4+为载体,成功介导了质粒pEGFP在HeLa细胞中的基因转染。
Claims (5)
2.权利要求1所述配合物的制备方法,其特征在于步骤如下:
将钌和辅助配体的配合物二(2,2′-联吡啶)-二氯-二水合钌(II)和主配体化合物溶解于乙二醇,加热反应,冷却后加水稀释,再NaClO4饱和溶液即产生沉淀,过滤后沉淀依次用水、乙醚洗涤后干燥,即得。
3.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于干燥后的粗产品采用氧化铝柱色谱分离提纯。
4.如权利要求3所述的制备方法,其特征在于所述加热反应的温度为120~160℃,同时用氩气保护;反应时间为8~12小时。
5.权利要求1所述配合物在基因药物载体制备中的应用。
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