CS270437B2 - Method of pancreatic alpha-amylase specific determination and reagent for realization of this method - Google Patents
Method of pancreatic alpha-amylase specific determination and reagent for realization of this method Download PDFInfo
- Publication number
- CS270437B2 CS270437B2 CS865451A CS545186A CS270437B2 CS 270437 B2 CS270437 B2 CS 270437B2 CS 865451 A CS865451 A CS 865451A CS 545186 A CS545186 A CS 545186A CS 270437 B2 CS270437 B2 CS 270437B2
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- amylase
- monoclonal antibody
- enzyme
- salivary
- antibody
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/40—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving amylase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/81—Packaged device or kit
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
Vynález se týká způsobu specifického stanovení pankreetické α-amylázy za přítomnosti л-amylázy se slinných žláz· Vynález se rovněž týká činidla к provádění tohoto způsobu.
cc-amyláza (E. C. 3. 2. 1· 1.) odbourává o ligo sacharidy a póly sacharidy, spojeně
1,4—d—glukosidickou vazbou převážně hydrolýzou 1,4-3-glukosidických vazeb na naltózu a maltooligosacharidy. Enzym má kromě použití při průmyslové fermentaci velký význam také při klinické analytice a diagnostice. U četných onemocnění se mění zejména obsah o-amylázy v tělesných tekutlnáoh, jako jsou krevní sérum, moč nebo dvanáctníková Sláva. V lidském těle se vSak vyskytují v podstatě dvě a-amylázy, a to ensym se slinivky břišní a ensym ze sLinných žláz· Diagnostický význam má pouze ensym se slinivky břišní, čímž vzniká problém, jak tyto dvě O-amylázy od sebe analyticky rozlišit, protože další isoenzymy se vyskytují pouze zřídka a pouze v malém množství. Obtíž spočívá v tom, že obě svrchu uvedené formy způsobují podobný rozklad cukru a také imunologicky jsou totožné, jak již bylo uvedeno v publikaci K. Lorenta, Laboratorium blfttter 32, 118 (1982). К eliminaci účinnosti enzymu se slinných žláz byly až dosud používány různé metody, například adsorpce na aniontoměniče, blokování účinnosti bílkovinou s pšenice nebo elektroforézou, popřípadě elektrofokusaoí· Tyto postupy jsou bul nedostatečné pokud jde o oddělení obou enzymů, nebo jsou pro běžnou diagnostiku příliš nákladné. Ze známých způsobů je v publikaci Clin. Chem. 28/7, 1525-1527 (1982) popsán způsob inhibioe enzymu ze slinných žláz inhibitorem, získaným z pšeničných klíčků, provedení je přijatelné pokud jde o časovou náročnost i pro běžnou diagnózu, selektivita reakce však není dostatečná. I při optimální koncentraci inhibitoru zůstává uchováno ještě přibližně 13 % účinnosti enzymu ze slinných žláz, kdežto účinnost ze slinivky břišní je snížena přibližně na 81 %·
V Evropské patentové přihlášce č. 84 114 172 4, jež bylo navrženo stanovit pankreatiokou (Uamylázu v přítomnosti o-amylázy se slinných žláz tak, že se postup provádí za přítomnosti monoklonální protilátky, která reaguje s £-amylázou ze slinných žláz a má zkříženou účinnost nejvýše 5 % proti penkreatické o-emyláze. Při použití této monoklonální protilátky je za současného přidání srážecího činidla také možno vyrobit nerozpustný komplex Λ-amylázy se slinných žláz, který je pak možno z roztoku oddělit, takže v roztoku zůstane pouze enzym se slinivky břišní a je možno jej stanovit. Je také možno užít monoklonální protilátku v immo liz ováné formě a tímto způsobem oddělit amylázu ze slinných žláz. V obou těchto případech je však nezbytné vytvořit nejprve nerozpustnou fázi a od ní oddělit fázi rozpustnou.
V NSR patentové přihlášce č. 35 00 526 2 je navrhován postup, přiněmž se místo monoklonální protilátky, navrhované podle svrchu uvedené Evropské patentové přihlášky užije monoklonální protilátka, která působí specifiokou inhibici isoenzymu se slinnýoh žláz. Tímto způsobem je možno dosáhnout dalšího zlepšení při stanovení α-amylázy se slinivky břišní, aniž by bylo zapotřebí od zebe oddělovat jednotlivé fáze, maximální dosažená inhibioe enzymu ze slinných Žláz však byla nižší než 97 %, čímž ještě stále dochází к nežádoucí nepřesnosti tohoto stanovení.
