SE448259B - Forfarande for bestemning av ligander i testprover och analytiskt reagens dertill - Google Patents

Description

' ie»_såsom PGE, PGF¿ PGA;_ i¿sàsom indïkatorenz&mer använda vid testet eller inhibítorer för fantikroppsbildninglí Sådana avlägsnas lämpligen genom jonbytarë íl44sr2s9relenl¿ ,írreversíbelt ínhineras av det av bindningsproteinet obundna ¶konjugatetiaV_ligandanalog och irreversíbel enzyminhibitor; och att man inblandarísubstrar till enzymer och moniterar enzym- substratreaktíonen, varvid enzymet är acetylkolinesteras och att 'den irreversibla enzyminhíbitorn år en organofosforenzyminhibi- tor, som reagerar med aeetylkolínesieras till bildning av kova- lenta bindningar. Uppfinningen innefattar även ett analytiskt -reagens för beStämning.av_ligander i testprover och övriga kän- inetecken hos förfarandet ooh reagensef framgår av bilagda patent- krav¿*Förfarandet othïreagenaet enligt föreliggande uppfinning är speciellfjanvåndbara-vid bestämning av läkemedel, hormoner ooh lik- nande.f rDetaljerad beskrivning av uppfinningen :Föreliggande uppfinning-avšer ett förfarande och reagens form -bestämning-av ligander i biologiska fluida, såsom serum, plasma; P spinalvätska, amnionvätska och urin./ de _ d Den vid föreliggande uppfinning använda uttrycket ligandr aveer haptener¿ polypefitider, proteiner ooh glykoproteiner med molekylvikter i allmänhet understígande l50;OOOL l ifl'Haoteher är profieinfria ämnen, vanligen av låg molekyl- vikfi, vilka ej inducerar anfiikroppsbildning_när de injiceras in * ett_djur men är reaktiva_gentemot antikroppar,* Antikroppar mot: hapten bildas genom-att man först konjugerar'haptenet till ett protein och injicerar konjugatprodukten på efit däggdjur eller enf; människa. *Bildade antikroppar isoleras genomïkonventionell teknik för antikroppsísolering., För föreliggande uppfinnings ändamål bör antikropparna vara-i huvudsak fria från serumproteinmaterial, .._...~v.u.uu..l.a... . ~ kromatografi på en anjonbytarkolonn eller annan lämplig protein- oseparationsteknik.

¶ Representativaíligander som kan bestämmas genom för- faranden enligt föreliggande uppfinning är steroider, såsom estron,*n estradíol,_korbisol,_teetoàkeron, progesteron,Jkenodeoxikolinsyra,r¶5 e>digoXin, kolinsyra,ddeoxikolinsyra,flitokolinsyror och ester- och amidderiyat därav; 'vitaminerg såsom vitamin B-12, folinsyra, etyrokin, trijodtyronín, histamin, serotonin;.prostaglandiner, ¶ i i adrenalin, noradrenalin och läkemedel, såsom opiater,~teofyllin, dilantin;»1barbituater§ såsom fenobarbitol .- fl-av-u- _ .p 'Il e 15 _20 » iso' ssí n Jcqättiksyfaaerivatï WN-bromeuccinimid~derivab n 3? i n 448 259 ¶¶,0ch.deriVafi därav och karbamazepiner, aminoglykosidantibiotika, : såsom gentimycin och fiobramycin:_ ' ' m Å RenresentativaÉpelypeptider och glykoproteiner som kan bestämmas genem förfaranden enligt föreliggande uppfinning är Ieinsulin, piáttfaktófiä och polypepfiid-determinanter av stora iantigener.

Ligandanalçger är funktionellå eller funktionaliserade x*ligander_lämpiiga fö? konju$eringlmed irreversibla enzyminhibi- torer. Syror§Westràr,iamider, aminer, hydpoxi, išocyanat, iso- tiocyenab är lämpliga funktionella grupper. _ l =_'Representátiva enzymer och irreversibla_enzyminhibitører 7 fanvändbara för utförandet av föreliggande uppfinning är uppställda ¿i tabell I.~~ i - n - TAeELL.I¶i Ifreversibel inhibitbr"' e i; Enzymer Organofosfattriestrar e ¶ " Trypsin Organofosfonatdiestrar ^ Acetylkolinesteras Organofosfotioater Butyrokolinesteras i Kymotrypsin Trombin Elastas Adenøsindeaminas Alkylsulfonater _. *Acetylkolinesteras Alkylisocyanater._ _ e e _ Elastas ii e * e e ' 2 nTrypsin ¶ mm e Kymotrypsin p-klormerkuribensoatderivat e ¶> Papain * W f i -' e Alkoholdehydrogena Kymopapain eKlostridiopeptidas'B Adenosindeaminas Lipas _ B-amalyas Pepsin _ Glyceraldehyd-3-fosfat n deh. e Luciferas Aspartataminotransferas Alaninaminotransferas Hexokinas Isubstrazepoxíder in'“ ,n I i e_ e Pepsin _6-diaz0J5-oxó-L-norleucin-derïva; Glutaminas A Syradeoxiribonukieas II fAlkoholdehydrogenas iSyradeoxiribonukleas II Dextranas ! soj 'ss fd 44s~259 '-torer.rVFöredragnaíorganofosforföreningar användbara för konju- kan representeras med formeln: »vari X och Y representerar funktionella grupper, såsom fOH, ' C02H (estrar), -CO-CHëZ, vari Z är (I, Cl, Br): Ä representerar ty.*Irreversibla»organofosforenzyminhibitorer är föredragna. r_J.Am¿cnemrsoç;,i8o, 45§-(i958)§ J.Am,çhem¿soe., 82, 596 (1960) - och Beo;Irav.Chim;, 86,Ü599 (l967) beskriver flera klasser av organofosforföreningar; som är lämphga irreversibla enzyminhibi- prgering till ligandanaloger kan representeras med följande formel: n _O _ , '”v' I! e K ' ' ., _ , _ K , _ s n BI-ï-SfCHQ-fCHQ-fß- (Cflgën-'X V _ f I _ I v R2_ _- ivari“B representerar kväve eller svavel eller deras alkylerade salter; _nJär 1510, företrädesvis 2-8;fl X representerar en funk: ftionell grupp; såsom hydrpxíQiamino,.karboXi, a-halometylkarboxí, -vari halo är jod, klor eller brom; Rl och H2 representerar en -alkylradikal med l-lO'kolatomer eller alkoxi med l-10 kolatomer.

Alkylradikalen kan vara substituerad med nitro, halo, oyano, bensyl eller liknande substituenter.- Fackmän inom organisk kemi inser lätt en mångfald ekvivalenta strukturer för tillämpning av' föreliggande uppfinning; p p ' É I i En annan föredragen irreversibel enzyminhibitorradikal I r_ 9' ap” ajflfäßf apps RÅ '"vari RB är_samma som tidigare beskrivits för Rl och R2 och RA -representerar vanliga organiska lämnande grupper, såsom p-nitroé fenyl, hydroxikinolyl, såväl som alkyl, halo och cyansubstituerade kinolyler,_ i l ° 7 ' _ 7 7 I Z i Irreversibia enzyminhibitorer är bundna till iigandana- loger genom konventionella bifunktionella bryggbildande grupper !r med den allmänna formeln: f ' ' ' " V X-Å-Y",) -NH2; -(CH2)n-, där n är 3-20.ZtAlkylenkedjan kan vara avbruten med en eller flera tvàvärda grupper, såsom ¿O-, -CO-, :S-, -NH-, ¿QONH-, r-CH=CH¿¿ -CšC-,_fenylen och sfilfonium ooh ammoniumsalter. Alkylen- kedjan kan vara substituerad med vanliga substituenter, såsom _ f ff 7”halo (I, Br; Cl, F);ihydroxi, eyano, fenyl, amino, karboxi, organokarboxiestrar, alkyl med lf? kolatomer, alkoxi med l-5 kol- h.

J* ' zio , l~3ol ._35, 448 259 atemef.:lXÅAeY kan utgöras ev en liten polypeptid-eller poly- saekaridKedje._ X¥A-YQemsättes sålunda genom konvenfiionell teknik med en inreversibellenzymínhibítor dch Iigandanalóg till bildning 7 *av amid-¿ ester-,lamin~, imin-,lsulfonamid~, tioester-, fosfat-, tiofqsfan--och liknande bindningar mellan den.bryggb11dande W'gruppenroch den írreversiblaïenzyminhibitorn Och-ligandanalogen; lI allmänhet är en sïdokedja byggt pà en ligand eller l ligandanalbg och pñQdukten“omsättes med en irreversibel enzym- inhlbítef som är lämpligfi fünktionaliserad för reaktion med sido- kedjan på ligándanalogen} eAlt¿ kan en sidokedja inbyggas på den l írreversibla enzymínhibitorn Och qmsättas med en lämplig ligand eller ligàndanalog¿; Föreningar med formeln irreversibel enzym- einhibitor_f A å ligandanalogfär sålunda lämpliga reagens.

,FÖïjande strnkturer illustrerar kenjugat enligt före- * liggande uppfinning; %; %flif44sí259%í¿¶l" . Ty§oxin¶1 * -íf' ¶¿_ 7 ' " _ fw ?~g§ 7-1 _ I I ' _ * ¶ í . ' 'I°“á"š*š'cflz*cf*z'š'”HQ(NflïïHffiz-'Qšæ;°H_ I _ 1Kdïinsy§a :1¶j- Dilanfin ' Teofïllin » , |3f_¶ :QcH2§§3Z}:j H3 ¶_¶"C33 OSQB CH3_fܧCH2çH2f$ïçH27CHåfNH“°°(C32)3'N§f oçH2cH3 íf 1 ¶ 3, ¶ H0 . ' » .f ~¶ . . Ä- ¶ qçH3fï-sfcH2c§2f:f(cH2)6-Nflf -CH ocnzcfl ¶v33 2 zug-E-CH 3 Digoxih _ VI+VV , CÉ3_Pf§fCH2Cfi2*ï-(CH2Ä6'NH-CfQf _ ">CH CH CH '2~.3 3 ¶ íí ¶ ¶¶-_^ íífl ¶ f R' ï ' g o 'o\\ NfHß ¶ 2-NHfÉ4fcH2)5~7fif 0 __CH3;ï-SfçH2QH2fSfCH2CH V'OçH2FH *m 3 .w 533 ¶ Äï . ¶ .~_ O W í ¶ ¶ ~co;-N_r;-(cH-2V) .flflvufl-fçcflgs-ofïàv-o N Q-cH-2-cH3 3 í Lcn 3 , 95? _ f ' Digoxin o í í .__g=-Q-iCH -CH ¶ 2 3 CZHS à n v-»yfm 42L3.'2¿59L”“ ¶_+' íí 8 ' 'fiñlinsïra - ¿ í " H N I ca í oofi ¿ . H2N--coNH VH f Hzu* omm ¿ í H92". _ çnzna-v-conxfn N ¶ I _oNH(cH_,_,)¿.s/\/s-í-oc2n5 H3¶ MefiÖtrëxåfi _ {¶ (IHZ) 2 } om (C112 _) ¿s//\/is- -oczfi H3 'KórtisolVf-~ % 44s259 ¶' Üalpr$ífiɧra _ A í ' í ' 021%; , _ :fQfij-CHIZCH2CHZNHïO . } f 53112 ¶ j IA % . %. % »%«J$%*% ä í É it: y H; VCH 3.: m. 7 ¿SülfQlitoKo1ylÅ__V¿ ¶ ' ïglyßinx, -' ' 'CH _ ; OHIÉE-l-cnzf ”ri-cm (C112) G-s- (C112) zfsf -kcn3 H *_94 9 _ --_ Ä , - -IÜ-:fl- 4 4ß > 2 ß 9 i Gentamicin¿7í:¶_* v(bunden till énbamíncgrüfiß . ;' . Å* _» 33/ genfiamigiffi f '_ '_ " °COCH2ç§H_ CVONHCH2CH 2 »_ zscrïzcníz-s Tóbrah2cín ,:Ŷ¶ _"(áminogrupp åš tofifàmyQin¶)+ç0 ¶ ¶_ . .¶._ _ ¶ ¶CH - _-_| .2 i i *CONHCHZQEI-ZVSCHZCHZSÉ-CHS ç2Hs , 4 _ 4 _ V i I I i > , V V V ' I V I i cvrgaml¶n BRN). -czçf- (C212) sïs/ys-F-oczfiis = Å í í í í _ i 0:13 TS ' _ _ ¶ _ ¶ 1 l ¶ 'V 3-.IH-P- -, +¶-- ¶ _ .H1ï1 í í .OH _-_c;n2-_ Hv-cufli- (c32)j6_-f-?(.cr12) É-s-ïf-çnï) I ¶ ¶ } _ , .¶ ¶ ¶ ¶}} .¶ : í Fso '00 I - li å czHs ¶ u» ï n . \n~' i iofl i ao i aè5_ 50 fïg fligafidji .> _under.användning av kinetisk liiite ¿L4 4 s. 2.519 i :l}1"Bindningsproteineraärlantikroppar_eller andra specifika iÄabindningSproteiner¿^såSomityroidbindande globulin, som_är bind-I iågbart till den ligand¿som{eKall bestämmas och ligandanalogenheten, a~i konjugatet av ligandanalog och irrevereibel enzyminhibitor. *_Näribindningsproteinet är bundet.till,ligandanalogen inaktiveraa .den irreversibla enzyminhibitorn. l t l 7 De vid föreliggande uppfinning involverade reaktionerna i“kan.illuetreras pà följande sätt:-”K” . K - ' .

