CN101954092A - 牙鲆淋巴囊肿病基因工程疫苗及其生产方法 - Google Patents

牙鲆淋巴囊肿病基因工程疫苗及其生产方法 Download PDF

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Abstract

一种牙鲆淋巴囊肿病基因工程疫苗及其生产方法，其特征是该基因工程疫苗由大小为0.6kb的淋巴囊肿病毒核衣壳蛋白基因MCP片段，插入到真核表达载体pEGFP-N2中构成的重组质粒pEGFP-N2-LCDV-MCP 0.6kb。将其转化入大肠杆菌制备生产用菌种，划线到Mi nca琼脂平板、分离纯化、制备并确定合格的一级种子，再接种于琼脂扁瓶中，在37℃培养后24-48h后，对其鉴定确定合格的二级种子；再发酵培养得到发酵的二级种子培养菌液；进行菌体收集、离心、质粒DNA提取、纯化，进行常规检验合格者即得。本发明完整的生产工艺简便、稳定性好和成本低；比目前的灭活疫苗、减毒疫苗、多肽疫苗、亚单位疫苗和重组多肽疫苗等免疫效果好、安全无副作用。

Description

牙鲆淋巴囊肿病基因工程疫苗及其生产方法
技术领域
本发明涉及一种海水鱼病毒病基因工程疫苗及其生产方法，特别涉及一种牙鲆淋巴囊肿病毒病基因工程疫苗及其生产方法。 
背景技术
淋巴囊肿病是由淋巴囊肿病毒引起的病毒性传染病，具有水平和垂直双重传播的特点，可感染多种鱼类，是在中国海水养殖鱼中大规模流行的首例病毒性疾病，该病在我国重要养殖经济鱼类牙鲆、真鲷、石斑鱼、鲈鱼、等名贵鱼种中广泛传播，造成了严重的经济损失。目前，我国海水养殖病害控制仍以抗生素等化学药物为主，药物的滥用导致了水产品药残，严重影响了食品安全。此外，抗生素和化学药品的大量使用还造成了病原微生物耐药性增加及养殖环境恶化，妨碍了产业和经济的发展。因此，疫苗是治疗病毒病的最好选择。基因工程疫苗是将外源基因克隆到真核质粒表达载体上，然后将重组质粒DNA注射到动物体内，当外源基因进入活体细胞内并表达后，既可诱导体液免疫反应，也可诱导长期的免疫记忆，被誉为第三代疫苗，大规模制备临床级质粒DNA的生产加工工艺逐渐受到关注，但由于基因工程疫苗不同于以往的传统疫苗，工程菌的选择、制备工艺和生产方法等都不成熟，更没有相关的质量保证体系，这极大地阻碍了该产业的发展。目前，国内外获得上市的基因工程疫苗仅有马西尼罗病毒的基因工程疫苗West Nile Innovator和鲑鱼传染性出血性坏死病毒的基因工程疫苗APEX-IHN。 
发明内容
本发明的目的是提供一种牙鲆淋巴囊肿病基因工程疫苗及其生产方法，以实现该疫苗的规模化生产，该生产方法克服了基因工程疫苗生产工艺的缺陷，弥补了现有技术的不足。 
上述牙鲆淋巴囊肿病基因工程疫苗是由大小为0.6kb的淋巴囊肿病毒核衣壳蛋白基因MCP片段插入到真核表达载体pEGFP-N2中构成的重组质粒pEGFP-N2-LCDV-MCP0.6kb，插入到基因工程疫苗中的淋巴囊肿病毒核衣壳蛋白基因MCP片段序列为： 
ATGATCGGTAATACTATTGATATGACACAACCCGTTGATTCCAATGGTCAATTACCTGAAGAAGTGTTAATACTTCCTTTACCTTATTTCTTTTCTCGAGATAGCGGTATGGCTTTACCCAGCGCTGCTTTGCCTTATAATGAAATAAGATTAACTTTTCATCTGAGAGATTGGACTGAATTATTGATCTTTCAAAATAAAAACGACTCTACCATCATGCCTTTGACAGCAGGCGATTTAGACTGGGGTAAACCTGATTTAAAGGATGTGCAAGTATGGATTACTAATGTAGTAGTAACCAATGAGGAACGTCGTTTAATGGGTACAGTACCTAGAGACATCTTGGTGGAACAGGTACAAACAGCACCTAAACATGTATTTCAACCTCTAACTATTCCAAGTCCTAATTTTGACATCAGATTTTCTCATGCCATTAAAATCCT TTTTTTCGGTGTGCGTAATGTTACCTATCAAGCTATACAATCCAATTACACCAGTTCTTCTCCTGTAATCTTTGACGGTGGAATTGCTAGCGATTTACCGGGTATTGCTGCTGATCCTATTTCAAATGTTACCTTGGTTTATGAAAATAGTGCTCGTCTTAATGAAATGGGTAGTGAATAT。 
