CN103710347B - 黄曲霉毒素b1的核酸适体afb1-22及其应用 - Google Patents

Abstract

黄曲霉毒素B₁的核酸适体AFB₁-22及其应用，涉及一种核酸。所述黄曲霉毒素B₁的核酸适体AFB₁-22是通过基于琼脂糖微珠分离-流式细胞术分析的亲和SELEX方法筛选制备。所述黄曲霉毒素B₁的核酸适体AFB₁-22富含G碱基，具有茎环结构，亲和力高，稳定性好，无毒，易于合成和标记，可作为样品中黄曲霉毒素B₁的一种潜在检测试剂。

Description

黄曲霉毒素B1的核酸适体AFB1-22及其应用

技术领域

本发明涉及一种核酸，特别是涉及黄曲霉毒素B₁的核酸适体AFB₁-22及其应用。

背景技术

在粮油食品的生物性污染问题中，真菌毒素的污染是最主要的因素之一，而黄曲霉毒素（Aflatoxins，AF）是迄今发现的毒性和致癌性最强的天然污染物。黄曲霉毒素是由黄曲霉菌和寄生曲霉菌等产生的一组化学结构类似的次生代谢产物，具有二呋喃环和氧杂萘邻酮（香豆素）的基本结构，目前已发现20多种，主要包括B₁、B₂、G₁、G₂、M₁和M₂等。其中，AFB₁的毒性最强，存在量最大，稳定性也最高，其毒性为氰化钾的10倍、砒霜的68倍，主要作用于肝脏等器官，可诱发原发性肝癌、胃癌和肺癌等，并于1993年被世界卫生组织癌症研究机构划定为一类致癌物。AFB₁广泛存在于土壤和动植物中，尤其是植物性食物，如花生、玉米、大米、小麦、牛奶和各种坚果等。AFB₁的理化性质比较稳定，脂溶性，耐热，难以去毒，对人和动物的健康产生极大的危害。AFB₁含量是国际食品卫生和农产品贸易中的必检指标，许多国家均制定了其在食品中允许量的国家标准。因此，对AFB₁开展有效、快速、高灵敏检测具有重要的意义。（1.Wogan,G.N.Chemicalnatureandbiologicaleffectsoftheaflatoxins.BacteriolRev1966,30,460-470;2.Shankaran,R.;Raj,H.G.;Venkitasubramanian,T.A.Biochemicalchangesinliverduetoaflatoxin.BrJExpPathol1970,51,487-491）。

目前，常用的AFB₁检测方法概况起来主要有化学分析法和免疫分析法。化学分析法主要有薄层层析色谱法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）和微柱法等，这些常规检测方法具备了较高的检测灵敏度和准确度，但存在繁杂的样品前处理、分离检测耗时、仪器设备昂贵笨重而难以实现现场快速分析、需要专业技术人员等缺点。免疫分析法主要是基于抗黄曲霉毒素单克隆抗体的高亲和力和高特异性发展的一系列免疫学检测方法，其中的酶联免疫吸附法（ELISA）灵敏度高、安全性好、干扰少，操作简便快速，是目前最普遍实用的AFB₁的检测方法。但AFB₁是一种剧毒小分子，其抗体的制备存在较大困难，试剂寿命较短难保存，批间差异也较大等，这些瓶颈限制了免疫学检测方法的应用范围和快速发展（3.JinHwanDo;Dong-KugChoi.Aflatoxins:Detection,Toxicity,andBiosynthesis.BiotechnologyandBioprocessEngineering2007,12,585-593;4.LiuZ.;GaoJ..Advancesinresearchondetectionmethodsforaflatoxins.JournalofAnhuiAgriculturalUniversity2004,31,223-226）。因此，面向AFB₁的新型检测试剂和检测方法亟待发展。

