CN102517289A - 黄曲霉毒素b1核酸适体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种与黄曲霉毒素B1高特异性和高亲和力结合的核酸适体及其应用，该核酸适体可以用于黄曲霉毒素B1的检测分析和分离富集，具有特异性好、亲和力高、品质均一、稳定性好、开发周期短、生产成本低、使用方便的特点。本发明还涉及所述核酸适体序列的衍生序列，包括修饰后的序列。

Description

黄曲霉毒素B1核酸适体及其应用

(一)技术领域：

本发明属于生物技术领域，涉及利用分子生物学技术----SELEX技术设计和制备一种与黄曲霉毒素B1高特异性和高亲和力结合的黄曲霉毒素B1核酸适体及其应用。

(二)背景技术：

黄曲霉毒素(AF)是一组化学组成相似的真菌毒素的总称，属二呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，包括毒素B1、B2、G1、G2等10多种，其中以黄曲霉毒素B1存在量最大，毒性也最强，主要产生菌种是黄曲霉和寄生曲霉，最常见于花生及粮油等花生制品、玉米、大米、棉籽、一些坚果类食品和饲料、奶制品中。AF有强烈的毒性，按毒性级别分类，属于超剧毒级，其毒性是氰化钾的10倍，是砒霜的68倍。其作用的主要靶器官为肝脏，急性中毒主要表现为肝脏损伤、肝实质细胞消失延迟、胆管增生、肝细胞脂质消失延迟和肝出血，慢性中毒主要表现为生长发育迟缓、肝脏出现亚急性或慢性损伤，并引起原发性肝细胞癌，已成为人类肝癌发病的重要因素，还可作用于如肾脏、胃、直肠、乳腺、卵巢等器官。包括中国在内的许多国家均制定了食品中AF允许量的国家标准。

目前世界各国通用的AF检测方法为薄层层析法、微柱法、高压液相法等，这些方法均不同程度地存在操作繁琐、效率低、对操作者、操作环境要求较高的缺点，酶联免疫吸附法是国际公认的测定AF的先进方法，灵敏度高、干扰少、测定步骤简便、快速、操作安全。然而，对于AF这种毒性小分子，其抗体的制备周期长、生产成本高、技术难度大、批间差异大、克隆株(细胞)难以有效保存等难题，大大限制了酶联免疫吸附法等免疫学检测技术的快速发展。核酸适体(aptamer)作为一种特异性更好、亲和力更高、品质均一、稳定性好的抗体替代品，在检测分析领域中的应用已经被广为认可，并具有开发周期短、生产成本低、使用方便的特点，因此，核酸适体在AF这种毒性小分子的快速检测中具有良好的应用前景，其高度特异性(具有对靶标分子单个取代基修饰的识别能力)更特别适合于AF这种结构类似物复杂的分子分析。

(三)发明内容：

本发明的目的在于提供一种采用新一代SELEX技术筛选得到的能够与黄曲霉毒素B1高特异性和高亲和力结合的结构转换信号适体，并提供黄曲霉毒素B1核酸适体在黄曲霉毒素B1检测分析和样品分离富集中的应用方法，具有简便、快速、经济等特点，与其他组合化学库如随机肽库、抗体库和噬菌体表面展示文库相比，从寡核苷酸文库中筛选出的适体具许多优势。

本发明的技术方案：一种黄曲霉毒素B1核酸适体，其特征在于它为核苷酸序列

GCATCACTACAGTCATTACGCATCGGGTAATCCTAAGCGGAACTGAGGAGTGGGAGGTAAATCGTGTGAAGTGCTGTCCC或其互补的核苷酸序列所示的DNA分子。

所述一种黄曲霉毒素B1核酸适体的衍生物具有相同功能用途。

所述一种黄曲霉毒素B1核酸适体的衍生物为核苷酸序列进行氨基化或巯基化或同位素化修饰

所述一种黄曲霉毒素B1核酸适体的衍生物为核苷酸序列结合生物素或酶或地高辛或荧光物质或纳米发光材料。

一种黄曲霉毒素B1核酸适体的应用，其特征在于将黄曲霉毒素B1核酸适体用于黄曲霉毒素B1的检测分析，它包括以下步骤：

(1)竞争板准备：50μg/ml手臂分子氨基丙基三乙氧基硅烷或多聚赖氨酸100μl于4℃包被过夜，交联剂次亚苯基二异硫氰酸盐或戊二醛活化6h，200-2000pmol/ml NH₂-引物100μl偶联，0.2mol/L乙醇胺或甘氨酸封闭2h，硼氢化钠还原，1％BSA封闭，PBS洗涤后备用；