本发明的生产方法：首先制备牙鲆淋巴囊肿病基因工程疫苗质粒库；然后将上述牙鲆淋巴囊肿病基因工程疫苗转化入大肠杆菌制备生产用菌种K12 DH-5α-LCDV0.6kb；再将该生产用菌种划线到Minca琼脂平板、分离纯化制备一级生产种子，并对其鉴定确定合格的一级种子；再将该合格的一级种子接种于若干琼脂扁瓶中，在37℃培养后24-48h后得二级生产种子，并对其鉴定确定合格的二级种子；再将该合格的二级种子在发酵罐中无菌条件下进行发酵培养，得到发酵的二级种子培菌液；最后对该二级种子培养菌液进行菌体收集、离心、质粒DNA提取、纯化，再对提取得到质粒DNA分别进行无菌、DNA纯度、外源DNA含量、内毒素、蛋白质、超螺旋质粒含量的检验，检测合格者即得到淋巴囊肿病半成品的因工程疫苗，再经过常规的效力检验和安全检验，合格者即为生产用牙鲆淋巴囊肿病毒病基因工程疫苗成品。详细叙述上述各步骤如下： 
1、制备牙鲆淋巴囊肿病基因工程疫苗质粒库：首先在真核表达载体pEGFP-N2(pEGFP-N2载体为常用真核表达载体，购买于clontech公司、大小为4736bp，具有高拷贝数、高效表达、加强型绿荧光蛋白标记和卡那霉素抗性标记等特点，宿主为DH5a)的多克隆位点处通过SphI和EcoRI双酶切克隆入抗原编码基因MCP 0.6kb片段、并经Bam HI和NotI双酶切去除EGFP基因后，得到重组质粒pEGFP-N2-LCDV-MCP0.6kb，全长4.7kb，即为牙鲆淋巴囊肿病基因工程疫苗质粒库；上述抗原编码基因的获得是由接种牙鲆淋巴囊肿病毒中国株(LCDV-cn)的牙鲆鳃细胞系FG-9307，经RNA提取、反转录合成cDNA，并针对MCP设计特异性引物，经PCR扩增，PCR产物经测序仪测序鉴定获得的624bp LCDV-cn MCP基因片段。 
2、基因工程疫苗生产用菌种的制备：然后将上述重组质粒pEGFP-N2-LCDV-MCP0.6kb加入到盛有感受态K12DH-5α细胞的1.5mL离心管中，重组质粒的体积不得超过感受态细胞的5％，轻轻旋转该离心管混匀，然后42℃热激90s(期间不要摇动)后迅速将该离心管移到冰浴中，使细胞冷却1-2min，向每200μL感受态细胞中，加入800μL的SOC培养基(配方为：2％(W/V)胰蛋白胨，0.5％(W/V)酵母浸出汁，0.05％(W/V)NaCl，2.5mM KCl，10mM MgCl2，20mM葡萄糖)，然后将管放在37℃摇床上，温育45min，即得到生产用菌种K12DH-5α-LCDV0.6kb。 
3、基因工程疫苗一级种子的制备方法：将上述生产用菌种划线到Minca琼脂平板，并且按常规方法分离纯化，用0.01mol/L pH7.2的PBS缓冲液洗下菌落作为一级种子，将其分装在5mL灭菌小瓶中，加10％甘油混匀，-70℃保存；上述PBS是由每升三蒸水含8g Nacl，0.2g Kcl，1.44g Na2HPO4，0.2g KH2PO4，调pH7.2，灭菌20min制备而成，室温保存。 
4、基因工程疫苗一级种子的鉴定以确定合格的一级种子：接种一级生产种子至含30ug/mL卡那霉素的LB液体培养基，在160-190转/分的摇床上37℃培养，取趋于饱和期的细菌，碱裂解法提取质粒DNA，依次用PCR方法和Xba1和EcoR1双酶切进行鉴定，PCR方法和双酶切方法的产物经电泳和测序鉴定，条带大小为0.6kb和无突变及其它非目的性重组的产生为合格的基因工程疫苗的一级种子。上述LB液体培养基是由每升蒸馏水中含10g胰蛋白胨，5g酵母浸出汁，5g NaCl，调pH为7.0，灭菌20min制备而成，室温保存。 
上述的PCR方法的上游引物为：5’GAC GAA TTC ATG ATC GGT AAT AC 3’，下游引物为：5’GAC GCG GCC GCG AAT AAT ATT CAC T 3’，程序为94℃、5min，进入循环(94℃、30sec，50℃、45sec，72℃、1min，30个循环)，72℃延伸10min。 
