CN103913538B - 一种茶鲜叶中有机磷类农药的定量检测方法 - Google Patents

Abstract

一种茶鲜叶中有机磷类农药的定量检测方法，其特征在于：茶鲜叶试样用含体积分数为1%乙酸的乙腈溶液超声提取，再用适量PSA、C18和GCB混合填料净化，上清液氮吹浓缩至近干，用丙酮溶解定容，DB-1701石英毛细管柱程序升温分离，GC/FPD检测，最后用基质外标法定量。通过试验确证，该方法线性范围宽，检测灵敏度、准确度及精密度等技术指标均满足残留分析的要求，并且前处理操作简单、方便快速，为测定茶鲜叶中有机磷类农药残留的分析研究提供了可靠的手段。

Description

一种茶鲜叶中有机磷类农药的定量检测方法

技术领域

本发明涉及农药残留量的检测方法领域，具体涉及一种茶鲜叶中有机磷类农药的定量检测方法，该定量检测方法是采用改进的QuEChERS法对茶鲜叶进行提取、净化，再用气相色谱法对有机磷类农药进行检测，以达到快速、简便、可靠的目的。

背景技术

茶叶是世界三大植物饮料之一，因其独特的口感和具有抗癌、防突变、清除自由基、延缓衰老等保健功效越来越受到人们的青睐。我国是茶叶生产大国也是出口大国，施用农药是保证茶叶产量，控制其生长过程中免受病虫害威胁的最有效的手段，有机磷类农药（英文名称：Organophosphoruspesticides）因广谱、高效、成本低、用量少被广泛应用于茶叶病虫害的防治工作。但是已有研究证实这类农药会对人体的神经系统产生毒害作用，部分品种具有致癌、致畸、致突变作用以及一定的蓄积性，过量使用有可能在人体内累积，造成慢性蓄积中毒。因此，关于有机磷类农药在茶叶中的残留一直是人们关注的焦点问题。

国际上许多国家、特别是欧盟和日本制定了苛刻的农药残留限量法规，以限制茶叶中农药的最大残留限量（MRL）。我国国家标准GB2763-2012《食品中农药最大残留限量》规定了茶叶中25种农药的MRL，《中华人民共和国农业部公告第199号》规定了21种农药禁止或限制在茶叶中使用。欧盟在2008年3月1日发布了新的农药残留限量标准法规（EC）No149/2008，更新了茶叶中农药残留的MRL，新法规涉及茶叶农药残留现行限量标准221项，临时性限量标准171项，共392项，且90%以上的农药采用方法检出限作为MRL。日本于2006年5月29日正式实施食品中农业化学品“肯定列表制度”，该制度中与茶叶有关的农药残留限量标准达251项，且大多数农药的MRL要求不大于0.1mg/kg，对未设定限量标准的农药全部则执行“一律标准”，即含量不得超过0.01mg/kg，且全部采用“干茶法”进行检测。这在很大程度上限制了我国茶叶的出口，同时对茶叶中农药残留的检测也提出了更高的要求。

近年来，有关茶叶中农药残留的分析方法已有不少研究报道，但主要集中在成茶上，对茶鲜叶中的残留研究的不多。茶鲜叶作为茶叶加工的原料，是决定茶叶品质的物质基础，它的质量好坏直接关系到茶叶品质的优劣。因此，直接测定茶鲜叶中的农药残留量具有重要的现实意义，不但可以实现茶叶农药的源头控制，有效引导农民正确地对茶园用药，提高饮茶安全性，而且可以减少农药不合理地使用对茶园土壤环境造成污染。

由于茶鲜叶比成茶含有更多的水分、色素、水溶性灰分、茶多酚等干扰物质，更容易造成提取净化困难，因此现有的测定茶叶中有机磷类农药的检测方法，不适用于茶鲜叶基质的测定。国内虽有一些关于茶鲜叶农残的研究工作报道，但仅涉及六六六、滴滴涕等有机氯农药以及少数几种菊酯类农药的检测，对有机磷等其它类型农药的检测方法研究较少。而且在茶鲜叶农药残留提取过程中，现有的报道主要运用传统的振荡提取、均质提取、液液萃取等方法，净化手段针对不同的目标农药多采用浓硫酸磺化法和柱层析净化法。这些前处理方法消耗有机溶剂多、样品通量小、应用范围有限、操作繁琐、耗费时间、成本高，对于多类多残留不是简单或有效的方法。

