CN110508029A - 一种用于同时提取氟苯尼考、氯霉素、甲砜霉素的免疫亲和柱 - Google Patents

Abstract

本发明实施例公开了一种用于同时提取氟苯尼考、氯霉素、甲砜霉素的免疫亲和柱，所述免疫亲和柱包括一空心柱体，所述空心柱体的一端设有第一盖体，另一端设有第二盖体，在所述空心柱体靠近所述第二盖体内部填充有偶联氟苯尼考单克隆抗体的固相介质，在所述固相介质的上表面上设有第一筛板，在所述固相介质的下表面上设有第二筛板。本发明实施例公开了一种可同时提取氟苯尼考、氯霉素、甲砜霉素的免疫亲和柱，其中在亲和柱中填充有偶联有氟苯尼考抗体的固相介质，可同时检测样本中氟苯尼考、氯霉素、甲砜霉素残留，取得了意想不到的技术效果。

Description

一种用于同时提取氟苯尼考、氯霉素、甲砜霉素的免疫亲和柱

技术领域

本发明实施例涉及免疫检测技术领域，具体涉及用于同时提取氟苯尼考、氯霉素、甲砜霉素的免疫亲和柱。

背景技术

氯霉素类抗生素主要包括：氟苯尼考、氯霉素、甲砜霉素，氟苯尼考是酰胺醇类第3代动物专用抗菌药，具有广谱、高效、吸收好、体内分布广、无致再生障碍性贫血作用等特点，作为氯霉素的替代药物被广泛用于治疗畜禽的细菌性疾病。研究表明，氟苯尼考、氯霉素、甲砜霉素具有胚胎毒性和耐药性，在畜禽生产上的大量应用也导致其在畜禽产品中残留，危害公众健康。对于氯霉素类抗生素的液相色谱检测来说，样品采集和前处理是目前分析方法中的瓶颈，样品前处理方法步骤繁多，分为提取和净化2个大步骤，特别是净化步骤更多，容易造成误差，误差率20％以内，操作过程烦琐、复杂、时间长,劳动强度大，对操作人员伤害较大。

因此，需要如何研发一种操作简单和净化效率高的氯霉素类抗生素免疫亲和柱，利用氯霉素类抗生素特异性抗体对待检样本中的氯霉素类抗生素进行分离和净化，是亟待解决的技术问题。

发明内容

为此，本发明实施例提供一种用于同时提取氟苯尼考、氯霉素、甲砜霉素的免疫亲和柱，以解决现有技术中提取分离氟苯尼考、氯霉素、甲砜霉素过程复杂，净化效率低的问题。

为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

一种用于同时提取氟苯尼考、氯霉素、甲砜霉素的免疫亲和柱，其所述免疫亲和柱包括一空心柱体，所述空心柱体的一端设有第一盖体，另一端设有第二盖体，在所述空心柱体靠近所述第二盖体内部填充有偶联氟苯尼考单克隆抗体的固相介质，在所述固相介质的上表面上设有第一筛板，在所述固相介质的下表面上设有第二筛板。

优选的，所述氟苯尼考单克隆抗体是是通过氟苯尼考FF3C11细胞株制备得到的，所述氟苯尼考FF3C11细胞株已于2019年7月4日保藏于位于中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CTCC NO:C2019152。

优选的，所述氟苯尼考单克隆抗体是由氟苯尼考半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得。

优选的，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、齿孔血蓝蛋白或人血清白蛋白。

优选的，所述第一盖板和所述第二盖板均采用塑料材质制成；

所述第一筛板和第二筛板均采用亲水材料制成。

优选的，所述空心柱体的直径为2cm，高度为10cm。

优选的，所述固相介质包括琼脂糖4FF介质。

优选的，所述空心柱体内填充有质量分数为20％的乙醇保存液。

本发明实施例具有如下优点：

本发明实施例公开了一种可同时提取氟苯尼考、氯霉素、甲砜霉素的免疫亲和柱，其中在亲和柱中填充有偶联有氟苯尼考抗体的固相介质，可同时检测样本中氟苯尼考、氯霉素、甲砜霉素残留，取得了意想不到的技术效果。本发明所提供的免疫亲和柱具有操作简单、灵敏度高、检测速度快、成本低等特点，适合蜂蜜、肉、蛋、奶、饲料、血清、饲料、鸡蛋等多种样本的检测。本发明实施例的免疫亲和柱采用特异性免疫反应为分离手段，大大提高了样品的纯度和纯化效率，保证了检测结果的可靠性和稳定性。本发明实施例采用直径2cm,高10cm空心柱体，增加了作用面积，大大减少了保存溶液的压力，使得介质的孔径不受压力影响而变小，从而不影响流速，避免了使用压力泵设备帮助引流，给样品的检测提供了便利。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。

