CN104818319A - 黄曲霉毒素 b1 的实时定量 pcr 检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黄曲霉毒素B₁的实时定量PCR检测方法，属于黄曲霉毒素B₁的检测领域。本发明利用黄曲霉毒素B₁适配体对黄曲霉毒素B₁进行识别，利用实时定量PCR对黄曲霉毒素B₁适配体的互补DNA链进行扩增作为信号输出，根据扩增结果，建立黄曲霉毒素B₁与扩增循环数之间的线性关系，对黄曲霉毒素B₁的含量进行定量分析，实现对黄曲霉毒素B₁的识别和检测。本发明在线性、灵敏度、回收率、选择性和重现性等方面做了方法验证，结果证明本发明所建立的黄曲霉毒素B₁的实时定量PCR检测方法具有线性范围好、灵敏度高、选择性好、稳定性强等优点。

Description

黄曲霉毒素 B1 的实时定量 PCR 检测方法

技术领域

本发明涉及一种黄曲霉毒素B₁的检测方法，尤其涉及一种基于适配体的生物传感器结合实时定量PCR的黄曲霉毒素B₁的检测方法，属于黄曲霉毒素B₁的定量检测领域。 

背景技术

黄曲霉毒素是最重要的霉菌毒素之一，是由包括黄曲霉和寄生曲霉的霉菌产生的有毒次级代谢产物，在黄曲霉毒素的几种亚型中(B₁,B₂,G₁,G₂和M₁)，AFB₁的毒性最强，因此AFB₁被世界卫生组织(WHO)国际癌症研究机构指定为主要致癌物。由于霉菌毒素对动物和人类产生的毒性效应，霉菌毒素污染在饲料和食品安全领域已经引起了全球的广泛关注。 

AFB₁可以直接污染食品(例如在高温潮湿环境下谷类，坚果)或者间接污染饲料，动物采食AFB₁后，在奶中产生代谢物。为了阻止由于污染的饲料和食品的召回带来的食品安全恐慌和经济损失，很多国家对黄曲霉毒素进行了限量。不同食品AFB₁的限量范围为0.05-20ng mL^-1。对于AFB₁低限量，高出现率和其剧毒性表明快速，灵敏和特异性检测方法甚至定量追踪AFB₁的水平是十分必要的。 

现有的定量检测AFB₁的方法主要有TLC、HPLC和LC结合MS技术。然而，仪器法需要复杂的前处理，专业的操作人员和昂贵的仪器设备，这些要求限制了仪器法的应用。因此，一些快速筛选方法如ELISA，免疫传感器和SPR的方法也得到了广泛的应用。但是在运输和贮存过程中由于抗体的稳定性难以保证，尤其是在受控环境中时，限制了这类方法的应用。与抗体有着类似功能的适配体，具有低价格，高稳定性，易修饰和易合成等优点，可以重复使用和长时间保存。除此之外，适配体可以作为PCR扩增的模板很大 程度上提高检测灵敏度，产生的荧光信号作为定量检测的指示器。但是，基于适配体传感器的霉菌毒素研究主要集中于OTA和FB₁，可用于霉菌毒素的适配体是十分有限的，有待改进。 

发明内容

本发明的目的是提供一种基于适配体的生物传感器的黄曲霉毒素B₁的实时定量PCR检测方法，该检测方法具有线性范围好、灵敏度高、选择性好、稳定性强等优点。 

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的： 

一种检测黄曲霉毒素B₁的实时定量PCR检测方法，该方法包括以下步骤： 

本发明公开了一种黄曲霉毒素B₁(AFB₁)的实时定量PCR检测方法，该方法利用黄曲霉毒素B₁适配体对黄曲霉毒素B₁进行识别，利用实时定量PCR对黄曲霉毒素B₁适配体的互补DNA链进行扩增作为信号输出，从而实现对黄曲霉毒素B₁的识别和检测，所述实时定量PCR检测方法包括以下步骤： 

(1)将AFB₁的生物素化的适配体与互补单链DNA链进行杂交，得到混合溶液；(2)将混合溶液加入到PCR管中；(3)将待检测的样品加入到PCR管中；与适配体杂交的互补单链DNA链与待检测的样品中的AFB₁相结合，释放出互补单链DNA链；去除PCR管中适配体与黄曲霉毒素B₁的复合物以及释放出的互补DNA链；(4)向PCR管中加入特异性的上下游引物，以固定在PCR管表面的互补单链DNA为模板建立RT-qPCR定量检测体系，进行RT-qPCR扩增反应；(4)根据扩增结果，建立黄曲霉毒素B₁与扩增循环数(Ct值)之间的线性关系，对黄曲霉毒素B₁的含量进行定量分析。 

