CN109781688A - 基于二氧化硅纳米粒子的dna硅纳米水凝胶的构建方法及比率型检测细胞内atp的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了基于二氧化硅纳米粒子的DNA硅纳米水凝胶的构建方法及其比率型检测细胞内ATP的方法，构建方法包括三个步骤，分别是硅纳米粒子‑甲基丙烯酸(MAA)‑DNA 1结构的构建；甲基丙烯酸(MAA)‑DNA 2结构的构建；DNA‑硅纳米水凝胶的合成；检测细胞内ATP的方法包括两个步骤：包括细胞培养和细胞成像。本发明使用二氧化硅纳米粒子，建立了一种DNA‑硅纳米水凝胶。不同于一般的金属纳米粒子，二氧化硅纳米粒子具有良好的生物相容性，及稳定性，使得DNA‑硅纳米水凝胶具有更低的毒性。
Description
技术领域
本公开一般涉及细胞内ATP的检测方法，具体涉及一种基于二氧化硅纳米粒子的DNA硅纳米水凝胶比率型检测细胞内ATP的方法。
背景技术
三磷酸腺苷(ATP)作为生物体中的通用能量货币，在调节细胞代谢途径和各种生化反应过程中起着关键作用，如调节细胞代谢过程和生化途径。ATP含量的异常促使细胞活力，损伤，坏死和细胞凋亡可以进一步诱发某些疾病，如恶性肿瘤，心血管病，阿尔茨海默病和帕金森病。大量证据表明，ATP已被公认为诊断疾病，监测疾病进展的有力和可靠的指标考虑到ATP在临床应用中的重要意义，迫切需要开发一种准确，特异，超敏感的ATP检测方法。
目前检测细胞内三磷酸腺苷(ATP)的方法主要包括化学发光，电化学，荧光和电致发光等方法。例如，将ATP适体与核酸结构相连接，构成ATP检测探针，通过ATP分子与适体核酸序列特异性结合前后产生的信号变化来达到检测ATP的目的。而核酸结构易受周围环境的影响，在细胞内呈现弱酸性，而核酸结构在酸性环境中易发生双链解旋，使得探针在没有与ATP分子结合前就已经散开，而不能够达到灵敏检测ATP分子的目的。
除此之外，采用金属纳米粒子与核酸结构相连接，金属纳米粒子的使得探针能够快速进入细胞内，达到快速检测的目的。但是金属纳米粒子极其不稳定，且在生物体内难降解，富集效应会对生物体造成危害。
基于上述内容，现有的技术都存在以下问题：
1、目前大多数检测方法是基于金属纳米粒子，其细胞穿透性好，易于合成，但在生物体内不易降解，在体内富集则会对生物体造成伤害。
2、核酸结构不稳定，易受环境影响，在细胞内弱酸性环境中双链易解旋，使得探针在未进入细胞前就被排出体外，从而使得探针失去原有作用。
而水凝胶，交联亲水聚合物网络，是一类重要的软材料，其许多性质与生物组织相似。虽然这些宏观材料已在各种技术领域进行了深入研究和开发，但其纳米尺寸材料，即所谓的纳米凝胶，目前正在吸引人们对其在先进技术(如成像)中的潜在用途的重视。因其具有良好生物相容性、毒性低、防污染、生物降解高，并且对靶细胞具有高度特异性等，故纳米凝胶适用于成像。然而，满足所有这些关键要求仍然是纳米凝胶特别是聚合物纳米粒子的临床应用的一大挑战。
理想的纳米粒子应具有以下特征：
(a)生物相容性好，
(b)体内循环时间长，
(c)足够高的稳定性，
(d)生物降解性好，
(e)低毒性
设计DNA-硅纳米水凝胶主要解决稳定性及毒性问题。目前的检测方法通常稳定性差，使得构建的探针结构在没有到达细胞前就分解，无法达到预期目的。生物体的富集作用使得毒性物质在生物体内累积，故低毒性材料的使用成为关键问题。
目前DNA-硅纳米水凝胶的研究主要集中为以下四个方面：
1、如何提高探针准确度。相较于其他检测ATP的方法，必须在体液或溶液中检测，而由于体液或溶液中环境极其复杂，所以我们采用细胞内成像的方法原位比率型检测ATP，更加简便，直观，减少系统误差，能够达到准确的检测ATP的目的。
