CN101373189A - 一种检测弓形虫IgG抗体的化学发光免疫分析诊断试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测弓形虫IgG抗体的化学发光免疫分析诊断试剂盒，由阴性、阳性对照品，固相载体，弓形虫抗原标记物，酶结合物，化学发光底物液A、B，以及浓缩洗涤液组成。本发明还公开了一种弓形虫IgG抗体化学发光免疫分析诊断试剂盒的制备方法。使用本发明制备的试剂盒检测弓形虫IgG抗体，具有操作简便，灵敏度高，特异性好，与病原学检验结果符合度极高等特点，可以作为孕前检验的重要指标之一，对于提高出生人口素质、优生优育具有意义。

Description

一种检测弓形虫IgG抗体的化学发光免疫分析诊断试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及医学免疫体外诊断试剂领域，更具体地说，涉及一种检测弓形虫IgG抗体的化学发光免疫分析诊断试剂盒及其制备方法。

背景技术

弓形虫(Toxoplasma gondii)是猫科动物的肠道球虫，由法国学者Nicolle及Manceaux在刚地梳趾鼠(Ctenodactylus gondii)的脾脏单核细胞内发现，虫体呈弓形，故命名为刚地弓形虫。弓形虫病(toxoplasmosis)又称弓形体病，是由弓形虫所引起的一种人畜共患寄生虫病。据文献报道，弓形虫可感染多种哺乳动物，家畜感染率可达10-50％。全球约有10亿人感染了弓形虫，我国人群平均感染率为5.16％。

弓形虫是孕妇宫内感染导致胚胎畸形的五大病原体之一，先天性弓形虫病患者可导致智力发育障碍、神经系统病变如脑瘫、癫痫、脑膜炎、弱智等症状。我国每年约有9万名新生儿受弓形虫病损害，年均耗资上亿元，给社会和家庭带来了沉重的负担，同时也严重地影响了我国的人口素质。

当机体遭受弓形虫感染时，体内会产生相应的抗体(免疫球蛋白，Ig)，来抵抗病原体，以保护机体功能的正常运转。一般规律是先产生IgM抗体，然后产生IgG抗体。IgM抗体滴度在达到高峰后很快开始逐渐下降至较低水平，下降后一般不易检出，而IgG抗体达到高峰后则基本稳定在一个较高的滴度且持续较长时间。临床上检查出弓形虫IgG抗体说明曾经感染过，而且有一定的免疫水平。

弓形虫的病原学诊断方法具有确诊意义，但存在操作较困难、灵敏度低等缺点。因而，血清学试验是目前广泛应用的重要辅助诊断手段。常用的血清学诊断方法主要包括染色试验(Sabin-Feldman DT)、间接血凝试验(IHA)、放射免疫分析(RIA)以及酶联免疫分析(EIA)等。

染色试验存在需要活虫操作的缺点。间接血凝试验虽然与染色试验符合率高但重复性差、致敏红细胞不稳定。放射免疫分析虽然高灵敏、高特异，但存在有效期短、具有放射性污染的缺点。酶联免疫分析虽然有效期长、特异性强，但存在底物大部分有毒或为致癌物质等缺点。

化学发光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay，CLIA)是近十年来在世界范围内发展非常迅速的非放射性免疫分析，是继放射免疫分析和酶免疫分析之后发展起来的一种超高灵敏度的微量测定技术。化学发光免疫分析将抗原与抗体的高特异性免疫反应与高灵敏的化学发光检测技术相结合，具有高灵敏度、检测范围宽、操作简便快速、无污染、仪器简单经济等优点。它是放射性免疫分析与普通酶免疫分析理想的取代者，是目前最理想的免疫分析方法。

采用酶促增强的化学发光免疫分析原理为:样品中的待测物、酶标记物和固相载体上的包被物特异性结合形成酶标记的抗原-抗体复合物，催化发光底物反应，利用化学反应释放的自由能激发中间体发光，从而检测样品中待测物。

