FI86441B - Foerfarande och reagens foer specifik bestaemning av bukspottkoertelns alfa-amylas. - Google Patents

Description

Menetelmä ja reagenssi haiman alfa-amylaasin spesifiseksi määrittämiseksi 1 86441

Keksintö koskee menetelmää haiman alfa-amylaasin spesifiseksi määrittämiseksi syljen alfa-amylaasin läsnäollessa.

Alfa-amylaasi (E.C. 3.2.1.1) pilkkoo 1,4-d-glukosidisesti sitoutuneita poly- ja oligosakkarideja maltoosiksi ja malto-oligosakkarideiksi pääasiassa hajottamalla satunnaisesti 1,4-alfa-glukosidisidoksia. Tällä entsyymillä on käymisteollisuuden ohella huomattava merkitys kliinisessä analytiikassa ja diagnostiikassa. Nimittäin lukuisissa sairauksissa kehon nesteiden, kuten seerumin, virtsan tai pohjukaissuolieritteen, alfa-amylaasipitoisuus muuttuu. Kehossa esiintyy kuitenkin oleellisesti ottaen kahta alfa-amylaasientsyymiä, jotka ovat haiman alfa-amylaasi ja syljen alfa-amylaasi. Koska diagnostiikassa tulee kysymykseen vain haiman entsyymi, pitää nämä molemmat (harvoin ja vain pieninä määrinä esiintyvän muun isoentsyymin ohella) alfa-amylaasi t erottaa analyyttisesti toisistaan. Vaikeus on siinä, että molemmat muodot ovat rakenteeltaan samankal- • * täisiä ja immunologisesti identtisiä (K. Lorentz, Labora- « « ... toriumsblätter, 32 : 118 (1982)). Syljen entsyymin aktiivi- ! . suuden eliminoimiseksi on ennestään käytetty adsorptiota • ’· anioninvaihtimeen, inhibointia vehnän proteiinilla tai elektroforeesia tai elektrofokusointia. Nämä menetelmät ovat joko erotusvaikutukseltaan epätyydyttäviä tai rutiini-diagnostiikkaa ajatellen liian monimutkaisia. Mainituista • -j menetelmistä vain julkaisussa Clin. Chem. 28/7, 1525-1527 : (1982) selostettu menetelmä, jossa käytetään sylkityyppi- sen entsyymin inhibointia vehnänalkioista saadulla inhi-..* biittorilla, on nopeudeltaan rutiinidiagnooseihin hyväk- y syttävä, mutta menetelmän selektiivisyys on epätyydyttävä.

Myös optimaalisessa inhibiittoriväkevyydessä säilyy sylki-tyyppisen entsyymin aktiivisuudesta 13 %, kun taas haima-entsyymin aktiivisuus pienenee noin 81 %:iin.

2 86441

Eurooppalaisessa patenttihakemusjulkaisussa 150 309 kuvataan haiman alfa-amylaasin määrittämistä syljen alfa-amylaasin läsnäollessa siten, että työskennellään monoklo-naalisen vasta-aineen läsnäollessa, joka reagoi syljen alfa-amylaasin kanssa, ja jonka ristiinreagointikyky haiman alfa-amylaasin kanssa on 5 % tai vähemmän. Tätä monoklonaa-lista vasta-ainetta käytettäessä on saostavaa reagenssia lisäämällä myös mahdollista muodostaa syljen alfa-amylaasin kanssa liukenematon kompleksi, joka voidaan erottaa liuoksesta niin, että liuokseen jää jäljelle vain haiman entsyymi, joka voidaan määrittää siitä. Vaihtoehtoisesti on mahdollista käyttää monoklonaalista vasta-ainetta immo-bilisoidussa muodossa ja erottaa syljen entsyymi tällä tavalla. Kummassakin tapauksessa on kuitenkin tarpeen muodostaa liukenematon faasi ja erottaa se liukenevasta faasista .

Patenttijulkaisussa DE A-1 35 00 526.2 selostetaan menetelmää, jossa mainitussa eurooppalaisessa patenttihakemusjulkaisussa käytetyn sitoutuvan vasta-aineen tilalla käytetään spesifisesti syljen isoentsyymiä inhiboivaa monoklonaalista vasta-ainetta. Tällä tavalla tosin saavutetaan parannus alfa-amylaasi-isoentsyymin määritykseen ilman, että tarvittaisiin faasinerotus, mutta syljen entsyymille saavu-•' tettu maksimaalinen inhibitio oli alle 97 %, ja näin ol len määritysmenetelmän tarkkuus ei vieläkään ole riittävän hyvä.

