CN102507805B - 谷物中单端孢霉烯族毒素化合物的检测方法及检测用固相萃取柱 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种谷物中单端孢霉烯族毒素化合物的检测方法及检测用固相萃取柱，该固相萃取柱的本体包括一过滤管，该过滤管的顶端开口且底端开有滤孔，管底垫有滤纸，滤纸上填充有玻璃纤维及萃取剂，萃取剂主要由质量比为9∶（1.5～2.5）∶（5.0～6.0）的氧化铝、活性碳粉和二氧化硅组成。本发明的检测方法包括以下步骤：先利用乙腈水溶液对待测试样进行提取，然后将提取液过柱，将过柱后的滤液氮吹浓缩至干；再将衍生剂加入样品残渣中，振荡、脱水后上气相色谱仪分析；最后根据分析测得的峰面积即可换算出样品中单端孢霉烯族毒素化合物的含量。本发明的固相萃取柱结构简单、低碳环保，检测方法的步骤简单、检测精度高、检测成本低。

Description

谷物中单端孢霉烯族毒素化合物的检测方法及检测用固相萃取柱

技术领域

本发明属于色谱分析技术领域，具体涉及一种谷物中有毒有害化学物质的色谱分析检测方法及检测用固相萃取柱（SPE小柱）。

背景技术

单端孢霉烯族化合物广泛存在于多种谷物及其制品中，例如比较典型的脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）与雪腐镰刀菌烯醇（nivalenol，N1V），这两种物质是由镰刀菌产生的一类次级代谢产物。DON又称呕吐毒素，人和动物在食用被该毒素污染的食品或饲料后可产生广泛的毒性效应，常引起呕吐、头痛、发热和恶心。1998年，国际癌症研究机构（IARC）公布的评估报告中，DON被列为第3类致癌物。近年来研究表明，DON与人类食管癌、IgA肾病、胃癌、骨关节病等有关。NIV具有与DON相似的毒性，虽然其污染率与毒性相对较低，但也广泛存在于多种农作物中，危害性不容忽视。DON、NIV不仅污染粮食谷物，也可污染粮食制品，因其在世界范围内具有较高的污染率而引起人们的普遍关注，各国都制定了严格的限量标准，我国谷物中DON的限量标准为1.0mg/kg。

目前，谷物中单端孢霉烯族毒素化合物的测定方法有薄层色谱法（TLC）、酶联免疫吸附法（ELISA）、气相色谱（GC-ECD）、气质联用（GC-MS）和高效液相色谱法（HPLC）、液质联用（HPLC-MS）等，其中GC-ECD、GC-MS和HPLC-MS等方法被认为是检测此类毒素高灵敏度的方法，但GC-MS和HPLC-MS的检测用仪器昂贵。此外，在现有国内外文献有关单端孢霉烯族毒素化合物的检测报道中，样品的提取、净化步骤也较为繁琐，需要用到大量的有毒有害性有机试剂（如三氯甲烷、乙醚、石油醚等），而且现有的检测方法往往还需要用到Mycosep多功能净化柱、Sep-Pak、 Florisil柱等费用较为昂贵的SPE净化小柱，现有的检测方法不仅容易对环境造成污染，而且增加了检测成本和检测费用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种结构简单、成本低、低碳环保的用于检测谷物中单端孢霉烯族毒素化合物的固相萃取柱，还提供一种检测步骤简单、检测精度高、检测成本低的谷物中单端孢霉烯族毒素化合物的检测方法。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种用于检测谷物中单端孢霉烯族毒素化合物的固相萃取柱，所述固相萃取柱的本体包括一过滤管，该过滤管的顶端开口且底端开有滤孔，过滤管管底垫有滤纸，滤纸上填充有玻璃纤维，玻璃纤维上装填有萃取剂，萃取剂上覆盖有玻璃纤维；所述萃取剂主要由质量比为9∶（1.5～2.5）∶（5.0～6.0）的氧化铝、活性碳粉和二氧化硅组成。

上述本发明的技术方案中，所述单端孢霉烯族毒素化合物优选包括脱氧雪腐镰刀菌烯醇和/或雪腐镰刀菌烯醇。

上述本发明的技术方案中，所述过滤管优选采用注射针管。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种谷物中单端孢霉烯族毒素化合物的检测方法，包括以下步骤：

（1）提取：利用乙腈水溶液对待测试样进行提取得提取液，所述乙腈水溶液中乙腈的体积分数为80%～90%；

（2）过柱：将步骤（1）中的提取液过权利要求1所述的固相萃取柱，将过柱后的滤液在45℃下氮吹浓缩至干得样品残渣；

（3）衍生：将准备好的衍生剂加入步骤（2）后的样品残渣中，涡旋振摇后室温下反应12min～20 min，再加入正己烷涡旋混匀，加水剧烈振荡，静置分层后取上层溶液用无水硫酸钠脱水，上气相色谱仪分析；

