NL8000698A - Lingandanaloog-onomkeerbaar enzyminhibitorconjugaat alsmede toepassing daarvan. - Google Patents

Description

i

- ♦ V

r VO OO59

Ligandanaloog-onomkeerbaar enzyminhibitorconjugaat alsmede toepassing daarvan.

Er zijn een groot aantal immunoanalyse-enzymtech-nieken bekend. Deze omvatten methoden waarbij een enzym wordt gebonden aan een te detecteren antiliehaam of antigeen. De concurrentie tussen het met enzym gemerkte type en de onbekende om de 5 aan een vaste drager gebonden bindingspartner wordt gemeten. Het enzym dat in de oplossing achterblijft wordt gemeten door reactie met substraat.

Homogene enzym-immunoanalysetechnieken worden beschreven in de Amerikaanse octrooischriften b.0^3.872 (hapteen ge-10 bonden aan enzym) en b.065-35b (hapteen gebonden aan lysoyme).

Liganden gemerkt met enzymcofactor worden beschreven in Analytical Biochemistry 72, 271 en 283 (1976). Derwendt Abstract Bk, natural Products Week A26, blz. 30 van DT275^~086 beschrijft omkeerbare bindingsenzymmodulatoren als merkende stof voor antigenen, anti-15 lichamen, hormonen, vitaminen of geneesmiddelen. Het Belgische octrooischrift 86U.856 beschrijft conjugaten die methotrexaat als enzyminhibitor gebonden aan ligandanalogen toepassen.

De werkwijzen en reagentia van de uitvinding zijn in het bijzonder te onderscheiden omdat zij betrekking hebben op 20 de toepassing van onomkeerbare enzyminhibitors geconjugeerd aan ligandanalogen. De inhibitors van de uitvinding reageren met de enzymen en vormen covalente bindingen die de structuur van het enzym veranderen en daardoor onomkeerbaar de enzymactiviteit remmen. Γη het bijzonder worden organofosfor onomkeerbare enzyminhi-25 bitoren die met een enzym reageren onder vorming van covalente bindingen geconjugeerd met ligandanalogen.

De uitvinding betreft een werkwijze voor het bepalen van liganden in proefmonsters omvattende het mengen met het proefmonster van een ligandanaloog-onomkeerbaar enzyminhibitor-30 conjugaat en een bindingsproteine, dat aan de ligand en het li- gandanaloog-oncmkeerbaar enzyminhibitorconjugaat gebonden kan wor- . > 8 0 0 0 6 S 3 2 t den, waarbij de hoeveelheid van ligandanaloog-onomkeerbaar enzym-inhibitorconjugaat gebonden door het bindingsproteïne afhankelijk is van de hoeveelheid ligand in het proefmonster, welk bindings-proteïne de onomkeerbare enzyminhibitor bij binding aan het li-5 gandanalooggedeelte van het conjugaat inactiveert; het inmengen van een enzym dat onomkeerbaar wordt geremd door het ligandana-loog-onomkeerbare enzyminhibitorconjugaat niet gebonden door het binding sprot eïne i en het mengen van. substraat met het enzym en het volgen van de enzymsubstraatreactie. De uitvinding omvat ligand-10 analoog-onomkeerbare enzyminhibitorconjugaten die bruikbaar zijn als reagentia bij de uitvoering van de voornoemde methode.

Het onomkeerbare enzyminhibitorgedeelte van het conjugaat treedt in reactie met de enzymvormende covalente bindingen en inactiveert daardoor het enzym. Werkwijzen en reagentia van de uitvin-15 ding zijn bijzonder bruikbaar voor het bepalen van geneesmiddelen, hormonen en dergelijke.

De uitvinding heeft betrekking op werkwijzen en reagentia voor het bepalen van liganden in biologische vloeistoffen zoals serum, plasma, spinale vloeistof, ammonische vloeistof 20 en urine.

De uitdrukking ligand, zoals deze in de uitvinding wordt toegepast, heeft betrekking op haptenen, polypeptiden, proteïnen en glycoproteïnen met molecuulgewichten die in het algemeen beneden 150.000 liggen. Haptenen zijn proteïne-vrije li-25 chamen, in het algemeen met een laag molecuulgewicht die geen anti-lichaamvorming induceren bij injectie in een dier, maar die reactief zijn ten opzichte van antilichamen. Antilichamen ten opzichte van hepteen worden opgewekt door eerst het hapteen te conjugeren met een proteïne en het conjugaatprodukt in dier of mens te in-30 jeeteren. De verkregen antilichamen worden geïsoleerd door ge bruikelijke antilichaam-isoleringstechnieken. Voor de doeleinden van de uitvinding dienen de antilichamen nagenoeg vrij te zijn van serumproteïnematerialen, zoals indicatorenzymen toegepast in de proef of inhibitors ten opzichte van antilichaambinding. Deze 8 0 0 0 β S 8 3 r worden geschikt verwijderd door ionenuitwisselingschromatografie over een anionuitwisselingskolcm of door een andere geschikte proteïne-scheidingstechniek.

Representatieve liganden die hepaalhaar zijn 5 volgens de werkwijze van de uitvinding zijn steroïden zoals oestron, oestradiol, cortisol, testosteron, progesteron, chenodeoxycholine-zuur, digoxine, cholinezuur, deoxycholinezuur, lithocholinezuren en de ester- en amidederivaten daarvan; vitaminen zoals vitamine B-12, folinezuur; thyroxine, trijoodthyronine, histamine, sero-10 tonine, prostaglandinen zoals PGE, PGF, FGA; adrenaline, noradrenaline en geneesmiddelen zoals opiaten, theofylline, dilantine; barhituaten, zoals fenobarbitol en derivaten daarvan en earbama-zepinen, aminoglycoside-antibiotica zoals gentimycine en tobramy-cine.

15 Representatieve polypeptiden en glycoprotexnen die met de werkwijzen van de uitvinding zijn te bepalen zijn insuline, plaatjesfactor i en polypeptide determinanten van grote antigenen.

Ligandanalogen zijn functionele of gefunctionali-20 seerde liganden die geschikt zijn voor conjugering aan onomkeerbare enzyminhibitoren. Zuren, esters, amiden, aminen, hydroxy, isocyanaat, isothiocyanaat zijn geschikte functionele groepen.

Representatieve enzymen en onomkeerbare enzym-remmers of inhibitoren die bruikbaar zijn voor de uitvoering van 25 de uitvinding worden in tabel A gerangschikt.

TABEL A

Onomkeerbare inhibitor Enzymen

Organofosfaattriësters Trypsine

Organofosfonaatdiësters Acetylcholinesterase

Organofosfothioaten Butyrlcholinesterase 30 Chymctrypsine

Thromhine

Elastase 3 ö 0 0 S S 8 Adenosine deaminase » k TABEL A (Vervolg)

Onomkeerbare inhibitor Toymen

Alkylsulf onat en Acetylcholinesterase

Alkylisocyanaten Elastase

Trypsine 5 Chymotrypsine p-Chloormercuribenzoaat-derivaten Papaïne

Alcoholdehydrogenase Chymopapalne Clostridiopeptidase B

1^ Adenosine deaminase

Lipase 3-amaAyase

Pepsine

Glyceraldehyde-3-fosfaat Deh.

15

Luciferase

Aspartaat aminotransferase Alanine aminotransferase Hexokinase

Substraat epoxyden Pepsine 20 6-diazo-5-oxo-L-norleucine

derivaten Glutaminase A

Joodazijnzuur Zuur deoxyribonuclease II

Alcohol dehydrogenase

Ιί-Broomsuccinimide derivaten Zuur deoxyribonuclease II

25 dextranase

Onomkeerbare organofosfor enzyminhibitoren hebben de voorkeur. J. Am. Chem. Soc. 80, U56 (1958); J. Am. Chem. Soc. 82, 596, (i960) en Rec. Traw. Chim., 86, 399 (1967) beschrijven verschillende groepen organofosforverbindingen die geschikte 30 onomkeerbare enzyminhibitoren zijn. Voorkeursorganofosforverbin-dingen die bruikbaar zijn voor conjugering met ligandanalogen, worden voorgesteld door de formule: 8000698 t 5 R -P (=0)-S-OL-CHo-B-(CHo) -X I f d d dn ¾ vaarin B stikstof of zwavel of de gealhyleerde zouten voorstelt; n 1 - 10, bij "voorkeur 2-8 is; X een functionele groep zoals hydroxy, amino, carhoxy, α-halogeenmethylcarboxy waarin halogeen 5 jodium, chloor of broom is voorstelt; en een alkylgroep met 1-10 koolstofatomen of een alkoxygroep met 1-10 koolstof-atomen voorstellen. De alkylgroep kan gesubstitueerd zijn met ni-tro, halogeen, cyano, benzyl of soortgelijke substituenten. Het zal duidelijk zijn dat een groot aantal equivalente structuren 10 bij het uitvoeren van de uitvinding mogelijk zijn.

Een andere onomkeerbare enzyminhibitorgroep die de voorkeur heeft vordt voorgesteld door de formule: r3ru P(=0)-0- waarin R^ de betekenissen van R^ en Hp als voornoemd heeft en R^ een gebruikelijke organische zich afsplitsende groep voor stelt, zoals p-nitrofenyl, hydroxychinolyl, alsmede alkyl-, halogeen- en cyano-gesubstitueerde chinolylen.

Onomkeerbare enzyminhibitors worden gebonden aan ligandanalogen door gebruikelijke bifunctionele overbruggings-20 groepen met de algemene formule:

X - A - Y

waarin X en Y functionele groepen voorstellen zoals -OH, -HHg, CO^H (esters), -CO-CHgZ, waarin Z Γ, Cl, Br is. A stelt -(CH^)^-voor, waarin n 3 - 20 is. De alkyleenketen kan onderbroken zijn 2? met een of meer bivalente groepen zoals -0-, -CO-, -S-, -HH-, -C0HH-, -CH=CH-, —C=C—, fenyleen en sulfonium- en ammOniumzouten.

De alkyleenketen kan gesubstitueerd zijn met gebruikelijke sub-stituenten zoals halogeen (I, Br, Cl, F), hydroxy, cyano, fenyl, amino, carboxy, organo-carboxyesters, alkyl met 1 - 7 koolstof-30 atomen, alkoxy met 1 - 3 koolstofatomen, X-A-Y kan een kleine polypeptide of polysaccharideketen zijn. Aldus wordt X-A-Y vol- 8000688 . ^ 6 gens gebruikelijke technieken gereageerd met een onomkeerbare enzyminhibitor en ligandanaloog onder vorming van amide-, ester-, amiden-, imine-, sulfonamide-, thioester-, fosfaat-, thiofosfaat-en dergelijke bindingen tussen de overbruggende groep en de on-5 omkeerbare enzyminhibitor en ligandanaloog.

In het algemeen wordt een zijketen aan een ligand of ligandanaloog gekoppeld en het produkt in reactie gebracht met een onomkeerbare enzyminhibitor .die geschikt gefunctionaliseerd is voor de reactie met de zijketen van de ligandanaloog. Naar . 10 keuze kan een zijketen aan de onomkeerbare enzyminhibitor worden gekoppeld en in reactie gebracht met een geschikte ligand of ligandanaloog. Aldus zijn verbindingen met de formule onomkeerbare enzyminhibitor-A-ligand-analoog geschikte reactanten.

