CN110297092A - 一种呕吐毒素的化学发光检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明实施例公开了一种呕吐毒素的化学发光检测试剂盒及其制备方法，所述试剂盒包括吖啶取代物标记的呕吐毒素抗体、偶联有呕吐毒素抗原的磁微粒、校准品溶液、清洗液、化学发光预激发液A和化学发光激发液B；上述试剂盒以磁分离化学发光技术为检测手段，同时采用吖啶取代物标记技术进行检测以建立一种检测呕吐毒素的直接化学发光试剂盒，吖啶取代物具有分子量小、背景发光低、信噪比高、发光效率高、标记稳定、可显著提高检测呕吐毒素的灵敏度。

Description

一种呕吐毒素的化学发光检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明实施例涉及化学发光检测技术领域，具体涉及一种呕吐毒素的化学发光检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
呕吐毒素主体成分为DON(deoxynivalenol,脱氧雪腐镰刀菌烯醇)，属于单端孢霉烯族化合物，主要由禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌、拟枝孢镰刀菌、粉红镰刀菌、雪腐镰刀菌等镰刀菌属(Fusarium)的菌株产生。呕吐毒素主要污染玉米、小麦、大米、大麦、小米和燕麦等。呕吐毒素具有雌性激素作用，主要作用于生殖系统，可使家畜、家禽等产生雌性激素亢进症。食用含呕吐毒素的面粉制作的面食可以引起中枢神经系统的中毒，症状如恶心、发冷、头痛、神智抑郁和共济失调等。妊娠期的人和动物食用含呕吐毒素的食物易引起流产、死胎和畸胎，因此建立快速、灵敏、准确的呕吐毒素检测技术对人类健康具有重要意义。
目前，呕吐毒素的检测方法有化学发光法、液相色谱法、酶联免疫法、免疫胶体金法等，其中，液相色谱法需要大型仪器和专业人员，不利于随时随地快速检测，且成本较高，因而使用受限。化学发光免疫分析方法具有高灵敏度、操作简便、快速的特点，易于标准化操作，并且试剂保持期长，特别适用于临床实验诊断工作。
化学发光免疫测定所用的标记物有两种：一种是用直接发光物质(吖啶酯等)标记的抗体或抗原；一种是用催化剂(辣根过氧化物酶、碱性磷酸化酶)标记的抗体或抗原。按照标记反应的过程和形成结合物的结构特点，可以将标记分子分为“直接偶联”和“间接偶联”两种方式。间接偶联可以在原有结构中引进新的活性基，增加反应活性。
现有专利申请CN201611037179.3公开了一种呕吐毒素的化学发光免疫检测方法，该方法采用辣根过氧化物酶作为标记物，发光底物在酶的作用下，发生化学发光反应。采用辣根过氧化物酶等酶进行标记的缺点是酶促反应受环境影响大：如消毒液、酸碱度、离子都会对其造成影响，稳定性较弱，从而影响测定结果。
因此，需要开发出一种稳定性好、灵敏度高、操作方便的呕吐毒素检测方法。
发明内容
为此，本发明实施例提供一种呕吐毒素的化学发光检测试剂盒，以解决现有技术中采用酶进行标记而存在的酶促反应受环境影响大、稳定性较弱，准确性差以及灵敏度较低的问题。
为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
根据本发明实施例的第一方面提供一种呕吐毒素的化学发光检测试剂盒，所述试剂盒包括吖啶取代物标记的呕吐毒素抗体、偶联有呕吐毒素抗原的磁微粒、校准品溶液、清洗液、化学发光预激发液A和化学发光激发液B。
本发明上述试剂盒以磁分离化学发光技术为检测手段，同时采用吖啶取代物标记技术进行检测以建立一种检测呕吐毒素的直接化学发光试剂盒，吖啶取代物具有分子量小、背景发光低、信噪比高、发光效率高、标记稳定、可显著提高检测呕吐毒素的灵敏度；此外，本发明试剂盒对样本前处理要求低，样本在提取、稀释后即可用于检测，该试剂盒具有操作简便、发光值稳定、检测快速方便、准确性高、重复性好、特异性强等优点。
进一步地，所述吖啶取代物为吖啶酯(NSP-DMAE-NHS)或吖啶磺酰胺(NSP-SA-NHS)。
进一步地，所述呕吐毒素抗体由保藏编号为CCTCC NO：C201474的杂交瘤细胞株W5分泌得到。
进一步地，所述校准品溶液为采用含有0.5-5.0％BSA和0.1-0.5％PC300的Tris-HCl缓冲液配制而成的浓度为0μg/L、0.01μg/L、0.05μg/L、0.25μg/L、1.25μg/L、6.25μg/L的呕吐毒素溶液。