发明内容

本发明提供一种茶鲜叶中有机磷类农药的定量检测方法，其目的在于解决现有的测定茶叶中有机磷类农药的检测方法耗时长、操作繁琐、消耗有机溶剂多以及检测结果不够稳定可靠的问题。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种茶鲜叶中有机磷类农药的定量检测方法，所述定量检测方法有两部分组成：

第一部分，用气相色谱法建立已知梯度浓度的被测的有机磷农药的标准曲线；所述标准曲线的建立由以下步骤组成：

第一步，制备空白基质提取液，制备方法由以下步骤组成：

（1）称取5.0g经测定不含被测的有机磷农药的空白茶鲜叶样品，置于50mL离心管中，再向离心管中加入10mL含体积分数为1%乙酸的乙腈溶液，混匀，超声提取10～15min，再加入2g无水乙酸钠和1g无水硫酸镁，涡旋1.5min～2.5min，然后，以9000r/min的转速离心3.5min～4.5min，取上清液即为待净化的空白基质提取液；

（2）另取一支10mL离心管，加入0.15g C18、0.15g N-丙基乙二胺、0.12g石墨化碳黑和0.3g无水硫酸镁，加入4mL所述待净化的空白基质提取液，涡旋1.5min～2.5min，以9000r/min的转速离心4.5min～5.5min；离心后移取2.0mL上清液至刻度试管中，再在50～60℃水浴下将上清液用氮气缓慢吹至50～70μL；再在上清液中加入丙酮以定容至1.0mL，过有机系滤膜后，得到用于配制有机磷农药的空白基质提取液；

第二步，以所述第一步中得到的空白基质提取液为溶剂配制有机磷农药的基质混合标准工作溶液，其中，所述有机磷农药是指敌敌畏、乐果、毒死蜱、甲基对硫磷、马拉硫磷、杀螟硫磷、三唑磷；所述有机磷农药的基质混合标准工作溶液中各有机磷农药的浓度范围为：

第三步，用气相色谱法测定所述有机磷农药的基质混合标准工作溶液中各农药组分的色谱峰保留时间和色谱峰面积，以色谱峰保留时间定性，然后以质量浓度为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标绘制出有机磷农药的标准曲线；

其中，测定有机磷农药的色谱条件为：

色谱柱：型号为DB-1701的毛细管色谱柱，规格为30m×0.32mm×0.25μm；进样量：1.0μL，不分流进样；进样口温度：220℃，隔垫吹扫3mL/min；柱温：初始温度90℃，保持1min，20℃/min升至200℃，保持9min，30℃/min升至245℃，保持8min；载气：高纯氮气，纯度≥99.999%；恒流模式，流速3mL/min；检测器：火焰光度检测器；检测器温度：245℃；氢气：流量为75mL/min；空气：流量为100mL/min；尾吹气：高纯氮气，流量为60mL/min；

第二部分，测定茶鲜叶样品中所述第一部分中的7种有机磷农药残留量，定量检测方法包括以下步骤：

第一步，对茶鲜叶样品进行提取；

称取已粉碎的茶鲜叶样品，置于50mL离心管中，再加入含体积分数为1%乙酸的乙腈溶液，其中，所述茶鲜叶样品与所述乙腈溶液的投入比为向每0.5g茶鲜叶样品中投入1mL乙腈溶液，混匀，超声提取10～15min；再加入无水乙酸钠和无水硫酸镁，其中，所述茶鲜叶样品、无水乙酸钠以及无水硫酸镁三者的质量比为5:2:1，涡旋1.5min～2.5min，以9000r/min的转速离心3.5min～4.5min，取上清液即为待净化的茶鲜叶样品提取液；