Vynález si klade za úkol odstranit nevýhody svrchu uvedených postupů a navrhnout způsob stanovení ω-smylázy ze slinivky břišní, který by umožňoval rychlé a jednoduché, avšak přesto ještě přesné stanovení tohoto enzymu za přítomnosti tt-amylázy ze slinných žláz v tělesných tekutinách. Vynález si rovněž klade za úkol navrhnout činidlo, vhodné к provádění svrchu uvedeného postupu.
Předmětem vynálezu je tedy způsob specifického stanovení pankreatické ct-amylázy za přítomnosti 6-amylázy ze slinných Žláz v tělesných tekutinách, zejména v krevním séru, krevní plazmě, dvanáctníková šlávy, nebo moči reakcí se systémem pro stanovení «-amylázy za přítomnosti monoklonální protilátky, která působí inhibici ú^amylázy ze slinných žláz, jehož podstata spočívá v tom, že se na tělesnou tekutinu působí před reakcí se systémem pro stanovení л-amylázy jako inhibitorem první monoklonální protilátkou působící inhibici enzymu ze slinných žláz specificky na 70 až 97 % v kombinaci s druhou monoklonální protiCS 270 437 B2 látkou proti Cř-aayláze ze slinných žláz, která působí inhibici uvedeného isoenzymu na maximálně 10 %.
Při provádění způsobu podle vynálezu jsou zvláště vhodné jako první aonoklonální protilátka protilátky, které způsobují inhibici d-amylázy ze slinných žláz na hodnoty 70 až 93 % a jako druhá aonoklonální protilátka se s výhodou použije protilátka, působící inhibici enzymu ze slinných žláz na hodnotu 0 až Nejnižší hranicí pro inhibici je 70 %, s výhodou přibližně 80 % tak, aby bylo možno při provádění způsobu podle vynálezu dosáhnout inhibice vyšší než 97 %·
Způsob podle vynálezu je založen na překvapujícím zjištění, že inhibiční účinnost aonoklonální protilátky, která neinhibuje enzym ze slinných žláz zcela uspokojuje, je možno synergicky zvýšit současným použitím další aonoklonální protilátky, která však jinak nevyhovuje nebo zcela nevyhovuje, protože Její inhibiční účinnost Je nízká· Tímto způsobem Je možno dosáhnout téměř kvantitativní inhibice enzymu ze slinných žláz při 100% zachování účinnosti enzymu ze slinivky břišní· Mimoto Je možno podstatně zkrátit dobu inkubace při provádění reakce·
Při provádění způsobu podle vynálezu Je s výhodou možno použít aonoklonální protilátky z buněčné kultury, uložené pod č. (99D12) 84122003 а (89B2) 84122004 v National Collection of Animal Cell Cul ture, Porton Down, Velká Británie)· Jako druhá aonoklonální protilátka se s výhodou užije protilátka, uvedená ▼ Evropské patentové přihlášce Č. 84 114 172 4, uložená buněěná kultura, produkující tuto látku aá v téže sbírce jako svrchu č· 84111301, 84111302, zvláště výhodné Jé použití protilátky z buněčné kultury NCACC 84111301.
Potřebné množství první a druhé protilátky Je aožno u určitých přípravků těchto protilátek snadno zjistit poaocí malého množství předběžných pokusů· S výhodou se užije a lespoň 5 /Ug/ml, zvláště alespoň 20 /Ug/ml první aonoklonální protilátky a alespoň al, zejména alespoň 5 /Ug/al druhé aonoklonální protilátky·
Monoklonální protilátky, použitelné při provádění způsobu podle vynálezu Je možno získat imunizací pokusných zvířat nativní nebo modifikovanou O-amylázou ze slinných žláz, fúzí lymfocytů B, získaných z takto imunizovaných zvířat s následným klonováním a kultivací takto získaných hybridních buněk, které produkují aonoklonální protilátku, s následnou izolací této protilátky· Zvláště vhodným zvířetem pro produkci protilátek proti ot-amyláze ze slinných žláz Jsou krysy a myši· Imunizace se provádí bul nativní lidskou ď-amylázou ze slinných žláz nebo modifikovanou at-amylázou ze slinných žláz· V případě, že se užije nativního enzymu, Je zapotřebí užít elektrofoneticky homogenního preparátu. Chemicky modifikovanou ct-amylázu ze slinných žláz Je možno získat způsobem, známým pro modifikace enzymů, tak, Jak byl popsán například v PAS Č. 25 43 994· Vhodným prostředkem pro modifikaci tohoto enzymu Je například N-bromsukcinimid (BBS) za oxidace tryptofsnových skupin na bílkovině (BBA 143 (1967), 462-472), dále methylace karboxylových skupin působením Jodacetátu (IAA), která má za následek změnu karboxylové skupiny převážně na histiminu, dále Je možno užít nitrace působením tetranitromethanu (TNM), Jak bylo popsáno v J. Biol. Chem. 238 (1963) 3307, užít je možno také diazotace působením diazotované kyseliny sul fámylové, Jak bylo popsáno v Meth. Enzymol. 25 (1972), 515-531· Zvláště vhodné Je použití enzymu, modifikovaného tetranitromethanem při použití myěí kmene, В alb/с nebo použití nativního enzymu a myší kmene AJ.