L +->--- L '+__L ._ . _. ~¶ _ ïêa¿_ _~_ ; . _ : LA: -ÄÅ LAI + LA: -» LAI + Enz '--à I Enzel-+_X"< 7 LA: >--f +_Enz -g-ànnnz-I + X k . _ l.(bindningSprotein); LAI (kbnjugat av irre- versibel enzyninnibitor_och Iigandanalog);: Enz (ensym), Enz -I l e?(inaktiverat enzym); iX (reaktionsbiprodukt); k2}> kå och i I de jlesta fallen reduceras k , _ 2 till att vara nästan_noll; dvs . bindningsproteinet inaktiverarHLAI.

¶ ¶ "Reaktionen kan moniteras pà kinetisk väg eller genom änd- punktsbestämningci Sålunda följes-reaktionen l i i i ° = - d E . _ ~ i ---dtnz_e= ka /LAI/ /Enz/ _ _ > 'teknik.A Genom användning av ettf överskott av enzym och genom att låta reaktionen gå till 99% 'afuiištanaign-ef; är föreliggande system- fördelaktigt för änapunkts- bestämningsteknik.i_ _ __ _ e e . jßöredragnafkonjugat för användning i förening med acetyl- l kolinesteras (E.C.3.l.l.7) är föreningar med formeln: _ _ 0~. _ 7. _ ' H . _ i } .Rffllà-.s-CHB-cng-B' 40:12 hl-Nn-cfzhapten i- vari R' can R" är-alkyl med l-lO kolatomer, n är 2-8 och B' är ¿S- eller sulfoniumsalter därav. aHaptenet.är karboxylsyrahaltigt 7haptenÜeller hapten modifierat för innehållande av en karboxyl- Alsyra, vi1xa_báda näri kallas ligandanaloger. Uppfinningen inne- fattar även motsvarande metylsulfoniumsalter, 'speeiellt föredragna konjugat är sådana, vari R' och R" e.representerar"a1kyl ned_l-Ä kolatomer och n är 2-6 och innefattar fsulfoninmsalterna.därav. Speciellt föredragna föreningar har formelnzl' dy i l , 10" l5__ 2o_i i 7 40- >_sásóm är illa; _óehlligandanaloger§l i§ibelïinhibitor_(LAI) konkurrerar sålunda med bindningsproteinet i(>4ff+f)..aßifiuningsproçeinçu somfär«bundet_t111 (LAI) inakti-__ _-448e2s9neÜ« lell2 n-Ö fg1el=e;*ni e0~i e - nf , i ' “a , ai oH3,§-s¿cH2-cH2-a-(cH2)6-Nflfc-napten -O_R_g| '_ -. _ - _ ' . vari B" ar etyl ellen n-butyl och motsvarande'sulfoninmsalter, i 'o 'i ', 'çflš ' lig g . _ _eu -, 1 e _ i e - :CH3_š':;CH2'ç32f§f(çH2)nfNHfC'haP“?“ _ iivari motjpnen är jedid ellefemetylsnlfaf eller liknande. De inom kemibekniken förfafna_inSer ekvivalens-oçh utbyte mot en mångfald anjoner. Föreningar¿evari n är 2-6 är även föredragna. i__ 4 Andra föreningar_föredragna för utförande av föreliggande uppfinning är;_ i_ ffíhli-'Jag _f i___i_ ' ¿_\N+ 'Q-_-Q+(cH2)¿-NH-$j '_åH3 'e ' ' wgeo _ ; 30803 vari R“' är alkyl med 1-lO kolatomer¿ företkädesvis l-4¿ och n nmq ioch _ 7 _ _ alla _ . _ 7 1 K ípï _f 0 “ , We, e, ' _ V' _ _' “Nf-O-*lf-O- (Cflz) nfNHe-CÛ- nfbïšbfi* (hapten) i ,+e e -o e e e e 0 .

, CH . f å!!! L 7_ > , ' I i i vari R"f är alkyl med 1-10 kolatomer, företrädesvia l-4, och nuar 2-8, och L är en biologiskt kombinerbar motjon; såsom metylsulfat, i , jodid och liknande. _ _ i Föreliggande uppfinning innefattar sålunda analytiska I reagens innehållande konjugat av irreyersibla enzyminhibitorerg ___ g_Tillämpning'av föreliggande uppfinning illustreras med eföljandelschema:'_ L * f ii_ " _ g iii e i' e " 2Le+°2LAie+_2.>++- f-4>eÉL >--4'+iLAI}--4iL + LAIe; Liganden (L) pch kenäugatef av ligandanalbg oéh irrever-I' :varar inhibitorn unaçf det at; det fria LA: är tillgängligt för att.irreversibelteinnibera enzymet;e Ju större mäpga ligana som är närvarande i testprovet desto lägreiärlmängden LAI_bundet-till_“ n» .aw-.n-vv-n m- ». i .~...- ,,..vw.-umß.-.,.,...~l . är; i i l 443 259m 8 'bindninåsproteinetjoch därför_kommer mer enzym att inhiberas av lifritt LAItí Det olnniberade enzymet reagerar med ett lämpligt -lO_ el; i V20' f Q Äód 'l»subStrat Qch.enzymsetstratreaktionen moniteras.

Kolqrimetrisk analys utföres lämpligen i en bikromatisk i spektrofotometer som beskrivas i amerikanska patenten 5 748 044, l3~83l;6l8, l3a855>30#, -5 9oo 289, 5 817 425.o@n 3 811 780.

' Y Testproverna kan förbehandlas för avlägsnande eller in- lïaktivering av störande protein. -Störande proteiner kan avlägsnas 'genom,utfällning med organiska lösningsmedel, såsom etanol, metanol eller liknandel Värmebehandling vid basiska pH är även ett effektivt sätt att eliminera störande proteiner. Det är ofta önskvärt att ytterligare behandla testprover med stark syra eller tbas_författ avskilja haptenet som.skall testas från protein. iI vissa fall är det endast nödvändigt_att specifikt inaktivera störande proteiner.f EX.vis serumkolinesteras kan specifikt inhiberas med specifika inhibitorer, som har selektiv aktivitet gentemot serumpseudokolinesteras.- Föreningar med sådan aktivitet* är-orfenidrín, N-metylforgenadrin, fenatiaziner, bis4ß-metyl- -kolinester av ftalsyra, kinidin och-artan och dess kvaternära 'alkylsalter. t'rypískt kan digoxin 1 serum behandlat med N-metylor- afenadrin bestämmas under användning av kinetiskt analysförfarande~ och en“förening med formeln: 8 ' 8 seo"CH3'P'$fC52'CH2'f'fçH2)6'NH' "a" _ o-caz-QH3 f o l d 8 i i al" kan användas som konjugat av irreversibel enzyminhibitor och ligand för att konkurrera med digóxinantikropp med digoxin i testprovet. Efter en kort inkubationsperiod tillsättes acetyl- k0lineStGPaS-' Det Oinhiberade enzymet uppmätes genom reaktionen - med aqetyltlotolin :pm frigör tlotolin. Det frigjorda tiotollnet nppmätesdkolorimetriskt genom ytterligare reaktion med 5,5'- ' ditiobisf(2-nítrobensoesyra)- Denna reaktion moniteras vid 412 nm. fstandards användes för upprättande av en standardkurva, ' från vilken de okända värdena_bestämmes, 'fifc44si259c§i i 14¿tfl“ ffiörfaranden och reagens enligt foreliggande uppfinning: K- kan även användas för bestämning av bindningsproteiner;'såsom _ { antikroppar.f Vid denna teknik konjugeras~ligandanalogbindningsf ig7.partnern för bindningsproteinet som skall bestämmas till en irre-l lO fiog 40 ' gatet är specifikt bindbar till det bindningsprotein som skall versibel_enzyminhibitor._-Bindningsproteiner*i testprover be- dr estämmes genom inblandning av ett konjugat av ligandanalog och irreversibel'enzyminhibitor, vari ligandanalogenheten av konju- f tbestämmas; och sedan inblandas ett enzym som irreversibelt inhi-t gberas av den irreversibla_inhibitorenheten av konjugatet, suhstrat i sättes till_enZymet och reaktionen mpniteras. .Eftersom bindnings- proteinet inaktiverar den irreversibla enzyminhibitorn är enzymf_ aaktiviteten större ju större mängden av bindningsprotein är.-_ i i:iNedan angivna exempel är.avsedda att illustrera upp- finningen och icke att begränsa densamma. 7 “ Exemgel I 1 1 ~ g »-¶ll en lösning av 6-aminokapronsyra (T¿8 g) och 5,0 g cnatriumvätekarbonat ii5O ml vatten sattes genom droppvis tillsats 16 g N-bensyloxikarbonyloxisuccinimid i 60 ml tetrahydrofuran; i A Blandningen omröres i l timmevid rumstemperatur, varefter tetrahvdrofuranet_avlägsnas vid reducerat tryck. Återstoden nu surgöres till pH 3 och extraheras med metylenklorid och torkas över vattenfritt*magnesiumsulfat._tMagnesiumsulfatet_avlägsnas__ genom filtrering och lösningsmedlet avlägsnas genom avdrivning§ gÃterkristallisation ur etylacetat/hexan ger N-bensyloxikarbonyl- 6-aminokapronsyra. dj i 7 i g i Till en lösning av 4,09 g av denna förening i 40 ml dioxan sättes É,5 g N-hydroxisuccinimid och 4;l2 g dicyklohexylkarbo~ - diimid; iYtterligaretlO ml dioxan användes för att underlätta .reagensöverföring§ iBlandningen'omröres över natten vid rums- tm1peratur. Blandningen filtreras och 2,06 g 5-aminopentanol i ml vatten sattes till filtratet; aheaktionsblandningen omröres irl timme, koncentreras vid reducerat tryck och återstoden extra- “heras med metylenkloridil Extraktet tvättas med vatten och konc.c natriumkloridlösning. Lösningen torkas=över vattenfritt magne-f isiumsulfat, Magnesiumsulfatet avlägsnas genom filtrering och ilösningsmedlet avlägsnas genom avdrivning vid reducerat tryck. 'Återstoden kristalliseras två ggr ur etylacetat till bildning ävr_ N-(5-hvdroxipentyl)-öéhensyloxikarbonvlaminohexanamid, smp. .92,5+949c,ii.i “ e e i i E» Ålšodtu du f44s52s9 ï Detta material; 4;Ö g, reduceras med Pd/Ö i etanol under - lågt vätetryck. >Katalysatorn avlägsnas genom filtrering och -=[Élösfiiagsmealat avdrlyas-unaër reducera: tryck till bildning av u_ Ne(5¥hydroxipentvl)Ä6-aminohexanamid.- _ Till en lösning av 12-acetyloxi-5-klorformyloxi-l4- =_ hydrokikard-20(22)¿enolidderivat av digoxigenin (amerikanska apatentet'3 gäl 982) i 40 ml dioxan sättes 575 mg N-hydroxisuccin- "im1d,ífßiandningenfkylee på ett kallt vattenbad och 0,695 ml 'Ä"trietylaminjsättes därtill. *Blandningen omröres vid rumstempe- lot _ 715 ratur i 5 timmar. uBlandningen filtreras och filtratet sättes till enïlösning av 975 mg N-(5-hydroxipentyl)-6-aminohexanamid och ¶ _378 mg natriumvätekarbonat i 20 ml vatten och 10 ml etanol. Efter l timme avdrivesÄlösningsmedlet\ád reducerat tryck och återstoden uupplöses i metylenklorid.llMetylenkloridlösningen tvättas med vatten, mättad natriumkloridlösning och torkas över vattenfritt ¶magnesiumsulfat. Magnesiumsulfatet avlägsnas genom filtrering uÜ7 och lösningsmedlet genom avdrivning vid reducerat tryck. lÅter- 2oÜ' 25 f, _.