De volgende structuren illustreren conjugaten 15 van de uitvinding:

Thyroxine (formule 11), Cholinezuur (formule 12), Dilantine (formule 13), Digoxine (formule 1^), Theofylline (formule 15), Cholinezuur (formule 16), Digoxine (formules 17 en 18), Folinezuur (formule 19), Methotrexaat (formule 20), Cortisol (formule 21), Val-20 proInezuur (formule 22), Sulfolithocholyl-glycine (formule 23),

Lidocaïne (formule 2k), (formule 25), Gentamicine (formule 26), Tobramycine (formule 27), B^ (formule 28), T^ (formule 29), waarbij wordt verwezen naar het formuleblad.

Bindingsproteïnes zijn antilichamen of andere 25 specifieke bindingsproteïnes, zoals thyroïde bindend globuline, die gebonden kunnen worden aan de te bepalen ligand en de ligand-analoogeenheid van het ligandaualoog-onomkeerbaar enzyminhibi-torconjugaat. Wanneer het bindingsproteïne wordt gebonden aan de ligandanaloog wordt de onomkeerbare enzyminhibitor geïnactiveerd.

30 Reacties die bij de uitvinding zijn betrokken worden geïllustreerd in reactieschema A van het formuleblad. Hierbij is L (ligand); ^- (bindingsproteïne); LAI (onomkeerbaar enzym inhibitor-ligandanaloogconjugaat); Enz (enzym); Enz-I (geïnactiveerd enzym); X (reactie hij-produkt); kg k'g, terwijl 8000698 7 in de meeste gevallen k’2 tot bijna 0 -wordt gereduceerd; d.w.z. het bindende proteïne inactiveert de LA!.

De reactie kan worden gevolgd door kinetische of eindpunttechnieken. Aldus wordt de reactie - ^^nZ- = ^[LAl] [Enz] 5 gevolgd door toepassing van kinetische technieken. Door toepassing van een overmaat enzym en tijd te laten dat de reactie voor 99% wordt voltooid, is dit systeem geschikt aan te passen aan eindpunttechnieken.

Voorkeurs c on j ug at en ten gebruike in samenhang 10 met acetylcholinesterase (E.C. 3.1.1.7) zijn verbindingen met de formule: 0 R»-p(-OR")-S-CH0-B'-(CHj -ÏJH-C(=0)hanteen d dn waarin R’ en R" alkylgroepen met 1-10 koolstof atomen zijn, n 2 - 8, en B' -S- is of de sulfoniumzouten daarvan. Het hapteen 15 is een carbonzuur dat hapteen bevat of hapteen gemodificeerd om een carbonzuur te bevatten, welke beiden hier worden aangegeven als ligandaaalogen. De uitvinding omvat tevens de overeenkomstige methylsulfoniumzouten.

De conjugaten die de meeste voorkeur hebben zijn 20 die waarin R' en R" een alkylgroep met 1 - H koolstofatomen voorstellen en n 2 - 6 is, met inbegrip van de sulfoniumzouten daarvan. Bijzondere voorkeur hebben verbindingen met de formule: CH3-P (=0) (OR")-S-CH2-CH2-S- (CHg) g-M-C (=0) -hapteen, waarin R" ethyl of n-butyl is en de overeenkomstige sulfoniumzouten 25 zoals CH3-P(=0)(0R")-S-CH2-CH2-£ (CH3}-(CH2)n-M-C(=0)-hapteen, waarin het tegenion jodide of methylsulfaat en dergelijke is.

De vakman zal de equivalentie en verwisselbaarheid van een groot aantal anionen onderkennen. Verbindingen waarin n 2 - 6 is heb-30 ben tevens voorkeur.

Andere verbindingen die bij de uitvoering van de uitvinding de voorkeur hebben zijn die volgens formule 30, waarin R"' een alkylgroep met 1 - U koolstofatomen is, bij voorkeur met 8000698 Μ * 8 1 - U koolstofatomen en η 1 - 12 is, alsmede een groep volgens formule 31 van het formuleblad, waarin R,f' een alkylgroep met 1-10 koolstofatomen is, hij voorkeur met 1 - k koolstofatomen is en n 2 - 8 is, terwijl L een biologisch verenigbaar tegenion 5 is zoals methylsulfaat, jodide en dergelijke.

Aldus omvat de uitvinding analytische reagentia bestaande uit onomkeerbare enzyminhibitors-ligandanaloogconjuga-ten.

De werking van de uitvinding wordt geïllustreerd 10 door reactieschema B van het formuleblad.

Aldus concurreren ligand (L) en ligandanaloog-onomkeerhaar inhibitoreonjugaat (LAl) met het bindingsproteïne ( ^--------). Het aan LAI gebonden proteïne inactiveert de inhibi tor terwijl vrij LAI beschikbaar is voor het onomkeerbaar remmen 15 van het enzym. Des te meer ligand aanwezig is in het proefmonster des t e kleiner is de hoeveelheid LAI gebonden aan het bindingsproteïne waardoor derhalve meer enzym door vrij LAI zal worden geremd. Het niet-geremde enzym wordt gereageerd met een geschikt substraat en de enzymsubstraat-reactie gevolgd.

20 Colorimetrische analyses worden geschikt uitge voerd met een bichromatische spectrofotometer als beschreven in de Amerikaanse octrooischriften 3.7k8.oUt·, 3.831.618, 3.833.30^, 3.9ΟΟ.288, 3.817Λ25 en 3.811.780.

Proefmonsters kunnen worden voorbehandeld ter ver-25 wijdering of inactivering van storend proteïne. Storende proteïnes kunnen worden verwijderd door neerslaan met organische oplosmiddelen zoals ethanol, methanol en dergelijke. De warmtebehandeling bij een basische pH is tevens een effectieve methode ter verwijdering van storende proteïnes. Het is dikwijls gewenst de 30 proefmonsters verder te behandelen met sterk zuur of base voor het isoleren van het te beproeven hapteen uit het proteïne. In sommige gevallen is het alleen nodig de storende proteïnes specifiek te inactiveren. Het serumcholinesterase wordt b.v. specifiek geremd met specifieke inhibitoren die een selectieve activiteit ten 800069¾ 9 opzichte van serumpseudocholinesterase hebben. Verbindingen met een dergelijke activiteit zijn orfenidrine, H-methyl-orpenadrine, fenathiazinen, bis-S-methylcholine-ester van ftaalzuur, chinidri-ne, en artaan en de quaternaire alkylzouten daarvan.

5 Typerend wordt digoxine in serum behandeld met il-methylorfenadrine bepaald met behulp van de kinetische analysemethode en een verbinding volgens formule 32 van het formuleblad wordt toegepast als een onomkeerbaar enzyminhibitorligand-analoogconjugaat ter concurrentie om het digoxine antilichaam met 10 digoxine in het proefmonster. Ha een korte incuberingsperiode wordt acetylcholinesterase toegevoegd. Het niet-geremde enzym wordt gemeten door de reactie met acetylthiocholine dat thiocholine vrijmaakt. Het vrijgemaakte thiocholine wordt colorimetrisch gemeten door verdere reactie met 5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoezuur).

15 De reactie wordt gevolgd bij hl2 nm. Standaarden worden toegepast ter preparering van een standaardkromme waaruit de onbekenden worden bepaald.

De werkwijzen en reagentia van de uitvinding zijn tevens bruikbaar voor het bepalen van bindende proteïnen, 20 zoals antilichamen. In deze techniek wordt de ligandanaloog-bin-dingspartner aan het te bepalen bindingsproteïne geconjugeerd tot een onomkeerbare enzyminhibitor. 3indende proteïnen in de proefmonsters worden bepaald door een ligandanaloog-onomkeerbarè enzyminhibitor te mengen waarbij de ligandanaloogeenheid van het 25 conjugaat specifiek kan worden gebonden aan het te bepalen bindende proteïne, daarna een enzym dat onomkeerbaar wordt geremd 'door de onomkeerbare inhibitoreenheid van het conjugaat in te mengen, substraat aan het enzym toe te voegen en de reactie te volgen. Aangezien het bindende proteïne de onomkeerbare enzyminhibitor in-30 activeert is des te groter de hoeveelheid bindend proteïne des te groter de enzymactiviteit,

De hierna volgende voorbeelden geven een illustratie van de uitvinding en zijn niet beperkend bedoeld.

80006S6 * 10

Voorbeeld I

Aan een oplossing van 6-aminocapronzuur (7,8 g) en 5,0 g natriumbicarbonaat in 50 ml -water -werd druppelsgewijze 16 g H-benzyloxycarbonyloxysuc cinimide in 60 ml tetrahydrofuran 5 toegevoegd. Het mengsel werd gedurende een uur bij kamertemperatuur geroerd, waarna het tetrahydrofuran onder verlaagde druk werd verwijderd. Het residu werd aangezuurd tot pH 3 en geëxtraheerd met methyleenchlori.de en gedroogd met anhydrisch magnesium-sulfaat. Het magnesiumsulfaat werd door filtratie verwijderd en 10 het oplosmiddel door verdamping verwijderd. Rekristallisatie uit ethylacetaat/hexaan leverde H-benzyloxycarbonyl-6-aminocapronzuur.

Aan een oplossing van U,09 g van deze verbinding in kO ml dioxan werd 2,3 g ΓΓ-hydroxysuccinimide en U,12 g dicyclo-hexylcarbodiïmide toegevoegd. Een extra 10 ml dioxan werd toege-15 past ter bevordering van de reactant-overdracht. Het mengsel werd gedurende de nacht bij kamertemperatuur geroerd. Het mengsel werd gefiltreerd en 2,06 g 5-aminopentanol in 5 ml water aan het fil-traat toegevoegd. Het reactiemengsel werd gedurende een uur geroerd, geconcentreerd bij verlaagde druk en het residu geëxtra-20 heerd met methyleenchloride. De extracten werden gewassen met water en een geconcentreerde natriumchloride-oplossing. De oplossing werd gedroogd met anhydrisch magnesiumsulfaat. Het magnesiumsulfaat werd door filtratie verwijderd en het oplosmiddel door verdamping verwijderd bij een verlaagde druk. Het residu werd twee-25 maal gekristalliseerd uit ethyiacetaat en leverde N-(5-hydroxy- pentyl )-6-benzyloxycarbonylaminohexaanamide, smeltpunt 92,5 - 9^°C.

Dit materiaal, U,0 g, wordt gereduceerd met Pd/C in .ethanol onder lage waterstofdruk. De katalysator wordt door filtratie verwijderd en het oplosmiddel verdampt onder verlaagde 30 druk, waarbij N-(5-hydroxypentyl)-6-aminohexaanamide wordt verkregen.