Näin ollen esillä olevan keksinnön tarkoituksena on pois-: : taa tämä haitta ja tarjota menetelmä ja reagenssi, joilla on mahdollista määrittää nopeasti ja yksinkertaisesti, : mutta aikaisempaan verrattuna tarkemmin kehon nesteistä .·;·. haiman alfa-amylaasi syljen alfa-amylaasin läsnäollessa.

‘ * Keksinnönmukaisesti tämä on ratkaistu tarjoamalla mene telmä haiman alfa-amylaasin spesifiseksi määrittämiseksi syljen alfa-amylaasin läsnäollessa kehon nesteistä, kuten 3 86441 seerumista, plasmasta, pohjukaissuolinesteestä tai virtsasta, suorittamalla reaktio alfa-amylaasin osoittamis-systeemin kanssa sellaisen monoklonaalisen vasta-aineen läsnäollessa, joka inhiboi syljen alfa-amylaasia, ja menetelmälle on tunnusomaista se, että inhibiittorina käytetään ensimmäistä monoklonaalista vasta-ainetta, joka inhiboi spesifisesti syljen entsyymin aktiivisuudesta alle 97 %, sekä lisänä toista monoklonaalista syljen alfa-amylaasin vasta-ainetta, joka inhiboi tämän entsyymin aktiivisuudesta alle 10 %.

Tarkemmin sanottuna sopivat keksinnönmukaisesti estäviksi vasta-aineiksi sellaiset ensimmäisinä monoklonaalisina vasta-aineina käytettävät vasta-aineet, jotka inhiboivat alle 93 %, ja sitoutuviksi vasta-aineiksi sellaiset toisina monoklonaalisina vasta-aineina käytettävät vasta-aineet, jotka inhiboivat alle 5 % syljen entsyymin aktiivisuudesta. Inhiboivan vaikutuksen alarajana on pidettävä noin 70 %, mielellään 80 %, jotta keksinnönmukaisella yhdistelmällä saavutettaisiin 97 %:nen inhibitio.

: S" Keksinnönmukainen menetelmä perustuu siihen,yllättävään ha- ΙΓ * vaintoon, että sellaisen monoklonaalisen vasta-aineen inhi- ... boiva vaikutus, joka ei estä syljen entsyymiä täysin tyy- V . dyttävällä tavalla, vahvistuu synergisesti, kun lisäksi « · « '· " käytetään vain sitoutuvaa monoklonaalista vasta-ainetta, joka ei käytännöllisesti lainkaan estä tai estää aivan riittämättömässä määrin, ja lopputuloksena on syljen entsyymin lähes kvantitatiivinen inhiboituminen samalla kun haiman entsyymin aktiivisuus säilyy lähes 100 %:sesti.

Lisäksi näin on mahdollista lyhentää inkubointiaikoja huomattavasti,

Keksinnönmukaisessa menetelmässä on edullista käyttää ensim-*; mäisenä monoklonaalisena vasta-aineena NCACC-kokoelmiin nume- *··: roilla (99D12) 84122003 ja (89E2) 84122004 talletetuista (Na- | ' : tional Collection of Animal Cell Culture, Porton Down, Iso-

Britannia) soluviljelmistä saatuja vasta-aineita. Toisina monoklonaa- 4 86441 lisinä vasta-aineina on edullista käyttää patenttijulkaisussa EP-A-150 309 mainittuja sitoutuvia vasta-aineita, jotka saadaan NCACC-kokoelmiin numeroilla 84111301 ja 84111302 talletetuista soluviljelmistä, joista etusijalle asetetaan NCACC 84111301.

Kulloinkin tarvittavat ensimmäisen ja toisen vasta-aineen määrät voidaan helposti määrittää kokeellisesti kullekin vasta-ainepreparaatille. Mielellään käytetään ensimmäistä monoklonaalista vasta-ainetta vähintään 5 yg/ml, mieluunmin vähintään 20 yg/ml, ja toista monoklonaalista vasta-ainetta vähintään 1 yg/ml, mieluummin 5 yg/ml.