5、基因工程疫苗的二级生产种子制备并确定合格的二级种子：将上述一级种子接种于生产用琼脂扁瓶中，使其均匀分布于琼脂表面上，在培养箱中37℃培养18-24小时，将菌落生长良好的扁瓶取出，每瓶加入适量的pH6.3-6.8生理盐水将菌落洗下作为二级生产种子，再将纯净菌液混合均匀悬浮，分装5mL灭菌小瓶，加10％甘油混匀，逐瓶或分组作纯净性检验确定合格的二级种子。 
6、合格的二级生产种子的发酵培养：将马丁肉汤培养基装入发酵罐内，121℃、30分钟高压灭菌，在无菌条件下按发酵液的2％将合格的二级种子加入发酵罐内，并按100g/L和50g/L的比例分别向发酵液中加入葡萄糖和卡那霉素，消泡剂适量；在发酵过程中，用氨水和盐酸调节罐内pH至7.0，通过调节通气量和搅拌速度保持溶氧为30％。当溶氧高于30％时，进行指数连续流加补料培养基。当细胞OD600达到40时，添加氯霉素，使终浓度为150μg/ml，并将流加速度降低50％。上述的补料培养基是由每升含酵母抽提物40g，蛋白胨80g，葡萄糖100g，氯化镁5g配制而成。发酵过程的参数控制如下：pH 7.0，搅拌转速200rpm，通气量6.0m3/h，培养时间10-12h。 
在发酵6h、8h、10h、12h时取样进行纯度镜检，纯度大于99％为合格；并进行质粒稳定性检验：取发酵培养后的细菌，分别等量涂布于含与不含卡那霉素(30ug/mL)的平板上，菌落比例高于99％者视为稳定的二级生产种子。 
7、将上述的发酵培养菌液进行浓缩：将上述的发酵培养结束后的二级生产种子，即将检测合格的发酵培养的菌液，经3000rpm离心15分钟，收获菌体，称重，分装(60g/份)，将分装菌体溶解于500mL PBS溶液中即得到浓缩菌液，再分别置于1L体积的离心转子中，3000rpm离心5min，得到菌体，以便进行菌体质粒DNA提取和纯化。 
8、菌体质粒DNA提取和纯化： 
8.1将上述菌体进行RNA的去除：按每60g湿重向沉淀内加入100ml细胞悬浮缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.5；10mM EDTA；100μg/mL RNaseA)，充分混匀，在37 ℃水育摇床中缓慢水平振荡1h； 
8.2菌体的碱裂解：加入100mL细胞裂解液(0.2M NaOH；1％SDS)，边加边缓慢混匀，室温放置5分钟，达到充分裂解；随即缓慢加入125mL中和液(1.32M醋酸钾，pH 4.8)，再将加入中和溶液后的菌体4000rpm离心10min分钟后，取上清液； 
8.3质粒制备液的净化和浓缩：取离心后的上清液通过多层纱布过滤到一洁净的1000mL离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，混匀后4℃，4000rpm离心15min；弃上清，沉淀中加入20mLTE(10mM Tris-HCl 1mM EDTA PH＝8.0)溶解沉淀，并用吸管将溶解后的沉淀缓慢吹打均匀，放置4℃过夜，再13000rpm，离心10min，取上清，加入等体积的40％PEG8000，混匀后13000rpm，离心10min，弃上清，沉淀中加入20mL灭菌过滤的0.01mol/L pH7.2的PBS中以溶解沉淀，测定溶解沉淀后溶液的OD260，得到纯化的质粒DNA，在-20℃冻存待检。 
9、质粒DNA的检验：对上述冻存待检的质粒DNA进行以下七个方面的检验： 
9.1质粒的一致性检验：限制性双酶切(Xba I、EcoR I)和PCR鉴定应符合重组质粒特征。方法如下：(1)PCR方法：上游引物为：5’GAC GAA TTC ATG ATC GGT AATAC 3’，下游引物为：5’GAC GCG GCC GCG AAT AAT ATT CAC T 3’，程序为94℃、5min，进入循环(94℃、30sec，50℃、45sec，72℃、1min，30个循环)，72℃延伸10min，PCR产物经电泳检测，条带大小为0.6kb，应符合重组质粒特征。(2)双酶切方法：Xba I、EcoR I双酶切质粒DNA，37℃酶切2个小时后，进行电泳检测，条带大小为0.6kb，应符合重组质粒特征。 