化学发光底物液通常由A、B溶液组成。A溶液含有化学发光剂及增强剂，并加入缓冲溶液配制而成。B溶液由氧化剂和缓冲溶液配制而成。在使用前两者混合，加入到待测溶液中进行反应。

异硫氰酸荧光素(FITC)是一种很稳定的荧光素，极易结合在蛋白分子上，不仅标记简单，而且标记物十分稳定。FITC作为半抗原结合到蛋白质载体上具有很强的免疫原性，FITC单克隆抗体与标记在蛋白质上的FITC反应，不仅特异性高，而且亲和力也高于抗原抗体的结合。

《免疫学杂志》2003年，19(3)期，230-234页《FITC标记单克隆抗体检测icIL-lra的方法研究》公开了通过FITC标记抗体、辣根过氧化物酶标记FITC将其应用于ELISA检测icIL-lra的方法，使用此方法能有效地放大抗原抗体反应敏感性，在免疫分析中有很大应价值。其中，FITC标记单克隆抗体的方法为:将纯化的抗IL-lra单克隆抗体在50mmol/L pH9.5碳酸盐缓冲液透析后，加入DMSO溶解的FITC，4℃反应16小时后经Sephadex-G50纯化后，分装、避光保存。

改良的过碘酸钠法是制备辣根过氧化物酶标记抗体的通用技术，即为在低pH下以NaIO₄先将HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再与抗体上的氨基相结合，所获酶标记抗体的产率高，将近70％的HRP和抗体结合，99％的抗体与酶结合，酶与抗体的活性无重大损失，是目前最常用的方法。

抗原、抗体反应要求在最适比例条件下进行，其工作浓度不同对结果影响较大，因此必须对包被抗原或抗体和标记抗体或抗原进行最佳工作浓度的滴定和选择，通常采用棋盘滴定法(也称方阵实验或方阵滴定法)选择最佳抗原或抗体的工作浓度，即为制备抗原或抗体系列梯度稀释的包被板，按列分别加入用稀释的强阳性、弱阳性、阴性参考血清及稀释液，温育、洗涤后加入系列梯度稀释的标记抗体或抗原，温育、洗涤检测结果，选择P/N最大的抗原或抗体稀释度为最佳工作浓度。

微孔板的固相包被一般采用物理吸附法，而磁性颗粒固相包被则通常采用缩合剂EDC(碳二亚胺)共价偶联法，即为通过缩合剂EDC将待包被的抗体氨基或羧基与磁性颗粒上活化的功能团羧基或氨基发生缩合反应，形成共价偶联物。

发明内容

为了解决目前临床上病原学试验操作不方便、灵敏度低，放免试剂有效期短、放射性废弃物污染危害以及酶免试剂受多种因素干扰、底物大部分有毒等不足，本发明提供了一种检测弓形虫IgG抗体的化学发光免疫分析诊断试剂盒。本发明的试剂盒由阴性、阳性对照品，固相载体，弓形虫抗原标记物，酶结合物，化学发光底物液A、B，以及浓缩洗涤液组成，其中，所述的固相载体为包被FITC抗体的微孔板或磁性颗粒，弓形虫抗原标记物为FITC标记的弓形虫抗原，酶结合物为辣根过氧化物酶标记的抗-人IgG单克隆抗体。

所述的化学发光底物液A含有:1～20mmol/L鲁米诺、0.1～0.5mmol/L4-羟基联苯、0.01～0.1mmol/L4-碘代苯基硼酸、50～500mmol/L pH8.0～10.0硼酸缓冲溶液。

所述的化学发光底物液B含有:1～5mmol/L过氧化脲、0.05～0.5％(体积)吐温20、10～50mmol/L pH7.0～7.6磷酸盐缓冲溶液。

所述的浓缩洗涤液含有:12～20％(重量)NaCl、0.1～0.7％(重量)KCl、0.05～0.2％(体积)吐温20、50～500mmol/L pH7.2～7.6Tris-HCl缓冲液，使用时用蒸馏水20倍稀释。