进一步地，所述化学发光预激发液A为含有双氧水的硝酸溶液，其中，双氧水质量浓度为1-3％，硝酸浓度为为0.5-2mol/L。
进一步地，所述化学发光激发液B为含有氢氧化钠的Triton X-100溶液，其中，氢氧化钠浓度为0.5-0.8mol/L，Triton X-100浓度为0.5-2mol/L。
进一步地，所述吖啶取代物标记的呕吐毒素抗体通过如下方法制得：
(a)将呕吐毒素抗体置于透析袋中，并将透析袋置于标记缓冲液中进行透析，透析过程中标记缓冲液至少更换4次，最后一次透析过夜，所述标记缓冲液为pH 8.0-11.0、浓度为0.05-0.50mol/L Na2CO3-NaHCO3缓冲液；
(b)将吖啶取代物溶于无水二甲基甲酰胺中，得到浓度为10-20mmol/L吖啶取代物溶液；
(c)将透析后的呕吐毒素抗体置于离心管中，加入上述吖啶取代物溶液，使得吖啶取代物与呕吐毒素抗体的摩尔比为(10-50)∶1，随后加入标记缓冲液200μL，室温下反应1-2h，再加入10-20g/L赖氨酸100μL，继续反应10-30min；
(d)将上述反应后的溶液通过Sephadex G-50柱分离，再用pH 6.3、0.1mol/L的PBS纯化缓冲液洗脱并收集吖啶取代物标记的呕吐毒素抗体，加入1％BSA保存。
进一步地，所述偶联有呕吐毒素抗原的磁微粒由磁微粒直接与呕吐毒素抗原直接偶联制得，或由磁微粒与链霉亲和素偶联，再与生物素标记的呕吐毒素抗原结合制得。
优选地，所述呕吐毒素抗原与磁微粒直接偶联方法如下：
(a)将1-2mg羧基磁微粒置于离心管中，并加入200μL的0.2-0.3mol/L、pH 5.0的MES缓冲液，混匀，置于磁力架上静置4-6min使磁微粒与液体分开，弃去上清，洗涤3次，再加入200μL的0.2-0.3mol/L、pH 5.0的MES缓冲液，混匀；
(b)将呕吐毒素抗原25-50μg置入离心管中，室温孵育40-60min；
(c)再向离心管中加入10μL浓度为20-30mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，室温孵育3-5h；
(d)去上清，用含有0.05％Tween-20、pH 5.0、浓度为10mmol/L的Tris-HCl缓冲液，洗涤2-4次；
(e)再采用含2-2.5％BSA、pH 6.0、浓度为10mmol/L的Tris-HCl缓冲液进行封闭，反复封闭3-5次，每次10min，得到偶联由呕吐毒素抗原的磁微粒，并置于2-8℃保存。
进一步地，所述清洗液为含有氯化钠以及Tween-20的pH 7.0-9.0、浓度为5-50mmol/L的Tris-HCl溶液，其中氯化钠浓度为0.05-0.50mol/L，Tween-20的浓度为0.01-0.25％。
本发明实施例具有如下优点：
(1)本发明上述试剂盒以磁分离化学发光技术为检测手段，同时采用吖啶取代物标记技术进行检测以建立一种检测呕吐毒素的直接化学发光试剂盒，吖啶取代物具有分子量小、背景发光低、信噪比高、发光效率高、标记稳定、可显著提高检测呕吐毒素的灵敏度。
(2)本发明试剂盒对样本前处理要求低，样本在提取、稀释后即可用于检测，能够实现大批量自动化检测。
(3)本发明试剂盒具有操作简便、发光值稳定、检测快速方便、准确性高、重复性好、特异性强等优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
图1为本发明实验例1提供的实施例4中试剂盒的标准曲线。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例为吖啶酯标记的呕吐毒素抗体的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(a)将呕吐毒素抗体(由保藏编号为CCTCC NO：C201474的杂交瘤细胞株W5分泌得到)置于透析袋中，并将透析袋置于体积为1L的标记缓冲液中进行透析，透析过程中标记缓冲液更换4次，最后一次透析过夜，标记缓冲液为pH 10、浓度为0.1mol/L Na2CO3-NaHCO3缓冲液；
(b)将吖啶酯溶于无水二甲基甲酰胺中，得到浓度为10mmol/L的吖啶酯溶液；