Aan een oplossing van 12-acetyloxy-3-chlorofor-myloxy-1 !+-hydroxy-cart-20 (22) enolide derivaat van digoxigenine (Amerikaans octrooischrift 3-981.982) in Uo ml dioxan werd 575 mg 8000688 * 11 H-hydroxysuccinimide toegevoegd. Het mengsel werd in een koud waterbad gekoeld en 0,695 ml tri'êthylamine toegevoegd. Het mengsel werd "bij kamertemperatuur gedurende 3 uur geroerd. Het mengsel werd gefiltreerd en het filtraat toegevoegd aan een oplossing 5 van 9T3 mg H-(5-hydroxypentyl)-6-aminohexaanamide en 378 mg natriumbicarbonaat in 20 ml water en 10 ml ethanol. Ha een uur werd het oplosmiddel onder verlaagde druk verdampt en het residu ópgelost in methyleenchloride. De methyleenchlorideoplossing werd gewassen met water en een verzadigde natriumchlorideoplossing en 10 gedroogd met anhydrisch magnesiumsulfaat. Het magnesiumsulfaat werd door filtratie verwijderd en het oplosmiddel door verdamping bij verlaagde druk. Het residu werd gechromatografeerd over silica-gel (200 g).

Elutie met 5-15/5 methanol in methyleenchloride 15 leverde 12-ac etyloxy-3- [ïï-( 12-hydroxy-6-oxo-7-azadodecyl )carbamoyl-oxy]-14-hydroxycard-20(22)enolide met de formule 33 van het for-mul' blad. De voornoemde verbinding, 2,70 g, werd opgelost in 50 ml ethanol en 50 ml water werd toegevoegd gevolgd door 10 ml tri-ethylamine. Het reactiemengsel liet men bij kamertemperatuur ge-20 durende de nacht staan. Het oplosmiddel werd verdampt bij verlaagde druk en het verkregen residu gechromatografeerd over een kolom .van 150 g silicagel en geëlueerd met 2 liter 10/5's methanol-methyleenchloride waarbij 3-[Η-12-hydroxy-6-oxo-7-azadodecyl] ear-bamoyloxy]-11-hydroxycard-20(22) enolide werd verkregen.

25 Een oplossing van 170 mg tri'éthylammoniumethyl-7- chinolylfosfaat in 10 ml water werd geleid door 15 ml sulfonzuur-hars in de pyridiniumvorm. De oplossing werd geconcentreerd bij verlaagde druk en droog pyridine uit het residu verdampt. Aan dit residu werd 253 mg 3-[N-(12-hydroxy-6-oxo-7-azadodecyl) carbamoyl-30 oxy]-1^-hydroxycard-20(22) enolide toegevoegd. Droog pyridine werd driemaal uit het residu verdampt. Het residu werd opgelost in 1,0 ml droog pyridine en 1^5 mg gekristalliseerd tris-isopro-pylbenzeensulfonylchloride toegevoegd. Het reactiemengsel werd gedurende 15 uur bij kamertemperatuur geroerd. IJs werd toegevoegd 8090698 12 en na 0,5 uur werd het mengsel geëxtraheerd met methyleenchloride.

De methyleenchloride-oplossing werd gewassen met water, verzadigd natriumbicarbonaat, verzadigd natriumchloride en met anhy-driseh magnesiumsulfaat gedroogd. Het oplosmiddel werd verdampt 5 en tolueen verschillende malen uit het residu verdampt ter verwijdering van het pyridine. Het residu werd gechromatografeerd over silieagel onder toepassing van 5 - 10 % methanol in methyleenchloride als eluent waarbij een verbinding met formule 3^ werd verkregen. De voornoemde verbinding, 100 mg, en 23 microliter 10 dimethylsulfaat werden opgelost in 0,50 ml aceton waarbij na h uur een extra 60 microliter dimethylsulfaat in 2 ml aceton werd toegevoegd, en men het mengsel gedurende de nacht liet staan. De acetonoplossing werd toegevoegd aan ethylether en leverde een wit neerslag dat een verbinding is met formule 1 van het formuleblad.

15 Antilichaam-modulatie van de remmende activi

teit van verbinding T

*

Een voorraadoplossing van verbinding 1 (b,6 x 10 molair in methanol) werd 200 maal verdund met pH 7,0, 0,1 molaar fosfaatbuffer dat 0,1$ gelatine bevatte. Het digoxine-anti-20 lichaam werd verdund in fosfaat-gelatinebuffers als aangegeven in tabel A. 50 Microliter fosfaat-gelatinebuffer, pH 7*0, dat de aangegeven concentratie van antilichaam bevatte, werd in monsterkoppen geplaatst van het bichromatische spectrofotometer (model ABA-100 in de handel gebracht door Abbott Laboratories). Aan 25 elk van deze 50 microliter werd 1 microliter verbinding 1 werk- —7 oplossing toegevoegd tot een eindconcentratie van k,5 x 10 molair. Het antilichaam en verbinding 1 (inhibitor) werden gedurende 10 - 15 min bij kamertemperatuur geïncubeerd. Elk monster ontving 1 microliter werkenzymoplossing (9,5 x 10”^ molair E. electri-30 cus acetylcholinesterase in pH 7,0 fosfaat-gelatinebuffer). De eindenzymconcentratie is 1,9 x 10“ molair. Het monster werd 1/26 verdund met analysebuffer dat acetylthiocholine als substraat bevatte, 5 x 10 molair en' 5,5*-dithiobis(2-nitrobenzoëzuur) (DTNB), s -k 1,6 x 10 molair in pH 7,0 fosfaat-gelatinebuffer. De verandering 3000698 13 in de absorbantie als functie van de tijd werd na 5 min gemeten-in de bichromatische analysator uitgerust met 1(-15/550 nm filter bij 30°C.

De resultaten waren als volgt:

TABEL B

5 Enzym Antilichaam Verbinding 1 AAd/5 min (M)_(M)_(M)_na incubatietijd 10' 21' 1(3’ 1.9 x 10~10 0 0 0,220 0,221 0,222 1.9 X 10~10 9 X 10-7 u,5 X 10“7 o,161 0,137 0,107 10 1,9x10~10 9 X 10-s ί,5 X 10’7 0,089 0,027 0,005 1.9 X 10“10 0 k,5 X 10“7 0,0^5 0,015 0,003

De voornoemde proef werd herhaald met uitzonde- -5 ring dat digoxine met een concentratie van 2,5 x 10 molair aan de monsterkoppen werd toegeveegd. Op de2e wijze werd specifieke 15 modulatie gedemonstreerd. Vijftig microliter fpsfaat-gelatine- buffer werden toegevoegd aan een monsterkop. De bufferoplossing -5 ...

bevatte hetzij 2,5 x 10 molaire digoxine of is een blanco. Aan -7 de monsterkop werd een eindeoncentratie van 9 x 10 molaire digoxine antilichaam en x 10 molair verbinding 1 toegevoegd. 20 Deze oploissingen werden gedurende 5 min geïncübeerd waarna enzym werd toegevoegd en de analyse volgens de voornoemde procedure werd üitgevoerd. De resultaten zijn als volgt:

TABEL C

Jncubatiemengsel AAd/5 min na enzym-inhibitor- incubatietijd

25 _OjJj_TT_19T

alleen enzym (controle) 0,17^ 0,169 0,167 - enzym + verbinding 1 0,162 0,037 0,013 enzym + verbinding 1 + antilichaam 0,160 0,129 0,115 30 enzym + verbinding 1 + antilichaam + digoxine 0,160 0,068 0,038 800069e

1U

Met behulp van de voornoemde procedure met uitzondering dat de antilichaam^e inde on centrat ie in het monster 1(,5 ς —7 IQ molair was werden verschillende fosfaat-gelatme bufferop-lossingen bereid met de aangegeven digoxinec oneentrat ie. Elk van 5 deze oplossingen werd geanalyseerd door antiliehaam en verbinding 1 aan de oplossing toe te voegen, zoals in de voorafgaande procedure, waarbij men een periode van 2,5 min incubering liet verlopen en de analyse op de resterende enzymactiviteit na 21 min plaatsvond.

TABEL· D

10 ^u M Digoxine % Activiteit van enzym 0.,062 65 % 0,125 65 % 0,25 62 % 0,5 57 % 15 Normaal menselijk, serum dat digoxine-concentra- ties als aangegeven in tabel E bevatte werd volgens de bovengenoemde procedure onderzocht.

N,N,N-Trimethyl-2-( o-methyl-a-fenylbenzyloxy) -ethylammonium methylsulfaat (N-methylorfenadrine) werd bereid door 20 reactie van N,N-dimethyl-2-( o-methyl-a-fenylbenzyloxy). et hylamine (orfenadrine) met dimethylsulfaat. Bij een concentratie van 1mM remde deze verbinding meer dan 99 % menselijk serumcholinesterase terwijl slechts 25 % cholinesterase van E. electricus werd geremd.

N-Ethylmaleïmide wordt toegepast voor het blokke-25 ren van achtergrond sulfhydrylgroepen in menselijk serum.

Aldus werden 1 microliter geconcentreerd digoxine antiliehaam in pK 7,0 fosfaat-gelatxne buffer, dat 50 mM N-me-thyl-orfenadrine bevatte, toegevoegd aan 50 microliter van elke serum-standaard, waarna N-ethylmaleïmide onder roeren werd toege-30 voegd aan elk. serumstandaard cm een werke on centrat ie van 1,6 mM te verkrijgen. Aan het serum werden tevens 1 microliter van een oplossing van verbinding 1 in pH 7,0, 0,1 molair fosfaat-gelatine 8000658 -7 15 buffer toegevoegd. De eindantilichaamconcentratie is 8,0 x 10 mo-lair en de eindeoncentratie van verbinding 1 is x 10 . De ze oplossingen werden gedurende 12 min geincubeerd, na welke tijdsduur. acetylcholinesterase als eerder vermeld werd toegevoegd.

5 Na 26 min werd de bichromatische spectrofotometer gestart en werd een monster van elke kop 26-voudig verdund met analysebuffer dat . -5 -k 1,6 x 10 molair DTNM, 5 x 10 molair acetyl-0-methylthiocho-linejodide bevatte en 1 mM N-methyl-orfenadrine in pH 7,0, 0,1 molair fosfaatgelatinebuffer. De eindenzymconcentratie was onge- 11 o 10 veer 2 x 10” molair en de cuvet-temperatuur 30 C. De verandering in de absorbantie na 5 Juin was als volgt:

TABEL· E

Digoxine in serum Md/5 min _{ /uM) _ 0,1 0,096 15 0,13 0,089 0,17 0,083 0,26 0,077 0,31+ 0,073 0,51 0,063 20 0,6U 0,060 0,85 0,0U7 1,30 0,035

Voorbeeld II

Cholinezuur, 4,08 g, werd opgelost in 10 ml 25 droog dimethylformamide en 3,30 g imidazool toegevoegd, gevolgd door 3,6o g t-butyldimethylsilyl-chloride. Men liet het reactie-mengsel gedurende de nacht bij kamertemperatuur staan. Het reac-tiemengsel werd in water geschonken, gefiltreerd en het neerslag gewassen met water. Het neerslag werd opgelost in 30 ml tetrahydro-30 furan en 3 ml water en 2 ml azijnzuur toegevoegd. Na 6,5 uur werd het oplosmiddel verdampt en het residu geenromatografeerd over 200 g silicagel met 5 % methanol in methyleenchloride als eluent, 80006S8 16 waarbij 3a-(t-butyldiëthylsilyloxy)-7a,12a-dihydroxy-56-cholan-2U-zuur, smeltpunt 1^5,5 - 1W, werd verkregen met de structuur volgens formule 35 van het formuleblad.