第二步，对所述待净化的茶鲜叶样品提取液进行净化；

另取一支10mL离心管，加入C18、N-丙基乙二胺、石墨化碳黑和无水硫酸镁，加入所述待净化的茶鲜叶样品提取液，其中，投入的C18、N-丙基乙二胺、石墨化碳黑以及无水硫酸镁在待净化的茶鲜叶样品提取液中的含量分别为37.5mg/mL、37.5mg/mL、30mg/mL以及75mg/mL，涡旋1.5min～2.5min，以9000r/min的转速离心4.5min～5.5min；离心后移取2.0mL上清液至刻度试管中，在50～60℃水浴下将上清液用氮气缓慢吹至50～70μL；再在上清液中加入丙酮以定容至1.0mL，过有机系滤膜后，得到用于测定有机磷农药残留的茶鲜叶样品提取净化液；

第三步，用气相色谱法测定所述茶鲜叶样品提取净化液中的有机磷农药残留量，记录色谱峰保留时间和色谱峰面积，通过色谱峰保留时间定性后，将所述茶鲜叶样品提取净化液检测出的色谱峰面积与所述第一部分得到的有机磷农药的标准曲线进行比较，得到所述茶鲜叶样品提取净化液中含有的每种有机磷农药的测定值；再将所述测定值带入到定量计算公式中，最终得到茶鲜叶样品中待测有机磷农药残留量；

定量计算公式：ω=(ρ×v×f)/m，式中：ω为样品中待测有机磷农药残留量，单位为mg/kg；ρ为测定值，单位为mg/L；m为称取的样品量，单位为g；v为定容体积，单位为mL；f为稀释倍数；

其中，测定所述茶鲜叶样品提取净化液中的有机磷农药的色谱条件与所述第一部分的第三步中的有机磷农药的色谱条件相同。

上述技术方案中的有关内容解释如下：

1、上述方案中，所述敌敌畏、乐果、毒死蜱、甲基对硫磷、马拉硫磷、杀螟硫磷、三唑磷这7种农药的标准储备液质量浓度均为1000mg/L，购于农业部环境保护科研监测所；

丙酮为HPLC级，生产厂家为上海国药集团化学试剂有限公司；N-丙基乙二胺（英文简称为PSA），粒径为40～60μm，生产厂家为美国AgelaTechnologies公司；石墨化碳黑（英文简称为GCB），粒径120～400目，生产厂家为美国Agela Technologies公司；C18，孔径6nm，粒度40～60μm，生产厂家为美国Sepax Technologies公司；乙腈、乙酸、无水乙酸钠、无水硫酸镁，均需在620℃灼烧4h，均为分析纯，生产厂家为上海国药集团化学试剂有限公司；实验用水为超纯水（18.4MΩ）。

2、上述方案中，在配制有机磷农药的基质混合标准工作溶液前，先配制有机磷农药混合标准储备液，农药混合标准储备液配好后置于4℃冰箱中保存，使用时以空白基质提取液为溶剂配制成适当浓度的农药基质混合标准工作溶液；

其中，有机磷农药混合标准储备液的配制方法为：7种有机磷农药标准储备液浓度均为1000mg/L，分别取1mL置于5mL容量瓶中，用丙酮稀释定容，配制成浓度为200mg/L的单标溶液，于-20℃避光密封保存。根据各农药在FPD检测器上的响应值，单标溶液敌敌畏取0.5mL，乐果、三唑磷各取2mL，其余有机磷单标溶液各取1mL，置于10mL容量瓶中，用丙酮定容。7种有机磷农药混合标准储备液中：敌敌畏浓度为10mg/L，毒死蜱、甲基对硫磷、杀螟硫磷、马拉硫磷浓度分别为20mg/L，乐果、三唑磷浓度分别为40mg/L。

3、上述方案中，使用气相色谱法测定7种有机磷农药，以保留时间定性，峰面积外标法定量。

4、上述方案中，较佳的方案是所述第一部分的第一步和所述第二部分的第一步中超声提取的条件为超声功率在80W～100W之间，超声温度在20～30℃。

本发明工作原理以及有益效果是：2003年，美国农业部农业研究服务中心的Anastassiades M等人提出了一种被称为“QuEChERS”（Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged and Safe）的新型农药多残留样品制备方法。此方法灵活性强，应用范围广，可以根据样品和目标分析物的特点，选择适合的提取溶剂和净化填料，具有快速、简便、高效、安全等优点，目前已成功应用于食品中数百种农药残留的分析研究，但在茶鲜叶中的应用报道较少。“QuEChERS”方法推荐使用气相色谱-质谱联用（GC-MS）或高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）进行后续的检测分析，GC-MS、HPLC-MS虽然既可定性又可定量，是农药残留分析方法发展的趋势，但仪器价格昂贵，对操作技术要求高，从而限制了其广泛应用。气相色谱仪（GC）作为实验室常用的分析仪器，其价格适中，应用范围广，配以专属性较强的检测器，能获得很好的选择性和较低的检测限，是目前广大基层检测机构应用最普遍的检测手段之一。