图1为本发明实施例提供的免疫亲和柱的结构示意图；

图2为本发明实施例提供的氟苯尼考单克隆抗体纯度鉴定图。

图中：100-空心柱体；110-第一盖体；120-第二盖体；130-第一筛板；140-第二筛板；150-保存液。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1、氟苯尼考单克隆抗体的制备

1.免疫原的制备

1.1氟苯尼考(FF)0.3g、琥珀酸酐2g搅拌溶于2.25ml无水吡啶中，60℃回流反应24h，氮吹去除吡啶，用5ml乙酸乙酯复溶蒸干物，转至分液漏斗中，待溶液分层后，用0.5mol/L HCl 2ml洗涤3次，得到衍生溶液。减压浓缩上述溶液，避光真空干燥20h后得到粉红色单酯粗品FF半抗原。

1.2用0.5ml的N，N-二甲基甲酰胺溶解5mg的FF半抗原，再加入10mg N-羟基琥珀酰亚胺和10mg N-N-二环己基碳酰亚胺，室温避光搅拌2h，即为制备的氟苯尼考活化中间产物。将氟苯尼考活化中间产物在搅拌下逐滴加到含10mg齿孔血蓝蛋白(KLH)的1ml PBS中，搅拌1h后转至4℃下搅拌6h。最后用p H7.4 0.01mol/L PBS透析，每1h换液1次，透析2d，即得到FF免疫全抗原，并将此FF免疫全抗原进行免疫、融合筛选得到抗FF单克隆抗体细胞株。

2.氟苯尼考FF3C11细胞复苏

本发明实施例的氟苯尼考FF3C11细胞株已于2019年7月4日保藏于位于中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CTCC NO:C2019152。从液氮罐内快速取出一管氟苯尼考FF3C11细胞株后迅速放至37℃水中融化，完全融化后1000rpm离心3min，酒精擦拭消毒放置无菌工作台操作，弃上清，用600ul HT培养基悬浮管内细胞，转至24孔培养板中，放至37℃CO₂培养箱中培养。

3.腹水制备

氟苯尼考单克隆抗体的制备，采用动物体内腹水诱生法，按照0.5ml矿物油/只小鼠的用量制敏，制敏后7至10天将至80％满时的细胞打入小小鼠腹腔，按照100万/只的数量注入，稀释液为无菌生理盐水，7至10天取腹水。

4.氟苯尼考单克隆抗体的纯化

采用SPG柱法对腹水进行纯化，按常规操作，抗体纯度鉴定如图2所示，泳道1为纯化后的氟苯尼考单克隆抗体SDS-PAGE电泳观察到25KD和55KD的清晰条带，分别是抗体的轻链和重连，并无杂带，表明抗体纯度达到95％以上。

实施例2、免疫亲和柱的制备

1.制备偶联有氟苯尼考单克隆抗体的固相介质

1.1介质清洗

首先将高度交联4％的琼脂糖4FF介质用0.001M HCl、0.5M NaCl，调节pH 3.0进行清洗，用5倍体积的清洗液将介质重悬，2min后将溶液抽干，重复此步骤5次。

1.2偶联

将要偶联的纯化的FF单克隆抗体用0.5M NaHCO₃、0.5M NaCl，调节pH pH＝8.5-9.0，溶解到5mg/ml。将清洗完的固相介质和准备好的抗体按等体积比混合，室温条件下温和混匀1h，将溶液抽干。

1.3封闭

用5倍体积的0.1M Tris-HCl，调节pH 8.3将偶联后的介质重悬，再将溶液抽干，再重复此步骤5次，用5倍体积的0.1M Tris-HCl，调节pH 8.3重悬，室温条件下温和混匀3-4小时以封闭未偶联的介质上面的基团，最后将溶液抽干。

1.4除杂

用5倍体积的0.05M Tris-HCl、0.5M NaCl，调节pH 8.5将封闭后的介质重悬，5min后将溶液抽干；再用5倍体积的0.05M甘氨酸、0.5M NaCl，调节pH 3.5将介质重悬，5min后将溶液抽干，重复此步骤3次，此步骤用于酸碱清洗掉偶联不够紧密的生物分子。

1.5保存

用5倍体积的纯化水将介质重悬后抽干，再用5倍体积的20％乙醇将介质重悬后抽干，最后用20％乙醇浸泡保存。

2.组装免疫亲和柱

如图1所示，本发明实施例的免疫亲和柱包括一空心柱体100，该空心柱体100的一端设有第一盖体110，另一端设有第二盖体120，在空心柱体100靠近所述第二盖体120内部填充有偶联氟苯尼考单克隆抗体的固相介质，在所述固相介质的上表面上设有第一筛板130，在所述固相介质的下表面上设有第二筛板140。