本发明中所述的“AFB₁的生物素化的适配体”的核苷酸序列优选为 SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，在其3′端连有生物素。 

本发明中所述的“互补单链DNA链”的核苷酸序列可以是任何一种能够与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列进行互补或杂交的序列；本领域技术人员根据SEQ ID No.1所示的核苷酸序列很容易设计得到，优选为SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。 

本发明通过优化试验发现，链霉亲和素修饰的PCR管与未修饰的PCR管检测后的Ct值有明显的差异，表明链霉亲和素修饰的PCR管与生物素化的适配体有很强的结合能力。因此，为了达到更好的检测效果，优选的，本发明步骤(2)中将混合溶液加入到固定或交联有链霉亲和素的PCR管中，能够有效提高检测的灵敏度及准确性。 

链霉亲和素、生物素化的适配体和互补单链DNA的浓度在很大程度上会影响检测效果。本发明通过比较不同浓度的链霉亲和素检测出的Ct值，发现链霉亲和素浓度为2.5ng mL^-1时，Ct值达到最低水平。当生物素化的适配体的浓度低于5.0nM时，适配体的浓度升高，Ct值相应降低。当生物素化的适配体的浓度高于5.0nM时，生物素化的适配体的浓度升高，Ct值相应升高，可能是由于空间位阻产生了这样的结果。因此，本发明最终优选2.5ng mL^-1的链霉亲和素和5.0nM的生物素化的适配体作为优化后的浓度用于RT-qPCR检测。 

固定在PCR管表面的互补单链DNA作为PCR扩增的模板，其浓度和特异性的PCR扩增引物非常重要并需要优化。扩增曲线表明互补单链DNA浓度与循环数的相互关系，DNA浓度降低，循环数升高。当互补单链DNA浓度范围为1×10^-4到10nM之间，显示了很好的线性关系，有很高的相关系数(R²＝0.9962)，线性回归方程为Ct＝-3.3661lg C+38.127(Ct表示循环数，C表示AFB₁-DNA的浓度)。互补DNA的浓度为10nM是缘于该浓度下检测到最低水平的Ct值。 

步骤(4)中所述的RT-qPCR定量检测体系优选按照以下方式建立： 

50μL PCR反应体系由以下部分组成：浓度范围1×10^-4到10nM之间的互补DNA为5μL,10μM上、下游引物分别添加2μL，25μLPremix Ex(2×),1μL ROX Reference Dye II(50×)和15μL水。 

所述上、下游引物的核苷酸序列分别为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。 

所述的实时PCR循环参数设置如下：预变性30s95℃,变性40个循环5s95℃,退火34s60℃。每一次退火后进行荧光检测。熔解曲线分析从60℃-95℃检测是否有非特异性引物产生，条件设置如下：预变性15s95℃,变性40个循环1min60℃,退火15s95℃. 

通过公式E＝10^(-1/slope)-1计算扩增效率并评估RT-qPCR的定量效果，其中，E表示扩增效率；slope表示斜率。 

本发明通过对各种参数进行优化，RT-qPCR检测出不同浓度的AFB₁对应的扩增曲线所示，AFB₁的浓度增加，循环数相应增加。反应体系中AFB₁的量越大，释放的互补DNA的量越大，导致PCR模板的减少，Ct值的增加。通过PCR检测的标准曲线的线性回归方程计算出样品中AFB₁的含量。AFB₁的浓度范围5×10^-5-5ng mL^-1与对应的Ct值之间的校准曲线呈线性相关(R²＝0.9932)，线性回归方程为Ct＝3.816lg C+24.622(Ct表示循环数，C表示AFB₁的浓度)。检测AFB₁的检出限(S/N＝3)为25fg mL^-1，相比已经报道的AFB₁检测方法中的检出限低400倍。与当前可用的仪器法和快速筛选方法相比(表1)，本发明检测AFB₁的灵敏度要远远优于现有的检测方法的灵敏度。 