Imunizace se provádí běžným podáváním nativního nebo modifikovaného enzymu, s výhodou v kombinaci s pomocným prostředkem· Vhodným pomocným prostředkem Je hydroxid hlinitý spolu s Bordetella pertussis· V případě, že se pro imunizaci užije nativní tf-amyláze ze slinných žláz na myších kmene AJ nebo tetranitromethenem modifikovaná oc-aayláza ze slinných žláz na myších kmene Balb/c, trvá imunizace s výhodou alespoň 9 měsíců, v nichž se enzym ze slinné žlázy podává alespoň sedmkrát vždy intraperitoneálně·
Po provedené imunizaci se běžným způsobem provádí fúze lymfocytů В imunizovaných zví
CS 270 437 B2 řat při použití vhodného transformačního činidla. Příkladem transformačních činidel, vhodných pro použití pro účely vynálezu jsou například buňky myelouu, viry, které mají transformační účinek, například virus Epstein-Barr- nebo prostředky, které byly uvedeny v DOS č. 32 45 665. Fúze se provádí známým způsobem, který byl uveden v publikaci Koehler a Miletein Nátuře 256 (1975) 495-497· Tímto způsobem získané hybridní buňky se klonují běžným způsobem, získané klony, které tvoří monoklonální protilátky se pak dále pěstují· Vzhledem к tomu, že růst hybridních buněk uá povahu, obdobnou růstu nádorů je tyto buňky možno pěstovat dále po neomezenou dobu a tím i produkovat požadovanou monoklonální protilátku v libovolném množství·
К provádění způsobu podle vynálezu je možno užít monoklonální protilátky jako takové nebo je možno užít jejich fragmenty, které rovněž mají imunologické vlastnosti (Fáb-Pragmente) · Pod pojmem monoklonální protilátky se tedy v průběhu přihlášky rozumí také tyto fragmenty· Jak úplné protilátky, tak také jejich fragmenty je možno užít i immobili2ované formě.
Stanovení o-amylázy jako takové, se provádí známým způsobem· Vzhledem к tomu, že kombinace monoklonálních protilátek, užitá pro provádění způsobu podle vynálezu způsobuje selektivní inhibioi a-amyláz ze slinných žláz a vyřazuje tak tyto amylázy ze stanovení bez ovlivnění účinnosti enzymu ze slinivky břišní, odpovídají hodnoty, získané pro o-amylázu se slinivky břišní za přítomnosti monoklonálních protilátek skutečně přesně pouze účinnosti pankreatioké o-amylásy bez příměsi účinnosti amylázy ze slinných žláz.
S výhodou se způsob podle vynálezu provádí při použití systému pro stanovení o-amylázy, který obsahuje maltopolyosu s obsahem 4 až 7 zbytků glukosy v molekule, maltozofosforolázu, 0-fosfoglukomutázu, glukoso-6-fosfátdehydrogenázu a nikotinamidadenindinuleotid. .
Další systém, použitelný při provádění způsobu podle vynálezu pro stanovení cř-amylázy obsahuje nitrofenylmaltopolyosu se 4 až 7 glukosovýml zbytky v molekule a ct-glukosidázu.