Keksinnönmukaisesti käyttökelpoiset monoklonaaliset vasta-aineet saadaan aikaan immunisoimalla koe-eläimet luontaisella tai muunnetulla syljen alfa-amylaasilla, fuusioimalla näin saatujen immunisoitujen eläinten B-lymfosyytit transformoivien agenssien kanssa, kloonaamalla ja viljelemällä näin aikaansaatuja hybridisoluja, jotka tuottavat monoklonaalisia vasta-aineita, ja eristämällä vasta-aineet. Erittäin sopivia eläimiä syljen alfa-amylaasin vasta-ai-. : : neiden tuottamiseen ovat rotat ja hiiret. Immunisointi voidaan suorittaa joko luontaisella ihmisen syljen alfani*: amylaasilla tai muunnetulla syljen alf a-amylaasilla. Jos käytetään luontaista entsyymiä, sopii tähän tarkoitukseen . kaupallisesti saatavissa oleva, elektroforeettisesti puh- das preparaatti. Kemiallisesti muunnettu syljen alfa-amy-laasi saadaan aikaan ennestään tunnetuilla entsyymien muun-. tamisemenetelmillä, kuten esim. patenttijulkaisussa DE- !., AS 25 43 994 on tarkemmin selostettu. Sopivia muuntamis- aineita ovat esimerkiksi N-bromisukkinimidi (NBS) ha-• pettämällä proteiinin tryptofääniryhmät (BBA 143 (1967) : : 462-472), karboksimetylointi jodiasetaatilla (IAA), joka . vaikuttaa pääasiassa histidiiniin, tai nitraus tetranitro- .. . metaanilla (TNM) (J. Biol. Chem. 238 (1963) 3307) sekä ' ‘ diatsotointi diatsotoidulla sulfaniliinihapolla (Meth.

5 86441

Enzymol. 25 (1972) 515-531). Parhaiten soveltuvaksi osoittautui tällöin TNMrllä muunnettu entsyymi käytettäessä Balb/c -hiiriä ja luontainen entsyymi käytettäessä AJ-hiiriä.

Immunisointi suoritetaan tavalliseen tapaan antamalla luontaista tai muunnettua entsyymiä mielellään yhdessä adju-vantin kanssa. Edullinen adjuvantti on alumiinihydroksidi yhdessä Bordatella pertussis -bakteerin kanssa. Kun immunisointi suoritetaan luontaisella syljen alfa-amylaasilla käytettäessä AJ-hiiriä tai TNMrllä muunnetulla syljen alfa-amylaasilla käytettäessä Balb/c -hiiriä, tapahtuu immunisointi mielellään 9 kuukauden kuluessa vähintään 7 immunisointi-injektiolla (i.p.).

Onnistuneen immunisoinnin jälkeen fuusioidaan immunisoitujen eläinten B-lymfosyytit tavalliseen tapaan transformoivien agenssien kanssa. Esimerkkejä transformoivista agens-seista, joita voidaan käyttää keksinnönmukaisesti, ovat myeloomasolut, transformoidut virukset, kuten esim. Epstein-Barr -virus, tai DE-hakemusjulkaisussa 32 45 665 selostetut ··1 · agenssit. Fuusiointi suoritetaan ennestään tunnetulla Köh- : ·' lerin ja Millsteinin menetelmällä (Nature 256 (1975) 495- : 497). Näin muodostuneet hybridisolut kloonataan tavalliseen ' tapaan, esim. käyttämällä kaupallisesti saatavissa olevaa : solunerottelijaa, ja saatuja klooneja, jotka tuottavat haluttuja monoklonaalisia vasta-aineita, viljellään. Hybri-doomasolujen syöpämäisen kasvun perusteella voidaan näitä ; kasvattaa rajoittamaton aika ja ne tuottavat haluttuja monoklonaalisia vasta-aineita rajattomasti.

Keksinnönmukaisessa määritysmenetelmässä voidaan monoklo- : ·' naalisia vasta-aineita käyttää sellaisinaan tai vastaavat immunologiset ominaisuudet omaavina fragmentteina (Fab-.. . fragmentteina). Termillä monoklonaaliset vasta-aineet tar koitetaan tässä yhteydessä näin ollen myös fragmentteja.

Sekä täydellisiä vasta-aineita että niiden fragmentteja voidaan käyttää immobilisoidussa muodossa.

6 86441

Alfa-amylaasin määrittäminen tapahtuu sinänsä tunnetuilla menetelmillä. Koska keksinnönmukainen monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmä inhiboi selektiivisesti syljen tyyppistä alfa-amylaasia ja näin poistaa sen määritetyksi tulemisen, vaikuttamatta haiman entsyymiin, vastaavat monoklonaalisten vasta-aineiden läsnäollessa saadut alfa-amy-laasinmääritystulokset pelkkää haiman entsyymin aktiivisuutta .

Keksinnönmukainen menetelmä on edullista toteuttaa käyttämällä alfa-amylaasin toteamisessa systeemiä, joka sisältää maltopolyoosia, jonka molekyylissä on 4-7 glukoosi-tähdettä, maltoosifosforylaasia, β-fosfoglukomutaasia, glu-koosi-6-fosfaattidehydrogenaasia ja NAD:tä.