表1  现有AFB₁检测方法的灵敏度数据 

为了验证本发明检测方法的特异性，本发明选择八种主要的霉菌毒素，即：OTA,ZEN，α-ZOL，FB₁，AFM₁，AFB₂，AFG₁和AFG₂，作为干扰物。当检测这八种霉菌毒素时，浓度均为5ng mL^-1，Ct值没有明显变化。除此之外，不含任何霉菌毒素的对照组的结果也没有显著差异。特异性验证结果表明本发明检测方法具有优秀的选择性(因为生物素标记的适配体不识别其他的干扰物)。此外，作为AFB₁检测方法的实际应用，重复性的检测也至关重要，本发明通过检测相同的样品(5.0×10^-4ng mL^-1AFB₁)七次，通过检测结果Ct值的变化评估本发明方法的重复性。试验结果表明，本发明检测方法的相对标准偏差仅为2.0％，表明重复性很好。 

为了评估本发明检测方法的实用性和准确性，采用本发明方法验证了羊草样品和婴幼儿米粉样品中添加的AFB₁的水平。羊草样品中添加AFB₁的浓度分别为5×10^-5,1×10^-4,0.01和0.1ng mL^-1，婴幼儿米粉中AFB₁的添加浓度为5×10^-4,1×10^-3,0.005和0.01ng mL^-1。实验结果显示，回收率范围分别为88-127％和94-119％，表明本发明检测方法用于快速检测饲料和食品中的AFB₁具有良好的实用性和准确性。 

附图说明

图1本发明方法检测黄曲霉毒素B₁的原理图。 

图2互补单链DNA以及PCR引物的特异性的优化实验；(A)不同浓度互补DNA的扩增曲线；(B)互补DNA链的浓度与Ct值之间的标准曲线。 

图3互补单链DNA以及PCR引物的特异性的优化实验；对应于扩增曲线的溶解曲线图。 

图4链霉亲和素，生物素化的适配体和互补单链DNA的浓度优化实验结果；(A)固定互补DNA的AFB₁的浓度，不同浓度适配体与链霉亲和素条件下Ct值的变化；(B)固定适配体，互补DNA和AFB₁的浓度，不同浓度链霉亲和素条件下Ct值的变化。 

图5RT-qPCR检测出不同浓度的AFB₁对应的扩增曲线；(A)不同浓度AFB₁的扩增曲线；(B)AFB₁的浓度与Ct值之间的标准曲线。 

图6本发明检测方法的选择性试验结果：固定互补DNA，适配体和链霉亲和素的浓度，比较不同毒素产生的Ct值变化。 

图7本发明检测方法的重复性试验结果：固定AFB₁，互补DNA，适配体和链霉亲和素的浓度。 

具体实施方式

通过下列实施例将更具体说明本发明的实施方式，但是应理解所述实例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。 

1.材料与方法 

1.1实验材料和主要试剂 

表2  标准品和主要试剂 

适配体序列： 

5′-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCC-biotin-3′(SEQ ID No.1) 

互补DNA序列： 

5′-ACACGTGCCCAACAATCTGGTTTAGCTACGCCTTCCCCGTGGCGATGTTTCTTAGCGCCTTAC3′(SEQ ID No.2) 

在适配体的3′端修饰生物素(biotin)。 

修饰方法： 

3′BIOTIN：使用3’biotinCPG，直接合成DNA序列，然后氨解，HPLC纯化，定量，抽干后获得序列 

上游引物:5′-AATCTGGTTTAGCTACGCCTTC-3′(SEQ ID No.3) 

下游引物:5′-GTAAGGCGCTAAGAAACATCG-3′(SEQ ID No.4) 

实验例1 互补单链DNA以及PCR引物的特异性的优化实验 

固定在PCR管表面的互补单链DNA作为PCR扩增的模板，其浓度和PCR引物的特异性非常重要；本发明为了提升检测效果，对互补单链DNA的浓度以及PCR检测引物进行了优化。 

优化实验过程如下：利用ABI7500实时PCR系统进行检测，50μLPCR反应体系由以下部分组成：浓度范围1×10^-4到10nM的互补单链DNA 分别为5μL,10μM上下游引物(SEQ ID No.3和SEQ ID No.4)分别添加2μL，25μLPremix Ex(2×),1μL ROX Reference Dye II(50×)和15μL水。实时PCR循环参数设置如下：预变性30s95℃,变性40个循环5s95℃,退火34s60℃。每一次退火后进行荧光检测。熔解曲线分析从60℃-95℃检测是否有非特异性引物产生，条件设置如下：预变性15s95℃,变性40个循环1min60℃,退火15s95℃。 

通过公式E＝10^(-1/slope)-1计算扩增效率和评估RT-qPCR的定量效果。 

与扩增曲线对应的标准曲线如图2所示，扩增曲线表明互补单链DNA浓度与循环数的相互关系，DNA浓度降低，循环数升高。Ct值与互补DNA浓度的相互关系表明RT-qPCR方法检测互补DNA具有灵敏度高，可定量检测和高扩增效率(98.2％)。 