Bof ¿ aan 50 ml vatten síllaäfies àtföljt av tillsats av lo ml trietylf aminlf Reaktioneblandníngen_får stå vid rumstemperatur över natten. 55 “ *jufoa k 2o(a2)-ënolld. stoden kromatograferas på silikagel (200 g). cEluering med 5~l5% metanol i metylenklorid ger l2=acetyl- oxi-Be/N=(12-hydroxi-64oxo-7-azadodekyl)karbamoyloxi/#14-hydroxi- kafd42o(22)-enolla med formein=fa 5 5 ' ï » _no-(cg2)5-Necflçnz)5-N-o-o 5 ' 5 Lo ¿ 5 o_ ” lOvanštående föreninë, 2¿7O g, upplöses i 50 ml metanol Lösningsmedlet avdrives vid reducerat tryck och den erhållna ”återstoden kromatograferas på en kolonn av 150 g silikagel och eluerae med 2 liter lO%-metanol-metylenklorid till bildning avel Ef/Nfl2-hydroxl-6~oXo-7-azadQdekyl/karbamoyloxi/~l4-hydroxíkard- /§'En'lögping av 170 mg_trietylammoniumetyl-T-kinolylfosfat 5 _i 10 ml vatten ledes genom 15 ml sulfonsyraharte i pyridinium- ¶ form. 'Lösningen koncentreras vid reducerat tryck och torrt '10 šo 55 40 ltÜl443l259 gel _ pyridin avdrlves från återstoden, -Till dehna återstod sättas '¿t25§1mg*3§2N+(l2-hydrofiífößoxo-7-azgqodékyl)karbamoy1oxí/Äl4- ñydroxikafdäzofizz)-enolío. torrt pyriain avdrives från à:er;¿ l.3todenf3 ggf¿l ÅterstodenÜupplöseä i l,O ml torrt pyridin ßch 145 mg krístallïserad'trisëisopropylbénsensulfonylklorid tillé j sättes.**Rèaktionsblandningen omröres vid rumstemperatür i 15 timmgr. Is tillsättes och efter en halvtimme extraheras blahd- ningen med métylenklofíd.' Metylenkloridlösñingén tvättas med *I o Avatten, mättat natfiumvätekafbonat, mättad natriumklorid och tor- m; ' lkás¶övèfoVattenfritt magnesiumsulfat. _LöSníngsmedlet avdrives__ o“och_toluen'avdriyes flèfa gånger från återstoden för avlägsngnde gy¿pyrídiñet+o_Äterotodép-kromatograféfaslpàlsilikagel_under användning av 5-10% metanol i metylenklorid som elueringsmedel ïfltill bildning av en föréníng med formeln: }¶ ¿_N1 ¿o-f-o-(CH2)5-N-fi~(CH2)5fN-í 1 -V ,,~Vfi OQHZCH3' ", _, _ V in ¶Ovanstâ$nde;föreníñg; 100 mg, och 23 llodimetylsulfat j upplöses i Ö;5O ml aceton och efter 4 timmar tillsättes ytter- _liggre 60/fil dímetylsulfàt i 2 ml aceton och blandningen får stå 7 över nattenf Acetonlösningen.sättes till etyleter varvid bildastot Wen vit fällñíng, som.utgöres av en förening med fcrmeln: , /' 1' V ' _' , * >N W _0-š~07(C3¿)5-N-%-(cfizäsggfílot 0 “ “ ,Ot _cH¿çH3ot @~_*,__-~;~«m,, 1 i0'_ .l5 205 305 “ 255 dvid rumstemperatur, vid en koncentration av 2,5 X 10' 117 det 5 -443 259' .Antinrnppsmnanieringfnv“1nniberande aktivitet av förening 1.

En baslösning av förening I (4,6 X lO-3 molar i metanol) Énšspädes zooffaiaigt med pH 7,0 0,1 moinr rnsfntbuffert inne- -ihållande O,l% gelatin. Digoxinantikropp utspädes i fosfat-gela- tinöuffertar såsom anges i tabell I.5 50 mixroliter fosfat-gela- 'tinbuffert, pH 7,0; innehållande angiven koncentration av anti- kropp placeras i provkopparna till en bikromatisk spektrofoto- -'meter (modell ABA-100, reg, varumärke, saluförd av Abbott Labora- tories). Till vardera av dessa 50/ul"sättes 1/ul av baslösningen 7 molar.- av_förening I till en slutkoncentration av 4,5 x 10- Antikropp och förening I (inhibitor) får inkubera i 10-15 min.

Varje prov tillföres l/ul basenzymlösning (9,5 X lQ"9=molar av.E.e1eotricus acetylkolinesteras i pH 7,0 *fosfat-gelatinbuffert)¿ _Den slutliga enzymkoncentrationen är f l,9 x lO'lOvm0lar. Provet utspädes l/26 med.assaybuffert inne- ihållande acetyltiokolin som substrat, 5 X 10' molar och 5,5'- ditiobis-(2-nitrobensoesyra) (DTNB)¿ 1,6 X lO'4 molar i pH 7,0 fosfat-gelatinbuffert.' Förändringen i absorbans med tiden upp- rmätes efter 5 min, i den bikromatiska analysatorn som är försedd men ett 415/550'nm fiiter vid 50°c. " 'ppaesnitnten är följande: TABELL i 0 0 5 0-_aH Å _ lina/5 min.

' Enzym 5 Antikrgppp Förening I Efter Inkubering Tid 041, - 000. i i 00 -lo- al, 45» 1;9 X loflo 0 ' ' Å' [ 0 0,220 0,221 0,222 1,9 X iofto 9'x-10'7”Ü 4,5 X 10'7' 0;161- 0¿157 0,10? “i,9 x 10*1Q I '9 i i0'8 5 4,5 x 10"? 0,089' 0,027 0,005 ' _ 5 4;5 X 10“7 _0,o45 0,015 0,005 1,9_x_10"É9a_ _ 0 -Ovanstående försök upprepas bortsettifràn att digoxin molar tillsättes provkopparna.

På detta sätt visas specifik modulation. 50 l fosfat-gelatin- buffert sättes till en provkopp. Buffertlösningen innehåller enderaf 2,5 x lQf5_molar digoxin eller utgör kontroll. Till prov- koppen sättes en slutlig koncentration av'9 x lO_7 molar digoxin- antikropp.ooh 4,5_x lO_T molar förening I. Dessa lösningar får .inkuberas i 15 min¿, varefter enzymet tillsättes och analys denligt tidigare procedur utföres. _Resultaten är följande: io n 125f Boi 135 40' ål min. bestammes._ _sedan under omröring till varje serumstandard till bildning avg, 1 0 'e $ 01 av en lösning innehållande förening Igi pH 7,0 0¿l molar fosfat? 443 259i~= T elßeo liAä/B min. efter 1nxubat1onsb1andn1ng>0~ .nnzyminnibitcr I Inkubationstia ¿ 1 dig ¿¿ _e ~ 1 o;5f 1-,. 11' 01 , 19' 1 Enzym enbart çk§ntr011)_e1 -1 o,174l. 00,169 00,167 gEnzym + förening I _ _ O,l621 0,057 0,013 Enzym + förening I 0 1 1 W og 1- - Å 1 1 g * e+ antixropp _ 0. ee_1o,16oe ¿ 10,129 0,115 1 1 lEnzym + förening I 0 i j 0. + antikropp + digoxin 0,160' _ g 0,068 0,038 1 0 “ Under användning av ovanstående procedurer med undantag 'för att den slutliga antikroppskoncentrationen i provet är 4;5_x' "? molar beredes olika fosfat-gelatinbuffertlösningar med angiven digoxinkoncentration. Vardera av dessa lösningar ana- lyeeras genom tillsats av antikropp och förening I till lösningeni såsom i den tidigare proceduren, varefter en 2,5 min. inkubations- period får förflyta och den kvarvarande enzymaktiviteten efter _ /u M digoxin _ _ l É aktivitet av enzyg ; o;o62' e101jge 0 065 . o,125f 1 gg 1 , g 65 o,2511gfg , g ~ gg62 01,5 ¿ -e pj- 57 1,0; ,1 = 1 -1 1 36 0 Nornalt humanserum innehållande digoxinkoncentrationer angivna i tabellen nedan undersökas med ovan angiven procedur.7 N,N,N-trimetyl-24(o-metyl-d~fenylbensyloxi)etylammonium- metylsulfat-(N-metylorfenadrin) franställt genom omsättning av N,N-d1mety1eefkc-metyi-Q-fenylbensyioxi)etyiam1n(orfenaar1n) med dimetylsulfat«_ vid lnM koncentration inhiberar denna före- ning mer än 99% av humanserum-kolinesteras_under det att endast %e av kolinesteras från E. electricus ínhiberas, 0 N-etylmaleimid användes för blockering av bakgrunds- 1 sulfhydrylgrüpper i numanserum.- g Sålunda sättes 11 l-koncentreradidigoxinantikropp i pHZ 7;O fosfat4gelatinbuffert innehållande 50mM N-metylorfenadrin till15O)ul av varje serumstandard, och N-etylmaleimid sättes en.arbetskoncentnition av I,6mM. Till serumet sättes även l 1 (in gelatinbuffert.* Den slutliga antikroposkoncentrationen är 8,0 x "? molar och den slutliga koncentrationen av förening I är' (ü V Vi: l 20 ¿5 25o ¿ ~c¶är;föIjand§: lo me ' 19o -'l 448 259 1&;5 X lQ_?, ~Dessá lösningar får_inkuberas_í 12 min., varefter acetylkolinesterasïtillëättesfsåsom tidigare. tEfter 26 min. 7-Äigàngsättes den bikromatiska spektrofotometern och ett prov från l.varje kopp utspätn'26-faldigc med testbuffert innehållande 1,6 xt lO'5 molar DTNB, 5'x lOf4lmolar acetyl=5-metyltiokolinjodid och 1o1mm*N¿mefiyïorfèngar1n-1 pH 7,0 o;1 molar fosfat-gelatinbufferr.

Den slutliga enzymkoncentratïonen är ca 2 X lO"l1'molar och kuvettftemperaturen är 5000. Ändringen i absorbans efter 5 min. 1 Digogin Å Serum ÄXAd/§_min§ c t(/UM) m'o,1 e _ f 'o,o96 e“o,13 en lo,o89»> o o;17 o o oåo¿o85 ¿b;26c A,too““0,o77 o 'o,34 .e ,o 0,075! 0,51 _ o H o,o63 Q,64l r }0;o6o to,85 _ ' l o_o,o47 ." - jKolinsyra; 4,08 g, upplöses i 10 ml torr dimetylformamid Exemgeleïfyl 1 ~ol>l 7 och §,4Ö g ímidazolïtillsättee àtföljt av 3360 g t-butyldimetyl- ailylkIQríd.' Reaktionsblandningen får stå över natten vid rums- .temperaturL' Reaktíonsblandningen hälles i vatten, filtreras och fällningen tvättas med_vatten.¶ Denna fällning upplöses i 30 ml tetrahydrofuran och 5 ml vatten och 2 ml ättiksyra tillsättes. l Efter 6,5 timmar avdrives lösningsmedlet och âteràtoden kromato-l graferas på 200 g šilikagel med 5% metanol i metylenklorid som elueríngsmedel för âstedkommande av Ba-(t-butyldimetylsilyloxi)- eTa,làaèdihydroxi-5ß¿ko1an-24-oinsyra,lsmp. 145,5~148 med följande i struk:urformeI¿ l 55' _40», Z 20 i44s 2597, .“rOvanstàendejförening, 2,092 g, 1,728 g N>(5-hydroxi- a'pentyl)-6faminonexanamid-ochi1,87 g N+etoxikarbony1~2-etoxifl,2- eudinydrokipciin.¿terfiödeskQkades.1ai75 m1 etylaceuat 1 24 timmar.- 151 len kristallin förening.