使用本发明的试剂盒检测弓形虫IgG抗体，操作简便，灵敏度高，特异性好，与病原学检验结果符合度极高。

在上述技术方案的基础上，优选方案为:

所述的化学发光底物液A含有:10mmol/L鲁米诺、0.3mmol/L4-羟基联苯、0.05mmol/L4-碘代苯基硼酸、200mmol/L pH8.0～10.0硼酸缓冲液。

所述的化学发光底物液B含有:3.5mmol/L过氧化脲、0.1％(体积)吐温20、20mmol/L pH7.0～7.6磷酸盐缓冲液。

在上述技术方案的基础上，优选方案为:

所述的浓缩洗涤液含有:16％(重量)NaCl、0.4％(重量)KCl、0.1％(体积)吐温20、200mmol/L pH7.4Tris-HCl缓冲液，使用时用蒸馏水20倍稀释。

本发明还提供了一种检测弓形虫IgG抗体的化学发光免疫分析诊断试剂盒的制备方法，包括以下步骤:

A、包被固相载体的制备:用含0.5～4μg/mL FITC抗体20mmol/LpH7.2～7.4磷酸盐缓冲液包被固相载体，2～8℃包被18～20小时后，用含20％(体积)小牛血清、5％(重量)蔗糖的20mmol/L pH7.4磷酸盐缓冲液封闭18～20小时，弃尽封闭液后抽湿，28℃干燥18～20小时，加入干燥剂密封；

B、FITC标记弓形虫抗原的制备:将用50mmol/L pH9.6碳酸缓冲液透析的弓形虫抗原加入DMSO溶解的FITC，反应终止后纯化、分装、低温避光保存；采用棋盘滴定法选择最佳的FITC标记抗原工作浓度，并溶解于1％(重量)牛血清白蛋白，10mmol/L pH7.2磷酸盐缓冲液中以制备FITC标记的弓形虫抗原工作溶液；

C、辣根过氧化物酶标记抗-人IgG单克隆抗体溶液的制备:采用改良过碘酸钠法制备辣根过氧化物酶标记抗-人IgG单克隆抗体，采用棋盘滴定法选择最佳的酶标抗体工作浓度，并溶解于1％(重量)牛血清白蛋白，10mmol/LpH7.2磷酸盐缓冲液中以制备酶标抗体工作溶液；

D、发光底物液的制备:

化学发光底物液A含有:

鲁米诺                 1～20mmol/L

4-羟基联苯             0.1～0.5mmol/L

4-碘代苯基硼酸         0.01～0.1mmol/L

硼酸缓冲液             50～500mmol/L pH8.0～10.0；

化学发光底物液B含有:

过氧化脲               1～5mmol/L

吐温20                       0.05～0.5％(体积)

磷酸盐缓冲溶液               10～50mmol/L pH7.0～7.6；

E、浓缩洗涤液的制备:

浓缩洗涤液含有:

NaCl                         12～20％(重量)

KCl                          0.1～0.7％(重量)

吐温20                       0.05～0.2％(体积)

Tris-HCl缓冲液               50～500mol/L pH7.2～7.6

使用时用蒸馏水20倍稀释；

F、阴性、阳性对照品的制备:

收集弓形虫IgG抗体、HBsAg、HIV(1+2)抗体、TP抗体、HCV抗体为阴性的正常人血清过滤除菌、分装、低温储存。

收集弓形虫IgG抗体阳性，HBsAg、HIV(1+2)抗体、TP抗体、HCV抗体为阴性的患者血清过滤除菌、分装、低温储存。

该方法便于生产，易于监控生产过程，保证了批次间的稳定性。

在上述技术方案的基础上，步骤A、包被固相载体还可以采用以下方法制备:以磁性颗粒作为固相载体，以EDC共价偶联法将FITC抗体偶联到磁性颗粒表面。

在上述技术方案的基础上，优选方案为，所述的化学发光底物液A含有:

鲁米诺                             10mmol/L

4-羟基联苯                         0.3mmol/L

4-碘代苯基硼酸                     0.05mmol/L

硼酸缓冲溶液                       200mmol/L pH8.0～10.0；

所述的化学发光底物液B含有:

过氧化脲                           3.5mmol/L

吐温                         200.1％(体积)

磷酸盐缓冲溶液               20mmol/L pH7.0～7.6；

在上述技术方案的基础上，优选方案为，所述的浓缩洗涤液含有:

NaCl                         16％(重量)

KCl                          0.4％(重量)

吐温20                       0.1％(体积)

Tris-HCl缓冲液               200mmol/L pH7.2～7.6

使用时用蒸馏水20倍稀释。

具体实施方式

以下所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1

一种检测弓形虫IgG抗体的化学发光免疫分析诊断试剂盒的制备:

A、包被板制备:

用含2μg/mL FITC抗体的20mmol/L pH7.4磷酸缓冲液溶液，以100μL/孔体积包被微孔板，2～8℃包被18～20小时后，用含20％(体积)小牛血清、5％(重量)蔗糖的20mmol/L pH7.4磷酸盐缓冲液120μL/孔封闭18～20小时，甩尽封闭液后抽湿，28℃干燥18～20小时，加入干燥剂密封并检查密封的铝箔袋是否漏气，置于2～8℃保存。

B、FITC标记弓形虫抗原的制备:

a)、FITC标记:将弓形虫抗原2mg用50mmol/L pH9.6碳酸缓冲液在2～8℃条件下透析，将FITC溶于二甲基亚砜(DMSO)中，终浓度为1mg/mL，按弓形虫抗原:FITC＝1mg:150μg的比例将FITC二甲基亚砜溶液缓慢加入弓形虫抗原溶液中混合均匀，暗处4℃反应8小时，加入5mol/L的NH₄Cl溶液至终浓度50mmol/L，4℃终止反应2小时，将FITC标记的弓形虫抗原溶液在0.05mol/L pH7.2的磷酸盐缓冲液中透析至透析液清亮，加入0.1％(重量)NaN₃、1％(重量)牛血清白蛋白(BSA)pH7.2的10mmol/L磷酸盐缓冲液中，4℃暗处保存。

b)、FITC标记抗原稀释液的配制

将0.2g NaH₂PO₄·2H₂O、2.9g Na₂HPO₄·12H₂O和10g牛血清白蛋白(BSA)加入洁净容器中，用双蒸水定溶至1000mL。

c)、FITC标记抗原工作液的配制

将制备的FITC标记抗原用稀释液分别稀释成不同浓度，使用棋盘滴定法选择出最佳的稀释度为1:5500。

C、辣根过氧化物酶标记抗-人IgG单克隆抗体的制备:

a)、标记方法:采用改良过碘酸钠法将辣根过氧化物酶与抗-人IgG单克隆抗体偶联，加入50％甘油、置于-20℃冻存。

b)、酶标记物稀释液的配制

将0.2g NaH₂PO₄·2H₂O、2.9g Na₂HPO₄·12H₂O和10g牛血清白蛋白(BSA)加入洁净容器中，用双蒸水定溶至1000mL。

c)、酶标记物工作液的配制

将制备的酶标记物用稀释液分别稀释成不同浓度，使用棋盘滴定法选择出最佳的稀释度为1:6000。

D、发光底物液的制备:

a)、化学发光底物液A

采用如下配方:10mmol/L鲁米诺、0.3mmol/L4-羟基联苯、0.05mmol/L4-碘代苯基硼酸、pH8.0～10.0200mmol/L硼酸缓冲液。将1.7716g鲁米诺、0.051g4-羟基联苯、0.012g4-碘代苯基硼酸、11.4g硼酸、4.9g硼砂加入洁净容器中用双蒸水溶解，调整pH值为8.0～10.0，用双蒸水定溶至1000mL。

b)、化学发光底物液B

采用如下配方:3.5mmol/L过氧化脲、0.1％(体积)吐温20、pH7.0～7.620mmol/L磷酸盐缓冲液。将0.329g过氧化脲、1ml Tween20、51.58gNa₂HPO₄·12H₂O、8.74g NaH₂PO₄·2H₂O加入洁净容器中用双蒸水溶解，调整pH值为7.0～7.6，用双蒸水定溶至1000mL。