De voornoemde verbinding, 2,092 g, 1,728 g N-(5-5 hydroxypentyl)-6-aminohexaanamide en 1,87 g H-ethoxy-carbonyl-2- ethoxy~1,2-dihydrochinoline werden gedurende 23 uren onder terug-vloeikoeling gekookt in 175 nil ethylacetaat, Men liet het reac-tiemengsel bij kamertemperatuur staan waarbij een kristallijne verbinding werd verkregen. Dit materiaal werd gerekristalliseerd 10 uit ethylacetaat en leverde 2βθ mg 3a-(t-butyldimethylsilyloxy)-7a, 12a-dihy dr oxy-ET-(12-hydroxy-6-oxo-7-azadodecyl) cholan-2U-amide, smeltpunt 1^5,5 - 11+8°C met de structuur volgens formule 36 van het formuleblad.

Een oplossing van k2k mg triëthylammonium-ethyl-15 7-chinolyl-fosfaat in 10 ml water werd geleid door 15 ml carbon-zuurhars in de pyridiniumvorm. De eluent werd bij verlaagde druk geconcentreerd en droog pyridine tweemaal uit het residu afj e-dampt. Aan het residu werd 721 mg van de voornoemde alcohol toegevoegd. Droog pyridine werd driemaal uit het residu af gedampt.

20 Het residu werd opgelost in 1,0 ml droog pyridine en 36b mg gekristalliseerd tris-isopropylbenzeensulfonylchloride toegevoegd.

Het reactiemengsel werd 15 uur bij kamertemperatuur geroerd. IJs werd toegevoegd en na 0,5 uur werd het mengsel geëxtraheerd met methyleenchloride. De methyleenchloride-oplossing 25 werd gewassen met verzadigd natriumbicarbonaat en verzadigde na-triumchloride-oplossing en met magnesiumsulfaat gedroogd. Het oplosmiddel werd verdampt en tolueen verschillende malen uit het residu verdampt ter verwijdering van pyridine. Het residu werd toegevoegd aan een kolom van 50 g silicagel en de kolom gewassen met 30 300 ml 5$'s methanol-methyleenchloride en 1000 ml 10%1s methanol- methyleenchloride. Het oplosmiddel werd verwijderd en leverde een verbinding met de formule 37 van het formuleblad.

Deze-verbinding, 1+0 mg, werd opgelost in 2 ml aceton en 0,10 ml dimethylformamide gevolgd door ^0 microliter 8000093 17 dimethylsulf aat. Men liet ’net reactiemengsel gedurende de nacht staan hij kamertemperatuur. Het acetonmengsel werd toegevoegd aan ethylether en het mengsel gecentrifugeerd. Het neerslag werd aangewreven met ethylether en gaf verbinding 2 van het formuleblad.

5 Verbinding 2 werd toegepast om de antilichaam- modulatie van de remming en omkering door cholylglycine (glyco-cholinezuur) te demonstreren. Antilichaam tegen cholylglycine-runder-serum-albumine (BSA) conjugaten werden gevoimd in konijnen en het konijnenserum verkregen volgens gebruikelijke technieken.

10 De anti-cholineglycine IgG-fraetie werd verkregen door ammonium-sulfaat-fraetionering en ionenuitwisselingschromatografie. De concentratie van het anti-lichaam werd niet bepaald maar werd ingesteld uit een samengevoegde fractie uit de ionenuitwisselkolom teneinde de beste modulatie van remming door verbinding 2 te ge-15 ven. In een blanco proef toonde IgG tegen digoxine op identieke wijze gezuiverd als het anti-cholyl-glycine IgG geen effect op de activiteit van de remming, hetgeen een specifieke binding van verbinding 2 aanduidde. De proef werd uitgevoerd met een ABA-100 model bichromatische analysator (Abbott Laboratories, North Chicago, 20 111*) waarbij de volgende instellingen werden toegepast:

IABSL F

Filter : ^15/550 nm 2 min offset

Temp.. : 30°C Tijdsverloopschaal: 1

Snelheidsmodus : 'v Carousel oraw.: 2

Zero : 0,000 Analysetijd: 5 min 25 Calibreren : 0,500 1/26 verdunningsplaat FRR : aan

De substraatoplossing en buffer werden gebracht in de primaire spuit van de verdunningsplaat. De buffer was pH 7,0, 0,1M kaliumfosfaat, 0,1$ gelatine. Het - substraat was acetylthio--k ^ —h 30 choline, 5,0 x 10 M, met DTNB, 1,o x 10 M, als indicator. Tabel G toont de reactant in de monsterkop. In al deze gevallen was de acetylcholinesterase (T. californica) concentratie bij benadering 8000398 • v t 18 2 x 1Q-1^ M en de concentratie van verbinding 2, de inhibitor, —l’ was 10 x 10 M. Bij toevoeging van cholylglycine was de concen- _3 tratie in de monsterkop 10 M. De monsterkop bevatte pH 7,0, 0,1M kaliumfosfaat-huffer, die 0,1 % gelatine bevatte, plus de compo-5 nenten aangegeven in tabel G:

TABEL G

Verandering in Ad in 5 min als. functie van de tijd en de ____~ ' reactieeonrponenten_'

Reactie- Enzym-inhibitor componenten incubatietijd Ad/5 min 10 (mini T = 0 T=13 T=25 T=36

E alleen 0,2¼6 0,237 0,23¼ Q,23Q

E + Γ 0,226 0,072 0,025 0,013 E+I+Ab 0,235 0,192' 0,164 0,147 E+I+Ab+CG 0,22¼ 0,078 0,032 0,017 15 E + Ab 0,22¼ 0,225 0,218 0,215 E+AL+CG 0,225 0,223 0,216 0,207 E + CG 0,236 0,228 0*220 0,211 E+I+CG 0,22¼ 0,062 0,022 0,013 alleen buffer 0,001 0,003 0,001 0,002 20 E = acetylcholinesterase I = verbinding 2 CG = cholylglycine

Ab = antilichaam ten opzichte van cholylglycine geconjugeerd met BSA.

25 Voorbeeld ΓΕΙ

In 100 ml tetrahydrofuran werd achtereenvolgens 17,0 g U-(t-butoxycarbony1J-1-aminoboterzuur bereid volgens de procedure van Moreder et al.; Z. Physiol. Chem., 357, 1651 (1976), 10,6 g N-hydroxy suecinimide en 18,9 g dicyclohexylcarbodiimide 30 toegevoegd. Het mengsel werd gedurende 2 uur geroerd. Het verkregen dicyclohexylureum werd gefiltreerd en 11,1 g 5-amino-3-thia-1-pentanol in 150 ml tetrahydrofuran aan het filtraat toegevoegd.

a 0 0 0 S 9 8 19

Na gedurende 2,5 uur roeren werd tetrahydrofuran afgedampt en het residu verdeeld tussen methyleenchloride en pekel. De me-thyleenchloridefractie werd gewassen met verzadigd waterig na-triumcarbonaat, gedroogd en het oplosmiddel verwijderd, waarbij 5 een olie werd verkregen die bestond uit 10-(t-butoxycarbamoyl-7-oxo-6-aza-3)-thiadecanol met formule 38 van het formuleblad.

Onder een inerte atmosfeer werden 2,28 g van de-• ze verbinding, 1,1*5 g diisopropylethylamine en 1,8 g methaansul-fonzuuranhydride achtereenvolgens toegevoegd aan 20 ml methyleen-10 chloride bij 0°C. Na 30 min werden 2,0 g Q-ethylmethylfosfono-thioaat en 1,92 g diisopropylethylamine aan het reactiemengsel toegevoegd. Men liet de oplossing tot kamertemperatuur opwarmen waarna deze gedurende 1,5 uut werd verhit tot i*5°C. De oplossing werd verdeeld tussen pekel en methyleenchloride en achtereenvol-15 gens gewassen met 15%'s chloorwaterstofzuur, verzadigd natriumbicarbonaat en daarna met anhydrisch magnesiumsulfaat gedroogd.

Het magnesiums· Ifaat werd gefiltreerd en het oplosmiddel verdampt waarbij een ge..e olie werd verkregen die bestond uit 0-ethyl-S-[10-(t-butoxycarbamoyl)-6-aza-7-oxo-3-thiadecyl] methylfosfono-20 thioaat, met formule 39 van het formuleblad.

Bij kamertemperatuur werd 1,0 g van deze verbinding opgelost in Λ ml 50%’s trifluorazijnzuur en methyleenchloride en het mengsel gedurende 10 min geroerd. Het oplosmiddel werd onder verlaagde druk verdampt en het residu opgelost in overmaat 25 benzeen. Het benzeen werd snel gedestilleerd zodat sporen tri-. fluorazijnzuur werden verwijderd. De resterende olie werd opgelost in 2 ml dimethylformamide en achtereenvolgens 1,08 g suceinimi-de actieve ester van cholinezuur en 37 mg hydroxybenzotriazool toegevoegd. De pH van de oplossing werd ingesteld op 7,5 met 30 triëthylamine. Na gedurende 6 uur roeren werd het oplosmiddel door verdamping onder verlaagde druk verwijderd en het residu verdeeld tussen pekel en methyleenchloride. De methyleenchloride-fractie werd gewassen met verzadigd natriumbicarbonaat en gedroogd met anhydrisch magnesiumsulfaat. Het magnesiumsulfaat werd gefil- gO 0 0 6 9 3 20 treerd en het oplosmiddel door verdamping verwijderd waarbij U- [ 5-aza-1O-ethoxymethylf osf inylthio-i|-oxo-thiadecyl ] -3a, 7a, 12 a-trihydroxy-5 i3-cholan-2U-amide met formule 3 van het formuleblad werd verkregen.

5 A. De snelheidsconstante voor de remming van acetylcholinesterase door verbinding 3 wordt als volgt geschat:

De volgende reactanten werden toegepast:

Buffer: Werkoplossingen van alle reagentia werden bereid in 0,1 M natriumfosfaat, pH 7,0 buffer, dat 0,1 % gelatine 10 (fosfaat-gel) bevatte.

Ligand analoog-onomkeerbaar Remmingsconjugaatoplossing:

Een werkoplossing van 6,7 x 10“^ M oplossing van verbinding 3 in fosfaat-gelbuffer werd bereid door verdunning 15 uit 0,067 M voorraadoplossing van verbinding 3 in methanol.

Acetylcholinesterase: Een werkoplossing van 100 eenheden acetylcholinesterase per ml werd bereid in fosfaatgel-buffer. Een eenheid enzymactiviteit wordt gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die de hydrolyse van 1 micromol acetylcholine per 20 min bij 25°C zal katalyseren. Wanneer men een omzetgetal van 5 x 5-1 10 mm aanneemt is de concentratie van het enzym m deze op--7 lossing 2 x 10 M.

Substraat: In al de gevallen werd de enzymacti-viteit gemeten in fosfaat-gel buffer die ^,88 x 10 Si acetylthio-25 choline en 1,56 x 1oSi DTEE bevatte.