~Reaktionsblandningen_får stå vid rumstemperatur till bildning av Detta material àterkristalliseras ur ; etyiacetat till bildning av 260 mg ja-(t-buty1dimety1si1y1or;)~ ¶7q,12a:d1nydroxi-N-/12-nydroxi-6-oxo474azadodeky1/kólan-24-amid, smp. 145,5-14800 med följande strukturformel: Én_lösninQ1av 424 mg trietylammoniumetyl-7-kinolylfosfat i i lO ml vatten ledes genom_l5 ml sulfonsyraharts i pyridinium- 20i formen.W Eluatet konoentreras vid reducerat tryck och torrt Till återstoden sättes 72l mg av ovanstående alkohol. iTorrt pyrídin avdrives från återstoden tre gånger. fÅterstoden upplöses i 1,0 ml torrt pyridin avdrives från återstoden två gånger. klørid ni11sättes,r _ _ Reaktionsblandningen omröres vid rumstemperatur i 15 ,pyridin och 364 mg kristallíserad tris-isopropylbensensulfonyl- itimmar{ Is tillsättes och efter en halvtimme_extraheras bland-i ningen med metylenklorid.i Metylenkloridlösningen tvättas med en 7 mättad lösning av natriumvätekarbonat_och en mättad lösning av 7 natriumklorid och torkas över vattenfritt magnesiumsulfat. Lös- ningsmedlet avdrives och toluen avdrives flera gånger från åter- istoden för avlägsnande av pyridin. Återstoden sättes till en kolonn av 50 g silíkagel och kolonnen tvättas med 300 ml 5% metanol-metylenklorid och 1000 ml lO% metanolemetylenklorid.

Lösníngsmedlet avlägsnas för åstadkommande av en förening med formelnši=~ ' Ii ' ü*- e el5¿_ neaof ëà ~ t :ïweee e 21nt% e }n 4118 2:59: o _¶ f ¿ om _ to«cß2-CH3 §¶tU Denne förening, 40 mg üpplöšes i 2 ml aoeton och 0¿lO ml aimety1førmam1@'àtföljt av 40/u1'dimeny1su1fat, Beakfiionsblana- f ningen får stå vid rumstemperatuf_över natten. nAcetonblándningen sättes tili etyletef och blandningen centrifngeras. Fällningen _sönderdela§ med etyleter till bildning av förening II med formeln: tt t tt; t t no CH3 ¶t > _ . CH. =t_ __ . e . ca* e . e '- e -es . - e _ n y É ,te om |mße É ||e t É É e IH *20-11 0113.* "_ 170 “ “ i (en) cnf e »OH- - e 25- :” :P3 3. ¿~ .. t t.-n . liltjšj n 11 :e¿¿e =n:,:. - ~ j.:_ _0= -@-n .N<+ e; t " i' n tofcflz-CH3 \bH3* t n; 1 n~ ' en . e Cflæßæ [:Eörening'ïIïånyändeg för att demonstrefanantikroppsmoduf 'iëring ä? inhiberiñgioénïreversering med kolylglycin (g1yxoko11n- .tesy;à)Q Äntíkmooptgentemotvkolylglyoin~bovinserumalouminkonjugat_ *(BSA¿konjuget) alstïädes i kàniner och kaninserumet erhölls genom exqnvenfiionell-tekn1K,f Ancikolylglyoin-IgG~fraxtionen erhölls t genom ammoníumsulfätïraktionering och jonbytarkromatografi.

Koncentrationen av antikropp bestämdes ej men justerades från en t poolad fraktion från jonbytarkolonnen för àstadkommande av bästa moduleríng av inhibering med förening II.~ I ett kontrollförsök e uppvisade IgG gentemot digoxin renad på identiskt sätt som anti- Åkolšlglyçinet :go ifigen effekt på aktivitet ¿v'1nn1bering ~antydande specifik bindning av förening II. Försöket utfördes "i en bikromatisk analyšàtof model ABAFlOO (reg. Varumärke) A m(ÅboottÜEebopatorieS; Nofth Chioago, fllínois) och fëljande in- _ . _ _.._..-.,,_........__;..~...._.v.«,- V 'lO ; _25 30l l fås. 40 "k0mp0nenter ' 448 259 l l stäliningafianvändeàr , A_,F11ter=0 2 _,415/550»nm 02 min. offset 1nTemp.: nj Ü2.3O9C=~ l 7 Rate mode:.l::“*ï Zero: ”,“ 20,000 l Kà11brat=:_*. 0,500 FRB¿l, » . 1 Ti111;l ,, lf ïsübštratlösningenïbch buffert 0laceras1ilutspädningsÅ plarsans primärsprutázl Bufferten är pH 7,0 0,1M xa11umf0sfat, 1Grov Skala: l Kàrusell rèv.: 2 Analystïd: 5 min. 1/26 utspädningsplatta ¿ 0,1% gelauinï 'supsbráteç är a@@ty1tiok011n vid 5,0 X 10"” M med 1 _ DTNB vid 1,6 X lO'4'MÜš0m~indíkafior.0 Följande tabell visar _ lreaktantén i br0vkoppçn@”_I0s2mtliga fall är acetylkolinesterás- O (T.calífornica)-k0ncentfatíonenfungèfär 2 X lO“l- M och koncent-~ rationen av föreningen II, inhibitorn, är lO X lO_7 M. När ¶ kolylglyéín tíllšäfitšs än k0n0entrationen i provkoppen-lO'3 M. Å,Pr0vkoppen innehåller pH 7,0 0,1 M kaliumfosfatbuffert innehåll- iandè O,l% gelatin plus i tabellen angivna-komponenter.1 'Förändring iÛAd på 5 min. sóm funktion av tid '- 0 112_och»reaktionskompqnenter" 2 Enzyminhibitor Reakti0ns~0f _ - _: Inkubationstíd Ad/B min. 0E_enbarfi _ 0 .,0,2460 ' Z 0,257 0,234 _~ 0,230 ¶ Eflfl -l ~,Ä1gæ6;*,'1 Qom f0¿m5 man , E + 12+ Abf - ', l0,2551>f¿'2 , Ü0,192_1~ 0,164, 0,147 E 1 1 + Ab"+¶0G 2'lf0,224'0nl ' 10,078 _ 0,032 - 0,017 l' E,+ Ab,"à ;“f1 2-j1Ã0,224Ü 1 f ll 0,225 2l0,218 10,215, E'+¿Abï+"c0*>'~ "fÉ_0,225 12 _] 2-f 0,223¶ 0,216 -0,207 E +.c0, §Ü'j'0 10,236 , _ l .;flÖ,2281 0,220-l 0,211 Å E + I +~00l ” ' j¿O¿¿¿¿ 11 .l 0,062 .0 0,022» 0,013 ,Buffèrfi§enb¿rp. -1l0,0o1 0 , 0 -}0,003 _ 0,001 _0,0o2 E,=Aa0etylkollnesteras I l l 1 l I ¿ förénlng II' 'WGG = k0lylgljcin á ¿ 1 ¶¿¶ 2 » Abï= antikroppfgenfçnqtjkolylglycin konjugerat till BSA." lnxemgel III l'~ *n - ~ * "' "*' _--lTíll~lQO mlïtetrañydrofuran sättes i tur och ofdning l7,0 gl H NfKt-but0xikárbonyl)f4+amínosmöràyra framställd Éenom proceduren-i 0 enligt-Mgreaer en 21,jZ;Phys101§cfiem.,2357, 1651 (1976), 10,6 gí N-hydroxisuc0inímíd_och-l8,9 g dicyklóhexylkarbodiimïd,1 Bland- ningen dmröres sedan i 2 timmar. 1Bildad dicykl0hexylurealfilt¥_ =~(M1n) T~:_0j~ ~9 T=132 1 T=25 1- 1T=56"* _ f» n* ,iog _15? g ". 30i 1 55 40 _lägsnas lösningsmedlet genom avdrivning under reducerat tryck och j ¿ t rMetylenkloridfraktionen tvättas med en mättad läsning av natrium- “vätekarbonat och torkas över vattenfritt magnesiumsulfat. Magne- i 448 259 1 reras och 11,1 g Seamino-3-tia-1-pentanol i 150 ml tetrahydrofuranf 1 esättes till fïitratet, Efter omrör1ng'í 2,5 timmar avdrives tetrahydrofuranet och återstoden fördelas mellan metylenklorid och koksa1t1ösning.> Metylenkloridfraktionen tvättas med en mättad vattenlösning av natriumvätekarbonat, torkas, och lösningsmedlet avlägsnas till bildning av en olja, som är 10-(t-butoxikarbamoyl-, 7-oxo-6-aza-3)-tiadekanol med formeln: 1 ?H3 R ' n 2 CH ~C-0-C-NHr(CH2)3-C-NHrCH 3 »-caz-s-cazfcsz-on H 2 1 3 g _ ' 2 g Under inert atmosfär sättes i tur och ordning 2,28 g av denna förening, 1,45 g diisopropyletylamin och 1,8 g metansulfon- syraanhydrid till 20 ml metylenklorid vid OOC. Efter 50 min. ' ß sättes till reaktionsblandningen 2;O g O-etylmetylfosfonotioat och 1,92 g dfisopropyletylamin. Lösningen får anta rumstemperatur och upphettas sedan vid 4500 i 1,5 timmar. Lösningen fördelas' mellan koksaltlösning och metylenklorid och tvättas i tur och ordning_med 5% saltsyra¿ mättad natriumvätekarbonatlösning och torkas sedan över vattenfritt magnesiumsulfat. Magnesiumsulfatet avfiltreras och lösningsmedlet avdrives till bildning av en gul olja, som är.O-etyl-S-/lO-(t-butoxikarbamoyl)-6-aza-7-oxo-5-11 tiadekyl/metylfosfonotioat med formeln: 2 1 X _CH3~_-OrC-NH-(qäzi3-C-NH-CH2-CH2-S-CH2-CH2-S-P-CH3 7 'CH3 ' __ ' ' _ -CH2-CH3 H Vid rumstemperatur upplöses 1,0 g av denna förening i 4 ml 50% trifluorättiksyra i metylenklorid, och blandningen om- röres i 10 min, Lösningsmedlet avdrives under reducerat tryck goch återstoden upplöses i överskott bensen. Bensenet avdestil- 2 leras snabbt så att spår av trifluorättiksyra avlägsnas. Den rkvarvarande oljan upplöses därefter i 2 ml dimetylformamid, och l,08;g av den.aktiva succinimidestern av kolinsyra och 57 mg är hydroxibensotriazol tillsättes i tur och ordning. Lösningens pH justeras till 7,5 med trietylamin. Efter omröring i 6 timmar av- återstoden fördelas mellan koksaltlösning och metylenklorid.- 1 É- ~.,5 s* siumsulfatet filtreras och lösningsmedlet avlägsnas genom f N L._..__.__.___._.._._...._. .. _l5¶ '35 l4o “ esteras per ml beredes í fosfat-gelbüffert. 'aktivitet definieras som den mängd enzyn; som katalyserar hydror ll antagande av ett omsättningstal av Sax lO5 mín.f *och inkuberas§vid.rumstemperatur. -Med jämna mellanrum uppmätes - mängden.enzymaktivitet som är kvarvarande genom uttagning av l" . 448 259- ~. ~ ¶}et W - }. W e = fl indnnscning fiillhbilqníng av N-/5-aza-loeetoximetylfosfinyltio- '4-oxo-84t1aqexyl/-ša,Ta,lza-crinyaroxi553-kulan-24-amid mea,_ formeln-1II= w to-cH2¿cH3 Iriel A. e 'Hastignetskonstantenfför lnhinering av acetylkolinesterasl u med föreningen III bestämmes på följande eätt: ¶ a ¶ 1 l * Följande reagéns användes: _ ,. 1 .