结果显示，互补DNA浓度范围1×10^-4到10nM内显示了很好的线性关系，很高的相关系数(R²＝0.9962)，线性回归方程为Ct＝-3.3661lg C+38.127，Ct表示循环数，C表示AFB₁DNA的浓度。优化后的互补DNA的浓度为10nM是缘于该浓度下检测到最低水平的Ct值。 

图3的溶解曲线在80℃显示出单峰，表明PCR扩增进程是特异的，没有引物二聚体和其他的非特异性DNA片段产生。 

实验例2 链霉亲和素，生物素化的适配体和互补单链DNA的浓度优化实验 

链霉亲和素，生物素化的适配体和互补单链DNA的浓度很大程度上会影响适配体传感器的检测效果。为了获得最佳的检测效果，本发明对链霉亲和素，生物素化的适配体和互补单链DNA的浓度进行了优化。 

优化实验过程如下：1)固定互补DNA的浓度为10nM，通过分析PCR扩增信号的变化优化链霉亲和素和适配体的浓度，50μL0.8％戊二醛溶液处理PCR管37℃5h。超纯水洗三次之后，添加0.01M碳酸盐缓冲液溶解的链霉亲和素(浓度分别为2.5,5,10ng mL^-1)50μL孵育2h(37℃)，PBST 缓冲液洗两次之后，生物素化的适配体(浓度分别为0,2.5,5,10,20nM)和互补DNA链在杂交缓冲液中1:1(v/v)充分混合，50μL的混合物添加到每个管中孵育1h(37℃)。杂交缓冲液洗PCR管三次，分别添加5ng mL^-1的AFB₁，孵育1h(45℃)。Tris缓冲液洗三次后添加PCR反应体系，按上述PCR反应条件检测。2)固定适配体和互补DNA的浓度分别为5nM和10nM，链霉亲和素的添加浓度分别为0,2.5,5ng mL^-1，按实验例1的实验过程进行检测。 

实验结果见图4，图4显示，链霉亲和素修饰与未修饰的PCR管检测后的Ct值有明显的差异，表明链霉亲和素修饰的PCR管与生物素化的适配体有很强的结合能力。比较不同浓度的链霉亲和素检测出的Ct值，发现链霉亲和素浓度为2.5ng mL^-1时Ct值达到最低水平。当适配体的浓度低于5.0nM时，适配体的浓度升高，Ct值相应降低。当适配体的浓度高于5.0nM时，适配体的浓度升高，Ct值相应升高，可能是由于空间位阻产生了这样的结果。因此，本实验选择2.5ng mL^-1的链霉亲和素和5.0nM的适配体作为优化后的浓度用于RT-qPCR检测实验。详细实验结果见表3。 

表3 

优化条件下，RT-qPCR检测出不同浓度的AFB₁对应的扩增曲线如图5(A)所示，AFB₁的浓度增加，循环数相应增加。反应体系中AFB₁的量越大，释放的互补DNA的量越大，导致PCR模板的减少，Ct值的增加。AFB₁的浓 度范围5×10^-5-5ng mL^-1与对应的Ct值之间的校准曲线呈线性相关(R²＝0.9932)，线性回归方程为Ct＝3.816lg C+24.622,Ct表示循环数，C表示AFB₁的浓度。检测AFB₁的检出限(S/N＝3)为25fg mL^-1，相比已经报道的AFB₁检测方法中的检出限低400倍。与当前可用的仪器法和快速筛选方法相比(表1)，本实验结果有力证明本发明检测AFB₁的灵敏度要远远高于现有的检测AFB₁方法的灵敏度。 

实施例1 基于适配体的AFB₁的实时定量PCR检测方法的建立和方法验证 

1.适配体的固定 

适配体的固定和一些修饰作用。为提高吸附作用，使用之前用50μL0.8％戊二醛溶液处理PCR管37℃5h。超纯水洗三次之后，添加0.01M碳酸盐缓冲液溶解的链霉亲和素50μL孵育2h(37℃)，PBST缓冲液洗两次之后，适配体和互补DNA链在杂交缓冲液中1:1(v/v)充分混合，50μL的混合物添加到每个管中孵育1h(37℃)。为了除去未结合的DNA片段，用杂交缓冲液洗PCR三次，使适配体与修饰的DNA留在PCR管的表面。 