9.2质粒DNA纯度检验：质粒DNA经紫外分光光度计检测，方法如下：PBS(0.01mlo/L、pH7.2)溶解质粒，取80μL质粒溶液与2920μL PBS溶液混合，以3000μLPBS溶液作为对照，OD260∶OD280比值应在1.8-1.9因间内。 
9.3质粒DNA中外源DNA含量：定量PCR检测宿主K12DH-5α的基因组DNA应小于10ng/mg。 
9.4质粒DNA中内毒素：鲎试剂检测内毒素应低于10EU/mg。方法参照《中国生物制品规程》(2000版)进行检测。 
9.5质粒DNA中蛋白质：通过凯基BCA蛋白含量检测试剂盒(KEYGEN BCAProtein Assay Kit)检测，分光光度计检测宿主K12DH-5α蛋白质应小于10μg/mg。 
9.6质粒DNA中超螺旋质粒含量的检验：1％琼脂糖或8％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测超螺旋质粒应高于75％。 
9.7质粒DNA的无菌检验：质粒用PBS稀释，取样做无菌检验，按《中华人民共和国兽药典》第三部附录15页进行，应无菌生长。 
经以上七个方面的检测均合格者即为半成品基因工程疫苗，再用PBS稀释、分装，并于-20℃条件下保存，经预防用生物制品规范的常规检测，检验合格者即为生产用牙鲆淋巴囊肿病毒病基因工程疫苗成品，用于牙鲆淋巴囊肿病毒病的预防。 
本发明是牙鲆淋巴囊肿病基因工程疫苗的一套完整的生产方法，其生产工艺具有简便、稳定性好和成本较低的特点；该方法制备的的基因工程疫苗与目前使用的灭活疫苗、减毒疫苗、多肽疫苗、亚单位疫苗和重组多肽疫苗等相比，具有其免疫效果好、安全无副作用和质量可控的优点。 
具体实施方式
实施例1 
本发明的具体生产方法以生产2000mL淋巴囊肿病基因工程疫苗(可用于1万尾牙鲆淋巴囊肿病的预防)为例。 
将50ng重组质粒pEGFP-N2-LCDV-MCP0.6kb平分加入到2支盛有感受态细胞(K12DH-5α)的1.5mL离心管中，重组质粒的体积不得超过感受态细胞的5％，轻轻旋转1.5mL离心管混匀，然后42℃热激90s后迅速将1.5mL离心管移到冰浴中，使细胞冷却1-2min，向每200μL感受态细胞中，加入800μL的SOC培养基，然后将管放在37℃摇床上，温育45min，即得到生产用菌种K12 DH-5α-LCDV0.6kb。上述SOC培养基配方为为：2％胰蛋白胨，0.5％酵母浸出汁，0.05％NaCl，2.5mM KCl，10mM MgCl2，20mM葡萄糖，灭菌20分钟，室温保存备用。 
将上述1支生产用菌种划线到10个Minca琼脂平板，37℃培养24-36小时，取典型菌落划线Minca琼脂平板5个，用0.01mol/L、pH7.2的PBS将平板上的菌落洗下，分装5mL灭菌小瓶5瓶，加10％甘油混匀作为一级种子。接种1支一级生产种子至含30ug/mL卡那霉素的1升LB液体培养基，取趋于饱和期的细菌，参照分子克隆实验指南第三版中碱裂解法提取质粒DNA，依次用PCR方法和Xba1和EcoR1双酶切进行鉴定，产物经电泳检测，有0.6kb的条带产生，符合重组质粒特征，为合格。上述PBS配方为：每升三蒸水含8g Nacl，0.2g Kcl，1.44g Na2HPO4，0.2g KH2PO4，调pH7.2，灭菌20min，室温保存。上述LB液体培养基配方为每升蒸馏水中含10g胰蛋白胨，5g酵母浸出汁，5g NaCl，调pH为7.0，灭菌20min，室温保存。 
PCR方法的上游引物为：5’GAC GAA TTC ATG ATC GGT AAT AC 3’，下游引物为：5’GAC GCG GCC GCG AAT AAT ATT CAC T 3’，程序为94℃、5min，进入循环(94℃、30sec，50℃、45sec，72℃、1min，30个循环)，72℃延伸10min。 