Buffert: Arbetslösningar av samtliga reagens~beredes i 0,1 M' ¶ natriumfosfat, pH 7,0 buffert innehållande 031% gelatin (fosfat: -gel).¶ Ligandanalog - irreversibel l V ”6_ - "M, Inhiberings-konjugatlösning: En arbetslösning av 6,7 x 10' tlösning'av förening III i fosfat-gelbuffertlbenedes genom utspäd- ning från en 0,067 M baslösning av förening III i metanol. ¶¶ 3 Acetylkolinesterasz' En arbetslösning av 100 enheter acetylkoline En enhet enzym- Q lysen av 1 mikromol av aoetylkolín per minut-vid 25°C} Under _a ljär koncentra-a* tionen av enzym i denna lösning 2 x lO*7 M. I en e 'Ü Subetnat; MI samtliga fall unpmätes enzymaktïvíteten i fosfatflïZ_ gelbuffert inneha1i¿naeÃ4,88 x 1o'4 M aceçylciokolïn och 1,56 x'flf "” M*pTNB.l l l af"a t e_l e~'¿ _ e ¶, e _ ._ l Pseudohastighetskonstanten av första.ordningen för inhi- e beringsreaktionen uppmätes genom-blandning av lO fl av arbets? xonjugaclösníngen med 500. 1 fosfatfgelbufferz. vid tiden no11fl ¶_ tillsättes 5 l (O;5 enheter) acetylkolinesteraelösníng omblandae~,¶l*a e 2 (-11 ' en 10/ulfalïkvot del, blandning av denna med 1,0 ml substrat~o lösning och uppmätning av den hastighet med vilken absorbaneen 4. 1Q 0 15 250 BO 55 40. .fotometer.

I i 448 259 vid 410 nm(ÅÄA/Z§t) förhöjes i en Varian Super Scan 5 spektro- Den uppskattade speudohastighetskonstanten av första ordningen (kl(est_)) beräknas enligt ekvation l: i g (AA/Afng = - in mmm; tg - tl vari tg och tl är tiderna efter tillsats av enzymet vid vilken den kvarvarande aktiviteten (ÅIA/Zfit) uppmätes. akl(est.) Den uppskattade hastighetskonstanten av andra ordningen för inhiberingsreaktionen lberäknas genom division av kl(éSt ) med koncentrationen av kon- jugatet i reaktionen (l,3 x lO'7 M). genom denna metod visas i_följande tabell: De värden som erhålles TABEEL * Aktivitet Tid (absorbans~ §min.]“ _ _ enh. min. o;5 _ _ 9,45 x lo" 2,5 V6,87 X 10"” _5,o 4,87 x 10"” g Avsättning av -ln aktivitet mot t ger en lutning av O,lÄ7 min.fl som pseudohastighetskonstanten av första ordningen med en korrelationskoefficient av 0,998. Den beräknade skenbara hastighetskonstanten av andra ordningen är då l,l X 106 liter _mol'lmin_l¿ >Uppmätning kan.även göras i en bikromatisk spektro- fotometer. a _ ¿ . g _ Q; Utnyttjningen av acetylkolinesteras och förening III som reagens för bestämning av kolylglycinkoncentrationen visas enligt gföijanaeß Följande reagens användes: Kolylglycinstandard (buffert)j Lösningar av kolyglycin beredes i 0,l M natriumfosfatbuffert vid pH 7,0 innehållande 0,l% gelatin nvia koncentrat1ofier_av 1o'5, 10"", 1o'5, 1o'6 och 1o'7 M.

Standardlösningarna beredes av en baslösning av 0,01 M natrium- glykokolat i vatten.

Antikolylglycinantikropp: IgG-fraktionen av kaninantiserum beredes genom blandning av lika delar av en mättad lösning av ammoniumsulfat och av serumet. Den erhållna fällningen erhålles genom centrifugering och dialyseras mot 0,02 M kaliumfosfat vid pH 8,0. Dialysatet filtreras därefter och kromatograferas pà en tDEAE-oellulosakolonn bringad till jämvikt i 0,02 M kaliumfosfat lO - 55 40 ,min. , 5,449 259 s 26- vid pH 8,0. -av lämpliga fraktioner såsom bestämmes av elueringsprofilen.

Arbetslösningen av antikropp erhålles genom poolning En Scatchard-analys av denna lösning anger två klasser av anti- kroppar med bindningskonstanter av l X 107 och l x lO M-1 med motsvarande bindningskapaciteter av 2,2 x 10-6 och 3,2 x 10-5 M. f I Lösningarna av flirening III, acetylkolinesteras och -substrat beredes på samma sätt såsom beskrivits ovan i del A av , detta exempel. gg ' I I För uppmätning av koncentrationen av kolylglycin i fosfat- gelbuffert kombineras 96/ul fosfat-gelbuffert, 20/ul av tillämplig kolylglycinlösning, 4/ul av en 3,55 x lO-6 M lösning av förening III och 16/ul av antikolylglycinantikroppslösningen i en provkopp av den bikromatiska kinetiska analysatorn. ,Reagensen tillsättes i angiven.ordning. lO/ul silikonolja tillsättes därefter för att _ förhindra avdunstning; Efter 5 min. inkubering vid rumstemperatur - igángsättes den bikromatiska kinetiska analysatorn så att karu- ,sellen av provkoppar rör sig under den normala rotationen av 5 -Allteftenvarje provkopp kommer fram till analysposition tillsättes 4/ul (0,09 enhet) 1.sescylkolinesfisraslösning. De -slutliga koncentrationerna är 9,6 x lÖ-8 M förening III, 1,67 x '4 till 1,67 x 10' M kolyigiycih och 5,7 x 1o'1° tkolinesteras. Efter 12 min. inkubering uppmätes mängden kvar- M acetyl- . varande enzymaktivitet genom överföring av lO l alikvot del till den bikromatiska kinetiska analysatorkuvetten (3700) och blandning av denna del med 250/ul'substratlösning.- Den 36-faldiga utspäd_ ningen av materialet från provkoppen tjänar både till att effek- tivt stoppa inhiberingsreaktionen och att utspäda enzymet till ett koncentrationsintervall, där dess aktivitet lätt kan uppmätas.

Enzymaktiviteten anges som skillnaden mellan absorbanserna (Ad) bildade under 5 min. vid 415 hm och 550 hm. Resultaten visas 1 fö1jands”tabs11= Kolylglycin . - M_ Adx¿5 min. 1,67 x 10f 0,499 É 0,015 1,67 x 1o'8, 0,453 i 0,025 X W 1,67 X 1o'6 0,500 É 0,011 1,67 x 10*5 0,143 É 0,002 ' 1,67'x 10"” 0,103 T 0,001 XAd har här angiven definition. värdena är medelvärden f"en gstandarddeviation. Varje värde representerar tre mätningar. 2ol 551] lo" 2?-l_” tr 44st259 "Kolylglyoinkoncentrationer i serum bestämmes på samma ïisätt;s0m_beskrlvltsQl föregående axam§al.~ För föreliggande försök beredes°standardserumlösningar av kolylglycin genom utspädning av en 0,01 M vattenlösning av natriumglykokolat i normalt human- serum; som har en endogen kolylglyoinkoncentration av 7,5 x 10-7 M, såsom bestämts med radi0immunoassay'(Abbott Laboratories' 0 onnrA~Klt)fg Den letala kanaentratlonan av nolyglyain 1 serum- lösnlngarna anges 1 följande tabell." samtliga övriga lösningar är samma som beskrivits under A och B ovan, bortsett ifrån att I subetratlösningen innehåller l,OmM per liter N-metylorfenadrin för inhibering av serumpseudokolínesteras.e _ _ _ ¿4e~Till;provkopparna av den bikromatiska analysatorn sättes iftur och ordning 39a_l:fosfat¥gelbuffert, 60 1 av motsvarande normalstandardlösning av humanserumkolyglycin; och 2 l av en ,55 X lO'6 M lösning av förening III, 8/ul antikolylglyein_ _ antikroppslösning och 10 ul silikonolja. -Efter 5 min. inkubering .vid rumstemperatur tillsättes 5/ul (0505 enhet) aoetylkolin- esteras såsom beskrivits under del B av föreliggande exempel.

De slutliga koncentrationerna är l,l x 10-7 M förening III; 8,5 x l0'8 till 1,0 X lofå M xolylglyein, 1,7 x l0'9 M acetyl- kolinesteras. lEfter 12 min. inkubering vid rumstemperatur upp- mätes den i varje provkopp kvarvarande enzymaktíviteten såsom lbeskrivits i del B av föreliggande exempel; Resultaten visas il fölganae'tabel1=H_-I _K0lylglyoin _ Kolylglynin - '_i serum §M¶_ _ i rovko_ M 0 Ad _ min- e _ [8,5 X l0'7a "'""“ 8,5 x 10* _ 0,735 É 0;032 ll,8 X l0'6 ff _ el,8_x_l0*7' 0,735 É 0,0l6 l,l x'l0f5al ' * l,l_¿ 10'§ 0,500 É 0,025 1,0 a l0'4: _;1,0 x l0'5 0,204 ï 0,016 'l§0 x l0'5 _ H llo-x l0'4. o;l6l ï.0,oo5 _§. _I_Antikolylglyoinantikroppens effektivitet när det gäller att modulera aktiviteten av förening III för inhibering av acetyl- kolinesteras bestämmes pà följande sätt. Arbetslösningar av lfosfat-gelbuffert; antikolylglyoinantikropp; förening III, _acetylko1inesteras ooh substrat är desamma som de under del A av-detta exempel använda. Till provkopparna av den bikromatiska ^ kinetiska analysatorn överföres i uppställd ordning olika mängder av fosfat-gelbuffert, olika mängder av antikroppslösning (angivet ell följañaa tabell), 2 l av lösning av förening-:ll pan lo 1 _ g ¿.¿ _ _ ;a,/U; _ _ g - - /“ ~ I Ma zseff; êßeï 'av_$íiikpnQ1¿a för anfi förhindra afidunsßning. .¿_ Efper~5 min; inkubation vid rumstempenafiar"tillsättes" 6/ul (0,06-enhet)-acetylkolinesteras såsom beskriáita i del Bli: l¶detfia-exempel.“ Den totala volymen av reagens i vafje provkopp är 60 ul. De slutliga.koncentrationerna ar l,l x 10"? M förening _III beh 2;x l0*9 M acetylkólinesteras. .Resultaten är uppställda 1 följande tabell; ' _ . _ ._ . i* % oinhiberad Antikolylglycin- . ¿. a i l ,. antikropp (/ul)¶ :¶'a f Av/B min._ a. ¶ . enzymsignal ' "'øi .I >fi ”?o;o95 f o,oo4 '¶..¶- l8,5 i2_ “" i nu 0,480 f o,o27¶ . .».e 45 4_i _h_-o,7o6 i o;o84 ' e » 63 e6. lilO;856e“-“ 0,048 7 i -ej7-7 8. le. _ O;919 f o;o18. “.- 82 1o¿e . - 1o;89o~i o,o4o¶ n = 80 12” .iï> -_? ~o;899 f Q,o2o - 80 . Exem e1=Iv_¶ ¶ a ¶ 11 l ”Till en lösning av 5¿g öfaminohekanol ie5O ml metylen- ¿.. ' _x1pr1a vid o°c sattes arqppvis 9,3'g.d1~tfbuty1dikarbonat; Lösningen får anta rnmstemperatur oçh omröres i 17 timmar.