(2)检测步骤：

①黄曲霉毒素B1核酸适体5-10pmol，94℃3min、冰上5min变性；

②与0-100pmol靶标混匀，总体积100μl，加入板中，室温孵育30min；

③吸取50μl加入荧光板中，加入1∶200 OliGreen 100μl，作用5min；

④测定荧光值(Ex：485nm，Em：525nm)。

标准曲线：通过6次重复试验，以荧光数值为纵坐标，以标准浓度为横坐标，做标准曲线。

灵敏度计算：通过6次重复试验，检测的标靶含量为0ng/ml±3*STDV。

重复性：标样重复测定5次，计算其测定离散度CV值。

回收率：以玉米甲醇提取物稀释50倍为样品，加入低、中、高浓度标准，重复测定3次，计算其回收率。

AFB1检测试剂盒：检测灵敏度：0.1ng/ml，重复性：CV＜5％

以玉米匀浆甲醇提取物为样品1∶50稀释，回收率见表：

一种黄曲霉毒素B1核酸适体的应用，其特征在于将黄曲霉毒素B1核酸适体用于从样品中分离、富集黄曲霉毒素B1，它包括以下步骤：

(1)将偶联有黄曲霉毒素B1核酸适体的磁颗粒与待分离的含黄曲霉毒素B1的溶液充分混合；

(2)用磁分离器富集磁颗粒，并清洗，然后将黄曲霉毒素B1从偶联有核酸适体的磁颗粒上解离，得到黄曲霉毒素B1单组份。

一种黄曲霉毒素B1核酸适体的互补序列的应用，其特征在于用于黄曲霉毒素B1检测分析中，它包括以下步骤：

①黄曲霉毒素B1检测层析试纸条，其基本结构组成包括：支撑垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫等；

②胶体金结合垫上含有核酸适体与其互补序列组装的纳米颗粒聚集体(经生物素标记)6μl，硝酸纤维素膜上含有1-10mg/ml链霉亲和素2μl的检测线；

③检测时，将试纸条吸收板端插入待测样品的溶液中，约20s，液体完全湿润连接板并进入膜，取出纸条，放在平台上让液体继续流动，若待测液中无靶标，聚集体较大，不能随液流进入硝酸纤维素膜，不显色，若待测液中有靶标黄曲霉毒素B1存在，可导致组装的聚集体解离而形成分散的纳米颗粒，分散的纳米颗粒随液流进入纤维素膜，纳米颗粒上的生物素标记物与膜上链霉亲和素结合，显红色，是为阳性结果，且显色程度与靶标浓度呈正比关系。

本发明一种黄曲霉毒素B1核酸适体的特性评测：

1、荧光定量PCR法评价黄曲霉毒素B1核酸适体的活性：

充分洗涤组装(通过其互补序列实现)有黄曲霉毒素B1核酸适体的磁颗粒，然后用终浓度1μM的黄曲霉毒素B1进行竞争，室温反应30min。以竞争反应产物为模板进行荧光定量PCR反应，采用Invitrogen公司的试剂盒Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG，20μl体系中含模板2μl、引物P1、P2各20pmol，退火温度65℃。同时设置以溶剂甲醇作为竞争物的对照组。

结果：

可见黄曲霉毒素B1核酸适体对黄曲霉毒素B1具有特异性亲和能力。

2、染料法评价黄曲霉毒素B1核酸适体的活性：

充分洗涤组装(通过其互补序列实现)有黄曲霉毒素B1核酸适体的磁颗粒，然后用终浓度1μM的黄曲霉毒素B1进行竞争，室温反应30min。Oligreen染料用结合缓冲液按1∶200稀释后，等比例加入竞争反应液中，室温避光反应2-5min，用480nm光激发，测定520nm处的发射光。同时设置以甲醇作为竞争物的对照组和结合缓冲液本底对照组。