De pseudo-eerste orde snelheidsconstante 'voor de remmingsreactie werd gemeten door 10 microliter van de werk-con-jugaatoplossing te mengen met 500 microliter fosfaat-gelbuffer.

Op tijdstip nul werd 5 microliter (0,5 eenheden) acetylcholine-30 sterase-oplossing toegevoegd, doorgewerveld en bij kamertemperatuur geïncübeerd. Bij periodieke intervallen werd de hoeveelheid achterblijvende enzymactiviteit gemeten door een 10 microliter aliquot af te voeren, dit te mengen met 1,0 ml substraatoplossing en de snelheid van toename van de absorbantie bij ^10 nm 8 0 0 2 δ 3 8 21 (ΔΑ/At 1 in een Varian Super Scan. 3 spectrofotcmeter te meten. · -

De geschatte pseudo-eerste orde snelheidsconstante (k^ (geschatP wordt berekend -volgens de vergelijking 1: (AA/At)tp k1 (geschat 1 = - 1n (AA/Atlt, t2 - t, 5 waarin tg en t^ de tijdstippen zijn na toevoeging van., enzym waarbij de achterblijvende activiteit (AA/At), wordt gemeten.

De geschatte tweede orde snelheidsconstante voor de remmings-reactie wordt daarna, berekend door k^ (gesckat ] Ïe “leien cL°°r ie concentratie van het conjugaat in de reactie (1,3 x 10 ^M).

10 De waarden die door deze methoden zijn verkre gen worden weergegeven in tabel K.

TABEL· H

Tijd Activiteit (ABsorb.antie-eenh.eden (minuten) per minuut? 15 0,5 9,^5 x 1Q”4 2,5 6,87 x 10 5,0 ^,87 x 10^

Een grafiek van -ln activiteit versus t geeft een helling van 0,1^7 min-1 als de pseudo-eerste orde snelheids-20 constante met een correlatiecoëfficiënt van 0,998. De berekende ζ schijnbare tweede orde snelheidsconstante is daarna 1,1 x 10 liter mol” linin’"1. .De meting kan tevens worden uitgevoerd met een bi-chromatische spectrofotometer.

B. De bruikbaarheid van acetylcholinesterase 25 en verbinding 3 als reactanten ter bepaling van cholylglycine-concentraties werd als volgt gedemonstreerd:

De volgende reagentia werden toegepast:

Cholylglycine standaarden (buffer): Oplossingen van cholylglycine werden bereid in 0,1M natriumfosfaatbuffer, bij 8000898 22 een pH van 7,0, die 0,1 % gelatine bevatte met concentraties van _"3 „5 _7 10 , 10 , 10 , 10 M. De standaardoplossingen werden bereid uit een voorraadoplossing van 0,01M. natriumglycocholaat in water.

Anticholylglycine antilichaam: De IgG fractie 5 van konijnenantiserum werd bereid door gelijke delen van een verzadigde ammoniumsulfaat-oplossing en het serum te mengen. Het verkregen neerslag werd verkregen door centrifugeren en gedialyseerd versus 0,02M kaliumfosfaat bij pH 8,0. Het dialysaat werd daarna gefiltreerd en gechromatografeerd over een DEAE cellulosekolom TO in evenwicht gebracht in 0,02M kaliumfosfaat bij pH 8,0. De werk-oplossing van het antilichaam werd verkregen door de geschikte fracties als bepaald door het elutieprofiel samen te voegen. Een

Scatchard analyse van deze oplossing wees twee groepen antili- T é 1 chamen aan met bindingsconstanten van 1 x 10 en 1 x 10 M met -5 15 overeenkomstige bindingscapaciteiten van 2,2 x 10 en 3,2 x 10 'M.-

Oplossingen van verbinding 3, acetylcholinesterase en substraat werden op soortgelijke wijze bereid als die beschreven in deel A van dit voorbeeld.

Ter meting van de concentratie van cholylglycine 20 in fosfaatgelbuffer, werden 36 microliter fosfaatgelbuffer, 20 microliter van de passende cholylglycine-oplossing, microliter -6 van een 3,35 x 10 oplossing van verbinding 3 en 16 microliter van de anticholylglycine-antilichaam-oplossing gecombineerd in de monsterkop van de bichromatische kinetische analysator. De 25 reagentia werden in de aangegeven volgorde toegevoegd. Daarna werden 10 microliter siliconolie toegevoegd ter voorkoming van verdamping. Ha 5 min incubatie bij kamertemperatuur werd de bichromatische kinetische analysator bekrachtigd zodat de carousel van monsterkoppen zal voortbewegen via de normale 5 min omwenteling.

30 Bij aankomst van elke monsterkop bij de bemonsteringspositie werd k microliter (o,09 eenheden) in acetylcholinesterase-oplossing —8 toegevoegd. De eindconcentraties waren 9,6 x 10” M, verbinding 3, , _k „8 -10 1,67 x 10 - 1,^7 ·χ 10 'M cholylglycine en 5,7 x 10 M acetyl cholinesterase. Ha een 12 min incubering werd de hoeveelheid ach- 8 0 0 0 8 §8 23 terhlijvende enzymactiviteit gemeten door een 10 microliter aliquot af te leveren aan de bichromatische kinetische analysator-cuvet (37°C) en deze te mengen met 250 microliter substraatoplossing. De 26-voudige verdunning van het materiaal uit de monster-5 kop diende zovel voor het effectief stoppen van de remmingsreac-tie als het verdunnen van het enzym tot een concentratiegebied vaar de activiteit daarvan gemakkelijk kon vorden gemeten. De enzymactiviteit werd aangegeven door het verschil tussen de absor-banties (Adi die in 5 "min Dij ^15 nm en 550 nm verden geprodu-10 ceerd. De resultaten vorden weergegeven in tabel J.

TAB EL J

Cholylglycine Ad /5 min

(MI

1,67x10”® 0,^99+0,013 ι,6γχΐο“τ 0,^53 + 0,.025 15 1,67 x 0 0,300+0,011 1,67x1ο”5 0,1^3+0,002 , -k 1,67 x 10 0,103 + 0,001 H Ad wordt gedefinieerd in de tekst. De vaarden zijn de gemiddelde + een standaard deflatie. Elke vaarde stelt replicaten 20 van drie voor.

Cholylglycineconcentraties. in serum verden op dezelfde wijze bepaald als beschreven in voorafgaande voorbeelden.

To or de doeleinden van deze proef verden standaardserumoplossin— gen van cholylglycine bereid door verdunning van een Q,01M wa-25 terige oplossing van natriumglycocholaat in normaal menselijk se- _7 rum, dat een endogene cholylglycmeconcentratie van 7,5 x 10 M heeft, bepaald door radio-immuno-analyse (Abhotts Laboratories CGRIA Kit.}. De totale concentraties van colylglycine in serum-oplossingen vorden in tabel K samengevat. Alle andere oplossingen 30 zijn dezelfde als beschreven in A en B als boven, met uitzonde- 8000698 2h dering dat de substraatoplossing 1,0mMper liter H-methylorfe-nadrine bevat ter remming van serum pseudocholinesterase.

Aan de monsterkoppen van de bichromatische analysator werden in volgorde 39 microliter fosfaat-gelbuffer, 5 6 microliter van.de passende normale menselijke serumstandaard cholylglycine-oplossing, 2 microliter van een 3,35 x 10 M oplossing van verbinding 3, 8 microliter van de anticholylglycine-antilichaamoplossing. en 10 microliter siliconolie toegevoegd.

Ha 5 min incubatie bij kamertemperatuur werden 5 microliter (0,05

10 eenheden) acetylcholinesterase, toegevoerd als beschreven in deel B

-7 van dit voorbeeld. De eindconcentraties waren 1,1 x 10 M verbinding 3, 8,5 x 10'8 - 1,0 x 10 ^ M cholylglycine, 1,7 x 10 acetylcholinesterase. Ha 12 min incubatie bij kamertemperatuur werd de in elke monsterkop achterblijvende enzymactiviteit geme-15 ten als beschreven in deel B van dit voorbeeld. De resultaten worden aangegeven in tabel K.

TABEL K

Cholylglycine Cholylglycine in serum in monsterkop _(M)_ _(M) Ad/5 min 20 8,5 x 10"7 8,5 x ïtf8 0,733 + 0,032 1,8 x.10'é 1,8 x 10-7 0,733+0,016 1,1 x 10'5 1,1 x 10"6 0,500 + 0,023 1.0 X 10"1* 1,0 x 10‘5 0,20U + 0,016 -3 -1 .

1.0 x 10 : 1,0 x 10 0,161 + 0,005 25 C. De effectiviteit van anticholylglycine anti- lichaam bij het moduleren van de activiteit van verbinding 3 ter remming van acetylcholinesterase werd als volgt bepaald. Werk-oplossingen van fosfaat-gelbuffer, anticholylglycine antilichaam, verbinding 3, acetylcholinesterase en substraat waren dezelfde 30. als die toegepast in deel A van dit voorbeeld. In de monsterkoppen van de bichromatische kinetische analysator werden in de aangegeven volgorde verschillende hoeveelheden fosfaatgelbuffer, ver- 8000698 25 schillende hoeveelheden antilichaamoplossing (gerangschikt in tabel L), 2 microliter verbinding 3 oplossing en 10 ml silicon- olie toegevoegd ter vermijding van verdamping.

IJa een incubatie van 5 min bij kamertemperatuur 5 werd 6 microliter (Ο,Οβ eenheden) acetylcholinesterase toegevoegd als beschreven, in deel B van dit voorbeeld. Het totale volume van reagentia in elke monsterkop was 60 microliter. De eindconcen- -7 . . -1 traties waren 1,1 x 10 M verbinding 3 en 2 x 10 M acetylcholinesterase. De resultaten worden samengevat in tabel L.

TABEL L

10 Anticholylglycine Percentage niet-geremd antilichaam enzymsignaal ( /ul) Ad/5 min -i-f.- - -- 0 0,095 + 0,004 8,5 2 0,480 + 0,027 43 15 4 0,706 + 0,084 63 6 0,856 + 0,048 77 8 ' 0,919 + 0,018 82 10 0,890 + 0,040 80 12 0,899 + 0,020 80

20 Voorbeeld IV

Aan een oplossing van 5 g 6-aminohexanol in 50 ml methyleenchloride bij 0°C werd druppelsgewijze 9,3 g di-t-bu-tyldicarbonaat toegevoegd. Men liet de oplossing op kamertemperatuur komen, waarna 17 uur werd geroerd. De oplossing werd gewas-25 sen met waterig citroenzuur, waterig natriumbicarbonaat en gedroogd met anhydrisch magnesiumsulfaat. Het magnesiumsulfaat werd afgefiltreerd en het oplosmiddel verdampt, waarbij een gele olie werd verkregen. De olie werd gezuiverd over silicagel onder toepassing van 3 % methanol in methyleenchloride als eluent waarbij 30 B-t-butoxycarbonyl-6-aminohexanol werd verkregen met de structuur volgens formule 40 van het formuleblad.