Dalěí výhodný systém pro stanovení O-amylásy obsahuje Škroby, které jsou modifikovány určitými skupinami· Pod pojmem modifikovaných Škrobů se rozumí například Škroby, modifikované určitými stanovitelnými skupinami, například produkt, popsaný v DOS 28 12 154 a také produkty, získané odbouráváním škrobů, například škroby, modifikované karboxymethylovými skupinami a některé hraniční dextrlny. Všechny tyto systémy jsou známy a není tedy zapotřebí je zde podrobněji popisovat·
Při provádění způsobu podle vynálezu ae vzorek kapaliny bud nejprve inkubuje s příslušnými protilátkami a pak se přímo uvádí ve styk s činidlem pro stanovení amylázy nebo se přidá směs protilátek současně s činidlem pro stanovení amylázy po inkubaci ke vzorku. Trvání inkubace závisí na účinnosti použité protilátky a trvá s výhodou 0,5 až 10, zejména přibližně 5 minut·
V případě, že je výhodné oddělení a-amylázy ze slinných žláz, je možno fixovat monoklonální protilátku v úplné formě nebo ve formě účinných fragmentů také na pevný nosič, například na papír nebo na povrch trubiček nebo hadiček z plastické hmoty· Tímto způsobem se α-amyláza ze slinných žláz váže na nosič a je možno ji spolu a pevnou fází odstranit.
Účinek, dosažený způsobem podle vynálezu, je možno prokázat následujícími pokusy: Monoklonální protilátky (MAK), které jsou specifické proti lidské amyláze ze slinných žláz a působí jejich inhibioi na maximálně 93 % se čistí srážením síranem amonným a chromatografií na DEAE-celulose běžným způsobem· Druhá protilátka se čistí stejným způsobem. Protilátka nebo pritílátky v roztoku se smísí s lidskou amylázou a směs se inkubuje 5 minut při teplotě místnosti· Pak se tato směs přidá к re akčnímu činidlu pro stanovení amylázy a účinnost amylázy se změří· Kontrolní vzorek obsahuje smylásu, předem smíšenou 8 pufrem bez monoklonální protilátky· Je možno také postupovat tak, že se monoklonální protilátka nebo protilátky smísí s částí reakčniho činidla pro stanovení amylázy, napři
CS 270 437 B2 klad s roztokem d-glukos!dásy. Pak se přidá roztok amylázy a směs se 5 minut inkubuje· Pak se zahájí reakce přidáním substrátu, například p-nitrofenylmaltoheptaosidu (ΟγΡΝΡ). Kontrolní roztok obsahuje glukosidázu bez monoklonální protilátky. Na výkrese je znázorněna zbytková účinnost amylázy z lidských slinných žláz v procentech a účinnost lidské amylázy z pankreatu za přítomnosti monoklonální protilátky nebo v její nepřítomnosti jako funkce konečné koncentrace monoklonální protilátky·
V následující tabulce 1 jsou uvedeny výsledky stanovení amylázy v séru, při němž byla předem smí sena monoklonální protilátka nebo protilátky a amylázou.
Tabulka 1
Inhibice lidské «-amylázy ze slinných žláz a z pankreatu působením monoklonální protilátky NCACC 84122003 (MAK I) nebo 84122004 (MAK II) a/nebo NCACC 84111301 (MAK III), stanovení se provádí v séru při použití p-nitrofenylmaltoheptaosidu jako substrátu.
amyláza GA MAK I MAK II MAK III MAK I/II MAK II/III
| (u/i) | 30 yug/al | 25 /Ug/в! | 5 yUg/ml | 30/5 zUg/ml | 25/5 /ug/ml | ||||||
| A (U/1) | RA (%) | A (U/1) | RA W | A (U/1) | RA (%) | 1 - 1 > i O | RA («) | 1 1 § * 1 ~ | RA (*) | ||
| ze slinné | |||||||||||
| žlázy | 1476 | 127 | 8,6 | 135 | 9,1 | 1430 | 96,9 | 40 | 2,7 | 37 | 2,5 |
| z pankreatu | 1430 | 1442 | 100,8 | 1428 | 99,9 | 1424 | 99,6 | 1405 | 98,2 | 1426 | 99,7 |
GA = celková účinnost
A = účinnost s monoklonální protilátkou, RA = zbytková účinnost.
Podle výkresu a také z tabulky je zřejmé, že kombinace obou monoklonální ch protilátek má za následek synergické zvýšení inhibice účinnosti lidské aminosy ze slinných žláz· Tento účinek je nezávislý na substrátu· Projevuje se stejně při použití vysokomolekulárních substrátů, jako jsou například zbarvené škroby, jako u substrátů s krátkým řetězcem, například u p-nitrofenylnaltopentalosldu (G^PNP)· Také při použití eth-GyPNP jako substrátu bylo možno zaznamenat tentýž výsledek· Je tedy možno pomocí dvou monoklonálních protilátek způsobit inhibici amyláz ze slinných žláz ▼ tělesných tekutinách, zvláště v krevním séru.