结果本底对照组未检测到发射光，实验组荧光强度显著高于甲醇对照组，可见黄曲霉毒素B1核酸适体对黄曲霉毒素B1具有特异性亲和能力。

3、经基团修饰的黄曲霉毒素B1核酸适体的活性评价：

依荧光定量PCR法评价黄曲霉毒素B1核酸适体的活性的方法，用荧光定量PCR法分别进行氨基化黄曲霉毒素B1核酸适体、巯基化黄曲霉毒素B1核酸适体、同位素化黄曲霉毒素B1核酸适体、生物素标记的黄曲霉毒素B1核酸适体、HRP标记的黄曲霉毒素B1核酸适体、AP标记的黄曲霉毒素B1核酸适体、地高辛标记的黄曲霉毒素B1核酸适体、TAMRA标记的黄曲霉毒素B1核酸适体、以及纳米发光材料Y₂SiO₅:Eu标记的黄曲霉毒素B1核酸适体的活性评价。

结果：

可见氨基化黄曲霉毒素B1核酸适体、巯基化黄曲霉毒素B1核酸适体、同位素化黄曲霉毒素B1核酸适体、生物素标记的黄曲霉毒素B1核酸适体、HRP标记的黄曲霉毒素B1核酸适体、AP标记的黄曲霉毒素B1核酸适体、地高辛标记的黄曲霉毒素B1核酸适体、TAMRA标记的黄曲霉毒素B1核酸适体、以及纳米发光材料Y₂SiO₅:Eu标记的黄曲霉毒素B1核酸适体对黄曲霉毒素B1均具有特异性亲和能力。

本发明的优点是：1)本身是寡核苷酸，分子量较小，可以化学合成，节约成本；2)具有比抗体更高的亲和性和特异性；3)便于标记且可以在不同部位有选择性的标记；4)重复性和稳定性好，且易于保存，即对高温和剧烈条件不敏感；5)核酸适体技术具有良好的应用前景，特别是在检测分析领域。

(四)具体实施方式：

实施例：一种黄曲霉毒素B1核酸适体，其特征在于为核苷酸序列

GCATCACTACAGTCATTACGCATCGGGTAATCCTAAGCGGAACTGAGGAGTGGGAGGTAAATCGTGTGAAGTGCTGTCCC或其互补的核苷酸序列所示的DNA分子。

本发明中用于SELEX的单链DNA随机库及引物由Takara公司合成，两端为固定序列，中间为35个碱基的随机序列：5’GCATCACTACAGTCATTACGCATCG-(N35)-ATCGTGTGAAGTGCTGTCCC 3’，库容量为10¹⁴以上，引物1：5’GCATCACTACAGTCATTACGCA 3’，引物2：5’GGGACAGCACTTCACACGAT 3’，引物3：5’GCGTAATGACAAAAAAAAAAACAT-C6-NH2 3’，引物4：5’Biot in-GGGACAGCACTTCACACGAT 3’。黄曲霉毒素B1购自ALEXIS公司，磁珠购于invitrogen公司，寡核苷酸的纯化试剂购于Qiagen公司，PCR试剂盒和T载体购于普洛麦格(Promega)公司。

一种黄曲霉毒素B1核酸适体的筛选制备：

将初始文库通过互补序列偶联于磁颗粒上，以溶剂为反筛分子、黄曲霉毒素B1为筛选分子进行筛选。在伏马毒素B2存在下，与其有结合能力的寡核苷酸序列从磁颗粒上解离，经PCR扩增后，采用亲和分离纯化法制备次级文库，重复筛选8轮，克隆测序，获得黄曲霉毒素B1的单克隆核酸适体。

一种黄曲霉毒素B1核酸适体的应用，其特征在于将黄曲霉毒素B1核酸适体用于黄曲霉毒素B1的检测分析，它包括以下步骤：

(1)竞争板准备：多聚赖氨酸(50μg/ml，CBS)100μl于4℃包被过夜，戊二醛(2.5％，PBS)活化6h，NH2-引物(2000pmol/ml，PBS)100μl偶联，乙醇胺(0.2mol/L，pH8.0)封闭2h，硼氢化钠还原，BSA(1％，PBS)封闭，PBS洗涤后备用；