2、如何提高探针灵敏度。与普通纳米结构相比，纳米水凝胶因其三维立体多孔、缠绕结构，具有很大的比表面积，这样就可以在水凝胶结构中引入大量的检测基团，降低检测限，提高检测灵敏度。
3、如何提高探针稳定性。核酸有较好的生物相容性，在细胞内弱酸性环境下，双链核酸极易发生双链DNA解旋，而无法达到检测ATP的作用。本发明采用纳米水凝胶结构，具有较好的稳定性，使得双链DNA能够更稳定。
如何降低探针的毒性。金纳米材料具有极好的穿透性，合成方法简单，有利于续修饰，但其生物毒性较大，且容易在生体内富集，不易降解，排出体外。
发明内容
鉴于现有技术中的上述缺陷或不足，期望提供一种基于二氧化硅纳米粒子的DNA硅纳米水凝胶比率型检测细胞内ATP的方法。采用二氧化硅纳米粒子，具有好的生物相容性，生物毒性低。
根据本申请实施例提供的技术方案，基于二氧化硅纳米粒子的DNA硅纳米水凝胶比率型检测细胞内ATP的方法，包括硅纳米粒子-甲基丙烯酸-DNA 1结构的构建、甲基丙烯酸-DNA 2结构的构建和DNA-硅纳米水凝胶的合成，
所述硅纳米粒子-甲基丙烯酸(MAA)-DNA 1结构的构建：
S1、硅纳米粒子、DNA 1链及甲基丙烯酸的活化：取23.5μL 1×10-5M的DNA 1加入离心管中，加入取10μL 4.78×10-3M的N-羟基琥珀酰亚胺对DNA 1进行活化，活化时间为30min，同时取21μL 1.17×10-4M的甲基丙烯酸置于离心管中，加入10μL 1.04×10-3M的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐对甲基丙烯酸活化30min，取10μL硅纳米粒子于离心管中，加入10μL 4.78×10-3M的N-羟基琥珀酰亚胺活化30min；
S2、硅纳米粒子、DNA 1链及甲基丙烯酸的链接：将S1中活化好的甲基丙烯酸与活化好的DNA 1链在试管中混合，摇晃3min，然后放置在4℃环境中，反应12h，得到产物A，将产物A加入到S1中已经活化好的硅纳米粒子中继续反应，放置在4℃环境中，反应12h，得到产物Ⅰ；
所述甲基丙烯酸-DNA 2结构的构建；
S3、DNA 2链及甲基丙烯酸的活化：取52.15μL 1×10-5M的DNA 2加入离心管中，加入取10μL 4.78×10-3M的N-羟基琥珀酰亚胺对DNA 2进行活化，活化时间为30min，同时取4.01μL 1.17×10-2M的甲基丙烯酸于离心管中，加入10μL 1.04×10-3M的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐进行活化，活化30min；
S4、DNA 2链及甲基丙烯酸的链接：将活化好的甲基丙烯酸与活化好的DNA 2链混合，放置在4℃环境中，反应12h，得到产物Ⅱ，备用；
所述DNA-硅纳米水凝胶的合成；
S5、将所得产物Ⅱ加入10μL 1％的Irgacure2959，100μL的缓冲溶液和346.5μL的去离子水，混合均匀后，放置在365nm紫外光下照射30min，得到产物Ⅲ，备用；
S6、将所得产物Ⅱ加入4μL 1％的Irgacure2959，20μL的缓冲溶液和119.85μL的去离子水，混合均匀后，放置在365nm紫外光下照射30min，得到产物Ⅳ，备用；
S7、将所得产物Ⅲ、产物Ⅳ和1×10-5M的Linker按照比例加入，放入95℃的水浴锅中退火5min后，放入冰水浴中反应2-4h。
本发明中，进一步的，所述缓冲溶液为100mM Tris-HCl 500mM NaCl 100mMMgCl2。
本发明中，进一步的，所述S7中的产物Ⅲ、产物Ⅳ和Linker的比例为100:19.58:4.7。
一种基于二氧化硅纳米粒子的DNA硅纳米水凝胶的比率型检测细胞内ATP的方法，该方法包括细胞培养和细胞成像，细胞培养为在细胞培养皿中加入血清浓度为10％的1640细胞培养液进行细胞培养，将制备好的DNA-硅纳米水凝胶加入到培养皿中，充分混匀后，置于37℃，5％的二氧化碳培养箱中，培养1-5h。