针对目前基层检测部门大多没有昂贵的气质联用仪，只有普通的气相色谱仪，前处理操作繁琐的不足，本发明采用改进的“QuEChERS”方法对茶鲜叶进行提取、净化，采用气相色谱火焰光度检测器（英文名称GC/FPD）对有机磷类农药进行检测，建立了茶鲜叶中7种有机磷类农药残留的快速简便、省时可靠的分析方法。

茶鲜叶试样用含体积分数为1%乙酸的乙腈溶液超声提取，再用适量PSA、C18和GCB混合填料净化，上清液氮吹浓缩至近干，用丙酮溶解定容，DB-1701石英毛细管柱程序升温分离，GC/FPD检测，最后用基质外标法定量。通过试验确证，该方法线性范围宽，检测灵敏度、准确度及精密度等技术指标均满足残留分析的要求，为茶鲜叶中有机磷类农药残留的分析研究提供了可靠的手段。

与现有茶叶农药残留检测方法和国标方法相比，本发明前处理操作简单，提取与净化仅需几步即可完成，而且提取时采用超声方法，结果稳定，重复性好，方便后续批量样品的处理，实用性更强；净化过程避免使用净化柱及大量溶剂洗脱，农药损失少，回收率高，同时耗费的时间和有机溶剂大大减少，节约检测成本，对环境污染小，对操作者也更安全。检测分析采用实验室常用的气相色谱仪（配有FPD），价格适中，操作维护简单，技术要求不如色质联用严格，更适合在广大基层检测机构推广应用。定量方法采用基质匹配标准溶液校准定量，减小了待测农药的基质效应，测定结果更准确。本发明的定量检测方法在准确度、精密度、灵敏度等各项指标上均满足农药多残留分析的要求，为茶叶质量控制提供了科学的监测方法和依据，具有一定的推广使用价值。

附图说明

附图1为本发明实施例中7种有机磷农药的基质混合标准工作溶液色谱图；

附图2为本发明实施例中7种有机磷农药在茶鲜叶中的基质效应图；

附图3为本发明实施例中用于回收率和精密度测定的茶鲜叶中添加7种有机磷农药标准色谱图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例：一种茶鲜叶中有机磷类农药的定量检测方法

供试茶鲜叶取自苏州市当地某茶叶种植园，经粉碎机打碎混匀，装入洁净的容器，置于-20℃冰箱中保存，备用。所述定量检测方法有两部分组成：

第一部分，用气相色谱法建立已知梯度浓度的被测的有机磷农药的标准曲线；所述标准曲线的建立由以下步骤组成：

第一步，制备空白基质提取液，制备方法由以下步骤组成：

（1）称取5.0g经测定不含被测的有机磷农药和拟除虫菊酯农药的空白茶鲜叶样品，置于50mL离心管中，再向离心管中加入10mL含体积分数为1%乙酸的乙腈溶液，混匀，超声提取10～15min，超声功率在80W～100W之间，超声温度在20～30℃，再加入2g无水乙酸钠和1g无水硫酸镁，涡旋2min，然后，以9000r/min的转速离心3.5min～4.5min，取上清液即为待净化的空白基质提取液；

（2）另取一支10mL离心管，加入0.15g C18、0.15g N-丙基乙二胺、0.12g石墨化碳黑和0.3g无水硫酸镁，加入4mL所述待净化的空白基质提取液，涡旋2min，以9000r/min的转速离心5min；离心后移取2.0mL上清液至刻度试管中，再在50～60℃水浴下将每份上清液用氮气缓慢吹至50～70μL；再在上清液中加入丙酮以定容至1.0mL，过0.22μm有机系滤膜后，得到用于配制有机磷农药的空白基质提取液；