Aan 5,9 g van deze verbinding en 3,06 g tri-ethylamine in 50 ml methyleenchloride werd.3,47 g methaansulfonyl- 8 0 0 0-6 9 8 26 chloride toegevoegd. De oplossing werd 30 min geroerd en gewassen met waterig citroenzuur, waterig natriumbicarbonaat en gedroogd met anhydrisch magnesiumsulfaat. Het magnesiumsulfaat werd gefiltreerd en het oplosmiddel verwijderd door verdamping waarbij 5 N-t-butoxycarbonyl-6-aminohexyl methaansulfonaat werd verkregen.

In 10 ml dimethylformamide zonder verdere zuivering werd 6,2 g van dit materiaal toegevoegd aan een oplossing van 2,5 g β-mer-captoethanol in 60 ml anhydrisch dimethylformamide dat 3>5 g kalium-t.-but oxy de bevatte. Het mengsel werd gedurende 1-7 uur bij 10 kamertemperatuur geroerd. Het reaetiemengsel werd in water geschonken en geëxtraheerd met methyleenchloride. Het organische extract werd driemaal met 100 ml water gewassen en gedroogd met anhydrisch magnesiumsulfaat. Het magnesiumsulfaat werd gefiltreerd en het oplosmiddel door verdamping verwijderd. De restolie werd 15 gezuiverd door silicagelchromatografie onder toepassing van 5 % . methanol in methyleenchloride als eluent., waarbij N-t-butoxycarho-nyl-9-amino-3-thia-T-nonanol werd verkregen met de. formule t-butyl-O-C(=0I-NH (CH2 Jg-S-(CH2}g-0E.

Een oplossing van 2 g van dit materiaal en 1,4 g 20 diïsopropylethylamine in 20 ml methyleenchloride werd gekoeld tot 0°C en 1,6k g methaansulfonzuuranhydride toegevoegd. Na 30 min werden 1,86 g diïsopropylethylamine en 2,0 g O-ethylmethylfosfon-thionzuur toegevoegd waarbij het reaetiemengsel op 0°C werd gehouden. Men liet de oplossing gedurende 3Q min op kamertempera-25 tuur komen waarna gedurende 2,5 uur werd gekookt onder terugvloei-koeling. Na koeling van het produkt in methyleenchloride werd dit gewassen met waterig natriumbicarbonaat en met anhydrisch magnesiumsulfaat gedroogd. Het magnesiumsulfaat werd gefiltreerd en het oplosmiddel door verdamping onder verlaagde druk verwij-30 derd. Het ruwe produkt werd gezuiverd door kolomchromatografie met 1 % methanol in methyleenchloride als eluent waarbij 0-ethyl-S-(N-t-butoxycarbonyl-9-amino-3-thianonyl) werd verkregen met de structuur volgens formule Ui van het formuleblad.

Deze verbinding, 250 mg, werd in 2 : 1 mengsel 8000698 27 van methyleenchloride en trifluorazijnzuur gedurende een uur bij kamertemperatuur geroerd. Het oplosmiddel werd onder verlaagde druk verdampt. Het verkregen zout werd opgelost in 6 ml dioxan en •320 mg diïsopropyiethylamine toegevoegd. Daarna werd 620 mg van 5 de H-hydroxy-succ inimide-ester van N-acetyl-L-thyroxine toegevoegd en het mengsel gedurende 16 uur geroerd. Het reactiemengsel werd geschonken in 50 ml methyleenchloride en achtereenvolgens gewassen met waterig citroenzuur en waterig natriumbicarbonaat.

De oplossing werd gedroogd met anhydrisch magnesiumsulfaat. Het 10 magnesiumsulf aat werd verwijderd door filtratie en het oplosmiddel verwijderd door verdamping onder verlaagde druk. De residu-olie werd gechromatografeerd over silicagel met 1 % methanol in methyleenchloride als eluent. Rekristallisatie uit acetonitril leverde 9-(ethoxymethylfosfinylthio)-7-thianonyl-N-acetylthyroxine-15 amide met de structuur volgens formule k van het formuleblad.

Aan een oplossing van 50 mg van deze verbinding en 1,5 ml methyleenchloride werd 10,7 mg methylfluorsulfonaat toegevoegd. Ha 2,5 uur we 'd een vaste stof gevormd. Het oplosmiddel werd afgeschonken en het neerslag aangewreven met anhy-20 drische ether waarbij een poeder werd verkregen, dat het sulfo-niumzout is met de formule 5 van het formuleblad.

De snelheidsconstante voor verbinding 5 werd bepaald door de methode weergegeven in voorbeeld 3 A nl.:

Verbinding 5 Tweede orde snelheidsconstante liter mol”1 min”1/ 25 1,0 x 108 -9

Inhibitor concentratie/5,0 x 10 M

Thyroxine standaardkromme onder toepassing van'Verbinding 5 Reagentia: A. Een reagens bevattende 0,1 eenheid/ml (1,U x 10 3 30 10 M] acetylcholinesterase (E. electrius} activiteit en 1 x 10~ M in thyroxine IgG antilichaam, gezuiverd op soortgelijke wijze als eerder beschreven, in 0,1 molaire.fosfaatbuffer, pH 750, bevattende 0,1$ gelatine, 1,0 nM IT-methylorfenadrine en 0,25 mM 8- 8000698 28 anilino-naftaleensulfonzuur.

B. Het substraat reagens bevatte 1,0 mM acetyl- thiocholine en 0,32 mM DTNB in 0,1 molair pH 7,0 fosfaatbuffer.

_7 C. Een werkoplossmg van 2,5 x 10 M van verbin-5 ding 5 in 0,1 M fosfaatgel werd bereid.

De analyse werd uitgevoerd door 5 microliter serum dat verschillende hoeveelheden thiroxine bevatte met 250 microliter reagens te mengen.

A. Het mengsel werd gedurende 5 min bij 37°C ge-10 incubeerd. Aan deze oplossing werd 10 microliter reagens C en 250 microliter reagens B toegevoegd. Aflezingen werden ondernomen met intervallen van 5 min met behulp van een bichromatische analysator uitgerust met ^15/550 nm filterset.

TABEL M Serum-standaardkromme 15 Begin conc. van AAd/5 min thyroxine in serum (M) ^15/550 nm 0,6 x 10"8 0,980 2,6 x 10“8 0,927 5,2 x 10“8 0,902 20 1,0 x 10"7 0,793 2.1 x 10'T 0,599 3.1 x 10_T 0,578

De waarden voor de onbekenden werden bepaald uit de standaardkromme.

25 De snelheidsconstante voor verbinding U werd be paald door de methoden weergegeven in voorbeeld 3-A:

Tweede ord^ snelheidsconstante Inhibitor concentratie liter mol min·-^ --- --—5-

Verb, k 3,5 x 10 2,5 x 10 M

30 Een op serum gebaseerde standaardkromme voor thyroxine werd verkregen met verbinding ^ onder toepassing van 8000698 29 een modificatie van de procedure beschreven voor verbinding 5.

Reagens A bevatte 1 mM ff-methylorfenadrine en 7 mg/ml natriumsalicylaatf osfaatgel-buf fer, pH 7,0. De choline- sterase-activiteit was 0,07 eenheden/ml (7x10 M) en de thyro- -8 5 xine antilichaam-concentratie was 1,¾ x 10 M, gebaseerd op de bindingsplaat s en.

Reagens B isrhetzelfde als reagens B boven -7

Reagens C xs een werkoplossing van 5x10 M verbinding in 0,1M fosfaatgel-buffer.

IQ De analyse werd uitgevoerd met 10 microliter serum gemengd met 250 microliter reagens A en 10 microliter reagens C. Het mengsel werd gedurende 10 min bij 37°C gexncubeerd alvorens 250 microliter reagens B werd toegevoegd. De standaard-kromme voor het bepalen van de onbekenden is als volgt:

TABEL· S

15 Begin conc.

thyroxine in serum (M) AAd/5 min 0 0,6h6 5 x 10"8 0,588 1,5 x 10~7 0,525 20 3,1 x 10"7 0,W0 5 x 10"7 0,518 1 x 10“6 0,½¾ 5 x 10“é 0,k26

Voorbeeld V

25 Met de procedure van voorbeeld IV waarbij 6- amino-hexanol door ^aminobutanol; 5-amino-3-thiapentanol; ïT-gly-cyl-6-amino-1-hexanol werd vervangen werden de verbindingen I-t-but oxyc arbon yl-^amino-1 -butanol t-butyl-0-C (=0 ] -ïïïï- (Cïï2) k-OH.

30 F-t-butoxvcarbonvl-5-amino-3-thia-1-pent anol t-butyl-0-C(=0}-ÏÏH-(CH2)g-S-(CE,)2~0ÏÏ; en 8000898 . % 30 IT [H' -t-but oxycarbonyl) -glycyl ] -6-amino-1 -hexanol 0

t-butyl-O-C(=0)-NH-CH2CHH(CHg)g-OH

verkregen en deze alcoholen werden op hun beurt in reactie gebracht met methaansulfonylchloride, β-mercaptoëthanol, methaan-5 sulfonzuuranhydride en O-ethyl-methylfosfonthionzuur, voor zover nodig, ter levering van inhibitorarmen voor koppeling van de formules 1*2, U3 en 1*1* van het formuleblad. Haar keuze werd 0-butyl-methylfosfonothionzuur gebruikt ter levering van verbindingen zoals die volgens formule 1*5 -van het formuleblad.

10 Deze tussenreagentia werden daardoor gedeblok keerd en omgezet met H-hydroxysuccinimide-ester van H-acetyl-L-thyroxine en gaven conjugaten zoals H-[l2-(ethoxymethylfosfine-thio)-10-thia-3-aza-2-oxododecyl]-Ha-acetylthyroxine amide met formule 1*6 van het formuleblad, alsmede het overeenkomstige sul-15 foniumzout, verbinding 6. Deze verbindingen hebben tweede orde- snelheidsconstanten van. 2,5 x 10^ en 1,7 x 10^ liter mol 1min~1 _3 _n

bij inhibitorconcentraties van 5 x 10 molair en 2,5 x 10 molair. Voorbeeld VI

Een oplossing van 32 g H-benzyloxycarbonyloxy-20 succinimide in 100 ml tetrahydrofuran werd omgezet met 15 g 6-ami-no-1-hexanol in 30 ml 50$ ’s methanol: tetrahydrofuran. Het reac-tiemengsel werd gedurende de nacht bij kamertemperatuur geroerd en in water geschonken. Het verkregen mengsel werd geëxtraheerd met methyleenchloride, de organische laag gewassen met natrium-25 chloride-oplossing, en gedroogd met anhydrisch magnesiumsulfaat.

Het magnesiumsulfaat werd afgefiltreerd en het oplosmiddel door verdamping verwijderd. Het produkt werd gerekristalliseerd uit ethylacetaat/ether en leverde H-(benzyloxycarbonyl)-6-amino-1-hexanol, smeltpunt 81,5 - 83°C, met de formule 1*7 van het formuleblad.