细胞成像，细胞成像方法的步骤如下：
A1、取出培养1-5h后的细胞培养皿，倒掉混合培养液，再向培养皿中加入1640培养液，重复冲洗，最后，加入1mL含有10％血清的培养液,待用，
A2、在激光共聚焦显微镜下观察细胞内FAM和Cy3的荧光，以488nm为激发光源，采集520nm与565nm的发射光，明显观测到：细胞中有较强的Cy3红色荧光，随着时间的推移，可以清楚看到红色荧光越来越弱，绿色荧光越来越强，表明此DNA-硅纳米水凝胶具有良好的检测ATP的效果。
综上所述，本申请的上述技术方案通过
1、使用二氧化硅纳米粒子，建立了一种DNA-硅纳米水凝胶。不同于一般的金属纳米粒子，二氧化硅纳米粒子具有良好的生物相容性，及稳定性，使得DNA-硅纳米水凝胶具有更低的毒性。
2、引入水凝胶材料，它具有特定的3D网络立体结构，可以将大量的水分子锁定在其中。增强其生物相容性，并且较好的生物降解性使其不易在生物体内累积富集。另外，水凝胶在单位体积内拥有较高的比表面积，使纳米颗粒在一定粒径的限制下，负载更多适体，更加有效的识别靶标ATP。
3、采用2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮(Irgacure2959)作为光敏剂的紫外引发聚合反应，与传统制备方法--水热法相比，紫外引发聚合反应时间更短，更加高效。
4、相较于其他核酸结构而言，将DNA作为水凝胶的交联剂能够增加DNA结构在不同pH环境中的稳定性。使得DNA-硅纳米水凝胶在进入细胞后不会因为pH的变化而发生双链解旋，而是在细胞内保持较好的结构，只有当ATP存在时，ATP适体特异性识别ATP，从而达到检测细胞内ATP的目的。
附图说明
通过阅读参照以下附图所作的对非限制性实施例所作的详细描述，本申请的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为DNA-硅纳米水凝胶的合成原理图；
图2为DNA-硅纳米水凝胶透射电镜表征；
图3为DNA-硅纳米水凝胶的Zeta电位与动态光散射表征图；
图4为DNA-硅纳米水凝胶合成的紫外表征图；
图5为DNA-硅纳米水凝胶合成的电泳表征图；
图6为DNA-硅纳米水凝胶作用于肝癌细胞(Hepg2)效果的验证图；
图7为DNA-硅纳米水凝胶在不同pH环境中的效果图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本申请作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释相关发明，而非对该发明的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与发明相关的部分。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本申请。
请参考图1，一种基于二氧化硅纳米粒子的DNA硅纳米水凝胶的构建方法，其步骤如下：
(一)、硅纳米粒子-甲基丙烯酸(MAA)-DNA 1结构的构建
1)、硅纳米粒子、DNA 1链及甲基丙烯酸的活化：取23.5μL 1×10-5M的DNA 1加入离心管中，加入取10μL 4.78×10-3M的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化30min，同时取21μL 1.17×10-4M的甲基丙烯酸(MAA)于离心管中，加入10μL 1.04×10-3M的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)活化30min，取10μL硅纳米粒子于离心管中，加入10μL 4.78×10-3M的NHS活化30min。