第二步，以所述第一步中得到的空白基质提取液为溶剂配制有机磷农药的基质混合标准工作溶液，其中，所述有机磷农药是指敌敌畏、乐果、毒死蜱、甲基对硫磷、马拉硫磷、杀螟硫磷、三唑磷；所述有机磷农药的基质混合标准工作溶液中各有机磷农药的浓度范围为：

第三步，用气相色谱法测定所述有机磷农药的基质混合标准工作溶液中各农药组分的色谱峰保留时间和色谱峰面积，以色谱峰保留时间定性，然后以质量浓度为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标绘制出有机磷农药的标准曲线；

其中，测定有机磷农药的色谱条件为：

色谱柱：型号为DB-1701的毛细管色谱柱，规格为30m×0.32mm×0.25μm（即长度×粒径×液膜厚度）；进样量：1.0μL，不分流进样；进样口温度：220℃，隔垫吹扫3mL/min；柱温：初始温度90℃，保持1min，20℃/min升至200℃，保持9min，30℃/min升至245℃，保持8min；载气：高纯氮气，纯度≥99.999%；恒流模式，流速3mL/min；检测器：火焰光度检测器；检测器温度：245℃；氢气：流量为75mL/min；空气：流量为100mL/min；尾吹气：高纯氮气，流量为60mL/min；

第二部分，测定茶鲜叶样品中所述第一部分中的7种有机磷农药残留量，定量检测方法包括以下步骤：

第一步，对茶鲜叶样品进行提取；

称取已粉碎的茶鲜叶试样5.0g，置于50mL聚四氟乙烯离心管中，加入10mL含1%乙酸的乙腈溶液，混匀，超声提取10min，超声功率在80W～100W之间，超声温度在20～30℃，加入2g无水乙酸钠和1g无水硫酸镁，涡旋2min，以9000r/min转速离心4min，取上清液即为待净化的茶鲜叶样品提取液；

第二步，对所述待净化的茶鲜叶样品提取液进行净化；

另取一支10mL聚四氟乙烯离心管，加入0.15g C18、0.15g PSA、0.12gGCB和0.3g无水硫酸镁，加入4mL上述待净化的提取液，涡旋2min，以9000r/min转速离心5min；离心后移取2.0mL上清液至刻度试管中，在50～60℃水浴下将上清液用氮气缓慢吹至50～70μL；再在上清液中加入丙酮以定容至1.0mL，过0.22μm有机系滤膜后，得到用于测定有机磷农药残留的茶鲜叶样品提取净化液；

第三步，用气相色谱法测定所述茶鲜叶样品提取净化液中的有机磷农药残留，记录色谱峰保留时间和色谱峰面积，通过色谱峰保留时间定性后，将所述茶鲜叶样品提取净化液检测出的色谱峰面积与所述第一部分得到的有机磷农药的标准曲线进行比较，得到所述茶鲜叶样品提取净化液中含有的每种有机磷农药的测定值；再将所述测定值带入到定量计算公式中，最终得到茶鲜叶样品中待测有机磷农药残留量；

定量计算公式：ω=(ρ×v×f)/m，式中：ω为样品中待测有机磷农药残留量，单位为mg/kg；ρ为测定值，单位为mg/L；m为称取的样品量，单位为g；v为定容体积，单位为mL；f为稀释倍数；

其中，测定所述茶鲜叶样品提取净化液中的有机磷农药的色谱条件与所述第一部分的第三步中的有机磷农药的色谱条件相同。

以上实施例中，所用的仪器与设备有：7890A气相色谱仪，配有火焰光度检测器（FPD）、7693自动进样器和Chemstation色谱工作站（美国Agilent公司）；KQ-500DE数控超声波仪（昆山市超声仪器有限公司）；TG16-WS台式高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；HSC-24B氮吹仪（天津市恒奥科技发展有限公司）；K600型粉碎机（德国博朗公司）；VM-10涡旋振荡器（韩国Daihan Scientific公司）；SX2-4-10马弗炉（上海跃进医疗器械有限公司）；EXCEED-AD-24型超纯水机（成都唐氏康宁科技发展有限公司）。