使用时将底物液A、B等体积混合。

E、浓缩洗涤液的制备:

采用如下配方:16％(重量)NaCl、0.4％(重量)KCl、0.1％(体积)吐温20、pH7.4 200mmol/L Tris-HCl缓冲液。将160g NaCl、4g KCl、24.2g三羟甲基氨基甲烷(Tris)、1ml吐温20溶于900ml双蒸水中，用HCl调整pH至7.4，用双蒸水定溶至1000mL。

使用时用双蒸水20倍稀释。

F、阴性、阳性对照品的制备:

收集经ELISA法检测弓形虫IgG抗体、HBsAg、HIV(1+2)抗体、TP抗体、HCV抗体阴性的正常人血清6份以上，过滤除菌、分装、低温储存。

收集经ELISA法检测弓形虫IgG抗体阳性，HBsAg、HIV(1+2)抗体、TP抗体、HCV抗体阴性的患者血清6份以上，适当稀释后过滤除菌、分装、低温储存。

实施例2

一种检测弓形虫IgG抗体的化学发光免疫分析诊断试剂盒的制备:

以磁性颗粒作为固相载体，以EDC法将FITC抗体偶联到磁性颗粒表面，以含12％(重量)NaCl、0.1％(重量)KCl、400mmol/L pH7.2 Tris-HCl缓冲液为浓缩洗涤液，其余均以与实施例1相同的方法制备弓形虫IgG抗体化学发光免疫分析试剂盒。

实施例3

一种检测弓形虫IgG抗体的化学发光免疫分析诊断试剂盒的制备:

(1)、发光底物液的制备:

a)、化学发光底物液A

采用如下配方:1mmol/L鲁米诺、0.1mmol/L4-羟基联苯、0.01mmol/L4-碘代苯基硼酸、50mmol/L pH8.0～10.0硼酸缓冲液。将0.177g鲁米诺、0.017g4-羟基联苯、0.0025g4-碘代苯基硼酸、2.85g硼酸、1.225g硼砂加入洁净容器中用双蒸水溶解，调整pH值为8.0-10，用双蒸水定溶至1000mL。

b)、化学发光底物液B

采用如下配方:1mmol/L过氧化脲、0.05％(体积)吐温20、10mmol/LpH7.0～7.6磷酸盐缓冲液。将0.094g过氧化脲、0.5ml Tween20、25.79gNa₂HPO₄·12H₂O、4.37g NaH₂PO₄·2H₂O加入洁净容器中用双蒸水溶解，调整pH值为7.0-7.6，用双蒸水定溶至1000mL。

使用时将底物液A、B等体积混合。

(2)、浓缩洗涤液的制备:

采用如下配方:12％(重量)NaCl、0.1％(重量)KCl、0.05％(体积)吐温20、50mmol/L pH7.4 Tris-HCl缓冲液。将120g NaCl、1g KCl、6.05g三羟甲基氨基甲烷(Tris)、0.5ml吐温20溶于900ml双蒸水中，用HCl调整pH至7.2，用双蒸水定溶至1000mL。

使用时用双蒸水20倍稀释。

其余步骤同实施例1。

实施例4

一种检测弓形虫IgG抗体的化学发光免疫分析诊断试剂盒的制备:

(1)、发光底物液的制备:

a)、化学发光底物液A

采用如下配方:20mmol/L鲁米诺、0.5mmol/L 4-羟基联苯、0.1mmol/L4-碘代苯基硼酸、500mmol/L pH8.0～10.0硼酸缓冲液。将3.54g鲁米诺、0.0857g4-羟基联苯、0.025g4-碘代苯基硼酸、28.5g硼酸、12.25g硼砂加入洁净容器中用双蒸水溶解，调整pH值为8.0-10，用双蒸水定溶至1000mL。

b)、化学发光底物液B

采用如下配方:5mmol/L过氧化脲、0.5％(体积)吐温20、50mmol/LpH7.0～7.6磷酸盐缓冲液。将0.47g过氧化脲、5ml Tween20、128.95gNa₂HPO₄·12H₂O、21.85g NaH₂PO₄·2H₂O加入洁净容器中用双蒸水溶解，调整pH值为7.0-7.6，用双蒸水定溶至1000mL。

使用时将底物液A、B等体积混合。

(2)、浓缩洗涤液的制备:

采用如下配方:20％(重量)NaCl、0.7％(重量)KCl、0.2％(体积)吐温20、50mmol/L pH7.4 Tris-HCl缓冲液。将200g NaCl、7g KCl、60.5g三羟甲基氨基甲烷(Tris)、2ml吐温20溶于900ml双蒸水中，用HCl调整pH至7.6，用双蒸水定溶至1000mL。

使用时用双蒸水20倍稀释。

其余步骤同实施例1。

实施例5

一种检测弓形虫IgG抗体的化学发光免疫分析诊断试剂盒的使用方法。

(1)、取出实施例1中所制备的弓形虫IgG抗体化学发光免疫分析诊断试剂盒，室温平衡15-30分钟。

(2)、将待测样本用生理盐水1:100预稀释。

(3)、在包被板分别加入阴性对照、阳性对照以及预稀释的待测样本50μL，然后每孔分别加入50μL FITC标记弓形虫抗原，振荡混匀，37℃温育30分钟。

(4)、用稀释后的洗涤液洗5次，每孔加满洗涤液，每次浸泡10秒，最后在干净的吸水纸上拍干。

(5)、各孔加辣根过氧化物酶标记抗-人IgG单克隆抗体100μL，振荡混匀，37℃温育30分钟。

(6)、用稀释后的洗涤液洗5次，每孔加满洗涤液，每次浸泡10秒，最后在干净的吸水纸上拍干。

(7)、各孔加入混合后的化学发光底物液(发光底物液A、B按1:1混合)100μL，室温(20～25℃)避光反应5分钟。

(8)加化学发光底物液后的第5～30分钟内测量，在化学发光测量仪上依序测量各孔的发光强度(RLU)，测量时间1秒/孔。

(9)、Cutoff值＝2.1NC，RLU值≥Cutoff值则样本判定为阳性样本；RLU值<Cutoff值则样本判定为阴性样本。

实施例6

一种检测弓形虫IgG抗体的化学发光免疫分析诊断试剂盒的使用方法。

(1)、将实施例2中所制备的弓形虫IgG抗体化学发光免疫分析诊断试剂盒室温平衡15-30分钟。

(2)、将待测样本用生理盐水1:100预稀释。

(3)、将阴性、阳性对照以及待测样本50μL分别加入编号的圆底聚苯乙烯试管，然后每管分别加入FITC标记抗原50μL、磁性颗粒100μL，37℃振荡反应15分钟。

(4)、将试管架置于磁分离器上分离1min，然后倒转分离器倒出上清液，将倒转的试管放在滤纸上吸干，拍击分离器以除去挂壁液体。每管加入洗涤液500μL，充分混匀，置于磁分离器上分离1min，倒出上清液，将倒转的试管放在滤纸上吸干，拍击分离器以除去挂壁液体，重复4次。

(5)、各管加酶标抗体100μL，37℃振荡反应15分钟。

(6)、重复步骤(4)。

(7)、各管加入混合后的化学发光底物液(发光底物液A、B按1:1混合)200～400μL，充分混匀，置于磁分离器内，待磁微粒富集于底部后，暗处放置5min，在化学发光测量仪上依序测量各孔的发光强度(RLU)，测量时间1秒/管；Cutoff值＝2.1NC，RLU值≥Cutoff值则样本判定为阳性样本；RLU值<Cutoff值则样本判定为阴性样本。