Toinen keksinnönmukaisesti edullinen alfa-amylaasintotea-missysteemi koostuu nitrofenyylimaltopolyoosista, jonka molekyylissä on 4-7 glukoositähdettä, ja alfa-glukosidaa-sista.

Vielä eräs edullinen alfa-amylaasin osoittamissysteemi koos- · tuu määritettävissä olevilla ryhmillä muunnetusta tärkke- : " lyksestä. Muunnetulla tärkkelyksellä tarkoitetaan esimer- ".· " kiksi sellaisia tärkkelyksiä, jotka on muunnettu määri- :,Y tettävillä ryhmillä, kuten kauppanimellä "Phadebas" myy- : : : tävää tuotetta (Pharmacia, Ruotsi) sekä DE-hakemusjulkai- :Y: sussa 28 12 154 kuvattua tuotetta, sekä hajoamiskäyttäyty- miseltään muunnettuja tuotteita, kuten karboksimetyyli-: tärkkelyksiä ja rajadekstriinejä. Kaikki nämä systeemit ..." ovat ennestään tunnettuja, joten niitä ei tarvitse selos taa tarkemmin.

Y : Keksinnönmukaisen menetelmän toteuttamiseksi näyteliuosta ____: inkuboidaan ensin keksinnönmukaisesti käytettyjen vasta- .. . aineiden kanssa ja sen jälkeen suoritetaan välittömästi tavallinen amylaasikoe tai näyte lisätään seokseen, joka sisältää vasta-aineet ja amylaasinosoittamisreagenssin 7 86441 ilman substraattia ja inkuboinnin jälkeen lisätään substraatti. Inkubointiaika riippuu käytettyjen vasta-aineiden aktiivisuudesta ja on mielellään 0,5 - 10 minuuttia, erityisesti noin 5 minuuttia.

Mikäli syljen alfa-amylaasin erottaminen on toivottavaa, voi toinen monoklonaalisista vasta-aineista, joko täydellisenä tai osan muodossa, olla kiinnitettynä kiinteään kantaja-aineeseen, esimerkiksi immunosorptiiviseen paperiin tai muoviputken tai muoviletkun pintaan. Tällä tavalla sitoutuu syljen alfa-amylaasi kantaja-aineeseen eli siis kiinteään faasiin.

Keksintö perustuu seuraaviin koetuloksiin:

Monoklonaalinen vasta-aine (MAK), joka inhiboi spesifisesti ihmisen syljen alfa-amylaasin aktiivisuudesta korkeintaan 93 %, puhdistetaan tavalliseen tapaan ammoniumsul-faattisaostuksella ja DEAE-kromatografiällä. Samalla tavalla puhdistetaan monoklonaalinen vasta-aine, joka sitoutuu spesifisesti h-SA:han. Yhtä tai molempia monoklonaali-; siä vasta-aineita sisältävään liuokseen sekoitetaan ihmi- : sen amylaasia ja saatua seosta sekoitetaan 5 minuuttia huoneen lämpötilassa. Sen jälkeen tämä seos lisätään amy-: laasireagenssiin ja amylaasiaktiivisuus mitataan. Verrok- . .·. kina toimii amylaasi, johon on sekoitettu puskuria ilman monoklonaalisia vasta-aineita. Vaihtoehtoisesti voidaan toinen tai molemmat monoklonaaliset vasta-aineet ensin sekoittaa amylaasireagenssin osaan - alfa-glukosidaasiliuokseen. Sen jälkeen lisätään amylaasiliuos ja inkuboidaan ' 5 minuuttia. Reaktio aloitetaan substraatilla, joka on G^PNP (p-nitrofenyylimaltoheptaosidi) . Verrokkina toimii .**. glukosidaasiliuos, joka ei sisällä monoklonaalisia vasta- * . aineita. Kuvassa 1 on esitetty ihmisen syljen alfa-amy laasin ja ihmisen haiman alfa-amylaasin jäännösaktiivi-: .’ suus prosentteina, kun on käytetty sitoutuvia monoklonaa lisia vasta-aineita, tai kun niitä ei ole käytetty, inhi- 8 86441 hoivien monoklonnaJisien vasta-aineiden loppuväkevyyden funktiona substraatilla aloitetussa menetelmässä. Taulukossa 1 on esitetty .seerumilla aloitetulla menetelmällä (molemmat monoklonaaliset vasta-aineet ja amylaasi. sekoitetaan ensin keskenään).