Předmětem vynálezu je rovněž činidlo pro specifické stanovení pankreatické «-amylázy v přítomnosti «-amylázy ze slinných žláz v tělesných tekutinách, zejména v séru, dvanáctníkové štávě, plasmě nebo moči, obsahující systém pro stanovení α-amylázy a monoklonální protilátku proti o-amyláze ze slinných žláz > jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje první monoklonální protilátku, pro specifickou inhibici enzymu ze slinných žláz na 70 až 97 % v kombinaci s druhou monoklonální protilátkou, pro inhibici svrchu uvedeného enzymu na maximálně 10 %, přičemž poměr množství první monoklonální protilátky к množství druhé monoklonální protilátky je 5 až 20 : 1 až 5·
Pokud jde o obsažený systém pro průkaz oř-amylázy v činidle podle vynálezu a o ostatní podmínky, platí to, co bylo uvedeno svrchu při podrobném popisu provádění způsobu podle vynálezu·
Vynález umožňuje jednoduché, velmi rychlé a velmi přesné stanovení lidské «-amylázy ze slinivky břišní (h-PA) za přítomnosti O-amylázy ze slinných žláz (h-SA) v tělesných tekutinách a zlepšuje proto podstatně možnosti klinické diagnostiky·
Vynález bude osvětlen následujícími příklady.
Příklad 1
Inhibice lidské «-amylázy z pankreatu a d-amylázy ze slinných žláz první monoklonální protilátkou (NCACC 84122004) jako takovou a v kombinaci s druhou monoklonální proti
CS 270 437 B2 látkou (NCACC 84111301). reakce je zahájena přidáním séra·
Reakční složky
Pufr: 100 mM PO^^“, 150 nM chloridu sodného* && sérový albuain skotu. pH 7,1
Reakční činidlo na amylázu: G„PHP (p-nitrofenylmaltoheptaosid)* teplota při stanovení °C
Monoklonální protilátka 1: 0*63 mg/ml v pufru
Monoklonální protilátka 2: 0*63 mg/ml protilátky 1 a 0*105 mg/ml protilátky 2 v pufru
Protilátka 3: 0*105 mg/ml monoklonální protilátky 2 v pufru
Amyláza z lidských slinných žláz: přibližně 3000 jednotek/1 (G^PHP) v pufru Amyláza z lidského pankreatu: přibližně 3000 jednotek/1 (G^PNP) v pufru. Provedení pokusu
100 /U1 lidská amylázy ze slinných žláz nebo z pankreatu ee smísí vždy se 100 yul pufru nebo a různými roztoky monoklonálních protilátek a směs se inkubuje 5 minut při teplotě místnosti. Pak ae přidá vždy 25 /U1 této směsi к 1000 yUl činidla na amylázu* předehřátého na teplotu 37 °0 a stanoví se účinnost amylázy. Zbytková účinnost se vypočítá podle následujícího vzorce účinnost za přítomnosti monoklonální protilátky
Zbytková účinnost (%) » ———————— χ 100 účinnost v něpřítomnosti monoklonálních protilátek
Výsledky .
Odpovídající zbytková účinnost pro amylázu z lidských slinných žláz byla v případě první monoklonální protilátky 8*6* v případě druhé monoklonální protilátky 96*9 % a při použití obou monoklonálních protilátek 2*7 %· Odpovídající zbytková účinnost amylázy z lidského pankreatu byla 100*1 $* 99»6 % a 99*7 %·
Příklad 2
Xnhibice amylázy působením první monoklonální protilátky (HCACC 84122003) a/nebo druhé monoklonální protilátky (NCACC 84111301)* reakce se zahajuje přidáním séra. Reakční složky
Užívá se stejných reakčních složek jako v příkladu 1» pouze es smění první a druhá monoklonální protilátka·
Monoklonální protilátka 10*525 mg/ml monoklonální látky 1 v pufru
Monoklonální protilátka 2': 0*525 mg/ml první protilátky a 105 mg/ml druhé protilátky v pufru.
Provedení pokusu
Pokus se uskutečňuje stejně jako v příkladu 1 * stejným způsobem se také vypočítává zbytková účinnost amyláz v procentech.