(c)将透析后的呕吐毒素抗体置于离心管中，加入上述吖啶酯溶液，使得吖啶酯与呕吐毒素抗体的摩尔比为20∶1，随后加入标记缓冲液200μL，室温下反应1.5h，再加入15g/L赖氨酸100μL，继续反应20min；
(d)将上述反应后的溶液通过Sephadex G-50柱(1×25)分离，再用pH6.3、0.1mol/L的PBS纯化缓冲液平衡并淋洗层析柱，分离过程中用色谱仪检测蛋白峰，分别测量洗脱液的化学发光强度和280nm吸光度值，并收集光度值高其吸光度大的洗脱液，加入1％BSA后分装冰冻保存，即得吖啶酯标记的呕吐毒素抗体。
实施例2
本实施例为吖啶磺酰胺标记的呕吐毒素抗体的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(a)将呕吐毒素抗体(由保藏编号为CCTCC NO：C201474的杂交瘤细胞株W5分泌得到)置于透析袋中，并将透析袋置于体积为1L的标记缓冲液中进行透析，透析过程中标记缓冲液更换4次，最后一次透析过夜，标记缓冲液为pH 10、浓度为0.1mol/L Na2CO3-NaHCO3缓冲液；
(b)将吖啶磺酰胺溶于无水二甲基甲酰胺中，得到浓度为10mmol/L的吖啶磺酰胺溶液；
(c)将透析后的呕吐毒素抗体置于离心管中，加入上述吖啶磺酰胺溶液，使得吖啶磺酰胺与呕吐毒素抗体的摩尔比为20∶1，随后加入标记缓冲液200μL，室温下反应1.5h，再加入15g/L赖氨酸100μL，继续反应20min；
(d)将上述反应后的溶液通过Sephadex G-50柱(1×25)分离，再用pH6.3、0.1mol/L的PBS纯化缓冲液平衡并淋洗层析柱，分离过程中用色谱仪检测蛋白峰，分别测量洗脱液的化学发光强度和280nm吸光度值，并收集光度值高其吸光度大的洗脱液，加入1％BSA后分装冰冻保存，即得吖啶酯标记的呕吐毒素抗体。
实施例3
本实施例为一种偶联有呕吐毒素抗原的磁微粒的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(a)将1.5mg羧基磁微粒置于0.5ml的离心管中，并加入200μL的0.2mol/L、pH 5.0的MES缓冲液，漩涡混匀，置于磁力架上静置5min使磁微粒与液体分开，弃去上清，洗涤3次，再加入200μL的0.2mol/L、pH 5.0的MES缓冲液，漩涡混匀。
(b)将呕吐毒素抗原30μg置入离心管中，漩涡混匀，然后将离心管置入选装反应器上，室温孵育50min；
(c)再向离心管中加入10μL浓度为20mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，漩涡混匀，再将离心管置于旋转反应器上，室温孵育3h；
(d)去上清，将入200μL含有0.05％Tween-20、pH 5.0、浓度为10mmol/L的Tris-HCl缓冲液进行洗涤，洗涤3次；
(e)再采用含2％BSA、pH 6.0、浓度为10mmol/L的Tris-HCl缓冲液进行封闭，反复封闭4次，每次10min，得到偶联由呕吐毒素抗原的磁微粒，并置于4℃保存。
实施例4
本实施例为一种呕吐毒素的化学发光检测试剂盒，该试剂盒包括实施例1制备得到的吖啶酯标记的呕吐毒素抗体、实施例3制备得到的偶联有呕吐毒素抗原的磁微粒、校准品溶液、清洗液、化学发光预激发液A和化学发光激发液B，其中：
校准品溶液为采用含有2％BSA和0.25％PC300的Tris-HCl缓冲液配制而成的浓度为0μg/L、0.01μg/L、0.05μg/L、0.25μg/L、1.25μg/L、6.25μg/L的呕吐毒素溶液；
化学发光预激发液A为含有双氧水的硝酸溶液，其中，双氧水质量浓度为2％，硝酸浓度为为0.5mol/L，采用棕色瓶子分装成支，每支20ml；
化学发光激发液B为含有氢氧化钠的Triton X-100溶液，其中，氢氧化钠浓度为0.5mol/L，Triton X-100浓度为0.5mol/L，采用棕色瓶子分装成支，每支20ml；
清洗液为含有氯化钠以及Tween-20的pH 8.0、浓度为10mmol/L的Tris-HCl溶液，其中氯化钠浓度为0.1mol/L，Tween-20的浓度为0.1％。
实施例5
本实施例为一种呕吐毒素的化学发光检测试剂盒，该试剂盒与实施例4中的试剂盒基本相同，区别仅在于将实施例4中的实施例1制备得到的吖啶酯标记的呕吐毒素抗体中的呕吐毒素抗体替换为北京点石科创生物技术有限公司生产的批号为20170602的呕吐毒素单克隆抗体。