2)、硅纳米粒子、DNA 1链及甲基丙烯酸的链接：将活化好的甲基丙烯酸与活化好的DNA 1链混合，放置4℃，反应12h。将合成的产物加入到以经活化好的硅纳米粒子中继续反应，4℃，反应12h。得到产物Ⅰ。
(二)、甲基丙烯酸(MAA)-DNA 2结构的构建
1)、DNA 2链及甲基丙烯酸的活化：取52.15μL 1×10-5M的DNA 2加入离心管中，加入取10μL 4.78×10-3M的NHS活化30min，同时取4.01μL 1.17×10-2M的甲基丙烯酸(MAA)于离心管中，加入10μL 1.04×10-3M EDC活化30min。
2)、DNA 2链及甲基丙烯酸的链接：将活化好的甲基丙烯酸与活化好的DNA2链混合，放置4℃，反应12h。得到产物Ⅱ，备用。
(三)、DNA-硅纳米水凝胶的合成
1)、将所得产物Ⅰ加入10μL 1％的Irgacure2959，100μL的缓冲溶液(100mM Tris-HCl 500mM NaCl 100mM MgCl2)和346.5μL的去离子水。混合均匀后，放置在365nm紫外光下照射30min。得到产物Ⅲ，备用。
2)、将所得产物Ⅱ加入4μL 1％的Irgacure2959，20μL的缓冲溶液(100mM Tris-HCl 500mM NaCl 100mM MgCl2)和119.85μL的去离子水。混合均匀后，放置在365nm紫外光下照射30min。得到产物Ⅳ，备用。
3)、将所得产物Ⅲ、产物Ⅳ和1×10-5M的Linker按照100:19.58:4.7的比例加入，放入95℃的水浴锅中退火5min后，放入冰水浴中反应2-4h。
反应完成后，对成品进行电泳，如图5所示，其中，泳道1：DNA 1；泳道2：DNA 2；泳道3：DNA-硅纳米水凝胶；泳道4：marker；根据电泳的条带可以证明我们的DNA-硅纳米凝胶成功合成。
本发明中，DNA1、DNA2和Linker的序列如下：
如图7所示，DNA-硅纳米水凝胶在不同pH环境中的效果图，泳道从左到右分别为marker、pH值为5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5的不同缓冲溶液与DNA-硅纳米水凝胶反应1.5h后的样品，可以观察到几乎没有什么变化，说明DNA-硅纳米水凝胶较为稳定。
一种基于二氧化硅纳米粒子的DNA硅纳米水凝胶的比率型检测细胞内ATP的方法，
细胞培养
1)、在细胞培养皿中加入血清浓度为10％的1640细胞培养液进行细胞培养，将制备好的DNA-硅纳米水凝胶加入到培养皿中，充分混匀后，置于37℃，5％的二氧化碳培养箱中，培养1-5h。
细胞成像
1)、取出培养1-5h后的细胞培养皿，倒掉混合培养液，再向培养皿中加入1640培养液，重复冲洗，最后，加入1mL含有10％血清的培养液,待用，
2)、在激光共聚焦显微镜下观察细胞内FAM和Cy3的荧光，以488nm为激发光源，采集520nm与565nm的发射光，明显观测到：细胞中有较强的Cy3红色荧光，随着时间的推移，可以清楚看到红色荧光越来越弱，绿色荧光越来越强，表明此DNA-硅纳米水凝胶具有良好的检测ATP的效果。
如图6所示，将DNA-硅纳米水凝胶作用于肝癌细胞，可以看出随着时间的增加，荧光素Cy3的荧光强度先增强，后减弱，而羟基荧光素FAM逐渐增强，两个荧光素的荧光信号表现出比率型变化，说明可以达到检测细胞内ATP的目的。
本发明的原理是采用光引发聚合的方式，二氧化硅纳米粒子，甲基丙烯酸(MAA)为聚合单体，DNA为交联剂的DNA-硅纳米水凝胶，用于细胞内ATP的检测。其中所述的交联剂DNA包括修饰氨基和荧光素(FAM)的DNA1链、修饰氨基和荧光素(Cy3)的DNA 2链及一条ATP适体链(Linker)DNA组成。由于DNA 1链与DNA 2链分别和Linker发生碱基互补配对，所以起到交联剂的作用。