. Lösningen tväfitaa med en Vattenlösning av citronsyra; en vatten- lösning av natriumvätekarbonab och torkas_över vattenfritt magne--¶ siumsulfat; Magnesiumsulfateteavfiltreras och lösningsmedlep avdrivea till bildning.av en gul olja. Oljan nenas-på silikagel under användning av 3% metanol i mefiylenklorid som elueringsmedelf till bildning av Nfitfnütoxikarbonyl-öfaminohexanol.med fölfande strukturformel:. ¶ ” l in * l " -ë?š-3-nH(cH ) -enl ... , , Öflšl « l '2 6 a .-. e :~il~Till 5>9.š'aV denna förening och 5,06 g tfíetylamin i 50 ml metylenklbrid sattes 3,47 g metansulfonylklorid, Lösningen..

C33 ¶omröreS i 30 min: oéh fivättas med en vattenlösning av çitronsyra¿ en vattenlösning av natriumväfiekarbonat_och torkas sedan över. vattenfrítt magnesiüñsulfat. 1Magnesíumsulfatetlavfiltreras och .lösningšmedlet avlägsnas genom indunstning till bildning av N; ' t-butoxikarbonyl-6-aminohexylmetansulfonat.. I 10 ml dimetyl- formamidaaättes utan ytterligare rening 6,2 g av detta material till en lösning av 2,5 g ß-merxaptoetanoi 1 60 mi vattenfri .dimetylformanid innehållande 5,5 g kalium-t~butoxid. f!! dm '- d* io ' _l5g eos 25ï §O 55Ä 40 *29 -V s nya 448 2s9d nlandningenionröres irl? timmar vid rnnstemperatur. Reaktíonse d,blandningen-hälles i vatten ooh extraheras med metylenklorid. _ wDet organiska-extraktet tvättas ned 100 ml vatten tre gånger ochf otorkas över vattenfritt magnesiumsulfat. Magnesiumsulfatet av- if filtreras ooh lösningsmedlet avlägsnas genom indunstning. Den kvarvarande oljan renas med silikagelkromatografi under använd- ning av 5% metanol i metylenklorid som elueringsmedel till bild- ning av Net-butoxikarbonyl-9-amino-É-tia-l-nonanol med formeln: e_ g0' _._e o e g _* ïfi-bu;yi-o-É-NH(çH2)6-s-(oH¿)2¿oH f En lösning aV*2 g¿av detta material och l§4_g diisopropyl- geeyiamindi 20 ml metjienkiorid kyies till o°c och 1,64 g metan- sulfonsyraanhydridftillsättes.* Efter 30 min. tillsättes 1,86 g diisopropyletylamin och 2,0 g O-etylmetylfosfonotionsyra under _ det att reakcíønsbiananingen nåiies vid o°c; Läsningen far anta :¿rumstemperatur under loppet av 50 nin, och återflödeskokas sedan i 2,5_timmarL_ Efter kylning av produkten i metylenklorid tvättas den med en vattenlösning_av natriumvätekarbonat och torkas över lvattenfritt¿magnesiumsulfat.f Magnesiumsulfatet avfiltreras och lösningsmedlet avlägsnas genom indunstning under reducerat tryck.

Ràprodukten renas genom kolonnkromatografi under användning avf 1% metanol i metylenklorid som elueringsmedel till bildning av _o-eeyi-s}(N:fi;burøx1kanbony1-9-aminofj-ciancnyi)mety1fosfono-e tioat med följande struktnrformel; g.e g ~'o - - l g_fg-_ o ray:wa@¿eut9xg¿ëe§3¿(cH¿)¿¿s-¶çH¿)2-e+§+oH3 _vj -e e »e e en . e se e ocH2~cH5 :Denna förening¿ 250 mg; omröres i en 2:1-blandning avd? ._meÜyïénkloridvoen trifluorättiksyra i l timme vid rumstemperatur.d Lösningsmedlet avlägsnas genom avdrivning under reducerat tryck; Det bildade saltet upplöses i 6_ml dioxan och 320 mg diisopropyl- etylamin.tillsättes»_.Därefter tillsättes 620 mg N-hydroxisuccin- im1deeeerñ*avgN~aqeey1:n-tyrQx1n-och blandningen ømröree 1d16 timnar. gfleaktionsblandningen hälles i¶5O ml metylenklorid och tvättas i tnr och ordning av med en vattenlösning av citronsyra och en vattenlösning av natriumvätekarbonat. Lösningen torkas y över vattenfrittjmagnesiumsulfat§ Magnesiumsulfatet avlägsnas f genom filtrering oeh.lösningsmedlet avlägsnas genom avdrivning%¿ I under redueerat tryck. 7Den kvarvarande oljan kromatograferas på gsilikagel,under,användning av 1% metanol i metylenkloríd som 107 _25 ' 55 40 _TyfoXifiSbandardkurVa'under användning av förening V; 44ß w _eIuering$fieeeIÄe Åtenxfisfieliisatibn ur aeetonitríl ger 9-« (etqximetylfosfinylfiieÜ~7+tíaqohylfN-acetylhyróxinamíd“medefölj- -ande strükturfófmeléï eee_e e f- I e ' - ewee“*e*f°'9“ßeee; 1 e « e .cH¿,'_“-_ (cnze) .G-sf '(63:21) zv-s-e fcn3 \ !O*CH2fCH3 :IV° ,Tillïen'lösniñgnáv 50 mg av deñna-förening i 1,5 ml e metylenklórid Sättes IQ,7 mg metylfluórsplfonat,}fEtt fast ämne- bildas under Ioppet av 2:5 timmar; Lösningsmédlet dekanteras oçhefä1lningen_sönderdelas med vattenfri eter till bildning av __ett pulver, som-utgöres avfsulfonïumšaltet med formeln: í HQ*- cHeee-cnee NH v í ' + e f à I? } . _2} _-ï- *(CH2)6-_-(CH2)2-5-?-CH3¿ e 4 , e > e; e 0 Z í x o-CHZ-cfla _ e ¶ _ve A _ _Fso3'} ¶-Hastighetekonàbanten för föreningen V bestämd genom förfarandeï Som anges i ex. III-A är: Z ¶ I I le: e I > e Hastighetskonstant av - --andra ordningen- e Iñhibifi0r_ 'l koncentration 7_ _ liter mol_l min Föreningív: ¶ 1e,~o x 108 5,0 x 1o'9 m .

'Reagenš: gL Efåtfreagërisinnehà11ande mlíenhet/ml (1 gl» x 1040 M) av acetylkølinesteras-(E¿electricus)-aktivitet 'Qdh l X 10' ,M tyroxin-IgG-antikropperenad på eammá sätt som tidigare beskrivits ei o,1emo1ar fosfatbuffert, pH 7,oe,__ innehållande 0,17! gelatin., 1;O mM N-metylerfeñadrineoçh O,25mM 8-aníliñónaftalensulfonsyra.

Q. e ïsubstratreageñset innehåller 1,0mM àcety1biokolin_och 0,32 mM DTNB i 0,1 molar pH 7,0 fOSfatbuffertÅ ' ' §¿ fy" -En arbebslösning av 2,5 x lO~7 M av föfeníng Vfi 0,1 M feösfabgelpberedèsr, e ~ e ¶ í " ev , -Testet utföres genom blandning av 5/ul serum innehàllañde 1fl -...__, .. ,,_\,.,.,..\ ._ .».:_.~ ...._.._., . n; lO' 115 ezov 25ei 'jfO 55_ I av reagens B. siïlfo 448025901 varieranåe;mängder"šyroxin med 250i l-av_reagens.A, Blandningen ;inkuberee i 5 mini vid 37°c. Till denneflöening sattes 10 1 - av reagens C och 250/ul-av'reagensQB.1 Avläsningar göres med 5 -min; intervall under användning-av en bikromatisk analysator - försedd med ett 415/550 nm fi1tersei. ' g _g g * Serumstandardknrva g vi Urspr. konc; av i '¿§Ad 5 min.0 ii~tyr0xin_i serum 415 550-nm M » 1 1 1 _m6i1§à' 03% i2,6 x 10',.: 0,927~ge 'ge5i,-¿>~x 10": i 0,902 g iï-1,ofx 10" ~ 0,793 ig2,1 x 10"? 0¿599 3,1' x 1042:' 0,578 De okända värderna bestämmas från standardkurvan.

Hastighetskonstanten för föreningen IV bestämmas genom de imetoder som anges i eX¿ IlI}A: i iHastighetskonstant av ' andra ordningen _) _l _l Inhibitor-_ se liter mol min koncentration Förening iv ' 3,5 X 1o° 2,5 X 10'8 M 0071SerumbaseradÜstandardkurva för çyroïin bildas med före- ning IV unåer användning av en.modifikation av den_procedur som beskrivits för föreningen v. _ j _ 1 Reagens A innehåll-er l mM N-metylorfenadrin och inne-l heiler 7 mg/hi netriumsaiieylet i feefet-geibufferc; pH 7,0.

Keiinesfiereeektivineten.är 0,07 enhet/m1_(7 x 1o'1l M) een i tyroxinantikroppskonoentrationen är 1,4 x 10' M räknat på bind-1 *ningsställeni>. -gfieagens B är samma som reagens B ovan. 1 Reagens C är en arbetslösning av 5 x 10-7 M av förening 1 fïv i 0,1 M fesfetfgeibuffert. jFörsöket utföres under användning av 10/nl av serum eblandab med 250 ii av reagens A och 10 l av reagens C. Bland- 1 /Ur e V ningen ínkuberae i 10 min. vid 57°c före tillsats ev 250 V1 'är fö1¿ende= stenderakurven för bestämning av de;exände värdena 0 50 ä? ' I , M>'¿' » ' ;K" _ :ja ' eee448 259 ¶. e _ Ze Urs§r.;xóncÄ_ev' A ¶ 1 e : '1 ;uyrox1n'i_serum ¶ '¿šAa/5 min. íí"-o ¶ ~~j eeej-¶_ -¶ L Q,646 ¿- "¶ _ 1,5 x 1o*- ev _ 'ee ¶ o,525e 13,1' x 1o'7¶ e¿, e¶ e"j' e' 0,480' 'ex 1077 _ ;._e }_ e __ e o,518 l x1y5ge;'e : e @4æ à _ 5_ x ro'6", _ 'ee e' 'É'e ”eo,426 Exemgel V¶> 4* e * ,N-tëbutóxikarbohyl-4-amino-L-butanol e __e9}¶ ¶ ¶¶ ¶ tfbucyl-ofå-Ng-(cflà)4-ofl;- N~tšbutoxikarbony1-5-amino-jätiafl-pentanol ¶ ¶ 1 f O¶} _ ~ e "¶ : 1 . A “t-bubyl-O-ëfNH-(CH2)2-S-(CH2)2fOH; och N/N'fb-butoxikarbonyl)g1ycy1/l6+amino-1~nexano1 <¶.._ e 9. _ _q¶¶ ¶ ¶ _ . ¶ t-putyl-o-Ö¿NH-cH2¿êHH(cfi2)6-QH _ och dessa-alkoholereomsättes i sin tur med metansulfonylklorid, e B-merkaptçetanól, metansulfonsyrqanhydrid och O-etylmetylfosfonó-_ tiensyra_till bildning.av inhíbitorarmar_för koppling med formeln: . ' e *-: e e e' , M t-fbutyl-o-c-Nnf (CHZ) 4-5- (cnz) 2-S-ï-.cH3 ¶ I e ¶ ' " ¶ f -cnz-CH3 ¶}¶} 9 ¶_} } Ii ¿:._ ;-buty1-o-c-NH-(eH¿)2-s-(çH2;2~5-?_¿H3 eQe I_: o+çH¿-CH3 _ 1 1 . R - íj H¶ H- w I -I _ W Vet-buty1fo-c-ua+cn¿-cfNH-(cH2)65s-(çH2)2fs- -CH3. à ¶ ¶ > ¶ o-cH¿ÄcH3 eA1t. ahvåndeejQ-butylmehy;fosfonotiohsyra för bildning av föreningar, såsom e i ¶ L* ¶ I_eñlighe@,med firoceduren i ex; IV mefi under utbyte av¿. e'6-aminohexafio1*mot_4~amíhobutanol; 5-amino-3-tíapentanol; resp.