实施例7

采用实施例1中所制备的弓形虫IgG抗体化学发光免疫分析诊断试剂盒按实施例5所述方法对100例育龄妇女孕前筛查血样进行检测，同时采用珠海经济特区海泰生物制药有限公司生产的国药准字S20040019号弓形虫IgG抗体检测试剂盒(酶联免疫法)作为对照，比较检测结果。

结果如下:

表1 本发明试剂盒与酶联免疫试剂测定弓形虫IgG抗体结果比较

从实验结果可看出，本发明弓形虫IgG抗体化学发光免疫分析诊断试剂盒与对照试剂盒检测结果一致。

实施例8

采用实施例2中所制备的弓形虫IgG抗体化学发光免疫分析诊断试剂盒按实施例6所述方法对87例育龄妇女孕前筛查血样进行检测，同时采用珠海经济特区海泰生物制药有限公司生产的国药准字S20040019号弓形虫IgG抗体检测试剂盒(酶联免疫法)作为对照，比较检测结果。

结果如下:

表2 本发明试剂盒与酶联免疫试剂测定弓形虫IgG抗体结果比较

从实验结果可看出，本发明弓形虫IgG抗体化学发光免疫分析诊断试剂盒与对照试剂盒两种检测方法的符合率为100％。

实施例9

采用实施例3中所制备的弓形虫IgG抗体化学发光免疫分析诊断试剂盒按实施例5所述方法对109例育龄妇女孕前筛查血样进行检测，同时采用珠海经济特区海泰生物制药有限公司生产的国药准字S20040019号弓形虫IgG抗体检测试剂盒(酶联免疫法)作为对照，比较检测结果。

结果如下:

表3 本发明试剂盒与酶联免疫试剂测定弓形虫IgG抗体结果比较

从实验结果可看出，本发明弓形虫IgG抗体化学发光免疫分析诊断试剂盒与对照试剂盒两种检测方法的符合率为100％。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种检测弓形虫IgG抗体化学发光免疫分析诊断试剂盒，由阴性、阳性对照品，固相载体，弓形虫抗原标记物，酶结合物，化学发光底物液A、B，以及浓缩洗涤液组成，其特征在于，所述的固相载体由FITC抗体包被，弓形虫抗原由FITC标记，酶结合物为辣根过氧化物酶标记的抗-人IgG单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的化学发光免疫分析诊断试剂盒，其特征在于，所述的固相载体为包被FITC抗体的微孔板或磁性颗粒。

3.根据权利要求1所述的化学发光免疫分析诊断试剂盒，其特征在于，所述的化学发光底物液A含有:

鲁米诺                  1～20mmol/L

4-羟基联苯              0.1～0.5mmol/L

4-碘代苯基硼酸          0.01～0.1mmol/L

硼酸缓冲溶液            50～500mmol/L pH8.0～10.0；

所述的化学发光底物液B含有:

过氧化脲                1～5mmol/L

吐温20                  0.05～0.5％(体积)

磷酸盐缓冲溶液          10～50mmol/L pH7.0～7.6。

4.根据权利要求1所述的化学发光免疫分析诊断试剂盒，其特征在于，所述的化学发光底物液A含有:

鲁米诺                  10mmol/L

4-羟基联苯              0.3mmol/L

4-碘代苯基硼酸          0.05mmol/L

硼酸缓冲溶液            200mmol/L pH8.0～10.0；

所述的化学发光底物液B含有:

过氧化脲                3.5mmol/L

吐温20                  0.1％(体积)

磷酸盐缓冲溶液          20mmol/L pH7.0～7.6。

5.根据权利要求1-4之任意一项所述的化学发光免疫分析诊断试剂盒，其特征在于，其中的浓缩洗涤液含有:

NaCl                    12～20％(重量)

KCl                     0.1～0.7％(重量)

吐温20                  0.05～0.2％(体积)