Výsledky
Zbytková účinnost amylázy z lidských slinných žláz je za přítomnosti první monoklonální protilátky celkem 9*1 %* v přítomnosti druhé monoklonální protilátky 96,9 % a za přítomnosti obou protilátek 2*5 %· Odpovídající zbytková účinnost pro amylázu z lidského pankreatu je v těchto případech 99*9 99*6 % a 99*7 %.
Příklad 3
Inhibice amylázy z lidských slinných žláz a amylázy z lidského pankreatu v přítomnosti první monoklonální protilátky (NCACC 84122004)* a to v nepřítomnosti nebo za pří
CS 270 437 B2 tomnosti druhé monoklonální protilátky (NCACC 84111301), reakce se zahajuje přidáním substrátu.
Reakční Činidlo:
pufr, stejný jako v příkladu 1 amyláza z lidských slinných žláz, stejná jako ▼ příkladu 1 * monoklonální protilátka V': první monoklonální protilátka ▼ pufru při různé koncentraci monoklonální protilátka 2: 0,513 mg/ml druhé monoklonální protilátky v pufru d-glukosidáza: z činidla pro stanovení amylázy (Boehringer Mannheim, Č. kat. 568589) Substrát: G^PNP p-nitrofenylmaltoheptaosid, je rovněž přítomen v činidle pro stanovení amylázy
Provedení pokusu
К 880 yul oC-glukosidázy se přidá 10 yul roztoku monoklonální protilátky Г* a 10 yul roztoku monoklonální protilátky 211 nebo 10 /U1 svrchu uvedeného pufru. Pak se přidá vždy 25 /U1 amylázy z lidského pankreatu nebo amylázy z lidských slinných Žláz. Takto získaná reakční směs se pak nechá stát 5 minut při teplotě 37 °C. Pak ae reakce zahájí přidáním 100 /ul roztoku substrátu a stanoví se účinnost amylázy. Jako kontrolní roztok se užije směs O-glukosidázy s 20 /U1 pufru a s obsahem odpovídající amylázy. Zbytková účinnost v procentech se vypočítá jako účinnost za přítomnosti monoklonální protilátky, dělená účinností, vypočítanou v nepřítomnosti monoklonální protilátky.
Výsledky .
Na výkrese jsou znázorněny zbytkové účinnosti v procentech jako funkce konečné koncentrace první monoklonální protilátky u amyláz z lidských slinných žláz za případné přítomnosti druhé monoklonální protilátky, pro amylázu z lidského pankreatu pouze za přítomnosti druhé monoklonální protilátky.
Na ose úseček jsou znázorněny koncentrace první monoklonální protilátky v yug/ml, na ose pořadnic zbytková účinnost v procentech.
Na výkrese jsou zakresleny křivka χ pro lidskou pankreatickou 0Uamylázu za přítomnosti 5 yug/ml první monoklonální protilátky, křivka 2 pro cC-amylázu ze slinných žláz bez použití protilátky, křivka 3 pro tf-amylázu za přítomnosti 5 /Ug/ml první monoklonální protilátky.
Claims (14)
1. Způsob specifického stanovení pankreatické O-amylázy v přítomnosti ct-amylázy ze slinných žláz, zejména séru, plasmě, dvanáctníkové Slávě, moči nebo v jiných tělesných tekutinách reakcí se systémem pro stanovení O-amylázy v přítomnosti monoklonální protilátky, která působí inhibici O-amylázy ze slinných žláz, vyznačující se tím, že se na tělesnou tekutinu působí před reakcí se systémem pro stanovení O-aaylázy jako inhibitorem první monoklonální protilátkou, která inhibuje účinnost amylázy ze slinných žláz specificky na 70 až 97 $ v kombinaci s druhou aonoklonální protilátkou proti a-amyláze ze slinných žláz, která účinnost tohoto enzymu inhibuje na 0 až 10 %.
2» Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že první monoklonální protilátka inhibuje účinnost enzymu ze slinných žláz na 70 až 93 % a druhá protilátka inhibuje účinnost tohoto enzymu na 0 až 5 %·
3» Způsob podle bodu 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se užije monoklonální protilátka, získaná imunisací myší kmene AJ nativní nebo modifikovanou OC-amylázou ze slinných žláz, fúzí lymfocytů В imunizovaných zvířat působením transformačních činidel s následným klonováním a kultivací vzniklých hybridních buněk a isolací monoklonální protilátky z těchto buněk*
4. Způsob podle bodu 3» vyznačující ae tím, že se Jako první monoklonální protilátka užije protilátka NCACC č. 84122003 nebo NCACC 64122004·
5· Způsob podle bodu 2 nebo 3» vyznačující se tím, že se Jako druhá monoklonální protilátka užije protilátka NCACC č. 84111301 nebo protilátka NCACC č· 64111302.