将上述检验合格的一级种子接种于生产用琼脂扁瓶中，使其均匀分布于琼脂表面上。37℃培养18-24小时后，将菌落生长良好的扁瓶取出，每瓶加入适量的pH6.3-6.8生理盐水将菌苔洗下，将纯净菌液混合均匀悬浮，分装5mL灭菌小瓶，加10％甘油混匀，逐瓶作纯净性检验，合格者作为二级生产种子。 
将120L马丁肉汤培养基装入工作容积为170L的发酵罐内，121℃、30分钟高压灭菌，在无菌条件下按发酵液的2％将检验合格的二级种子加入到发酵罐内，并按100g/L和50g/L的比例分别向发酵液中加入葡萄糖和卡那霉素；在发酵过程中，用氨水和盐酸 调节罐内pH至7.0，通过调节通气量和搅拌速度保持溶氧为30％。当溶氧高于30％时，进行指数连续流加补料培养基。当细胞OD600达到40时，添加氯霉素，使终浓度为150μg/ml，并将流加速度降低50％。上述的补料培养基是由每升含酵母抽提物40g，蛋白胨80g，葡萄糖100g，氯化镁5g配制而成。发酵过程的参数控制如下：pH 7.0，搅拌转速200rpm，通气量6.0m3/h，培养时间10-12h。 
在发酵6h、8h、10h、12h时取样进行纯度镜检，纯度大于99％，为合格；并参照下述方法进行质粒稳定性检验：取发酵培养后的细菌，分别等量涂布于含与不含卡那霉素(30ug/mL)的平板上，菌落比例高于99％者视为稳定。 
发酵培养结束后，将检测合格的发酵培养的菌液，经3000rpm离心15分钟，收获菌体，称重，分装(60g/份)，共计50份，将分装菌体溶解于500mL PBS溶液中，分别置于1L体积的离心转子中，3000rpm离心5min，洗涤菌体一次后，进行菌体质粒DNA提取和纯化： 
首先，将上述菌体进行RNA的去除：按每60g湿重向沉淀内加入100ml细胞悬浮缓冲液，充分混匀，在37℃水育摇床中缓慢水平振荡1h；上述细胞悬浮缓冲液配方为：50mM Tris-HCl，pH 7.5；10mM EDTA；100μg/mL RNaseA。； 
然后，加入配方为0.2M NaOH和1％SDS的细胞裂解液100mL，边加边缓慢混匀，室温放置5分钟，达到充分裂解；随即缓慢加入配方为1.32M醋酸钾和pH 4.8的125mL中和液，再将加入中和溶液后的菌体4000rpm离心10min分钟后，取上清液； 
再次，质粒制备液的净化和浓缩：取离心后的上清液通过多层纱布过滤到一洁净的1000mL离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，混匀后4℃，4000rpm离心15min；弃上清，沉淀中加入20mLTE溶解沉淀，并用吸管将溶解后的沉淀缓慢吹打均匀，放置4℃过夜，再13000rpm，离心10min，取上清，加入等体积的40％PEG8000，混匀后13000rpm，离心10min，弃上清，沉淀中加入20mL灭菌过滤的0.01mol/L pH7.2的PBS中以溶解沉淀，测定溶解沉淀后溶液的OD260，得到纯化的质粒DNA。-20℃冻存待检。 
之后，对上述所获得的冻存待检的质粒DNA进行以下七个方面的检验： 
1、质粒的一致性检验：限制性双酶切(Xba I、EcoR I)和PCR鉴定应符合重组质粒特征。方法如下：(1)PCR方法：上游引物为：5’GAC GAA TTC ATG ATC GGT AAT AC3’，下游引物为：5’GAC GCG GCC GCG AAT AAT ATT CAC T 3’，程序为94℃、5min，进入循环：94℃、30sec，50℃、45sec，72℃、1min，30个循环，72℃延伸10min，PCR产物经电泳检测，条带大小为0.6kb，符合重组质粒特征。(2)双酶切方法：Xba I、EcoRI双酶切质粒DNA，37℃酶切2个小时后，进行电泳检测，条带大小为0.6kb，符合重组质粒特征。 
2、DNA纯度检验：质粒DNA经紫外分光光度计检测，方法如下：PBS溶解质粒，取80μL质粒溶液与2920μL PBS溶液混合，以3000μL的PBS溶液作为对照，OD260∶OD280比值为1.89。 
3、外源DNA含量：定量PCR检测，无宿主K12DH-5α的基因组的存在。 
4、内毒素：鲎试剂检测内毒素应低于8.5EU/mg，符合规定。 