Taulukko l

Ihmisen syl jen a J fn-amy l.ans i n ja haiman a I fa-ainy.l aas i n inhibointi inhiboivalla monoklonaalisei In vasta-aineella NCACC 84122003 (ΜΛΚ 1) tai 84122004 (ΜΛΚ li) ja/tai sitoutuvalla monoklonaal 1 se 1.1 a vasta-aineella NCACC 84 111301 (MAK III); seerumilla aloiteltu menetelmä, substraattina G^PNP. GA = kokonaisaktiivisuus, A = aktiivisuus yhden tai kahden MAK:n kanssa, RA = jäännösaktiivisuus prosentteina .

Amylaasi GA ΜΛΚ 1 MAK li ΜΛΚ III MAKtI/11 MÄKI. 1I/III 30 |iq/ml 2r> |iq/m1 3 pq/ml 3()/r> |ig/ml 2r>/ri pg/mL Λ RA Λ RA Λ RA A RA A RA

(U/l)(U/l)(%) (U/l)(%) (U/l)(%) (U/l) (%) (U/l) (%) • · • · · : Sylki 1476 127 8,6 133 9,1 1430 96,9 40 2,7 37 2,3 • «

Haima 1430 1442 100,8 1428 99,9 1424 99,6 1403 98,2 1426 99,7 • · · • · · • · • · · • · · • * : Kuvan ja taulukon perusteella voidaan havaita, että inhi- hoivien, spesifisten monoklonaalisten vasta-aineiden ja spesifisesti ihmisen syljen alfa-amylaasiin sitoutuvien monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmällä on synerqi- .·;·] sesti inhibointia lisäävä vaikutus. Tämä vaikutus on riip-* · · pumaton substraatista. Se ilmenee yhtä hyvin suurimoin- • · · : kyylisellä substraatilla (värjätty tärkkelys) kuin l.yhyt- ketjuisella substraatilla (esim. G.-PNP (p-nitrofenyyli-maltopentaosidi) . Vaikutus ilmeni myös, kun käytettiin substraattina etyyli-G7PNP:tä. Nämä molemmat monoklonaaliset vasta-aineet inhiboivat synergisesti myö ihmisen syljen amylaasia ihmisen seerumeissa.

9 86441

Keksintö koskee myös reagenssia haiman alfa-amylaasin spesifiseksi määrittämiseksi syljen alfa-amylaasin läsnäollessa kehon nesteistä, erityisesti seerumista, pöhjukaissuoli-nesteestä, plasmasta tai virtsasta, joka reagenssi sisältää systeemin alfa-amylaasin osoittamiseksi sekä syljen alfa-amylaasiin kohdistuvaa monoklonaalista vasta-ainetta, ja reagenssille on tunnusomaista se, että se sisältää ensimmäistä monoklonaalista vasta-ainetta, joka estää syljen entsyymin aktiivisuudesta alle 97 % sekä toista monoklonaalista syljen alfa-amylaasin vasta-ainetta, joka estää tämän entsyymin aktiivisuudesta alle 10 %.

Mitä tulee keksinnönmukaisen reagenssin sisältämään alfa-amylaasinosoittamissysteemiin ja muihin olosuhteisiin, pätevät edelläkuvatut toteutustavat vastaavasti.

Keksintö tekee mahdolliseksi haiman alfa-amylaasin (h-PA) määrittämisen yksinkertaisesti, nopeasti ja tarkasti syljen alfa-amylaasin (h-SA) läsnäollessa kehon nesteistä ja parantaa näin kliinisen diagnostiikan mahdollisuuksia huomattavasti.

Keksintöä valaistaan seuraavilla esimerkeillä:

Esimerkki 1 ‘ -t Ihmisen haiman alfa-amylaasin ja syljen alfa-amylaasin in- hiboituminen käyttämällä pelkkää 1. MAKrta (NCACC 84122004) tai lisäksi 2. MAK:ta (NCACC 84111301), seerumilla aloitet-: tu menetelmä

Reagenssit: Puskuri: 100 mM PO^3 , 150 nM NaCl, 6 % naudan seerumin albumiini, pH 7,1

Amylaasireagenssi: G^PNP (Boehringer Mannheim, luettelo no 568589, 37 °C) MAK-1: 0,63 mg/ml 1. MAK puskurissa ΜΛΚ-2: 0,63 mg/ml 1. MAK ja 0,105 mg/ml 2. MAK puskurissa MAK-3: 0,105 mg/ml 2. MAK puskurissa h-SA: n. 3000 U/l (G^PNP) puskurissa h-PA: n. 3000 U/l (G^PNP) puskurissa 10 86441