DNA-硅纳米水凝胶形成时，DNA 1与DNA 2分别与Linker发生碱基互补配对，由于两个荧光素距离较近，发生荧光共振能量转移，使得DNA-硅纳米水凝胶在492nm激发时在565nm处产生吸收峰。当有ATP分子存在时，Linker与ATP分子发生特异性结合，将原本杂交的DNA结构打开，两个荧光素距离变远，荧光共振能量转移现象消失，使DNA-硅纳米水凝胶在492nm激发时在521nm处产生吸收峰。根据荧光信号比率型变化达到检测细胞内ATP的目的。
如图2所示，图2中A为二氧化硅纳米粒子的透射电镜图，分散性较好，半径为50nm左右；图2B为用醋酸双氧铀将合成的DNA-硅纳米水凝胶染色后的透射电镜图，可以看出在图2B中的DNA-硅纳米水凝胶粒径更大，表面更粗糙，证明在二氧化硅纳米粒子表面连接上了水凝胶。
如图3所示，图3中A为Zeta电位图，Zeta电位由-6.68mV变成了-0.60mV，二氧化硅纳米粒子表面Zeta电位的变化说明DNA-硅纳米水凝胶的合成；图3B为动态光散射图，水合半径由55nm左右变成了135nm左右，合成的DNA-硅纳米水凝胶粒径比二氧化硅纳米粒子大，从而证明合成了DNA-硅纳米水凝胶。
如图4所示，其中a:SiO2；b:DNA-Si-nanohydrogel；c:DNA；d:MAA；c曲线是DNA曲线在260nm处有DNA特征吸收峰，在220nm处的吸收峰为荧光基团FAM中酰胺键的吸收峰，b曲线在220nm和260nm处都有峰，而不同于曲线C，所以可以表明DNA-硅纳米凝胶合成。
本技术还有以下几个方面的优点：
一、本方案建立了一种DNA-硅纳米水凝胶。不同于其他金属纳米粒子，二氧化硅纳米粒子具有良好的生物相容性，稳定性高及生物降解性，使得DNA-硅纳米水凝胶具有更低的毒性。在细胞存活的状态下进行原位成像检测，避免取样和处理样品带来的误差和繁琐的操作过程。
二、光聚合反应采用Irgacure2959作为光敏剂，紫外引发聚合与传统水热法相比，紫外引发聚合需要的时间更短，更有效，更节能。能够极大降低人力，物力，财力的消耗。
三、相较于其他核酸结构而言，将DNA作为水凝胶的交联剂能够增加DNA结构在不同pH环境中的稳定性。瘤细胞微环境为弱酸性，pH值为4.5-5.5。DNA双链在pH<6时，双链易水解，而加入水凝胶结构使得探针在进入细胞后不会因为pH的变化而发生分解，而是在细胞内保持较好的结构，解决了核酸纳米材料在生物体微环境中运输带来的降解问题。
四、采用比率型成像法检测细胞内ATP，与传统的荧光方法相比，直接根据成像显示出ATP所在位置，更加直观，而比率型荧光信号变化能够有效地减少系统误差，准确的检测ATP，具有更大的实际应用价值。
以上描述仅为本申请的较佳实施例以及对所运用技术原理的说明。本领域技术人员应当理解，本申请中所涉及的发明范围，并不限于上述技术特征的特定组合而成的技术方案，同时也应涵盖在不脱离所述发明构思的情况下，由上述技术特征或其等同特征进行任意组合而形成的其它技术方案。例如上述特征与本申请中公开的(但不限于)具有类似功能的技术特征进行互相替换而形成的技术方案。
序列表
<110> 青岛科技大学
<120> 基于二氧化硅纳米粒子的DNA硅纳米水凝胶的构建方法及比率型检测细胞内ATP的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
Claims (4)
1.基于二氧化硅纳米粒子的DNA硅纳米水凝胶的构建方法，其特征是：包括硅纳米粒子-甲基丙烯酸-DNA 1结构的构建、甲基丙烯酸-DNA 2结构的构建和DNA-硅纳米水凝胶的合成，