所用的药品与试剂：敌敌畏、乐果、毒死蜱、甲基对硫磷、马拉硫磷、杀螟硫磷、三唑磷质量浓度均为1000mg/L，购于农业部环境保护科研监测所；丙酮，HPLC级（上海国药集团化学试剂有限公司）；N-丙基乙二胺（PSA），40～60μm（美国Agela Technologies公司）；石墨化碳黑（GCB），120～400mesh（美国Agela Technologies公司）；C18，孔径6nm，粒度40～60μm（美国Sepax Technologies公司）；乙腈、乙酸、无水乙酸钠、无水硫酸镁（620℃灼烧4h）均为分析纯（上海国药集团化学试剂有限公司）；实验用水为超纯水（18.4MΩ）。

混合标准储备液的配制：

有机磷农药混合标准储备液的配制方法为：7种有机磷农药标准储备液浓度均为1000mg/L，分别取1mL置于5mL容量瓶中，用丙酮稀释定容，配制成浓度为200mg/L的单标溶液，于-20℃避光密封保存。根据各农药在FPD检测器上的响应值，单标溶液敌敌畏取0.5mL，乐果、三唑磷各取2mL，其余有机磷单标溶液各取1mL，置于10mL容量瓶中，用丙酮定容。7种有机磷农药混合标准储备液中：敌敌畏浓度为10mg/L，毒死蜱、甲基对硫磷、杀螟硫磷、马拉硫磷浓度分别为20mg/L，乐果、三唑磷浓度分别为40mg/L。

上述农药混合标准储备液均置于4℃冰箱中保存，使用时用空白基质提取液为溶剂分别配制成适当浓度的基质混合标准工作液。

本实施例的试验结果：

1、试验农药的气相色谱分离

采用上述气相色谱条件测定7种有机磷农药的基质混合标准工作溶液，标样分离效果较好，峰形对称，基线稳定，说明仪器条件适合。在此色谱条件下有机磷各农药的保留时间分别约为敌敌畏5.941min，乐果13.099min，毒死蜱15.787min，甲基对硫磷15.915min，马拉硫磷16.479min，杀螟硫磷16.607min，三唑磷22.684min（参见附图1所示，附图1中标号1为敌敌畏，浓度为0.25mg/L，标号2为乐果，浓度为1mg/L，标号3为毒死蜱，浓度为0.5mg/L，标号4为甲基对硫磷，浓度为0.5mg/L，标号5为马拉硫磷，浓度为0.5mg/L，标号6为杀螟硫磷，浓度为0.5mg/L，标号7为三唑磷，浓度为1mg/L）。

2、基质效应

基质效应是指样品中除待测物以外的其它基质成分对待测物测定值的影响。基质效应针对不同样品和待测物的情况而不同。在气相色谱分析中大多数农药表现出不同程度的基质增强效应，即相同浓度的农药在基质中的响应值比其在纯溶剂中的高，一般认为是样品中基质成分的存在减少了色谱系统活性位点与待测物分子作用的机会，使得待测物检测信号增强。消除基质效应影响的方法有基质匹配标准溶液法、标准添加法、多重净化法、分析保护剂应用及统计方法校正等。本发明中采用基质混合标准工作溶液和纯溶剂混合标准溶液中待测物的响应值之比表示基质效应，比值越接近1，表明基质效应越小。

试验结果表明，所分析的7种农药化合物均存在不同程度的基质增强效应，其中敌敌畏、乐果、毒死蜱、马拉硫磷的基质效应较强，如附图2所示。所以本发明在用外标法定量时，用空白基质提取液为溶剂配制标样，以消除基质干扰，减少误差。（在附图2中，标号1表示含有敌敌畏的基质混合标准工作溶液和纯溶剂混合标准溶液，浓度为0.05mg/L；标号2为含有乐果的基质混合标准工作溶液和纯溶剂混合标准溶液，浓度为0.2mg/L；同理，标号3表示含有毒死蜱，浓度为0.1mg/L；标号4表示含有甲基对硫磷，浓度为0.1mg/L；标号5表示含有马拉硫磷，浓度为0.1mg/L；标号6为杀螟硫磷，浓度为0.1mg/L；标号7为三唑磷，浓度为0.2mg/L；A_m表示基质匹配混合标准溶液中各农药的响应值；A_s表示纯溶剂混合标准溶液中各农药的响应值）。