Koe: 100 yl h-SA:ta tai h-PA:ta sekoitetaan 100 yl:aan puskuria tai kulloinkin kyseessä olevaa MAK-liuosta ja sen jälkeen inkuboidaan 5 minuuttia huoneenlämpötilassa. Sen jälkeen kussakin tapauksessa lisätään 25 yl saatua seosta 1000 ylraan 37 °C:een esilämmitettyä amylaasireagenssia ja amylaasiaktiivisuus määritetään ohjeen mukaan. Jäännös-aktiivisuus lasketaan seuraavan kaavan mukaan: Jäännösaktiivisuus (%) = aktiivisuus MAK:n (iden) kanssa x iq0 aktiivisuus ilman MAK:ta (itä)

Tulos: Vastaavat h-SA:n jäännösaktiivisuudet olivat 1.

MAK:11a 8,6 %, 2. MAK:11a 96,9 % ja kummallakin MAK:11a 2,7 %. h-PA:n jäännösaktiivisuudet olivat vastaavasti 100,1 %, 99,6 % ja 99,7 %.

Esimerkki 2

Amylaasin inhiboituminen 1. MAK:lla (NCACC 84122003) ja/tai 2. MAK:lla (NCACC 84111301), seerumilla aloitettu menetelmä.

Reagenssit: Samat kuin esimerkissä 1, vain MAK-1 ja MAK-2 ft muutettu.

MAK-1': 0,525 mg/ml 1. MAK puskurissa MAK-2 ' : 0,525 mg/ml 1. MAK ja 0,105 mg/ml 2. MAK puskurissa

Koe: Kuten esimerkissä 1, samoin jäännösaktiivisuusprosen-tin laskeminen.

Tulosi h-SA:n jäännösaktiivisuudet olivat 1. MAK: 11a 9,1 %, 2. MAK:11a 96,9 % ja kummallakin MAK:11a 2,5 %. Vastaavat h-PA:n jäännösaktiivisuudet olivat 99,9 %, 99, 6 % ja 99,7 %.

·* ·. Esimerkki 3 ‘.f Ihmisen syljen alfa-amylaasin ja haiman alfa-amylaasin inhiboituminen käyttämällä pelkkää 1. MAK:ta (NCACC 84122004) tai lisäksi 2. ΜΛΚ:tn (NCACC 84111301), substraa-• 'f tiliä aloitettu menetelmä.

11 86441

Reagenssit: Puskuri (kuten esimerkissä 1) h-SA (kuten esimerkissä 1) h-PA (kuten esimerkissä 1) MAK-1,,; 1. MAK puskurissa, eri pitoisuuksina MAK-2·': 2. MAK puskurissa, 0,513 mg/ml alfa-glukosidaasi: amylaasireagenssista (Boehringer Mannhäim, luettelon no 568589) substraatti: G^PNP amylaasireagenssista Koe: 880 |il:aan aifa-qlukosidaasia lisätään 10 μ 1 MAK-1 1 '-liuosta sekä 10 μ1 ΜΛΚ-2''-liuosta tai 10 μΐ puskuria. Sen jälkeen mukaan sekoitetaan 25 μΐ h-PA:ta tai h-SA:ta. Saatua seosta inkuboidaan 5 minuuttia 37 °C:ssa. Sen jälkeen lisätään 100 yl substraattiliuosta ja amylaasiaktiivisuus määritetään ohjeen mukaan. Verrokkina käytetään seosta, joka sisältää alfa-glukosidaasin, 20 yl puskuria sekä vastaavaa amylaasia. Kun MAK:n (iden) läsnäollessa saatu aktiivisuus jaetaan aktiivisuudella, joka on saatu MAK:n (iden) poissaollessa, saadaan prosentuaalinen jäännösak-tiivisuus.

Koe: Kuvassa 1 on esitetty prosentuaalinen jäännösaktiivi-: ! suus 1. MAK:n loppuväkevyyden funktiona; h-SA:n tapauk- . "·· sessa 2. MAK:n kanssa ja ilman ja h-PA:n tapauksessa vain · : : 2. MAK:n kanssa.

• « *

Claims (14)

1. Förfarande för specifik bestämning av pankreas-a-amylas i närvaro av saliv-a-amylas i kroppsvätskor, speciellt i serum, plasma, duodena1fluidum eller urin, genom omsättning med ett system för pävisande av α-amylas i närvaro av en monoklonal antikropp, som inhiberar saliv-a-amylas, känne-tecknat av att säsom inhibitor användes en första monoklonal antikropp, som hämmar salivenzymets aktivitet specifikt över 70 % men under 97 %, samt ytterligare en andra monoklonal antikropp av saliv-a-amylas som hämmar aktiviteten av detta enzym under 10 %.