30 Aan 21 g van deze verbinding in 100 ml anhydrisch pyridine werd 10,53 g methaansulfonylchloride bij 0° - 5°C toegevoegd. Het reactiemengsel werd in koud water geschonken en geëxtraheerd met-ether. De etheroplossing werd gewassen, gedroogd en 8000698 31 het oplosmiddel verwijderd waarbij H-(benzyloxycarbonyl)-6-amino-hexyl methaansulfonaat als een wasachtige vaste stof werd verkregen.

Aan een oplossing van 7,3 g β-mercaptoethanol in 5 -50 ml dimethylformamide werd 5,15 g natriummethoxyde onder koe len in een ijshad toegevoegd. De totale opbrengst van H-(ben-zyloxycarbonyl) -6-aminohexylmethaansulfonaat als boven in 150 ml dimethylformamide werd toegevoegd aan β-mercaptoethanoloplossing in een inert oplosmiddel bij 0°C. Het mengsel werd gedurende 2 10 uur bij kamertemperatuur geroerd en in een natriumchloride oplossing geschonken.

Extractie met methyleenchloride, wassen en drogen van de methyleenchloridelaag, gevolgd door verdamping van het methyleenchloride gaf een vaste stof. Eekristallisatie uit ethyl-15 acetaat leverde H-(benzyloxycarbonyl}-9-amino-3-thia-1-nonanol.

Een oplossing van 9,5 g van deze verbinding in 160 ml methanol die 1,1 equivalent geconcentreerd *aterstofchloride bevatte en 9,5 g palladium-zvart werd in een Pa: r hydrogeneringsinrichting gebracht. Ha 3 uur werd de katalysator afgefiltreerd en het metha-20 nol verwijderd waarbij 9-amino-3-thia-1-nonanol-hydrochloride met een smeltpunt van 69 - 72°C werd geleverd.

Aan een oplossing van 3,^9 mg, 12-acetyloxy-3-chloorformyloxy-1^-hydroxycard-20(22)enolide (Amerikaans octrooi-schrift 2.931.982) in 60 ml tetrahydrofuran werd 829 mg N-hydroxy-25 succinimide en 0,988 ml triêthylamine bij 0°C toegevoegd. Fa gedurende 3 uur roeren bij 0°C werd het vaste triëthylamine-hydro-chloride afgefiltreerd en aan het filtraat een oplossing van 1,5 g 9-amino-3-thia-1-nonanol-hydrochloride en 0,97 ml triêthylamine in 6,5 ml methanol toegevoegd. Het resulterende mengsel werd ge-30 durende een uur bij kamertemperatuur geroerd en daarna gedeeltelijk onder verlaagde druk ingedampt. Het residu werd verdund met waterig natriumchloride en met methyleenchloride geëxtraheerd. De organische fase werd gewassen, gedroogd en-het oplosmiddel afgedampt, waarbij een visceuze vloeistof werd verkregen. Chrcmatogra- 8000698 32 fie over silicagel met 2 - k% methanol in ethyleenchloride leverde 12-acetyl oxy- 3- [ N- (9-hydr oxy-7-thianonyl) carbamoyloxy ] -1 hydroxy card-20 (22)enolide.

Aan een oplossing van 2 g van dit materiaal in 5' 15 ml methanol werd U30 mg verpulverd anhydrisch kaliumcarbonaat toegevoegd. Na gedurende 35 min roeren bij kamertemperatuur werd het reactiemengsel verdund met overmaat chloroform, gefiltreerd door celite en het oplosmiddel gedeeltelijk onder verlaagde druk verdampt. Het residu werd opgelost in methyleenchloride, ach-10 tereenvolgens gewassen met 0,1N chloorwaterstofzuur en natrium-chloride-oplossing en gedroogd met anhydrisch magnesiumsulfaat.

Het magnesiumsulf aat werd gefiltreerd en het oplosmiddel verdampt, waarbij een ruw produkt werd verkregen. Chromatografie ove silicagel met methanol/methyleenchloride als eluent leverde 3-[N-15 (9-hy droxy-7-thi anonyl) carbamoyloxy ] -12,1 !+-dihydroxycard-20 (22 )— enolide.

Aan een oplossing van 0,725 g van het materiaal in 3 ml anhydrisch tetrahydrofuran werd achtereenvolgens 0,265 ml ethyldixsopropylamine en 0,265 g methaansulfonzuuranhydride in 20 0,75 ml tetrahydrofuran bij -20°C toegevoegd. Na gedurende 35 min roeren bij -10°C werd een oplossing van 0,78^- g dicyclohexylammo-. nium-O-ethylmethylfosfonothioaat in 2 ml methyleenchloride aan het mengsel toegevoegd. Roeren gedurende 5 uur bij kamertemperatuur werd gevolgd door het verdelen van het reactiemengsel tussen 25 methyleenchloride en. verdund chloorwaterstofzuur. De organische fase werd gewassen met natriumchloride-oplossing, gedroogd en het oplosmiddel verdampt ter levering van een ruw produkt. Chromatografie over silicagel met 2,5 - 5 % methanol in methyleenchloride als eluent leverde 3-[N-[9-(ethoxymethylfosfinylthio)-7-thia-30 nonyl]carbamoyloxy]-12,1k-dihydroxycard-20(22)enolide met de structuur volgens formule i+8 van het formuleblad.

Een mengsel van 25 mg van dit materiaal werd behandeld met 0,5 ml methyljodide en verscheidene druppels methyleenchloride. Na gedurende 3 dagen staan in het donker werd het oplos- 8000698 33 middel door verdamping verwijderd, waarbij het overeenkomstige . methylsulfoniumjodide, verbinding 7 van het formuleblad werd verkregen.

Met in wezen de procedures als. beschreven in 5 voorbeeld III werd een serumstandaardkromme verkregen uit verbinding 7· Commerciële digoxinestandaard toegepast in radio-immuno-analysekits, die 0, 1,2, b nanogram/ml digoxine bevatten, werden . toegepast. De eindconcentratie van digoxine antilichaam was 0,2 -9 . -3 -3 x 10 M, N-methyl-orf enadrme; 2,5x10 M en 1 x 10 Mm 10 resp. het immuno-reactiemengsel en substraatmengsel ter blokkering van serum-pseudocholinesterase. De resultaten voor de stan-daardkromme zijn: TABEL· 0

Digoxine standaard Ad/5 minuten 15 0 0,639 0,5ng/ml 0,6lk 1,0ng/ml 0,583 . 2,0ng/ml 0,527 i|-,0ng/ml 0,^62 20 Uit deze standaardkromme kunnen de digoxine- onbekenden in de serum-monsters worden bepaald.

Voorbeeld VTI

Een oplossing van 31,5 g U-hydroxysuecinimide-ester van U-benzyloxycarbonylglycine [J. Am. Chem. Soc., 86, 1839, 25 (196U) in 100 ml tetrahydrofuran werd druppelsgewijze in reactie gebracht met 12 g 6-amino-1-hexanol in 50 ml of 50% methanol in tetrahydrofuran. Het mengsel werd 12 uur bij 23°C geroerd en in water geschonken. Het verkregen neerslag werd zorgvuldig met water gewassen, gefiltreerd en gedroogd en leverde ruw H-(benzyloxy-30 carbonylglycyl)-6-amino-1-hexanol. De zuivere verbinding gere- kristalliseerd uit ethylacetaat had een smeltpunt van 1Oh· - 5°C.

Een oplossing van 15 g van deze verbinding in 70 ml - - > 8000698 3k pyridine werd gekoeld in een ijsbad en 1*,17 ml koud methaansulfo-nylchloride gedurende een periode van 5 min toegevoegd. Na gedurende 2 uur roeren bij 0 - 5°C werd het reactiemengsel geschonken in ijskoud water en het resulterende neerslag door filtratie 5 verzameld. De vaste stof werd gerekristalliseerd uit ethylace-taat/hexaan en leverde N-(benzyloxycarbonylglycyl)-6-aminohexyl-methaansulfonaat, smeltpunt 82 - 83°C.

Een oplossing van 16,5 g van dez'e verbinding in 75 ml dimethylformamide werd in een inerte atmosfeer toegevoegd .

10 aan een koude oplossing van k,0 g 3-mercapto-ethanol in 25 ml dimethylformamide dat 2,65 g natriummethoxyde bevatte. Het reactiemengsel werd gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geroerd en in een natriumchloride-oplossing geschonken. Extractie van deze oplossing met methyleenchloride en een standaard-wassing, dro-15 ging en verdampingsopwerking leverde N-(benzyloxycarbonylglycyl)- 9-amino-3-thia-1-nonanol. Door kristallisatie uit ethylacetaat verkreeg men de zuivere verbinding met een smeltpunt bij 99 -100°C.

Een oplossing van 1,15 g van deze alcohol in 7 20 ml chloroform werd behandeld met 0,387 g thionylchloride. Het mengsel werd gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur geroerd en de vluchtige stoffen werden bij verlaagde druk afgedampt. Een oplossing van 150h- g rest vaste stof in 3 ml dimethylformamide werd toegevoegd aan een oplossing van natrium-O-ethylmethylfosfonothio-25 aat (bereid uit 2,69 mM natriumhydride en 0,377 g O-ethylmethyl-fosfonothionzuur) in 1 ml dimethylformamide.

Na roeren gedurende 16 uur bij 60°C werd het mengsel geschonken in een natriumchloride-oplossing en met methyleenchloride geëxtraheerd. De organische fase werd gewassen, ge-30 droogd en het oplosmiddel verwijderd, waarbij een olie werd verkregen. Chromatografie over silicagel met 2 - k % methanol in methyleenchloride leverde 0-ethyl-S-[N-(benzyloxycarbonyl-glycyl)-9-amino-3-thianonyl]-methyl fosfonothioaat, met de structuur vol- 8000398 35 gens formule h9 "van het formuleblad.

Een oplossing van 6 g H-benzyloxycarbonylglycyl- 9-amino-3-thia-1-nonanol in 100 ml methanol, die 1,1 equivalent geconcentreerd chloorwaterstofzuur en 6 g palladium zwart bevat-5 te, werd gehydrogeneerd in een Parr-inrichting gedurende 2 uur. Filtratie van de palladiumkatalysator en verdamping van het oplosmiddel leverde H-glycyl-9-amino-3-thia-1-nonanolhydrochloride met de formule HCa.HgH-C^-CO-HH-tCïï^g-S-CHg-CHg-OÏÏ.

Aan een geroerde suspensie van 5 g natriumdife-'T0 nylhydantoine in 35 ml droog dimethylformamide werd 3,0U g ethyl-broomacetaat toegevoegd. Het mengsel werd gedurende 3 uur bij kamertemperatuur geroerd en het dimethylformamide bij verlaagde druk verdampt. Het residu werd verdeeld tussen methyleenchloride en natriumchloride-oplossing. De organische fase werd gewassen, 15 gedroogd en het oplosmiddel verwijderd, waarbij het H-gealkyleer-de difenylhydantoïne-derivaat werd geleverd, smeltpunt 1T9 - 180°C. Aan k,5 g van deze verbinding in 50 x1 tetrahydrofuran werd 2,1T g kaliumhydroxyde in 15 ml water toegevoegd. Het mengsel werd ge-_ durende 12 uur geroerd en het oplosmiddel onder verlaagde druk 20 verwijderd. Het residu werd verdund met 35 ml water en de waterige oplossing met ether geëxtraheerd. De waterige oplossing werd aangezuurd met 6U chloorwaterstofzuur ter neerslaan van 2-(ïï-difenylhydantoine)azijnsuur.