3、方法的线性范围、回归方程与检出限

配制质量浓度为0.01～4.0mg/L的7种有机磷农药基质混合标准溶液，分别按所述第一部分的第三步中的有机磷农药的色谱条件进行测定，以质量浓度（以ρ表示，单位为mg/L）为横坐标，以峰面积（y）为纵坐标绘制标准曲线，7种农药在其浓度范围内线性良好，相关系数（r²）均大于0.996，见表1所示。分别以最低添加水平色谱图中噪音信号的3倍和10倍计算各农药的检出限（LOD）和定量限（LOQ）。经计算，7种有机磷农药的LOD在0.0034～0.014mg/kg之间，LOQ在0.012～0.046mg/kg之间。

表1供试农药的线性范围、回归方程、相关系数、检出限和定量限

4、方法的回收率与精密度

采用空白样品加标方法进行方法回收率和精密度测定。称取5.0g经测定不含供试农药的空白茶鲜叶样品若干份，分别加入3种不同浓度水平的农药混合标准工作液，有机磷农药的添加水平为0.025～1.0mg/kg，每个浓度水平平行3份样品，涡旋混匀后，静置1h使标准溶液被样品充分吸收，按照所述第二部分进行样品前处理和色谱条件测定。采用基质外标法定量，计算各农药的平均回收率及其相对标准偏差（即RSD），参见表2所示，样品加标色谱图参见附图3。

由表2可知，茶鲜叶中有机磷农药的平均回收率为76.9%～97.3%，RSD（n=3）为1.8%～8.0%，说明方法具有良好的准确性和重复性。

表2 7种供试农药在茶鲜叶中的添加回收结果（n=3）

其中，附图3中标号1为敌敌畏，浓度为0.25mg/L，标号2为乐果，浓度为1mg/L，标号3为毒死蜱，浓度为0.5mg/L，标号4为甲基对硫磷，浓度为0.5mg/L，标号5为马拉硫磷，浓度为0.5mg/L，标号6为杀螟硫磷，浓度为0.5mg/L，标号7为三唑磷，浓度为1mg/L。

5、实际样品分析

采用本方法对取自苏州当地某茶叶种植园的茶鲜叶样品共16份进行了7种农药残留检测，没有检出有机磷类农药残留。研究结果表明，本方法可用于茶鲜叶中7种有机磷类农药残留的检测。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种茶鲜叶中有机磷类农药的定量检测方法，其特征在于：所述定量检测方法有两部分组成：

第一部分，用气相色谱法建立已知梯度浓度的被测的有机磷农药的标准曲线；所述标准曲线的建立由以下步骤组成：

第一步，制备空白基质提取液，制备方法由以下步骤组成：

（1）称取5.0 g经测定不含被测的有机磷农药的空白茶鲜叶样品，置于50 mL离心管中，再向离心管中加入10 mL含体积分数为1%乙酸的乙腈溶液，混匀，超声提取10～15 min，再加入2 g无水乙酸钠和1 g无水硫酸镁，涡旋1.5min~2.5min，然后，以9000 r/min的转速离心3.5min~4.5min，取上清液即为待净化的空白基质提取液；

（2）另取一支10 mL离心管，加入0.15g C18、0.15g N-丙基乙二胺、0.12 g 石墨化碳黑和0.3g无水硫酸镁，加入4mL所述待净化的空白基质提取液，涡旋1.5min~2.5min，以9000 r/min的转速离心4.5min~5.5min；离心后移取2.0 mL上清液至刻度试管中，再在50～60℃水浴下将上清液用氮气缓慢吹至50~70μL；再在上清液中加入丙酮以定容至1.0 mL，过有机系滤膜后，得到用于配制有机磷农药的空白基质提取液；

第二步，以所述第一步中得到的空白基质提取液为溶剂配制有机磷农药的基质混合标准工作溶液，其中，所述有机磷农药是指敌敌畏、乐果、毒死蜱、甲基对硫磷、马拉硫磷、杀螟硫磷、三唑磷；所述有机磷农药的基质混合标准工作溶液中各有机磷农药的浓度范围为：