(2)检测步骤：

①黄曲霉毒素B1核酸适体5-10pmol，94℃3min、冰上5min变性；

②与靶标(0-100pmol)混匀，总体积100μl，加入板中，室温孵育30min；

③吸取50μl加入荧光板中，加入100μl OliGreen(1∶200，TAE)，作用5min；

④测定荧光值(Ex：485nm，Em：525nm)。

标准曲线：通过6次重复试验，以荧光数值为纵坐标，以标准浓度为横坐标，做标准曲线。

灵敏度计算：通过6次重复试验，检测的标靶含量为0ng/ml±3*STDV。

重复性：标样重复测定5次，计算其测定离散度CV值。

回收率：以玉米甲醇提取物稀释50倍为样品，加入低、中、高浓度标准，重复测定3次，计算其回收率。

AFB1检测试剂盒：检测灵敏度：0.1ng/ml，重复性：CV＜5％

以玉米匀浆甲醇提取物为样品1∶50稀释，回收率见表：

一种黄曲霉毒素B1核酸适体的应用，其特征在于将黄曲霉毒素B1核酸适体用于从样品中分离、富集黄曲霉毒素B1，它包括以下步骤：

将偶联有黄曲霉毒素B1核酸适体的磁颗粒与待分离的含黄曲霉毒素B1的溶液充分混合，用磁分离器富集磁颗粒，并清洗，然后将黄曲霉毒素B1从偶联有核酸适体的磁颗粒上解离，得到黄曲霉毒素B1单组份。

一种黄曲霉毒素B1核酸适体的互补序列的应用，其特征在于用于黄曲霉毒素B1检测分析中，它包括以下步骤：

①黄曲霉毒素B1检测层析试纸条，其基本结构组成包括：支撑垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫等；

②胶体金结合垫上含有核酸适体与其互补序列组装的纳米颗粒聚集体(经生物素标记)6μl，硝酸纤维素膜上含有10mg/ml链霉亲和素2μl的检测线；

③检测时，将试纸条吸收板端插入待测样品的溶液中，约20s，液体完全湿润连接板并进入膜，取出纸条，放在平台上让液体继续流动，若待测液中无靶标，聚集体较大，不能随液流进入硝酸纤维素膜，不显色，若待测液中有靶标黄曲霉毒素B1存在，可导致组装的聚集体解离而形成分散的纳米颗粒，分散的纳米颗粒随液流进入纤维素膜，纳米颗粒上的生物素标记物与膜上链霉亲和素结合，显红色，是为阳性结果，且显色程度与靶标浓度呈正比关系。

Claims (6)

1.一种黄曲霉毒素B1核酸适体，其特征在于它为核苷酸序列GCATCACTACAGTCATTACGCATCGGGTAATCCTAAGCGGAACTGAGGAGTGGGAGGTAAATCGTGTGAAGTGCTGTCCC或其互补的核苷酸序列所示的DNA分子。

2.根据权利要求1所述一种黄曲霉毒素B1核酸适体，其特征在于与所述黄曲霉毒素B1核酸适体具有相同功能用途的衍生物为核苷酸序列进行氨基化或巯基化或同位素化修饰。

3.根据权利要求1所述一种黄曲霉毒素B1核酸适体，其特征在于与所述黄曲霉毒素B1核酸适体具有相同功能用途的衍生物为核苷酸序列结合生物素或酶或地高辛或荧光物质或纳米发光材料。

4.一种权利要求1所述黄曲霉毒素B1核酸适体的应用，其特征在于用于黄曲霉毒素B1的检测分析。

5.一种权利要求1所述黄曲霉毒素B1核酸适体的应用，其特征在于用于从样品中分离、富集黄曲霉毒素B1。

6.一种权利要求2或3所述黄曲霉毒素B1核酸适体衍生物的应用，其特征在于应用于黄曲霉毒素B1检测分析和分离富集中。