（4）测定：根据气相色谱分析测得的峰面积和已经绘制好的标准曲线定出待测试样中单端孢霉烯族毒素化合物的含量n，最后根据待测试样的稀释倍数F即可换算出实际谷物样品中单端孢霉烯族毒素化合物的含量N。

上述的谷物中单端孢霉烯族毒素化合物的检测方法，所述单端孢霉烯族毒素化合物优选包括脱氧雪腐镰刀菌烯醇和/或雪腐镰刀菌烯醇。

上述的谷物中单端孢霉烯族毒素化合物的检测方法中，优选的，所述衍生剂（TBT）主要是由体积比为3∶3∶2的三甲基硅烷咪唑（TMSI）、N，O一双三甲基硅基乙酰胺（BSA）和三甲基氯硅烷（TMCS）组成。

上述的谷物中单端孢霉烯族毒素化合物的检测方法中，所述气相色谱仪的工作参数优选为：检测器温度为250℃～300℃，进样口温度为230℃～280℃，载气为高纯氮气，载气流速为1.0 mL/min～2.5 mL/min，分流比为（1～10）∶1，电流为1.0nA，尾吹气流量为40mL/min。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

（1）本发明检测用的固相萃取柱结构简单、制作方便、成本低；

（2）本发明检测方法的整个预处理过程只用到一种有机试剂（即乙腈），具有低碳环保的显著特点；

（3）本发明的检测步骤更加简洁，实验成本低廉，有利于推广和应用；

（4）本发明检测方法的检测精度高，取得了很好的检测效果。

附图说明

图1为本发明实施例中未经固相萃取柱净化的样品分析色谱图。

图2为本发明实施例中经固相萃取柱净化后的样品分析色谱图。

图3为本发明实施例中DON含量分别为0.2μg/mL、0.4μg/mL、1.0μg/mL、1.4μg/mL、2.0μg/mL 时绘制的标准工作曲线。

图4为本发明实施例中NIV 含量分别为0.2μg/mL、0.4μg/mL、1.0μg/mL、1.4μg/mL、2.0μg/mL 时绘制的标准工作曲线。

图5为本发明实施例中小麦样品一检测出的色谱图。 

图6为本发明实施例中小麦样品二检测出的色谱图。

图7为本发明实施例中小麦样品三检测出的色谱图。

图8为本发明实施例中的固相萃取柱的结构示意图（剖视）。

图例说明

1、注射器针管； 2、注射孔； 3、滤纸片； 4、玻璃纤维； 5、萃取剂。 

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步描述。

实施例：

一种如图8所示的本发明的用于检测谷物中单端孢霉烯族毒素化合物（尤其是脱氧雪腐镰刀菌烯醇、雪腐镰刀菌烯醇）的固相萃取柱（SPE小柱），本实施例是利用5mL无菌塑料注射器针管自制固相萃取柱，该固相萃取柱的本体包括一注射器针管1，该注射器针管1的顶端开口且底端设有注射孔2作为滤孔，注射器针管1管底垫有大小适合的滤纸片3，滤纸片3上填充有玻璃纤维4（本实施例选用石英棉），玻璃纤维4上装填有1.60g混合均匀的萃取剂5，萃取剂5上再覆盖一层玻璃纤维4，用玻璃棒将以上填充物压实，自制SPE小柱制作完成。萃取剂5主要由质量比为9∶2∶5.5的氧化铝、活性碳粉和二氧化硅组成。

本发明实施例中未经固相萃取柱净化的样品分析色谱图和经固相萃取柱净化后的样品分析色谱图（采用的气相色谱仪为岛津GC-2010，具⁶³Ni电子捕获检测器）分别见图1、图2。由图1和图2可知，图2中色谱图的杂质峰明显少于图1，这表明本发明的固相萃取柱基本去除了杂质峰的干扰，达到了较好的净化效果。

一种谷物中脱氧雪腐镰刀菌烯醇、雪腐镰刀菌烯醇的检测方法，包括以下步骤：

（1）提取：分别称取5.0g混合均匀的三种小麦样品（分别标明样品一、样品二和样品三）于100mL具塞三角瓶中，然后加入乙腈水溶液（乙腈与水的体积比为84∶16）40mL，盖好瓶塞振摇30min，过滤，过滤后的提取液在-20℃保存备用；

（2）过柱：取步骤（1）中的提取液5mL以上过本实施例中自制的SPE小柱，滤液用10mL玻璃刻度离心管接收，然后用2mL上述的乙腈水溶液淋洗SPE小柱并将此滤液一并收集，将过柱后的滤液在45℃下氮吹浓缩至干得样品残渣；