1. Menetelmä haiman α-amylaasin spesifiseksi määrittämiseksi syljen α-amylaasin läsnäollessa kehon nesteistä, erityisesti seerumista, plasmasta, pöhjukaissuolinesteestä tai virtsasta, suorittamalla reaktio α-amylaasin osoittamissys-teemin kanssa sellaisen monoklonaalisen vasta-aineen läsnäollessa, joka inhiboi syljen a-amylaasia, tunnettu siitä, että inhibiittorina käytetään ensimmäistä monoklonaalista vasta-ainetta, joka estää spesifisesti syljen entsyymin aktiivisuudesta yli 70 %, mutta alle 97 %, sekä lisänä toista monoklonaalista syljen α-amylaasin vasta-ainetta, joka estää tämän entsyymin aktiivisuudesta alle 10 %.

2. Förfarande enligt patentkravet 1, kännetecknat av att den första antikroppen hämmar salivenzymets aktivitet under 15 86441 93. och att den andra antikroppen hämmar enzyxnets aktivitet under 5 %.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ensimmäinen vasta-aine estää syljen entsyymin aktiivisuudesta alle 93 % ja toinen vasta-aine estää entsyymin aktiivisuudesta alle 5 %.

3. Förfarande enligt patentkravet 1 eller 2, kännetecknat av att man använder monoklonala antikroppar, som erhälles genom immunisering av AJ-möss med nativt eller modifierat saliv-a-amylas, fusionering av B-lymfocyter frän immunisera-de djur med transformeringsmedel, kloning och odling av sä-lunda bildade hybridceller samt isolering av de monoklonala antikroppar som producerats av den sistnämnda.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään monoklonaalisia vasta-aineita, jotka saadaan immunisoimalla AJ-hiiret luontaisella tai muunnetulla syljen a-amylaasilla, fuusioimalla immunisoitujen eläinten B-lymfosyytit transformoivien agenssien kanssa, kloonaamalla ja viljelemällä näin muodostuneita hybridisolu-ja ja eristämällä viimeksi mainittujen tuottamat monoklonaa- • ' liset vasta-aineet.

4. Förfarande enligt patentkravet 3, kännetecknat av att den första monoklonala antikroppen är NCACC 84122003 eller NCACC 84122004.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ensimmäinen monoklonaalinen vasta-aine on NCACC 84122003 tai NCACC 84122004.

5. Förfarande enligt patentkravet 2 eller 3, kännetecknat av att den andra monoklonala antikroppen är NCACC 84111301 eller NCACC 84111302.

5. Patenttivaatimuksen 2 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että toinen monoklonaalinen vasta-aine on NCACC 84111301 tai NCACC 84111302.

6. Förfarande enligt nägot av patentkraven 2-5, kännetecknat av att man använder minst 5 μg/ml av den första monoklonala antikroppen och minst 1 μg/ml av den andra.

6. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 2-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ensimmäistä monoklonaalista i3 86441 vasta-ainetta käytetään vähintään 5 ug/ml ja toista vähintään 1 μg/ml.

7. Förfarande enligt nägot av patentkraven 1-6, kännetecknat av att man använder minst 20 μg/ml av den första monoklonala antikroppen och minst 5 μg/ml av den andra.

7. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ensimmäistä monoklonaalista vasta-ainetta käytetään vähintään 20 μς/ιηΐ ja toista vähintään 5 μg/ml.

8. Förfarande enligt nägot av de föregäende patentkraven, kännetecknat av att säsom system för pävisande av pankreas-α-amylas användes en maltopolyos med 4-7 glukosgrupper, mal-tosfosforylas, β-fosfoglukomutas, glukos-6-fosfatdehydro-genas och NAD.

8. Minkä tahansa edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että haiman a-amylaasin osoittamissysteeminä käytetään 4-7 glukoositähdettä sisältävää maltopolyoosia, maltoosifosforylaasia, β-fosfoglukomu-taasia, glukoosi-6-fosfaattidehydrogenaasia ja NADttä.

9. Förfarande enligt nägot av patentkraven 1-7, kännetecknat av att säsom system för pävisande av pankreas-a-amylas användes nitrofenylmaltopolyos med 4-7 glukosenheter samt a-glukosidas. ie 86441

9. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että haiman α-amylaasin osoittamissysteeminä käytetään 4-7 glukoosiyksikköä sisältävää nitro-fenyylimaltopolyoosia sekä α-glukosidaasia.