5、蛋白质：通过凯基BCA蛋白含量检测试剂盒检测，分光光度计检测宿主K12DH-5α蛋白质为1.89μg/mg，符合规定。 
6、超螺旋质粒含量的检验：1％琼脂糖凝胶电泳检测超螺旋质粒应高于85％，符合规定。 
7、无菌检验：质粒用PBS稀释，取样根据《中华人民共和国兽药典》第三部附录15页要求做无菌检验，无菌，符合要求。 
最后，将上述检验合格的质粒DNA用PBS稀释、分装，每瓶10ml，共计100瓶，并于-20℃条件下保存，经以下四个方面的检测，检验合格者即为生产用牙鲆淋巴囊肿病毒病基因工程疫苗成品，用于牙鲆淋巴囊肿病毒病的预防。 
1物理性状：为无色或略带白色的透明液体，无混浊或沉淀。 
2无菌检验：无菌生长。 
3安全检验：取体重为100-150g的牙鲆30条，肌肉注射50μg疫苗，观察15日，全部健活。 
4效力检验：用体重为100-150g健康牙鲆30条，各肌肉注射疫苗10μg，同时肌肉注射PBS 200μL，于16-22℃水温培养。免疫鱼血清转阳率应高于80％、对照鱼小于10％或免疫鱼特异性抗体效价应高于1∶1600、对照鱼小于1∶100为合格。 
本发明制备的牙鲆淋巴囊肿病毒病基因工程疫苗的生产工艺简便、稳定性好、成本较低，经上述步骤制备的牙鲆淋巴囊肿病毒病基因工程疫苗成品，可有效预防牙鲆淋巴囊肿病毒病的发生。 
SEQUENCE LISTING 
<110>国家海洋局第一海洋研究所 
<120>牙鲆淋巴囊肿病基因工程疫苗及其生产方法 
<160>1 
<170>PatentIn version 3.5 
<210>1 
<211>624 
<212>DNA 
<213>淋巴囊肿病毒Lymphocystis disease virus 
<400>1 
atgatcggta atactattga tatgacacaa cccgttgatt ccaatggtca attacctgaa     60 
gaagtgttaa tacttccttt accttatttc ttttctcgag atagcggtat ggctttaccc    120 
agcgctgctt tgccttataa tgaaataaga ttaacttttc atctgagaga ttggactgaa    180 
ttattgatct ttcaaaataa aaacgactct accatcatgc ctttgacagc aggcgattta    240 
gactggggta aacctgattt aaaggatgtg caagtatgga ttactaatgt agtagtaacc    300 
aatgaggaac gtcgtttaat gggtacagta cctagagaca tcttggtgga acaggtacaa    360 
acagcaccta aacatgtatt tcaacctcta actattccaa gtcctaattt tgacatcaga    420 
ttttctcatg ccattaaaat cctttttttc ggtgtgcgta atgttaccta tcaagctata    480 
caatccaatt acaccagttc ttctcctgta atctttgacg gtggaattgc tagcgattta    540 
ccgggtattg ctgctgatcc tatttcaaat gttaccttgg tttatgaaaa tagtgctcgt    600 
cttaatgaaa tgggtagtga atat                                           624 

Claims (10)

1.一种牙鲆淋巴囊肿病基因工程疫苗，特征在于该疫苗由大小为0.6kb的淋巴囊肿病毒核衣壳蛋白基因MCP片段，插入到真核表达载体pEGFP-N2中构成的重组质粒pEGFP-N2-LCDV-MCP 0.6kb，插入到核酸疫苗中的淋巴囊肿病毒核衣壳蛋白基因MCP片段序列为：