实施例6
本实施例为一种呕吐毒素的化学发光检测试剂盒，该试剂盒与实施例4中的试剂盒基本相同，区别仅在于将实施例4中的实施例1制备得到的吖啶酯标记的呕吐毒素抗体中的呕吐毒素抗体替换为HYTEST公司生产的批号为20160212的呕吐毒素单克隆抗体。
实施例7
本实施例为一种呕吐毒素的化学发光检测试剂盒，该试剂盒与实施例4中的试剂盒基本相同，区别仅在于将实施例4中的实施例1制备得到的吖啶酯标记的呕吐毒素抗体替换为实施例2制备得到的吖啶磺酰胺标记的呕吐毒素抗体。
实验例1
本实验例为采用上述试剂盒对奶粉样品中呕吐毒素的检测方法，该检测方法包括如下步骤：
1、样本前处理：
取1g的待测奶粉样本于50mL离心管中，加入10mL 2％NaCl以及0.2mol/L HCl-甲醇混合液，振荡1min，5000r/min离心8min，取0.5mL上清液，加入0.05mL、0.5mol/L NaOH溶液，再加入9.45mL浓度为0.02mol/L的磷酸盐缓冲液，混匀；
2、试剂盒的检测：
(1)分别将待测样本100μL、不同浓度的标准品溶液放入不同的反应管中，再依次分别加入偶联有呕吐毒素抗原的磁微粒混悬液150μL、吖啶酯或吖啶磺酰胺标记的呕吐毒素抗体150μL，振荡混匀，37℃孵育15min；
(2)分离，清洗5次；
(3)将洗涤后的反应容器充分振荡使磁微粒散开；
(4)加入100μL化学发光预激发液A，1s后加入100μL化学发光激发液B，分别测量相对发光强度，利用标准品的测定结果做出标准曲线，从而得出待测样本中呕吐毒素的含量。
采用本发明实施例4的试剂盒以浓度0、0.01μg/L、0.05μg/L、0.25μg/L、1.25μg/L、6.25μg/L系列梯度为横坐标，以B/B0(100％、85％、66％、42％、23％、9.4％)为纵坐标建立得到的标准曲线如图1所示；由图1可知，IC50＝0.146μg/L，r2＝0.9978。
实验例2
采用实验例1的检测方法，通过对20组呕吐毒素为零浓度的平行样本进行检测，获得20组标准曲线零浓度点计数的平均值和标准差，以平均值加上3倍标准差所得的数值从标准曲线中获取对应的呕吐毒素浓度，即为本发明试剂盒的检测灵敏度；经测定，实施例4-7中的试剂盒检测灵敏度依次分别为0.002μg/L、0.006μg/L、0.004μg/L、0.01μg/L；可见，采用杂交瘤细胞株保藏编号为CCTCC NO：C201474生产的单克隆抗体的试剂盒4的检测灵敏度较高，而且采用吖啶磺酰胺标记笔吖啶酯标记的灵敏度要更高。
实验例3
选择实施例7中的试剂盒，以呕吐毒素作为标准，设呕吐毒素的交叉反应率为100％，用于抗体交叉反应性研究的药物均为与呕吐毒素结构或者功能相似的竞争药物：黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮；按实验例1中试剂盒检测操作，制作抑制曲线，根据线性方程计算各药物的50％抑制浓度(IC50)，交叉反应率(％CR)即为抗体对呕吐毒素的IC50与抗体对呕吐毒素竞争物的IC50之比的百分数，结果显示：实施例7中的试剂盒对呕吐毒素具有较高的特异性，对与呕吐毒素结构或者功能相似的竞争药物均无交叉反应。
实验例4
选取3个批次的实施例4中的试剂盒分别置于37℃和4℃，观察试剂盒的稳定性，37℃加速破坏性实验与4℃保存测试，具体为在不同时间进行吸光度的检测，并计算平均值，计算结果如表1所示：
表1
由表1可知：
以平均吸光度值下降在20％以内为不失去稳定性进行判断，本发明试剂盒在4℃下的保质期为至少12个月。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种呕吐毒素的化学发光检测试剂盒，其特征在于，包括吖啶取代物标记的呕吐毒素抗体、偶联有呕吐毒素抗原的磁微粒、校准品溶液、清洗液、化学发光预激发液A和化学发光激发液B。
2.根据权利要求1所述的呕吐毒素的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述吖啶取代物为吖啶酯或吖啶磺酰胺。
3.根据权利要求1所述的呕吐毒素的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述呕吐毒素抗体由保藏编号为CCTCC NO：C201474的杂交瘤细胞株W5分泌得到。