所述硅纳米粒子-甲基丙烯酸(MAA)-DNA 1结构的构建：
S1、硅纳米粒子、DNA 1链及甲基丙烯酸的活化：取23.5μL 1×10-5M的DNA 1加入离心管中，加入取10μL 4.78×10-3M的N-羟基琥珀酰亚胺对DNA 1进行活化，活化时间为30min，同时取21μL 1.17×10-4M的甲基丙烯酸置于离心管中，加入10μL 1.04×10-3M的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐对甲基丙烯酸活化30min，取10μL硅纳米粒子于离心管中，加入10μL 4.78×10-3M的N-羟基琥珀酰亚胺活化30min；
S2、硅纳米粒子、DNA 1链及甲基丙烯酸的链接：将S1中活化好的甲基丙烯酸与活化好的DNA 1链在试管中混合，摇晃3min，然后放置在4℃环境中，反应12h，得到产物A，将产物A加入到S1中已经活化好的硅纳米粒子中继续反应，放置在4℃环境中，反应12h，得到产物Ⅰ；
所述甲基丙烯酸-DNA 2结构的构建；
S3、DNA 2链及甲基丙烯酸的活化：取52.15μL 1×10-5M的DNA 2加入离心管中，加入取10μL 4.78×10-3M的N-羟基琥珀酰亚胺对DNA 2进行活化，活化时间为30min，同时取4.01μL1.17×10-2M的甲基丙烯酸于离心管中，加入10μL 1.04×10-3M的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐进行活化，活化30min；
S4、DNA 2链及甲基丙烯酸的链接：将活化好的甲基丙烯酸与活化好的DNA 2链混合，放置在4℃环境中，反应12h，得到产物Ⅱ，备用；
所述DNA-硅纳米水凝胶的合成；
S5、将所得产物Ⅱ加入10μL 1％的Irgacure2959，100μL的缓冲溶液和346.5μL的去离子水，混合均匀后，放置在365nm紫外光下照射30min，得到产物Ⅲ，备用；
S6、将所得产物Ⅱ加入4μL 1％的Irgacure2959，20μL的缓冲溶液和119.85μL的去离子水，混合均匀后，放置在365nm紫外光下照射30min，得到产物Ⅳ，备用；
S7、将所得产物Ⅲ、产物Ⅳ和1×10-5M的Linker按照比例加入，放入95℃的水浴锅中退火5min后，放入冰水浴中反应2-4h。
2.根据权利要求1所述的一种基于二氧化硅纳米粒子的DNA硅纳米水凝胶的构建方法，其特征是：所述缓冲溶液为100mM Tris-HCl 500mM NaCl 100mM MgCl2。
3.根据权利要求1所述的一种基于二氧化硅纳米粒子的DNA硅纳米水凝胶的构建方法，其特征是：所述S7中的产物Ⅲ、产物Ⅳ和Linker的比例为100:19.58:4.7。
4.一种基于二氧化硅纳米粒子的DNA硅纳米水凝胶的比率型检测细胞内ATP的方法，其特征是：包括细胞培养和细胞成像，所述细胞培养为在细胞培养皿中加入血清浓度为10％的1640细胞培养液进行细胞培养，将制备好的DNA-硅纳米水凝胶加入到培养皿中，充分混匀后，置于37℃，5％的二氧化碳培养箱中，培养1-5h。
所述细胞成像包括以下两个步骤：
A1、取出培养1-5h后的细胞培养皿，倒掉混合培养液，再向培养皿中加入1640培养液，重复冲洗，最后，加入1mL含有10％血清的培养液,待用，
A2、在激光共聚焦显微镜下观察细胞内FAM和Cy3的荧光，以488nm为激发光源，采集520nm与565nm的发射光，明显观测到：细胞中有较强的Cy3红色荧光，随着时间的推移，可以清楚看到红色荧光越来越弱，绿色荧光越来越强，表明此DNA-硅纳米水凝胶具有良好的检测ATP的效果。
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