选择直径2cm，高10cm固相萃取柱空柱作为本发明实施例的空心柱体，先将第二筛板置于空心柱体的底部，将偶联好的固相介质装入柱体中，按照2ml/支的量装入，待到柱内溶液在介质上方1mm时，将第二盖体盖上，然后在介质上面置入第一筛板，固相萃取柱的空心柱体100内加满保存液150，保存液配方为：20％的乙醇保存液，最后盖上第一盖体110，免疫亲和柱组装完成，4-8℃保存。

实施例3、免疫亲和柱的回收率与柱容量

在0.01Mpbs中，分别添加不同浓度的氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素标准品，通过免疫亲和柱进行净化再进行仪器检测得出以下结果，如表1所示，免疫亲和柱的回收率与柱容量。结果表明，氯霉素在0-500ppb区间内回收率在85％-96％，1000ppb以上的回收率低于60％；氟苯尼考在0-1000ppb区间内回收率在79％-94％，2000ppb以上的回收率低于60％；甲砜霉素在0-1000ppb区间内回收率在82％-96％，2000ppb以上的回收率低于60％，说明本发明亲和柱对氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素来说柱容量分别为500ppb、1000ppb、1000ppb，批内批间变异系数均小于5％，说明该亲和柱适用于各种基质样本氯霉素类抗生素检测。

表1

实施例4、样品中氟苯尼考、氯霉素、甲砜霉素残留的分离检测

1.样品的前处理

用均质器均质样品，称取5.0+0.05g样品至50ml聚萃乙烯离心管中，加入5ml去离子水，再加入5ml乙腈，用涡旋仪涡旋5min，或者摇床180rpm震荡20min，4000rpm，室温20-25℃，离心5min；用定性滤纸过滤所有上清液，并用0.01Mpbs稀释10倍，待用。

2.样品过柱操作步骤

准确吸取10m1待测液加入到本发明实施例的免疫亲和柱中，通过亲和柱；再用5m1去离子水重洗亲和柱1次，待液体通过后，排干亲和柱内的液体；吸取1ml甲醇，进行洗脱操作，收集全部洗脱液，于50-60℃水浴氮气流下吹干，用1ml 0.01Mpbs进行复溶，用于分析。

3.免疫亲和柱检测的准确度

选取空白样本：鸡肉、鱼肉、鸡蛋、牛奶、蜂蜜、猪饲料，在不同种类以上空白样本中，添加不同浓度的氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素标准品，通过免疫亲和柱进行净化，再进行仪器检测得出以下结果，如表2-4所示，表2为不同样本里的氯霉素添加回收率，表3为不同样本里的氟苯尼考添加回收率，表4为不同样本里的甲砜霉素添加回收率。结果表明：各种基质下回收率均在82％-100％，各种样本2次重复测定变异系数均小于5％，说明该亲和柱适用于各种基质样本氯霉素类抗生素分离检测。

表2

表3

表4

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.一种用于同时提取氟苯尼考、氯霉素、甲砜霉素的免疫亲和柱，其特征在于，所述免疫亲和柱包括一空心柱体，所述空心柱体的一端设有第一盖体，另一端设有第二盖体，在所述空心柱体靠近所述第二盖体内部填充有偶联氟苯尼考单克隆抗体的固相介质，在所述固相介质的上表面上设有第一筛板，在所述固相介质的下表面上设有第二筛板。

2.如权利要求1所述的用于同时提取氟苯尼考、氯霉素、甲砜霉素的免疫亲和柱，其特征在于，

所述氟苯尼考单克隆抗体是通过氟苯尼考FF3C11细胞株制备得到的，所述氟苯尼考FF3C11细胞株已于2019年7月4日保藏于位于中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CTCC NO:C2019152。

3.如权利要求2所述的用于同时提取氟苯尼考、氯霉素、甲砜霉素的免疫亲和柱，其特征在于，

所述氟苯尼考单克隆抗体是由氟苯尼考半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得。

4.如权利要求3所述的用于同时提取氟苯尼考、氯霉素、甲砜霉素的免疫亲和柱，其特征在于，

所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、齿孔血蓝蛋白或人血清白蛋白。

5.如权利要求1所述的用于同时提取氟苯尼考、氯霉素、甲砜霉素的免疫亲和柱，其特征在于，

所述第一盖板和所述第二盖板均采用塑料材质制成；

所述第一筛板和第二筛板均采用亲水材料制成。

6.如权利要求1所述的用于同时提取氟苯尼考、氯霉素、甲砜霉素的免疫亲和柱，其特征在于，

所述空心柱体的直径为2cm，高度为10cm。

7.如权利要求1所述的用于同时提取氟苯尼考、氯霉素、甲砜霉素的免疫亲和柱，其特征在于，

所述固相介质包括琼脂糖4FF介质。

8.如权利要求1所述的用于同时提取氟苯尼考、氯霉素、甲砜霉素的免疫亲和柱，其特征在于，

所述空心柱体内填充有质量分数为20％的乙醇保存液。