6* Způsob podle bodů 2 až 5, vyznačující se tím, že se užije alespoň množství 5 Aig/ml první monoklonální protilátky a alespoň množství 1 druhé monoklonální pro9 /Ug/Bl tilátky.
7· Způsob podle bodů 1 až 6, vyznačující se tím, že se užije alespoň množství 20 rug/ml první monoklonální protilátky a alespoň množství 5 /Ug/ml druhé monoklonální pro tilátky
8· Způsob podle bodů 1 až 7> vyznačující se tím, že se Jako systému pro stanovení cC-amylázy ze slinivky břišní užije maltopolyóza s obsahem 4 až 7 zbytků glukózy, maltozafosforyláza, β-fosfoglukomutáza, glukóza-6-fosfátdehydrogenáza a nikotinamidadeninnukleotid.
9· Způsob podle bodů 1 až 7> vyznačující se tím že ae Jako systém pro stanovení pankreatické ct-amylázy užije nitrofenylmaltopolyóza s obsahem 4 až 7 zbytků glukózy v molekule společně s enzymem O-glukosidázou.
10. Způsob podle bodů 1 až 7, vyznačující se tím, že se jako syntéza pro stanovení a-amylázy užijí škroby, které Jsou modifikovány stanovitelnými skupinami.
11. Činidlo pro specifické stanovení pankreatické ot-amylázy v přítomnosti o-amylázy ze slinných žláz v tělesných tekutinách, zvláště v séru, v dvanáctníkové šíávě, plasmě nebo moči, obsahující systém pro stanovení «-amylázy a monoklonální protilátku proti a-amyláze ze slinných žláz, vyznačující se tím, že sestává z první monoklonální protilátky, pro specifickou inhibici enzymu ze slinných žláz na 70 až 97 % v kombinaci s druhou monoklonální protilátkou proti α-amyláze ze slinných žláz, pro inhibici tohoto enzymu na 0 až 10 %, přičemž poměr množství první monoklonální protilátky к množství druhé monoklonální protilátky je 5 až 20 : 1 až 5. .
12. Činidlo podle bodu 11, vyznačující se tím, že Jako systém pro stanovení oL-amylázy ze slinivky břišní obsahuje maltopolyózu s obsahem 4 až 7 zbytků glukózy, maltozofosforylázu, /3-fosfoglukomutázu, glukózo-6-fosfátdehydrogenázu a nikotinamldadenindinukleotid.
13. Činidlo podle bodu 11, vyznačující se tím, že Jako systém pro stanovení pankreatické α-amylázy obsahuje nitrofenylmaltopolyózu s obsahem 4 až 7 zbytků glukózy v molekule
CS 270 437 B2 společně s enzymem cC-glukosidázou.
14. činidlo podle bodu 1>, vyznačující se tím, že ;ako systém pro stanovení O-amylázy obsahuje škroby, modifikované stanovitelnými skupinami, například barevnými skupinami Jako nitro skupinami nebo к arboxym ethylovými skupinami·
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19853525926 DE3525926A1 (de) | 1985-07-19 | 1985-07-19 | Verfahren und reagenz zur spezifischen bestimmung von pankreas-alpha-amylase |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS545186A2 CS545186A2 (en) | 1989-11-14 |
| CS270437B2 true CS270437B2 (en) | 1990-06-13 |
Family
ID=6276259
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS865451A CS270437B2 (en) | 1985-07-19 | 1986-07-17 | Method of pancreatic alpha-amylase specific determination and reagent for realization of this method |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5573918A (cs) |
| EP (1) | EP0209154B1 (cs) |
| JP (1) | JPS6222600A (cs) |
| KR (1) | KR910002958B1 (cs) |
| AT (1) | ATE49058T1 (cs) |
| AU (1) | AU561326B2 (cs) |
| CA (1) | CA1276106C (cs) |
| CS (1) | CS270437B2 (cs) |
| DE (2) | DE3525926A1 (cs) |
| DK (1) | DK161169C (cs) |
| ES (1) | ES2000691A6 (cs) |
| FI (1) | FI86441C (cs) |
| IE (1) | IE59301B1 (cs) |
| NO (1) | NO167422C (cs) |
| SU (1) | SU1637670A3 (cs) |
| ZA (1) | ZA865364B (cs) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3621271A1 (de) * | 1986-06-25 | 1988-01-07 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren und reagenz zur bestimmung von alpha-amylase |