ATGATCGGTAATACTATTGATATGACACAACCCGTTGATTCCAATGGTCAATTACCTGAAGAAGTGTTAATACTTCCTTTACCTTATTTCTTTTCTCGAGATAGCGGTATGGCTTTACCCAGCGCTGCTTTGCCTTATAATGAAATAAGATTAACTTTTCATCTGAGAGATTGGACTGAATTATTGATCTTTCAAAATAAAAACGACTCTACCATCATGCCTTTGACAGCAGGCGATTTAGACTGGGGTAAACCTGATTTAAAGGATGTGCAAGTATGGATTACTAATGTAGTAGTAACCAATGAGGAACGTCGTTTAATGGGTACAGTACCTAGAGACATCTTGGTGGAACAGGTACAAACAGCACCTAAACATGTATTTCAACCTCTAACTATTCCAAGTCCTAATTTTGACATCAGATTTTCTCATGCCATTAAAATCCTTTTTTTCGGTGTGCGTAATGTTACCTATCAAGCTATACAATCCAATTACACCAGTTCTTCTCCTGTAATCTTTGACGGTGGAATTGCTAGCGATTTACCGGGTATTGCTGCTGATCCTATTTCAAATGTTACCTTGGTTTATGAAAATAGTGCTCGTCTTAATGAAATGGGTAGTGAATAT
其中A为腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，G为鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸，C为胞嘧啶脱氧核糖核苷酸，T为胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸。
2.牙鲆淋巴囊肿病基因工程疫苗的生产方法，其特征在于生产步骤依次是牙鲆淋巴囊肿病基因工程疫苗质粒库的制备；
然后将该牙鲆淋巴囊肿病基因工程疫苗转化入大肠杆菌制备出生产用菌种K12DH-5α-LCDV0.6kb；再将该生产用菌种划线到Minca琼脂平板、分离纯化制备出一级生产种子，并对其鉴定确定合格的一级种子；
再将上述合格的一级种子接种于若干琼脂扁瓶中在37℃培养24-48h后得二级生产种子，并对其鉴定确定合格的二级种子；
再将上述合格的二级种子在发酵罐中进行发酵培养，得到发酵的二级种子培养菌液；
最后对上述二级种子培养菌液进行菌体收集、离心、质粒DNA提取、纯化，再对提取得到的质粒DNA分别进行无菌、DNA纯度、外源DNA含量、内毒素、蛋白质和超螺旋质粒含量的检验，检测合格者即得。
3.如权利要求2所述的牙鲆淋巴囊肿病基因工程疫苗的生产方法，其特征是所述的牙鲆淋巴囊肿病基因工程疫苗质粒库制备方法，首先在真核表达载体pEGFP-N2的多克隆位点处通过SphI和EcoR I双酶切克隆入抗原编码基因MCP 0.6kb片段，并经Bam HI和NotI双酶切去除真核表达载体pEGFP-N2中的EGFP基因后，得到重组质粒pEGFP-N2-LCDV-MCP0.6kb，全长4.7kb，即为牙鲆淋巴囊肿病基因工程疫苗质粒库；上述抗原编码基因的获得是由接种牙鲆淋巴囊肿病毒中国株LCDV-cn的牙鲆鳃细胞系FG-9307，经RNA提取、反转录合成cDNA，针对MCP设计特异性引物，经PCR扩增，PCR产物经测序仪测序鉴定获得的624bp LCDV-cn MCP基因片段。
4.如权利要求2所述的牙鲆淋巴囊肿病基因工程疫苗的生产方法，其特征是上述的基因工程疫苗生产用菌种的制备方法：将上述生产用菌种划线到Mi nca琼脂平板，并且按常规方法分离纯化，用0.01mo l/L pH7.2PBS洗下，分装5mL灭菌小瓶，加10％甘油混匀作为一级种子，-70℃保存。
5.如权利要求2所述的牙鲆淋巴囊肿病基因工程疫苗的生产方法，其特征是上述的基因工程疫苗的二级种子的制备：将上述一级种子接种于生产用琼脂扁瓶中，使其均匀分布于琼脂表面上，在37℃培养18-24小时，将菌落生长良好的扁瓶取出，每瓶加入适量的pH6.3-6.8生理盐水将菌苔洗下，将纯净菌液混合均匀悬浮，分装5mL灭菌小瓶，加10％甘油混匀，逐瓶或分组作纯净性检验，合格者作为二级生产种子。