（3）衍生：将100μL衍生剂加入步骤（2）后的样品残渣中，衍生剂主要是由体积比为3∶3∶2的三甲基硅烷咪唑、N，O一双三甲基硅基乙酰胺和三甲基氯硅烷组成，快速涡旋振摇1min，室温下反应15min，再加入500μL正己烷涡旋混匀30s，再加入1mL剧烈振荡2min，静置分层后取上层溶液用无水硫酸钠脱水，上气相色谱仪分析（同上），进样量1μL；

色谱柱：RTX-5MS弹性石英毛细管柱（15m×0.25mm id，液膜厚度0.25μm），ECD检测器温度为300℃，进样口温度为250℃；柱箱程序升温：初始温度120℃，维持2min，以20℃/min升温到160℃后维持2min，再以15℃/min升温到240℃后维持10min；载气为高纯氮气（纯度99.999%），载气流速为2.0mL/min，分流比为5∶1，电流为1.0nA，尾吹气流量为40mL/min；

（4）绘制标准曲线：准备吸取一定量的标准溶液，与上述待测样品同时衍生化，用作气相色谱测定时标准溶液中待测物质（DON、NIV）的含量分别为0.2μg/mL、0.4μg/mL、1.0μg/mL、1.4μg/mL、2.0μg/mL，以分别测得的峰面积作为纵坐标，以标准溶液中待测物质的含量作为横坐标绘制出标准曲线如图3、图4所示，由图3和图4可见，DON、NIV在0.2μg/mL～2.0μg/mL浓度范围内线性关系良好，相关系数分别为0.9994和0.9991；

（5）测定：根据气相色谱分析测得的峰面积（样品一、二、三测得的色谱图分别如图5～图7所示）和已经绘制好的标准曲线定出待测试样中脱氧雪腐镰刀菌烯醇或雪腐镰刀菌烯醇的含量n，最后根据待测试样的稀释倍数F即可换算出实际谷物样品中雪腐镰刀菌烯醇或雪腐镰刀菌烯醇的含量N，换算公式为：

N = n×F×1000/m（m为待测试样的质量，即5.0g）。

由图5可见，本实施例的小麦样品一中DON、NIV两种毒素均有检出，检出值分别为526.3μg/kg、106.83μg/kg，由图6可见，本实施例的小麦样品二中仅有DON这一种毒素检出，检出值为318.5μg/kg，由图7可见，本实施例的小麦样品三中DON、NIV两种毒素均未检测出。

回收率试验：当小麦粉中DON、NIV的添加量在0.1mg/kg～1.0 mg/kg时，两者的五次重复试验回收率分别为92.6%～97.6%和90.9%～93.3%，方法的精密度小于6%，检出限为0.01mg/kg。通过回收率试验和精密度试验证明本发明的方法准确可靠。

Claims (2)

1.一种谷物中单端孢霉烯族毒素化合物的检测方法，包括以下步骤：

（1）提取：利用乙腈水溶液对待测试样进行提取得提取液，所述乙腈水溶液中乙腈的体积分数为80%～90%；

（2）过柱：将步骤（1）中的提取液过固相萃取柱，将过柱后的滤液在45℃下氮吹浓缩至干得样品残渣；所述固相萃取柱的本体包括一注射针管，该注射针管的顶端开口且底端开有滤孔，注射针管管底垫有滤纸，滤纸上填充有玻璃纤维，玻璃纤维上装填有萃取剂，萃取剂上覆盖有玻璃纤维；所述萃取剂主要由质量比为9∶2∶5.5的氧化铝、活性碳粉和二氧化硅组成；

（3）衍生：将准备好的衍生剂加入步骤（2）后的样品残渣中，所述衍生剂主要是由体积比为3∶3∶2的三甲基硅烷咪唑、N，O一双三甲基硅基乙酰胺和三甲基氯硅烷组成，涡旋振摇后室温下反应12min～20 min，再加入正己烷涡旋混匀，加水剧烈振荡，静置分层后取上层溶液用无水硫酸钠脱水，上气相色谱仪分析；

（4）测定：根据气相色谱分析测得的峰面积和已经绘制好的标准曲线定出待测试样中单端孢霉烯族毒素化合物的含量n，最后根据待测试样的稀释倍数F即可换算出实际谷物样品中单端孢霉烯族毒素化合物的含量N；

所述气相色谱仪的工作参数为：检测器温度为250℃～300℃，进样口温度为230℃～280℃，载气为高纯氮气，载气流速为1.0 mL/min～2.5 mL/min，分流比为1～10∶1，电流为1.0nA，尾吹气流量为40mL/min。

2.根据权利要求1所述的谷物中单端孢霉烯族毒素化合物的检测方法，其特征在于：所述单端孢霉烯族毒素化合物包括脱氧雪腐镰刀菌烯醇和/或雪腐镰刀菌烯醇。