Tris-HCl缓冲液          50～500mmol/L pH7.2～7.6。

6.根据权利要求5所述的化学发光免疫分析诊断试剂盒，其特征在于，所述的浓缩洗涤液含有:

NaCl                    16％(重量)

KCl                     0.4％(重量)

吐温20                  0.1％(体积)

Tris-HCl缓冲液          200mmol/L pH7.2～7.6。

7.检测弓形虫IgG抗体化学发光免疫分析诊断试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤:

A、包被固相载体的制备:用含0.5～4μg/mL FITC抗体的20mmol/L pH7.2～7.4磷酸盐缓冲液包被固相载体，2～8℃包被18～20小时后，用含20％(体积)小牛血清、5％(重量)蔗糖的20mmol/L pH7.4磷酸盐缓冲液封闭18～20小时，弃尽封闭液后抽湿，28℃干燥18～20小时，加入干燥剂密封；

B、FITC标记弓形虫抗原的制备:将用50mmol/L pH9.6碳酸盐缓冲液透析后的弓形虫抗原加入DMSO溶解的FITC，反应终止后纯化、分装、低温避光保存；采用棋盘滴定法选择FITC标记抗原工作浓度，并溶解于1％(重量)牛血清白蛋白，10mmol/L pH7.2磷酸盐缓冲液中以制备FITC标记的弓形虫抗原工作溶液；

C、辣根过氧化物酶标记抗-人IgG单克隆抗体溶液的制备:采用改良过碘酸钠法制备辣根过氧化物酶标记抗-人IgG单克隆抗体，采用棋盘滴定法选择最佳的酶标抗体工作浓度，并溶解于1％(重量)牛血清白蛋白，10mmol/L pH7.2磷酸盐缓冲液中以制备酶标抗体工作溶液；

D、发光底物液的制备:

化学发光底物液A含有:

鲁米诺                   1～20mmol/L

4-羟基联苯               0.1～0.5mmol/L

4-碘代苯基硼酸           0.01～0.1mmol/L

硼酸缓冲溶液             50～500mmol/L pH8.0～10.0；

化学发光底物液B含有:

过氧化脲                 1～5mmol/L

吐温20                   0.05～0.5％(体积)

磷酸盐缓冲溶液           10～50mmol/L pH7.0～7.6；

E、浓缩洗涤液的制备:

浓缩洗涤液含有:

NaCl                     12～20％(重量)

KCl                      0.1～0.7％(重量)

吐温20                   0.05～0.2％(体积)

Tris-HCl缓冲液           50～500mmol/L pH7.2～7.6；

F、阴性、阳性对照品的制备:弓形虫IgG抗体、HBsAg、HIV(1+2)抗体、TP抗体、HCV抗体为阴性的正常人血清过滤除菌、分装、低温储存；

弓形虫IgG抗体阳性，HBsAg、HIV(1+2)抗体、TP抗体、HCV抗体为阴性的患者血清过滤除菌、分装、低温储存。

8.根据权利要求7所述的化学发光免疫分析诊断试剂盒的制备方法，其特征在于，所述包被固相载体由如下方法制备:以磁性颗粒作为固相载体，以EDC共价偶联法将FITC抗体偶联到磁性颗粒表面。

9.根据权利要求7-8之任意一项所述的化学发光免疫分析诊断试剂盒的制备方法，其特征在于，所述的化学发光底物液A含有:

鲁米诺                  10mmol/L

4-羟基联苯              0.3mmol/L

4-碘代苯基硼酸          0.05mmol/L

硼酸缓冲溶液            200mmol/L pH8.0～10.0；

所述的化学发光底物液B含 有:

过氧化脲                3.5mmol/L

吐温20                  0.1％(体积)

磷酸盐缓冲溶液          20mmol/L pH7.0～7.6；

所述的浓缩洗涤液含有:

NaCl                    16％(重量)

KCl                     0.4％(重量)

吐温20                  0.1％(体积)

Tris-HCl缓冲液          200mmol/L pH7.2～7.6。