核酸适体（aptamer）是一类新型功能性核酸分子探针，基于指数富集配体系统进化技术（SELEX）从随机寡核苷酸文库中体外筛选获得，被誉为“人工抗体”，能与靶分子高亲和力和高特异性结合，具有筛选周期短、化学合成便捷经济且无批量差异、稳定性高、易于精确定点修饰等诸多优点，是潜在的抗体替代物，在生化分析检测领域显示出巨大的应用前景。目前，基于核酸适体的识别与检测方法逐渐成为一种新的普遍适用的技术（5.Liu,J.;Cao,Z.;Lu,Y.Functionalnucleicacidsensors.ChemRev2009,109,1948-1998;6.Clark,S.L.;Remcho,V.T.Aptamersasanalyticalreagents.Electrophoresis2002,23,1335-1340）。核酸适体技术应用于真菌毒素检测分析的生物传感器正处于积极开发研制中。例如，赭曲霉毒素A（OchratoxinA，OTA）和伏马毒素B₁（FumonisinB₁，FB₁）等多种真菌毒素的核酸适体已经筛选出来，并发展了多种检测体系（7.ScreeningandInitialBindingAssessmentofFumonisinB1AptamersInt.J.Mol.Sci.2010,11,4864-4881.8.DeterminationofOchratoxinAwithaDNAAptamer.J.Agric.FoodChem.2008,56,10456–10461.9.Yang,C.;Wang,Y.;Marty,J.;Yang,X.Aptamer-BasedColorimetricBiosensingofOchratoxinAusingUnmodifiedGoldNanoparticlesIndicator.Biosens.Bioelectron.2010.10.Kuang,H.;Chen,W.;Xu,D.;Xu,L.;Zhu,Y.;Liu,L.;Chu,H.;Peng,C.;Xu,C.;Zhu,S.FabricatedAptamer-BasedElectrochemical“signal-Off”SensorofOchratoxinA.Biosens.Bioelectron.2010,26,710–716）。因此，筛选AFB₁的特异性核酸适体并发展核酸适体技术用于AFB₁的检测新方法具有重要的研究意义和市场应用价值。

发明内容

本发明的第一目的在于提供黄曲霉毒素B₁的核酸适体AFB₁-22，该核酸适体应用基于琼脂糖微珠分离-流式细胞术分析的亲和SELEX技术筛选获得，能够高亲和力识别黄曲霉毒素B₁。

本发明的第二目的在于提供黄曲霉毒素B₁的核酸适体AFB₁-22在制备样品中黄曲霉毒素B₁检测试剂中的应用。

所述黄曲霉毒素B₁的核酸适体AFB₁-22，其序列如下：

ATACCAGCTTATTCAATTGTGGGGCGAGGGTGGCAGGAGGCAGGGGGGTGTTTTGATAGCGGGAGATAGTAAGTGCAATCT

所述黄曲霉毒素B₁的核酸适体AFB₁-22，利用OligoAnalyzer3.1在线软件模拟其二级结构，具有一种可能的茎环结构，其茎环结构如下：

所述黄曲霉毒素B₁的核酸适体AFB₁-22，与靶分子黄曲霉毒素B₁结合之后形成的复合物具有荧光偏振响应，并且黄曲霉毒素B₁本身的荧光会被猝灭，因此基于荧光偏振技术或荧光光谱方法，所述黄曲霉毒素B₁的核酸适体AFB₁-22可以作为样品中黄曲霉毒素B₁的一种潜在检测试剂，在制备样品中黄曲霉毒素B₁检测试剂中的应用。

本发明的优点在于：1）核酸适体通过基于琼脂糖微珠分离-流式细胞术分析的亲和SELEX技术筛选获得，体外筛选及检测简便快速；2）核酸适体本身是一段寡核苷酸，可以大量化学合成，无批量差异，稳定性好，易于保存；3）核酸适体能高亲和力识别黄曲霉毒素B₁，可与抗体媲美；4）核酸适体易于定点修饰标记，应用形式灵活多样，并且黄曲霉毒素B₁为有机小分子，本身具有荧光性质，两者性质相结合可发展一系列生物传感器，在检测分析领域的应用前景广阔。

附图说明

图1为AFB₁-beads的荧光显微镜成像图。图a为对照组Control-beads的明场成像，图b为样品组AFB₁-beads的明场成像，图c为对照组Control-beads的荧光暗场成像，图d为样品组AFB₁-beads的荧光暗场成像。

图2为AFB₁-beads的荧光光谱扫描图。曲线a为样品组AFB₁-beads。曲线b为对照组Control-beads。

图3为流式细胞术监测筛选进程中DNA初始文库对于靶分子AFB₁-beads富集的荧光偏移图。曲线a为空白AFB₁-beads，曲线b为DNA初始文库，曲线c为第4轮富集库，曲线d为第6轮富集库，曲线e为第8轮富集库，曲线f为第11轮富集库。

图4为流式细胞术监测筛选进程中DNA初始文库对于反筛分子COOH-beads富集的荧光偏移图。曲线a为空白COOH-beads，曲线b为DNA初始文库，曲线c为第4轮富集库，曲线d为第6轮富集库，曲线e为第8轮富集库，曲线f为第11轮富集库。

图5为流式细胞术测定核酸适体AFB₁-22对靶分子AFB₁-beads的结合曲线图。

图6为黄曲霉毒素B₁与核酸适体AFB₁-22结合的荧光偏振响应图。a为空白组自由AFB₁，b为对照组随机序列Random，c为样品组核酸适体AFB₁-22。

图7为黄曲霉毒素B₁与核酸适体AFB₁-22结合的荧光光谱扫描图。曲线a为空白组AFB₁，曲线b为对照组随机序列Random，曲线c为样品组核酸适体AFB₁-22。