10. Förfarande enligt nägot av patentkraven 1-7, känneteck-nat av att säsom system för pävisande av α-amylas användes stärkelse, som är modifierad med bestämningsbara grupper.

10. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että α-amylaasin osoittamissysteeminä käytetään tärkkelystä, joka on muunnettu määritettävissä olevilla ryhmillä.

11. Reagens för specifik bestämning av pankreas-a-amylas i närvaro av saliv-a-amylas i kroppsvätskor, speciellt i serum, duodenalfluidum, plasma eller urin, vilket reagens innehäller ett system för pävisande av α-amylas och en mono-klonal antikropp gentemot saliv-a-amylas, kännetecknat av att det innehäller en första monoklonal antikropp, som häm-mar salivenzymets aktivitet specifikt över 70 % men under 97 %, samt ytterligare en andra monoklonal anti-saliv-a-amy-las-antikropp, som hämmar aktiviteten av detta enzym under 10 %, och att monoklonala antikroppar framställes genom im-munisering av AJ-möss med nativt eller modifierat saliv-a-amylas, fusionering av B-lymfocyter frän immuniserade djur med transformer.! ngsmedel, kloning och odling av sälunda bi.l -dade hybridceller samt isolering av de monoklonala antikroppar som producerats av den sistnämnda, och att den första monoklonala antikroppen kan framställas med hybridom NCACC 84122003 eller NCACC 84122004 samt den andra monoklonala antikroppen kan framställas med hybridom NCACC 84111301 . . eller NCACC 84111302.

11. Reagenssi haiman α-amylaasin spesifiseksi määrittämiseksi syljen α-amylaasin läsnäollessa kehon nesteistä, erityisesti seerumista, pöhjukaissuolinesteestä, plasmasta ____ tai virtsasta, joka reagenssi sisältää systeemin a-amylaasin osoittamiseksi ja syljen a-amylaasiin kohdistuvaa monoklonaalista vasta-ainetta, tunnettu siitä, että käytetään ensimmäistä monoklonaalista vasta-ainetta, joka estää syljen entsyymin aktiivisuudesta yli 70 %, mutta alle 97 %, sekä lisäksi toista monoklonaalista syljen α-amylaasin vasta-ainetta, joka estää tämän entsyymin aktiivisuudesta alle 10 %, ja että monoklonaaliset vasta-aineet valmistetaan immunisoimalla AJ-hiiret luontaisella tai muunnetulla syljen a-amy-laasilla, fuusioimalla immunisoitujen eläinten B-lymfosyytit transformoivien agenssien kanssa, kloonaamalla ja viljele- 14 86441 mällä näin muodostuneita hybridisoluja ja eristämällä viimeksi mainittujen tuottamat monoklonaaliset vasta-aineet, ja että ensimmäinen monoklonaalinen vasta-aine voidaan valmistaa hybridoomalla NCACC 84122003 tai NCACC 84122004 sekä toinen monoklonaalinen vasta-aine voidaan valmistaa hybridoomalla NCACC 84111301 tai NCACC 84111302.

12. Reagens enligt patentkravet 11, kännetecknat av att det säsom system för pävisande av pankreas-a-amylas innehäller en maltopolyos med 4-7 glukosgrupper, maltosfosforylas, β-fosfoglukomutas, glukos-6-fosfatdehydrogenas och NAD.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen reagenssi, tunnettu siitä, että se sisältää haiman a-amylaasin osoittamissystee-minä 4-7 glukoositähdettä sisältävää maltopolyoosia, maltoo-sifosforylaasia, β-fosfoglukomutaasia, glukoosi-6-fosfaatti-dehydrogenaasia ja NAD:tä.

12 86441

13. Reagens enligt patentkravet 11, kännetecknat av att det säsom system för pävisande av pankreas-a-amylas innehäller en nitrofenylmaltopolyos med 4-7 glukosenheter och a-glu-kosidas.

13. Patenttivaatimuksen 11 mukainen reagenssi, tunnettu siitä, että se sisältää haiman α-amylaasin osoittamissystee-minä 4-7 glukoosiyksikköä sisältävää nitrofenyylimaltopoly-oosia ja α-glukosidaasia.

14. Patenttivaatimuksen 11 mukainen reagenssi, tunnettu siitä, että se sisältää haiman α-amylaasin osoittamissystee-minä tärkkelystä, joka on muunnettu määritettävissä olevilla ryhmillä.

14. Reagens enligt patentkravet 11, kännetecknat av att det säsom system för pävisande av pankreas-a-amylas innehäller stärkelse, som har modifierats med bestämningsbara grupper.