. Nfglycyl-6-amino-L-hexanql ger så i e . - ¶ i 2 448 259% I friíf*b“¿Y1;9¿C*NHÉlC32)a;3'(C3252?5; 'C331 CH2-cH24CH2-CH3 ¶ ¶ ÜÜ Dessa mellanprodukter frigönes'och Omsättes sedan med g _N-hydfokisudeinimidesfiern av Nëabebyl-L-tyroxin till bildning av'konjngat;'sâsdmLN~/ï2~(etoximefiylfbefinyltio)#lO-tia-3-a2a- ¶d 2-okododekyl/ïNa«acefiyltyroxinamid med följande formel: lol* = » i ~ Hin _ _ - n I ¶7H-å-CH 3, a a '- Cnzííénn-(Tn2)6' ' , i F _, If” jfif O 'C33 oi 'L-ca 2 -çH3 >a2O och motsvarande eulfoninmsalt, förening VIÄ dDessa föreningar har fas J haatïghebskQnstanterÅanÜandra ordningen om 2§5 x”lO resp. 1,7 x 109 liter móI_l min_l vid en inhibitorkoncentration av “ 5 x 1Q'8 mo1araresp."2;5fx 1o'1l'mo1ar. de ïn-ÉLCH3 f H3 _ ¿ 'CH-z- H-ï"NH-CH2-C-NH__(CH2) 6-5- i» a¿_ i ¶ ocuz-CH3a" çfläoso *a vIj ï ' * 3a 'Exemge1~vI a 35 _'ÅEn lösning av 527g N-bensnloxikarbonylqnisnceinimid in 100 ml fietrahydrofuranaomsättes med l5'g 6-amind-I-hexanol i ¶'3O ni 50% metanolzfieprahydrofuran- ,Reaktiónsblandningen,omröres f Svar natfien vid rünstenperatuf Qeh hälles i vatten. Den bildade aaà¿blandningen extraheras_med metylenklorid och det organiska skiktetf ï ÄO¿_-tvättas med natriumklorídlösning, tórkas överlvattenfritt magne-í“¿ ,'d . ' ' 50 Z 40 iooh«metanelen avläg$na$_till bildning av 9-aminof34tia-l-nonanol- ihydroxkloríd, smp. 69-7200. . _ 9 9 -1 P fd44s 259fÉg ifaïï” siumsülfat,, Magnesifimsdlfatet avfiltreras och lösningsmedlet_ avlägsnas_genom indunstning.7 Produkten återkristalliseras un-- etylaeetat/eter till Bildning'av N-(benáyloxikarbbñyl)>6-aminef~.. . 9 1-mexan01,¿smp.»81,5-83°ç med följande formeif (li ¿ -Cxié-ioêc-NHÉ- (cfliziögæn- av É .dÅTill12l g av denna förening i lOO ml vattenfritt pyridinu *à 'V sättea 10,53 g'metansulfonylKlorid vid O-59C;i Beaktiónsbland- ' ningen hälles i kallt vatten och extraheras med eter. Eterlös-_ _ ningen tvåttasii torkas-benaiàssningsmeaiet aviagfsmas till bildning; av N-(ténsyloxikarbonyl)-ófaminohexylmetansulfonat som ett vax-9 artat fast ämne, ] i g i . i ' _ Tiiiem 1ösn-img{av;7,8 gl ßh-merkaptoecanql i 50 mi aimetyi- ífofmamid sättes 5,15 g natniummetoxid under kylning på isbadi 9 Hela utbytet av N-(bensylokikarbonyl)-6ëaminohexylmetansulfonat ° från ovan i 150 mi-dimetylformamid sattes till e-merxaptøetanoi- lösning i inert atmosfär vidÉO°C.l vid rumstemperatur och hållas i en natriumklofidlösning. 9 Extraktion med metylenklerid, tvättning och torkning av metylenkleridskiktet atföljt av avdfivning av metylenkloriden. I Blandningen omröres i 2 timmarl_ ger ett_fast ämne» Återkristallisation ut etylacetat ger N- '9(bensylóxikafbonyl)~9famino#3Åtia-l-nonanol._ En löšning av 9,5 g av denna förening i 160 ml metanol innehållande_l,l"ekvivalenteri konc. saltsyra och 9,5 g palladiumsvart placeras i en nydrerings- apparat av typen_Parr.f Efter tre timmar avfiltreras katalysatorn _.f. 7 lill en lösning av BQÄQ mg 12-acetyloxiÉ5-klorformyloXi- 7' 14-nydroxikard-20(22)-enolid (amerikanska patentet 3 981 982) 'i:6O ml tetrahydrofuranisättes 829 mg Néhydrexisuccinimid och 0,988 m1 firietyiamin g~vidgo°c.g Efter omr-öring i 3 timmar vid o°C avfiltreras den fasta trietylaminhydrokloriden, och till filtf ggratet sättes en löšning av 1,5 g 9-aminoë3-tia4l~nonanolhydro¿ miøridmoeh 0,97 m1 dtrigetyiamin i 6,5 m1 'metanoL “Dengerhàiinag blandningen ómröres i l timme vid rumstemperatur beh indunstas .'99 \ sedan partiellt under redncerat tryck; Ãtenstoden utspädes med_ 9en vattenlöšning av natriumklorid och extraheras med metylenklorid-9 i) Den organiska fasen tvättas, torkas pch lösningsmedlet avdrivesg till bildning av en viskös vätska. Kromatografi på Silikagel 1 n 5 ,l5 #50, 55 40 448 259 under användning av 2-4% metanol i metylenklorid ger l2-acetyl- oxi-3-/N-(9-hydroxi-7-tianonyl)karbamoyloxi/Äl4-hydroxikard-2O- (22)-enoiia, ' e 5 ' o ' Till en lösing av 2 g av detta material i 15 ml metanol sattes 430 mg pulvriserat vattenfritt kaliumkarbonat. Efter om-H röring i 35 min. vid rumstemperatur utspädes reaktionsblandningen med överskott kloroform, filtreras genom celite och lösnings- _ medlet avdrives partielflzunder reducerat tryck. Återstoden uppf löses i metylenklorid, tvättas i tur och ordning med O,l N Salt-_ syra ooh natriumkloridlösning och torkas över vattenfritt magnes siumsulfat., Magnesiumsulfatet-avfiltreras och lösningsmedletl avdrives till bildning av en râprodukt. Kromatografi på silikagel under användning av metanol/metylenklorid som elueringsmedel ger -/N-(9-hydroxi-7-tianonyl)karbamoyloxi/312,l4-dihydroxikard- (22)-enolid.e ' _ Till en lösning av O,725,g_av materialet i 3 ml vatten- fritt tetrahydrofuran sättas i tur och ordning 0,265 ml etyl- diisopropylamin och 0,265 g metansulfonsyraanhydrid i 0,75 ml tetrahydrofuran vid f2O0C. Efter omröring vid -lO°C i 55 min. sättes till blandingen en lösning av 0,784 g dicyklohexylammonium- O-etylmetylfosfonotioat i 2 ml.mety1enklorid. Omröring i 5 timmar vid rumstemperatur àtföljt av fördelning av reaktionsblandningen mellan metylenklorid och utspädd saltsyra utföres. Den organiska fasen tvättas med natriumkloridlösning, torkas och lösningsmedlet avdrives till bildning av en råprodukt. Kromatografi på silikagel under användning av 2,5-5% metanol i metylenklorid som eluerings- medel ger 5-/N~/@-(etoximetylfosfinyltio)-?-tianonyl/karbamoyl- oxi/Äl2,14-dihydroxikard-20(22)-enolid med följande struktur- formel: l ' ~ e o O:C\N I f H-(cnz)6-s-cH2-cflzfs-P-CH3 o-cH2-CH3 30_ 40 448 259 dEn blandning av 25 mg av.detta material behandlas med 0,5 ml metyljodid och flera droppar metylenklorid. Efter att ha fått stå under 3 dygn i mörker avlägsnas lösningsmedlet genom avdrivning till-bildning av motsvarande metylsulfoniumjodid, oförening VII, med formeln: 2 3 I o-C32-CH3 E' fi2)6 I -s-I-cn _ CH I F í_ O: .I " 1 içhfl-(CH I-É-cH2-CH I gg a g 3 VII g I huvudsak i enlighet med de procedurer som anges i ex.

III erhålles en serumstandardkurva fràn förening VIIL Kommer- siella digoxinstandards använda i radioimmunoassay kits inne- ' hållande O, l, 2 och 4 nanogram (ng)/ml.digoxín användes. Slut- konoentrationen av digoxinantikropp är 0,2 X 10"? M, N-metyl- orfenadrin; 2,5 X 10-3 M och 1 x 10'3 M i immunoreaktionsbland- ningen resp. substratblandningen för blockering av serumpseudo- kolinesteras. ifiesultaten för standardkurvan är: Ii Digoxinstandard Ad¿5 min.

I 0 _ _ g »o,659.

I >o,5 ng/mi g 0,614 >-1,0 ng/ml ao,58§ -2,0 ng/hi: o,527 -4,o>ng/ml . - o,462g Av denna standardkurva kan okända kvantiteteridigoxin i serum-' prover bestämmas; Exemgel'VII _ En lösning av 3l,5 g av N-hydroxisuccinimidestern av_Nf bensyloxikarbonylglycin /U.Am.Chem.Soc,,_86, l859'(1964)/ i lOO ml tetrahydrofuran omsättes droppvis med l2.g 6-amino-l- hexanol ii5O ml 50% metanol i tetrahydrofuran. Reaktionsbland- ningen omröres iiialtimmar vid 23°c och hälies 1 vatten. Den. fl. 1A) *M5 (I 55] '?7 ..__ 'm448.259._ ¿ 1a1bildadeffallningén tvättas noggrant med vatten; filtreras pen'-ei *_ torkas till bildninšiav rå N:(pensyloxikarbónylglyeyl)-É~aminoél} » ihekan0lÄ_ Den rena föreningeniaterxristalliserad ur etylacetat; ehaiaeiíf 'smäi-fipunkc ¿v'š_1ou.-5»°c~.iii i ' i i__5 °En1lösning¿av 15 g av denna förening i TO ml pyridin kyles i :på iisbad, och 4,17 m1.¿ka11 metans-ulfonyikiorid. tillsätt-es under» lóppet av 5fmin¿r Efter Qmröringvii2 timmar vid-O-5OC hällesf rïreaktionsblandningen i iskylt vatten och bildad fällning upp: “ lsamlasfgenbmifiltrering. Det fasta ämnet àterkristalliseras ur i 'etylacetat/hexanftillfbildning av N-(benšyloxikarbonylglycyl)Å öæaminnhexylmetaneülfónat, smpfl 82f83OC.j¶ 1 I I i iösvningt» av 165 g» av". denna förening 1 75' m1 aimeuyifh i ï forníamid sättas till enf kall lösning aviluoig1ßèmerxaptoe1¿anoi ' i i 25Ümi qilmefiyiformamidi innehållande 2,65 g pafiriummeitoxid under :inert_atmQefär. ifieaktionsblandningen omröres i 2 timmar vid I frumetemperatur och nalles i natrinmkloridlösning._ Extraktion av i : ¶aennaf_i1ösning_ medi mefiyienklorid och scandardtvättníng,torkning ïochinpbarbetning'geriNå(bensyløxikarbonylalycyl)-9~amino-3-tia-1 e del-nonanól. >ÅterkristallisatiónVur etylacetat ger den rena före-I 520 . i ningen med smp;e99ÅlOO9C. ¿ i i' i * En lösning av 1,15 g av dennaialkohol i 7'ml klorofonn fbehandlas med 0,587 g tionylklorid; aßlandningen omröres i 1,5 timmar vid rnmstemperatur och de flyktiga ämnena avdrives vid ref= 'iducerat tryck. En lösning av l,O4ig av det kvarvarande fasta ämnet isš ml dimetylformamid sättes till en lösning av natrium- a' iO-etylmetylfosfonotipat (framställt av 2,69 mM natrinmhydrid och O,377_g Öaetylmetylfosfdnótionsyra)_i 1 ml dimetylfermamid. Efter pmröring i_l6 timmar vid 60°C hälles blandningen i en lösning av i.nafiriumklorid och extraheras med mefiylenklorid. .Den organiska e 3oie ¿ fasen tvättas, torkas och lösningsmedlet avläg%nas för åstad- kommande av en olja._ÜKromatografi på silikagel under användning 7'av 2-4%}metanel i metylenklorid ger O-etyl-S-/N-(bensyloxikarbonylf -Lglyeyl)f9-amine-Bftianonyl/metylfosfonotioat med följande struk- _¶- turformel: * i i i V' ~ ifçfiz 'a°"CI"_i*“'iHi'?H2'C'-ÜH (C32:7s'5"°32fçH2'S*P*°33_ i « i-fcnfcflš arfrliiEn lösning av 6¶g av N-beneyloxikarbqnylglycyl-9+amino-3-»i iVtiaÉl¿nQnanól i 100 ml metanøl innehållande l,l ekvivalentér ,e ¿w - tic.