具体实施方式

实施例1靶标AFB₁-beads的合成与表征

以琼脂糖微珠作为靶分子的固相载体，有利于分离未结合或弱结合及非特异性结合序列，并且适用于流式细胞术检测。将AFB₁偶联到琼脂糖微珠的合成路线具体如下：

取7.6mgAFB₁溶于4mL吡啶，加入35mg羧甲基羟胺盐酸盐，80℃回流过夜，经真空浓缩和硅胶柱层析（氯仿/甲醇=10:1），分离出AFB₁-oxime并溶于3mL无水二氯甲烷，加入5.4mgNHS、9.6mg二环己基碳二亚胺和5mg二甲氨基吡啶，磁转子搅拌过夜，经过滤和蒸发浓缩，获得AFB₁-oxime活化酯（11.Chu,F.S.;Hsia,M.T.;Sun,P.S.:Preparationandcharacterizationofaflatox-nB1-1-(O-carboxymethyl)oxime.Journal-AssociationofOfficialAnalyticalChemists1977,60,791-4.）。取0.107gNHS-beads分散在900μL磷酸氢二钾缓冲液（50mM，pH9.0）中，加入100μL乙二胺，磁转子搅拌过夜。离心去上清，并用PB缓冲液（0.1M，pH8.0）清洗微珠得到NH₂-beads。将AFB₁-oxime活化酯溶于0.8mLDMF，NH₂-beads分散于0.8mL磷酸氢二钾缓冲液（50mM，pH9.0）中，两者混合，磁转子搅拌过夜，然后用50%DMF和PB缓冲液清洗微珠获得AFB₁-beads，4℃避光保存。通过荧光光谱扫描（Ex：365nm；Em：380-600nm）和荧光显微镜成像对AFB₁-beads进行表征（参见图1和2）。

实施例2黄曲霉毒素B₁的特异性核酸适体的筛选

（1）随机寡核苷酸文库的设计与合成

设计并合成两端固定区域为18个核苷酸、中间随机区域为45个核苷酸的随机寡核苷酸文库如下：5'-ATACCAGCTTATTCAATT-N45-AGATAGTAAGTGCAATCT-3'，库容量在10¹⁵。所用引物序列分别为正向引物（FP）：5'-ATACCAGCTTATTCAATT-3'，反向引物（RP）：5'-AGATTGCACTTACTATCT-3'，荧光标记引物（FFP）：5'-FAM-ATACCAGCTTATTCAATT-3'，生物素标记引物（BRP）：5'-Bio-AGATTGCACTTACTATCT-3'（12.Shangguan,D.;Li,Y.;Tang,Z.;Cao,Z.C.;Chen,H.W.;Mallikaratchy,P.;Sefah,K.;Yang,C.J.;Tan,W.Aptamersevolvedfromlivecellsaseffectivemolecularprobesforcancerstudy.ProcNatlAcadSciUSA2006,103,11838-11843）。

（2）核酸适体的筛选

AFB₁-beads作为靶分子，水解NHS-beads形成的COOH-beads作为反筛分子。

取10nmol初始文库溶于200μL结合缓冲液（20mMTris-HCl，pH8.0，100mMNaCl，5mMKCl，2mMMgCl₂，1mMCaCl₂）中，95℃5min，冰浴5min，室温30min。次一级文库均使用200pmol。反筛操作从第三轮开始，将变性处理的文库与2μLCOOH-beads室温孵育5min。其过滤收集液与2μLAFB₁-beads室温孵育60min。使用结合缓冲液清洗微珠，将结合了DNA的AFB₁-beads直接进行PCR放大（使用FP和BRP，94℃3min；94℃15s；50℃15s；72℃15s；72℃3min），并用链酶亲和素微珠吸附和经0.1M的NaOH洗脱得到单链核酸文库，用于下一轮筛选。筛选过程逐轮增加筛选强度，共进行11轮。通过流式细胞术检测文库的富集情况（参见图3和4）。最后将富集收敛库进行克隆测序（13.Hu,J.;Wu,J.;Li,C.;Zhu,L.;Zhang,W.Y.;Kong,G.;Lu,Z.;Yang,C.J.AG-quadruplexaptamerinhibitsthephosphataseactivityofoncogenicproteinShp2invitro.Chembiochem.2011,12,424-430）。