6.如权利要求2所述的牙鲆淋巴囊肿病基因工程疫苗的生产方法，其特征是上述的二级生产种子的发酵培养方法：将马丁肉汤培养基装入发酵罐内，121℃、30分钟高压灭菌，在无菌条件下按发酵液的2％将合格的二级种子加入发酵罐内，并按100g/L和50g/L的比例分别向发酵液中加入葡萄糖和卡那霉素，消泡剂适量；在发酵过程中，用氨水和盐酸调节罐内pH至7.0，通过调节通气量和搅拌速度保持溶氧为30％；当溶氧高于30％时，进行指数连续流加补料培养基；当细胞OD600达到40时，添加氯霉素，使终浓度为150μg/ml，并将流加速度降低50％；发酵过程的参数控制如下：pH 7.0，搅拌转速200rpm，通气量6.0m3/h，培养时间10-12h；在发酵6h、8h、10h、12h时取样进行纯度镜检，纯度大于99％为合格；并进行质粒稳定性检验：取发酵培养后的细菌，分别等量涂布于含30ug/mL卡那霉素与不含卡那霉素的平板上，菌落比例高于99％者视为稳定；上述的补料培养基是由每升含酵母抽提物40g，蛋白胨80g，葡萄糖100g，氯化镁5g配制而成。
7.如权利要求2所述的牙鲆淋巴囊肿病基因工程疫苗的生产方法，其特征是上述的二级生产种子的发酵培养后菌液的浓缩方法：将上述的检测合格的发酵培养的菌液，经3000rpm离心15分钟，收获菌体，称重，分装，60g/份，将分装菌体溶解于500mL PBS溶液中即得到浓缩菌液，再分别置于1L体积的离心转子中，3000rpm离心5min，得到菌体，以便进行菌体质粒DNA提取和纯化。
8.如权利要求2所述的牙鲆淋巴囊肿病基因工程疫苗的生产方法，其特征是上述的菌体质粒DNA提取和纯化，分三个步骤进行：(1)上述菌体进行RNA的去除：按每60g湿重向沉淀内加入100ml细胞悬浮缓冲液，充分混匀，在37℃水育摇床中缓慢水平振荡1h；(2)菌体的碱裂解：加入100mL细胞裂解液，边加边缓慢混匀，室温放置5分钟，达到充分裂解；随即缓慢加入125mL中和液再将加入中和溶液后的菌体4000rpm离心10mi n分钟后，取上清液；(3)质粒制备液的净化和浓缩：取离心后的上清液通过多层纱布过滤到一洁净的1000mL离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，混匀后4℃，4000rpm离心15min；弃上清，沉淀中加入20mLTE溶解沉淀，并用吸管将溶解后的沉淀缓慢吹打均匀，放置4℃过夜，再13000rpm，离心10min，取上清，加入等体积的40％PEG8000，混匀后13000rpm，离心10min，弃上清，沉淀中加入20mL灭菌过滤的0.01mol/LpH7.2的PBS中以溶解沉淀，测定溶解沉淀后溶液的OD260，得到纯化的质粒DNA，在-20℃冻存待检。
9.如权利要求2所述的牙鲆淋巴囊肿病基因工程疫苗的生产方法，其特征是上述的质粒DNA的检验，分七个方面进行：(1)质粒的一致性检验：限制性双酶切和PCR鉴定应符合重组质粒特征；(2)DNA纯度检验：质粒DNA经紫外分光光度计检测，OD260∶OD280比值应在1.8-1.9区间内；HPLC检测纯度应大于95％；(3)外源DNA含量测定：定量PCR检测宿主K12DH-5α的基因组DNA应小于10ng/mg；(4)内毒素含量测定：鲎试剂检测内毒素应低于10EU/mg；(5)外源蛋白质含量检测：通过凯基BCA蛋白含量检测试剂盒检测，分光光度计检测宿主K12DH-5α蛋白质应小于10μg/mg；(6)超螺旋质粒含量的检验：1％琼脂糖或8％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测超螺旋质粒应高于75％；(7)无菌检验：质粒用PBS稀释，取样做无菌检验，应无菌生长；经以上七个方面的检测均合格者即为半成品基因工程疫苗，再经过常规的效力检验，血清转阳率应高于80％，最后常规的安全检验，合格者即为生产用牙鲆淋巴囊肿病毒病基因工程疫苗成品。
10.牙鲆淋巴囊肿病基因工程疫苗应用于牙鲆淋巴囊肿病毒病的预防。
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