2.RT-qPCR条件 

利用ABI7500实时PCR系统进行检测，50μL PCR反应体系由以下部分组成：10μM上下游引物分别添加2μL，25μLPremix Ex (2×),1μL ROX Reference Dye II(50×)和20μL水。实时PCR循环参数设置如下：预变性30s95℃,变性40个循环5s95℃,退火34s60℃。每一次退火后进行荧光检测。熔解曲线分析从60℃-95℃检测是否有非特异性引物产生，条件设置如下：预变性15s95℃,变性40个循环1min60℃,退火15s95℃.通过公式E＝10^(-1/slope)-1计算扩增效率和评估RT-qPCR的定量效果。 

3.方法验证 

3.1特异性和重复性验证 

为了验证本发明检测方法的特异性，本发明选择八种主要的霉菌毒素，即：OTA,ZEN，α-ZOL，FB₁，AFM₁，AFB₂，AFG₁和AFG₂作为干扰物。当检测这八种霉菌毒素时，浓度均为5ng mL^-1，Ct值没有明显变化。除此之外，不含任何霉菌毒素的对照组的结果也没有显著差异。特异性验证结果表明本发明检测方法具有优秀的选择性(图6)。此外，作为AFB₁检测方法的实际应用，重复性的检测也至关重要，本发明通过检测相同的样品(5.0×10^-4ng mL^-1AFB₁)七次，通过检测结果Ct值的变化评估本发明方法的重复性。试验结果表明，本发明检测方法的相对标准偏差仅为2.0％，表明重复性很好(图7)。 

3.2实用性和准确性验证 

通过检测羊草样品和婴幼儿米粉样品对本发明检测方法的实用性和准确性进行验证。 

羊草样品中AFB₁的添加浓度为5×10^-5,1×10^-4,0.01和0.1ng mL^-1。 

样品处理过程如下：烘干后每份样品准确称取0.5g于10ml离心管，添加2.5ml70％的甲醇水溶液提取样品中的AFB₁,利用Vortex-Genie2(Scientific Industries,USA)涡旋上述整个混合物5min后10,000g条件下离心10min。收集上清液氮吹浓缩至0.5ml。最后，剩余的溶液用2ml5％的甲醇水溶液复溶，利用RT-qPCR进行检测。除此之外，婴幼儿米粉样品中AFB₁的添加浓度为5×10^-4,1×10^-3,0.005和0.01ng mL^-1，前处理方法与羊草样品的相同。 

实验结果见表4。实验结果显示回收率范围分别为88-127％和94-119％，表明本发明检测方法用于快速检测饲料和食品中的AFB₁具有良好的实用性和准确性。 

表4  羊草样品和婴幼儿米粉样品中AFB₁的加标测定 

a.三次重复试验平均值；b.SD＝标准偏差 。

Claims (10)

1.黄曲霉毒素B₁的实时定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将AFB₁的生物素化的适配体与互补单链DNA链进行杂交，得到混合溶液；(2)将混合溶液加入到PCR管中；(3)将待检测的样品加入到PCR管中，释放出互补单链DNA链；(4)用固定在PCR管表面的互补单链DNA建立RT-qPCR定量检测体系进行RT-qPCR扩增反应；(4)根据扩增结果，对样品中AFB₁的含量进行定量分析。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的AFB₁的生物素化的适配体的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，其3′端连有生物素。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的互补单链DNA的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中将混合溶液加入到吸附或交联有链霉亲和素的PCR管中；优选的，链霉亲和素的浓度为2.5ng mL^-1。

5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：将AFB₁的生物素化的适配体与互补单链DNA链按照1:1的体积比进行杂交；其中，所述生物素化的适配体浓度为5.0nM。

6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：RT-qPCR定量检测体系中互补单链DNA浓度范围为1×10^-4到10nM。

7.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)中所述的RT-qPCR定量检测体系按照以下方式建立：

50μL PCR反应体系由以下部分组成：浓度范围1×10^-4到10nM之间的互补单链DNA为5μL，10μM上、下游引物分别添加2μL，25μL2×Premix Ex1μL50×ROX Reference Dye II和15μL水；所述上、下游引物的核苷酸序列分别为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。

8.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的RT-qPCR反应参数如下：预变性30s95℃,变性40个循环5s95℃,退火34s60℃。

9.按照权利要求7所述的方法，其特征在于：根据扩增结果，建立黄曲霉毒素B₁与扩增循环数之间的线性关系，对黄曲霉毒素B₁的含量进行定量分析。

10.按照权利要求9所述的方法，其特征在于：所述线性关系的线性回归方程为：Ct＝3.816lg C+24.622，其中，Ct表示循环数，C表示AFB₁的浓度。