实施例3核酸适体的亲和力表征

将核酸适体分子在5'端标记羧基荧光素（FAM），在200μL结合缓冲液中配制0-7000nM梯度溶液，热变性处理，与0.4μLAFB₁-beads室温孵育30min。用结合缓冲液清洗之后，悬浮于结合缓冲液中，用流式细胞仪测定微珠表面荧光强度。以荧光强度对核酸适体浓度作图，使用公式Y=BmaxX/(K_d+X)进行结合曲线的拟合测定核酸适体的结合解离常数K_d。（参见图5）。

实施例4荧光偏振与荧光光谱研究核酸适体与黄曲霉毒素B₁间的相互作用

用结合缓冲液（20mMTris-HCl，pH8.0，100mMNaCl，5mMKCl，2mMMgCl₂，1mMCaCl₂）配制2μM无标记核酸适体溶液，进行热变性处理，95℃5min，冰浴5min，室温放置30min。然后向其中加入黄曲霉毒素B₁使其终浓度为0.2μM，并在室温下孵育30min。空白组为相同条件下单独的黄曲霉毒素B₁溶液，对照组为随机序列Random。测定各组溶液体系的荧光各向异性值（Ex：365nm；Em：442nm）；对各组溶液体系进行荧光光谱扫描（Ex：365nm；Em：380～650nm）（参见图6和7）。

结果

实施例1按照在AFB₁上加一个羧基，与NH₂-beads通过形成稳定的酰胺键的基本思路进行偶联成功合成AFB₁-beads，并通过荧光显微镜成像和荧光扫描光谱对其形貌和偶联含量进行表征。如图1所示，在暗场荧光成像中，相对于没有经AFB₁修饰的Control-beads，AFB₁-beads发出明显的荧光；如图2所示，在365nm紫外光照射下，AFB₁-beads在425nm处发出荧光，比Control-beads的荧光值高6倍左右。由此可知，AFB₁-beads偶联成功。琼脂糖微珠上AFB₁的偶联含量通过基于荧光扫描光谱建立标准工作曲线进行测定，估测为4.5fmolAFB₁/beads。

实施例2基于琼脂糖微珠分离-流式细胞术分析的亲和SELEX技术筛选成功获得能够高亲和力识别黄曲霉毒素B₁的核酸适体。如图3所示，对于正筛靶分子AFB₁-beads，初始库没有明显的荧光偏移，基本上不与AFB₁-beads结合，随着筛选轮数的增加，第4、6、8、11轮富集库的荧光偏移逐渐增大，第11轮富集库的荧光偏移强度达到初始库的300倍，说明富集库中与AFB₁-beads结合的序列在筛选过程中逐渐富集；如图4所示，对于反筛分子COOH-beads，初始库、第4、6、8、11轮富集库都没有明显的荧光偏移，都不与COOH-beads结合。说明从随机寡核苷酸文库中筛选富集得到了与AFB₁-beads结合的核酸序列，因此将第11轮富集库送去克隆测序。

实施例3通过流式细胞术测定了核酸适体对靶分子AFB₁-beads的结合能力。如图5所示，黄曲霉毒素B₁的核酸适体AFB₁-22的结合解离常数K_d为2.06±0.17μM，具有较高的亲和力。

实施例4通过荧光偏振分析和荧光光谱扫描分析研究了核酸适体与靶分子黄曲霉毒素B₁之间的结合相互作用，因而验证了所述核酸适体可以作为样品中黄曲霉毒素B₁的一种潜在检测试剂。如图6所示，不存在核酸适体AFB₁-22时，自由的黄曲霉毒素B₁由于其本身是有机小分子，分子量仅为312.27g/mol，转动很快，测得其荧光各向异性值约为0.013；当核酸适体AFB₁-22存在时，测得其荧光各向异性值增加到约为0.043；而当对照随机序列Random存在时，其荧光各向异性值约为0.016，没有明显增加。由此说明所述核酸适体与靶分子黄曲霉毒素B₁之间的特异结合相互作用。如图7所示，在所用缓冲体系条件下，黄曲霉毒素B₁在紫外光365nm照射下，在442nm处发射荧光；当核酸适体AFB₁-22存在时，其最大发射波长处荧光值出现了非常显著的降低；而当对照随机序列Random存在时，相应的荧光值仅稍有降低。由此说明述核酸适体与靶分子黄曲霉毒素B₁结合之后，荧光猝灭。

Claims (2)

1.黄曲霉毒素B₁的核酸适体AFB₁-22，其特征在于，其序列如下：

ATACCAGCTTATTCAATTGTGGGGCGAGGGTGGCAGGAGGCAGGGGGGTGTTTTGATAGCGGGAGATAGTAAGTGCAATCT。

2.如权利要求1所述黄曲霉毒素B₁的核酸适体AFB₁-22的在制备样品中黄曲霉毒素B₁检测试剂中的应用。