农药                          浓度范围 mg/L

敌敌畏                             0.01～1.0

乐果                                 0.04～4.0

毒死蜱                             0.02～2.0

甲基对硫磷                      0.02～2.0

马拉硫磷                          0.02～2.0

杀螟硫磷                          0.02～2.0

三唑磷                             0.04～4.0

第三步，用气相色谱法测定所述有机磷农药的基质混合标准工作溶液中各农药组分的色谱峰保留时间和色谱峰面积，以色谱峰保留时间定性，然后以质量浓度为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标绘制出有机磷农药的标准曲线；

其中，测定有机磷农药的色谱条件为：

色谱柱：型号为DB-1701的毛细管色谱柱，规格为30m×0.32mm×0.25μm；进样量：1.0μL，不分流进样；进样口温度：220℃，隔垫吹扫3mL/min；柱温：初始温度90℃，保持1min，20℃/min升至200℃，保持9min，30℃/min升至245℃，保持8min；载气：高纯氮气，纯度≥99.999%；恒流模式，流速3mL/min；检测器：火焰光度检测器；检测器温度：245℃；氢气：流量为75 mL/min；空气：流量为100 mL/min；尾吹气：高纯氮气，流量为60mL/min；

第二部分，测定茶鲜叶样品中所述第一部分中的7种有机磷农药残留量，定量检测方法包括以下步骤：

第一步，对茶鲜叶样品进行提取；

称取已粉碎的茶鲜叶样品，置于50 mL离心管中，再加入含体积分数为1%乙酸的乙腈溶液，其中，所述茶鲜叶样品与所述乙腈溶液的投入比为向每0.5g茶鲜叶样品中投入1mL乙腈溶液，混匀，超声提取10～15 min；再加入无水乙酸钠和无水硫酸镁，其中，所述茶鲜叶样品、无水乙酸钠以及无水硫酸镁三者的质量比为5:2:1，涡旋1.5min~2.5min，以9000 r/min的转速离心3.5min~4.5min，取上清液即为待净化的茶鲜叶样品提取液；

第二步，对所述待净化的茶鲜叶样品提取液进行净化；

另取一支10 mL离心管，加入C18、N-丙基乙二胺、石墨化碳黑和无水硫酸镁，加入所述待净化的茶鲜叶样品提取液，其中，投入的C18、N-丙基乙二胺、石墨化碳黑以及无水硫酸镁在待净化的茶鲜叶样品提取液中的含量分别为37.5mg/mL、37.5mg/mL、30 mg/mL以及75mg/mL，涡旋1.5min~2.5min，以9000 r/min的转速离心4.5min~5.5min；离心后移取2.0mL上清液至刻度试管中，在50～60℃水浴下将上清液用氮气缓慢吹至50~70μL；再在上清液中加入丙酮以定容至1.0mL，过有机系滤膜后，得到用于测定有机磷农药残留的茶鲜叶样品提取净化液；

第三步，用气相色谱法测定所述茶鲜叶样品提取净化液中的有机磷农药残留量，记录色谱峰保留时间和色谱峰面积，通过色谱峰保留时间定性后，将所述茶鲜叶样品提取净化液检测出的色谱峰面积与所述第一部分得到的有机磷农药的标准曲线进行比较，得到所述茶鲜叶样品提取净化液中含有的每种有机磷农药的测定值；再将所述测定值带入到定量计算公式中，最终得到茶鲜叶样品中待测有机磷农药残留量；

定量计算公式：ω=(ρ×v×f)/m，式中：ω为样品中待测有机磷农药残留量，单位为mg/kg；ρ为测定值，单位为mg/L；m为称取的样品量，单位为g；v为定容体积，单位为mL；f为稀释倍数；

其中，测定所述茶鲜叶样品提取净化液中的有机磷农药的色谱条件与所述第一部分的第三步中的有机磷农药的色谱条件相同。

2.根据权利要求1所述的一种茶鲜叶中有机磷类农药的定量检测方法，其特征在于：所述第一部分的第一步和所述第二部分的第一步中超声提取的条件为超声功率在80W~100W之间，超声温度在20～30℃。