Hsíí j_¶ _f¶» <::> ¶à íg ¶f ¶ ¶ Zí ¶ _ _ ?N* _ ' .,~ * ¶* ' .r _ *_ , 0_,¶. __f .:- CH 0 ¶¶1 ¶ ¿/¶ \CH2¿C-NH-cH2-cfNnf(cH -s¿cH -ch -s-ï-en V*5o¶¶ ¶ff$51¿¶¶_ ¶¶-¶ _ *7ExemQel VlII 40 ¶_min' respßil;fl x 109 liter molfl min “f39+¶,?¿ ¶:__?44s 259 f K ¶:-»Qib§¶HL*;fA 1 " ïí ' . ~_ íf-1 ¶ " K '_ N;f?Q~_7Ü'-'-~ '¿ ~ K, ?" " ' ' Ö; ~ 'C$?rC*N3f9Hz*°'NH'(°H2)e'Sf(°H2*2'5' 'CH3 CH CH ¶L --- 2 3¶f V¥II~ §:En_1ö¿n1fig a§Ãö;512 g av'denr¿ím¿tefia1 och 0,119 gi 'aimešjlgqlfat 1ï1 ml fietrahyarofurän upphec:¿sfv1a 65-7o°c 1 6 :_bi@maf pñder inért atmosfär. ¶Lösningsmedlefi avlägànas vid réduŶ _"çerat gfyQk__ Återstódçñ Éàs upp i kldfoform Qch en fällníng <¶ ¶¶»erhå1içs”gefiom tillsabs av efiyleter till bildning äv o-etyl-s-: /ïzf/21(N-aifepylhyagntoinyl)apecamido/C11-oxo~1o-aza-3-t1a¿o~ ¶. dekyl/hetylfosfonotioatmetylsulfat med formeln: _ ¶ ) . _ 2 5 + 2 2 3 I :_ ; _' , ' O-CH2 )CH3Q$O3V ' ” -CÉ3 :X- “¿Föreñingafng VIII och IX Har hastighetskónstantér av andfa ofdningen för inhibériñg av gÖetylkolinesteras_bestämda. geñQm_tídigare beskrivna förfaranden om 6,8 X 105 liter mol'1 l -l Denna inhiberíng modus ¶: lefas med dilañtinantikropp. En typisk Stahdardkurva i_buffert_ för föréníngéh>ÉXjär;¶' ¶ ',* 7 ¶¶ 7 ¶ ¶ ¶¶ ¶ ” i J 9 fnilancinkoncï _¶_ ¶ _ ¶ mq1er¿liter'¶¶' mAd¿5 min.¶ K: Q! ”'i 8É,5' 'i loffk ¶ ¶¶¶ ¶74,1 ¿¿ _. 1o'5 ' ¶ ¶ ¶ ¶ °62,5 íí f1ø'51¶: ¶ I enlighet hed-procedüfen i ex§ VII men under användning> ¶- :av ètyl54-brombutyfat erhålles 4å(N4difenylhydantQinyl§smörsyfa;- f ~-smp,=1n7f1us°c, W ¶ *- * 'L íf¶¶N-hydšoxi45-norbornen-2,5-aikarboximiaëStern.av Nfxarbo- 47,2 ¶¶ “¶¶ . ¶¶¶ $7¶ï¶¶ i Åwß í 2ff9 ß A'.!_b§nsy1ø¿1ÅB-¿1¿n1fif2Chem§Pparm;Bfi11§, 2è;,ï857:(1974j/ (15¿88¶g§ J 1.. i lO ?f _ 30* 55 ud fmed fbrmélnzü ¶ - minfl.

A¶1ättïksyra, och blandningen ompöres vid rumstemperatur 1 l tímmeĶ ¶'Magnesipmšulfátèt¶á§lägSñàs;genoM'filtfêring och Iösnipgsmedlëå kpndenšérgš'mèd 5fg av¿54amino~3~tiáfl-pentángl uhder användning ¶¶ av tidigare beskrivna pbQcedurep¿till.bildníng av 9-bénsyloxi-¶'“¶ karBamido~¶-oxo?6åaza=5ffia-1-nonañol, smpf 99-lOl9C:1 Hydrering av dettá materia;-ger 9#amínó~7-oxofå-aza-5~ti¿4l-nohanolhydroi Klorïd;}f ¶ I ' Z ¶ _ ¶ ¶ ¶¶ ' ¶ ¶ ' ¶ ¶* ;._Ho1-N52-gH2;cH¿~co~NH+CHëÉCH¿~S+oHè~cH¿-OH* ;>, ¶ ; ¿¶petta¶materi3í;køqdçpseras'med_4+N-(Nidífenylhydantofnyl)-¶'V _¶ ' å Smörsyra npdér'tidígafç beskriven teknik;'oëh produkten omsättesïï ' med nabfï?m~O_etylmefiylfošfoñotioat tiil bildning av çtt konjpgaf ¶ _ \CH2)3"C"NH'(CH2)2“C-NH~(cH2)Qfs-tcfizëfs-I-cH3 -¶ffKonjugatet§X;har en haStighetskonstant¶áy andra ordningen _ får inhiberingïaü'aèetylkclinesfièraš av 2,2 X 106 liter mol-1 _ ¶ ¶Denna moduléring ihhiberas i fiärvaro'av dilantinantikfópp.

En standardkurva kaniàsßadkommas för att möjliggöra besfi_ämnihgÛ¶ ¶ ¶av-dilantin í'serumprover; i %Exempel%n% ^ ~ ¶25¶__ ¶¶ * ' peñtyl/hebylfqsfonopíaàç sättas 20 ml §O%_metyïehkl6rid~trifluo?¥ ¶ “'¶¶T111 204 mg oÄ¿ty1¿S-/5-(tfbutoxigafbçnylafiínoä~5fš1¿;f Lösningsmedlét avdrives och eñffioluenazeotrçp användes för avé \1ägsnandç av kvarvarande,triflnorättikšyra. ÅterstQden.upplöses íi 2,0 ml aimeuylfdrmgmia; och 83/ul cr1ety1am1n,fl14o mg 6-(3-f teøfyllin)hexansyra framštälld_genóm förfarandet enligfi W. Traube¿ ¶fBer,; 56; 5035 (1909), 14Q¶mg_hydrëxibenstriazol,¶113-mg aicyxlo- = heXylkarbodiimid¶ochïl-jl dimetylformámid tillsättes. Reaktions- blandnínåen omröres vid rumstemperatur i 6 timmar och 1ösningS~.¶«¶¶'_ '~ÜÜ ¶medlet avlägsnas genóm'avdríVníng'víd'reducerat'tryck.¿ Återstoden =upplö§çs i métylefiklorid, tvättas med ñàtríumvätekarbonat,¶mäçtgd .jv natriumklorídiösning'QQh_torkas överÅv¿ttébfrittfmàgnesiumsuifáš;¶, ¶É-'¶' si» avlägsnàs genom avåuhšfiningw. Åtèrstoden renaà genom kromatografi F ïpá silikagel ündér användning av 10% metafio1_í.metylenk1orid som N; \v¿ Pio if) +41 ¶ 443. 259V ji¶¶f:è1uefiiñéàmédél¶tilIfbilfinífigïav:N~/ÉÉ/@~fetóximetylfosfinylfiio)~ 'etylfiib/ètyl/Élfmetylèâ,§-dipXo+l,2;3;6-tetrahydro-7H-purín+3- V _1, ínexuanamiaj, ïsgnp; 1LQ¿5-IQ¶_6.°;C-'>~med.följàlnaeíformen * ' ¶ . (CI-Iz)sfiífblflrfCflvfCflz-S-efll-IzFCH2A-S-Ã-ÉH3 _ . Ä" -._'. >. > CHZ VCHQ- ¿>*T@ënna föréfiing har éh hastighetskonštant av andra ord- * ningen får inhibefing àviacetylkolingšteras av 5j5 X 10' liter 1 -¶ mål' .ñinfl.¶ Denna ifihíberingAmodu1eras med jebfyllinantikropp. _ ¶ ¶ Föfeliggahde förening användeà för att beštämma teofyllin-i blod- _ 715* f Séfüm_gepQfi förfàfandeñuàomidígare beskrivits.

Claims (1)

1. k kk2¶5_9 ef42¶ j! PATENTKRAx/e: _ i i med etfi konjuggt av lígandanalog och írrevereíbel enzyminhíbitor. v och ett bindningšpfotein; som är bindníngsbart till liganden och.e¶ emängden konjügat av lig¿nd;naIog_och irreversibel enzymínhibí- 1; jFöffaíànde för'bestänning'Äv"Iiganåer*í_testprovef,k' k äfn n e»rlefç¶k"n'a.tW därav; att nån šammanblandar testprovet konjngat av ligàndanlog och írrevereíbel enzyminhibítor, varvid 'tor bonden ;íl1_bíndningsproteínet är reláterad till mängden' ïliganä i testprovet, och varvid nämndá_bíndníngsprotein-inaktíf e_Vei¿r den ifïeveršíhla enzymínhibíforn vid bindning till kon- fjugatets lígandanalogdel; at; man ínblandar ett enzym, som irre- eveïsibelt inhiberas av det av bíndningsproteínet obundna konju- ¶ gàtef ávfligandánalog och írreversißel enzyminhíbipor§ och ätt' man inblandåf«subštfat till enzymet och moníterar¶enzym-substrat-1 »1reaktíonen, varvid enzymet är acetylkolinesteras och att den irre~ É ff versibla enzyminhíbítorn är en organofoeforenzyminhibítor, som 'ningar.' E däfav, att serümprovet behandlas för inaktiveríng eller avlägs- reagerár med acetylkolínéstefas till bildning av kovalenta bind. _ Z{ e Förfarande enligt krav 1, k äln n e_t e c k n a f nànde av serfimkólinestefas; f f , _ e=_ ¶1¶f 1 3. eFofÉarandeken1ígt krav l eller'2;_'k-ä n n e t'e c k- n a't Härav; att enzymsüßstratet är acetyltiokolin och att ensymsubstfatreaktionen moniteras genom_spektrofotometrísk mät- ning av reaktionen mellan tiokolin och 5,S'~ditiobís-(ZÉnítro- bensoesyra), ~-¶" 7 __ ” 1v_ i ' 4;- Analytisktereagens fö; bestämning av lígander i fest-e _, _,...... »...»-....~.__.-.;-,.....-M«.~._...;...., .__ _ _ v. prover; k ä-n-n e-t e c'k n a t_ därav, att det innehåller ¶ konjngat av lígandanalog och irreversíbel enáyminhibítoï, som* är en írreversíbeleorgánofosforenzymínhibito: av àcetylkoline-n stefas, 7 ' '_f * I I ” I j * Z 7 " 5;>, Ånaïytískteteggens¶enligf krav 4 med formeln; f.v ¶ -Z ¶* = ¶|L: Q ek'-ï-SeCHZ-CHZeBf -(CHz)n§NH-C-hapten I _; _ ., v . e v . - ' v e eR" e ” e e * Ü ; ¶ J. 'H e¶ none - \ vàrí n är_2f8 och R>och R" är alkyi med l¿10 kolatomer och B' ¶ är -S ellef¿$ü1fonjumšaltet därav; «, ,*