Aan een oplossing van 1,25 g van deze verbin-25 ding met 0,500 g H-hydroxysuccinimide in 5 ml ^0/£fs tetrahydrofuran in dimethylformamide werd 0,906 g dicyclohexylcarbodiïmide toegevoegd en het reactiemengsel gekoeld. Ha roeren gedurende 3 uur bij kamertemperatuur werd het dicyclohexylureum afgefiltreerd en aan het filtraat 1,09 g H-glycyl-9-amino-3-thia-1-nonanol-30 hydrochloride en 0,U1 g triëthylamine toegevoegd. Het mengsel werd gedurende 12 uur bij kamertemperatuur geroerd en daarna verdeeld tussen methyleenchloride en een verzadigde natriumchloride-' oplossing. De organische laag werd gewassen, gedroogd en het oplosmiddel verdampt ter levering van een olie. Chromatografie over 8000698 36 silicagel leverde 12-[2-(N-difenylhydantoïnyl)aceetamido]-11-oxo- 10-aza-3-thia-1-dodecanol met de structuur volgens formule 50 van het-formuleblad. Deze verbinding werd omgezet met natrium-Q-ethylmethylfosfonothioaat volgens eerder in dit voorbeeld besehre-. 5 ven methoden waarbij O-ethyl-S-[12-[2-(N-difenylhydantoïnyl)ac eet-amido]-11-oxo-10-aza-3-thiadodecyl]methyl fosfonothioaat werd verkregen met de structuur volgens formule 8 van het formuleblad.

Een oplossing van 0,512 g van dit materiaal en 0,110 g dimethylsulfaat in 1 ml tetrahydrofuran werd bij 65 - 70°C 10 gedurende 6 uur onder een inerte atmosfeer verhit. Het oplosmiddel werd bij verlaagde druk. verwijderd. Het residu werd opgenomen in chloroform en een neerslag werd verkregen door toevoeging van ethylether waarbij 0-ethyl-S-[12-[2-(N-difenylhydantoïnyl)-aceetamido]-11-oxo-10-aza-3-thiadodecylJmethylfosfonothioaat me-15 thylsulfaat werd verkregen met formule 9 van het formuleblad.

Verbindingen 8 en 9 hebben tweede orde snelheids- constanten voor de remming van acetylcholinesterase als bepaald

5 -I

volgens eerder beschreven methoden van 6,8 x 10^ liter mol min 9 —1 -1 en 1,U x 10 liter mol min . Deze remming wordt gemoduleerd 20 door dilantine-antilichaam. Een typerende standaardkromme in buffer voor verbinding 9 is als volgt:

TABEL P

Dilantine conc. mAd/5 min mol/liter _ 0 83,5 25 10“7 7^,1 10“6 62,5 10”5 kj,2

Voorbeeld VIII

Met de procedures van voorbeeld VII onder toepas-30 sing van ethyl-^-broombutyraat werd (N-difenylhydantoïnyl)boter- zuur verkregen. Smeltpunt 1^7 - 1^8°C.

De N-hydroxy-5-norborneen-2,3-dicarboxyimide-ester van N-carbobenzyloxy-S-alanine [Chem. Pharm. Buil., 22, 1857 8000698 37 (197*0], (15,88 g),werd gecondenseerd met 5 g 5-amino-3-thia-1-pen-tanol onder toepassing van de eerder beschreven procedures, -waarbij 9-benzyloxycarDamide-7-oxo-6-aza-3-thia-1-nonanol met een smeltpunt van 99 - 101°C werd verkregen. Hydrogenering van 5 dit materiaal leverde 9-amino-7-oxo-6-aza-3-thia-1-nonanol-hydrochloride: Hei. hh2-ch2-ch2-go-m-ch2-ch2-s-ch2-oh .

Dit materiaal werd gecondenseerd met U—IT— (1T— difenylhydantoïnyl) boterzuur volgens eerder beschreven technieken en het produkt omgezet met natrium-O-ethylmethylfosfonothioaat 10 waarbij een conjugaat volgens formule 10 van het formuleblad werd verkregen. Conjugaat 10 heeft een tweede orde snelheidscon- g stante voor de remming van acetylcholinesterase van 2,2 x 10 li- 1-1 . ' . .

ter mol” min . Deze remming wordt gemoduleerd m aanwezigheid van dilantine-antili chaam. Een standaardkromme kan worden gepro-15 duceerd om de bepaling van dilantine in serum-monsters mogelijk te maken.

Voorbeeld IX

Aan 20k mg 0-ethyl-S-[5-(t-butoxycarbonylamino)- 3-thiapentyl]-methylfosfonothioaat werd 20 ml 50%'s methyleen-20 chloride-trifluorazijnzuur toegevoegd en het mengsel bij kamertemperatuur gedurende een uur geroerd. Het oplosmiddel werd verdampt en een tolueenazeotroop toegepast ter verwijdering van rest trifluorazijnzuur. Het residu werd opgelost in 2,0 ml dimethyl-formamide en 83 microliter triëthylamine, 1 h-0 mg 6-(3-theofylline)-25 hexaanzuur, bereid volgens de methode van ¥. Traube, Ber., 36, 3035 (1900), 1Uo mg hydroxybenztriazool, 113 mg dicyclohexylcar-bodiïmide en 1 ml dimethylformamide werden toegevoégd. Het reac-tiemengsel werd bij kamertemperatuur gedurende 6 uur geroerd en het oplosmiddel door verdamping bij verlaagde druk verwijderd.

30 Het residu werd opgelost in methyleenchloride, gewassen met na-triumcarbonaat, verzadigd natriumchloride, en gedroogd met anhy-drisch magnesiumsulfaat. Het magnesiumsulfaat werd door filtratie verwijderd en het oplosmiddel werd door verdamping verwijderd. Het residu werd gezuiverd door chromatografie over silicagel met . ·» 8000698 38 behulp van 10$'s methanol in methyleenehloride als eluent -waarbij U- [2-[2-(ethoxymethylfosfinythio)ethylthio]ethyl]-1-methyl-2,6-dioxo-1 ,2,3,6-tetrahydro-7H-purine-3-hexanamide werd verkregen met een smeltpunt van 103 - 106°C, met de formule 51 van 5 het formuleblad.

Deze verbinding heeft een tweede orde snelheids-constante voor het remmen van acetylcholinesterase van 5,5 x 10° liter mol min . Deze remming wordt gemoduleerd door theofylli-ne antilichaam. Deze verbinding wordt toegepast ter bepaling van 10 theofylline in bloedserum volgens eerder beschreven methoden.

« '8 0 0 0 598

Claims (25)

1. Werkwij ze voor het "bepalen van liganden in proefmonsters omvattende het met het proefmonster mengen van een ligandanaloog-onomkeerbaar enzyminhibitorconjugaat en een bindings-proteïne dat aan het ligand en het ligandanaloog-onomkeerbaar en-5 zyminhibitorconjugaat kan worden gebonden, waarbij de hoeveelheid -ligandanaloog-onomkeerbaar enzyminhibitor c onjugaat gebonden door het bindingsproteïne afhankelijk is van de hoeveelheid ligand in het proefmonster, welk bindingsproteïne de onomkeerbare enzym-inhibitor wanneer gebonden aan het ligandanalooggedeelte van het 10 conjngaat inactiveert; het inmengen van een enzym dat onomkeerbaar is geremd door het ligandanaloog-onomkeerbaar enzyminhibi-torconjugaat niet gebonden door het bindingsproteïne; en het vermengen van- substraat met het enzym en het volgen van de enzym-substraat-reactie.

2. Werkwij ze volgens eonclus e 1, met het kenmerk, dat het enzym acetylcholinesterase en de onomkeerbare enzyminhi-bitor een organofosforenzyminhihitor is die in reactie treedt met acetylcholinesterase onder vorming van covalente bindingen.

3. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, 20 dat het serummonster wordt behandeld ter inac'tivering of verwijdering van serumcholinesterase. 1+. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat het enzymsubstraat acetylthiocholine is en de enzymsub straat-reactie wordt gevolgd door spectrofotometrïsche meting van de reac-25 tie van thiocholine met 5,5'-dithiobis (2-nitrobenzoëzuur).

5. Analytisch reagens voor het bepalen van liganden in proefmonsters omvattende ligandanaloog-onomkeerbaar enzyminhibit orconjugaat.

6. Reagens volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat 30 de onomkeerbare enzyminhibitor een onomkeerbare organofosfor- enzyminhibitor van acetylcholinesterase is. 8000398 ho

7. Reagens volgens conclusie 5, met de formule Rf-P(=OA(-OR',)-S-CH2-CH2-B'-(CH2)n-m-C(=0)-hapteen, waarin n 2 - 8 is en E' en R" alleylgr o epen met 1-10 koolstof atomen voorstellen, terwijl B* -S is of het sulfoniumzout ervan.

8. Verbinding volgens conclusie 7, met het kenmerk, dat R' en R" een alkylgroep met 1 - h koolstofatomen zijn en n 2 - 6 is.

9· Reagens met de formule 31, waarin R'1' een alkyl groep met 1-10 koolstofatomen en n 2 - 8 is, waarbij L een bio-10 logisch verenigbaar tegenion is.

10. Reagens volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat deze bestaat uit de verbinding volgens formule 11.

11. Reagens volgens conclusie 5, met het kenmerk,· dat deze bestaat uit verbinding volgens formule 12.

12. Reagens volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat deze bestaat uit verbinding volgens formule 13.

13. Reagens volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat deze bestaat uit verbinding volgens formule 1U. 1^. Reagens volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat 20 deze bestaat uit een verbinding volgens formule 15.

15· Reagens volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat deze bestaat uit een verbinding volgens formule 16.

16. Reagens volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat deze bestaat uit een verbinding volgens formule 17. 25 17·. Reagens volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat deze bestaat uit een verbinding volgens formule 18.

18. Reagens volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat deze bestaat uit een verbinding volgens formule 19.

19· Reagens volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat 30 deze bestaat uit een verbinding volgens formule 20.

20. Reagens volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat deze bestaat uit een verbinding volgens formule 21.

21. Reagens volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat deze bestaat uit een verbinding volgens formule 22. 8000698 in

22. Reagens volgens conclusie 5» met het kenmerk, dat deze bestaat uit een verbinding volgens formule 23*

23. Reagens volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat deze bestaat uit een verbinding volgens formule 2b. 5 2b. Reagens volgens conclusie 5, met het kenmerk, 'dat deze bestaat uit een verbinding volgens formule 25.

25. Reagens volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat deze bestaat uit een verbinding volgens formule 26.

26. R eagens volgens conclusie 5, met het kenmerk, 10 dat deze bestaat uit een verbinding volgens formule 27·

27. Reagens volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat deze bestaat uit een verbinding volgens formule 28.

28. Reagens volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat deze bestaat uit een verbinding volgens formule 29.

29. Reagens volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat deze bestaat uit een verbinding volgens formule 5. 8000698