4.根据权利要求1所述的呕吐毒素的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述校准品溶液为采用含有0.5-5.0％BSA和0.1-0.5％PC300的Tris-HCl缓冲液配制而成的浓度为0μg/L、0.01μg/L、0.05μg/L、0.25μg/L、1.25μg/L、6.25μg/L的呕吐毒素溶液。
5.根据权利要求1所述的呕吐毒素的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述化学发光预激发液A为含有双氧水的硝酸溶液，其中，双氧水质量浓度为1-3％，硝酸浓度为为0.5-2mol/L。
6.根据权利要求1所述的呕吐毒素的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述化学发光激发液B为含有氢氧化钠的Triton X-100溶液，其中，氢氧化钠浓度为0.5-0.8mol/L，Triton X-100浓度为0.5-2mol/L。
7.根据权利要求1所述的呕吐毒素的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述吖啶取代物标记的呕吐毒素抗体通过如下方法制得：
(a)将呕吐毒素抗体置于透析袋中，并将透析袋置于标记缓冲液中进行透析，透析过程中标记缓冲液至少更换4次，最后一次透析过夜，所述标记缓冲液为pH8.0-11.0、浓度为0.05-0.50mol/L Na2CO3-NaHCO3缓冲液；
(b)将吖啶取代物溶于无水二甲基甲酰胺中，得到浓度为10-20mmol/L吖啶取代物溶液；
(c)将透析后的呕吐毒素抗体置于离心管中，加入上述吖啶取代物溶液，使得吖啶取代物与呕吐毒素抗体的摩尔比为(10-50)∶1，随后加入标记缓冲液200μL，室温下反应1-2h，再加入10-20g/L赖氨酸100μL，继续反应10-30min；
(d)将上述反应后的溶液通过Sephadex G-50柱分离，再用pH6.3、0.1mol/L的PBS纯化缓冲液洗脱并收集吖啶取代物标记的呕吐毒素抗体，加入1％BSA保存。
8.根据权利要求1所述的呕吐毒素的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述偶联有呕吐毒素抗原的磁微粒由磁微粒直接与呕吐毒素抗原直接偶联制得，或由磁微粒与链霉亲和素偶联，再与生物素标记的呕吐毒素抗原结合制得。
9.根据权利要求8所述的呕吐毒素的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述呕吐毒素抗原与磁微粒直接偶联方法如下：
(a)将1-2mg羧基磁微粒置于离心管中，并加入200μL的0.2-0.3mol/L、pH5.0的MES缓冲液，混匀，置于磁力架上静置4-6min使磁微粒与液体分开，弃去上清，洗涤3次，再加入200μL的0.2-0.3mol/L、pH5.0的MES缓冲液，混匀；
(b)将呕吐毒素抗原25-50μg置入离心管中，室温孵育40-60min；
(c)再向离心管中加入10μL浓度为20-30mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，室温孵育3-5h；
(d)去上清，用含有0.05％Tween-20、pH5.0、浓度为10mmol/L的Tris-HCl缓冲液，洗涤2-4次；
(e)再采用含2-2.5％BSA、pH6.0、浓度为10mmol/L的Tris-HCl缓冲液进行封闭，反复封闭3-5次，每次10min，得到偶联由呕吐毒素抗原的磁微粒，并置于2-8℃保存。
10.根据权利要求1所述的呕吐毒素的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述清洗液为含有氯化钠以及Tween-20的pH7.0-9.0、浓度为5-50mmol/L的Tris-HCl溶液，其中氯化钠浓度为0.05-0.50mol/L，Tween-20的浓度为0.01-0.25％。
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