| DE3903114A1 (de) * | 1989-02-02 | 1990-08-09 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur bestimmung eines enzyms aus einem isoenzymgemisch sowie hierfuer geeigneter testtraeger und dessen verwendung |
| DE3929355A1 (de) * | 1989-09-04 | 1991-03-07 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur spezifischen bestimmung von pankreas-(alpha)-amylase |
| JPH085919B2 (ja) * | 1989-11-10 | 1996-01-24 | 日本商事株式会社 | 唾液―α―アミラーゼ活性阻害モノクローナル抗体およびそれを用いる膵臓―α―アミラーゼの分別定量法 |
| JPH04106694U (ja) * | 1991-02-26 | 1992-09-14 | 尚大 西村 | 浄水装置 |
| JPH11299498A (ja) | 1998-02-19 | 1999-11-02 | Toyobo Co Ltd | アミラ―ゼアイソザイム活性測定用試薬 |
| RU2671580C2 (ru) * | 2016-06-21 | 2018-11-02 | Государственное Бюджетное Образовательное Учреждение Высшего Профессионального Образования "Амурская Государственная Медицинская Академия" Министерства Здравоохранения Российской Федерации | Объективная оценка наличия тревоги и стресса у беременных путём определения изменения концентрации α-амилазы слюны во время операции кесарево сечение |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2543994C3 (de) | 1975-10-02 | 1979-10-11 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Proteinmodifizierte Verbindungen des schwangerschaftsspezifischen ß, -Glykoproteins und deren Verwendung als Bestandteil von immunisierenden Mitteln |
| DE2812154C3 (de) | 1978-03-20 | 1980-09-11 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur Bestimmung von a -Amylase |
| JPS5885899A (ja) * | 1981-11-16 | 1983-05-23 | Fujirebio Inc | アミラ−ゼインヒビタ−およびその製造法 |
| DE3245665A1 (de) | 1982-05-04 | 1983-11-10 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur herstellung permanenter tierischer und humaner zellinien und deren verwendung |
| US4514505A (en) * | 1982-05-21 | 1985-04-30 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Monoclonal antibody mixtures and use thereof for enhanced sensitivity immunoassays |
| DE3323245A1 (de) * | 1983-06-28 | 1985-01-10 | Merck Patent Gmbh, 6100 Darmstadt | Verfahren und reagenz zur bestimmung von (alpha)-amylase |
| DE3342736A1 (de) | 1983-11-25 | 1985-06-05 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Hybridoma-antikoerper |
| DE3404876A1 (de) * | 1984-02-11 | 1985-09-05 | Gödecke AG, 1000 Berlin | Verfahren zur verbesserung der selektiven aktivitaetshemmung von humaner pankreas- und speichelamylase sowie eine hierfuer geeignete inhibitorzubereitung |
| DE3500526A1 (de) | 1985-01-09 | 1986-07-10 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Spezifisch hemmender s-amylase-mak |
-
1985
- 1985-07-19 DE DE19853525926 patent/DE3525926A1/de not_active Withdrawn
-
1986
- 1986-07-14 KR KR1019860005664A patent/KR910002958B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1986-07-15 DK DK336586A patent/DK161169C/da not_active IP Right Cessation
- 1986-07-17 CS CS865451A patent/CS270437B2/cs not_active IP Right Cessation
- 1986-07-18 AT AT86109899T patent/ATE49058T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-07-18 NO NO862897A patent/NO167422C/no not_active IP Right Cessation
- 1986-07-18 FI FI862975A patent/FI86441C/fi not_active IP Right Cessation
- 1986-07-18 ES ES8600378A patent/ES2000691A6/es not_active Expired
- 1986-07-18 IE IE192086A patent/IE59301B1/en not_active IP Right Cessation
- 1986-07-18 EP EP86109899A patent/EP0209154B1/de not_active Expired
- 1986-07-18 ZA ZA865364A patent/ZA865364B/xx unknown
- 1986-07-18 CA CA000514128A patent/CA1276106C/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-07-18 JP JP61168213A patent/JPS6222600A/ja active Granted
- 1986-07-18 AU AU60312/86A patent/AU561326B2/en not_active Ceased
- 1986-07-18 DE DE8686109899T patent/DE3667858D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-07-18 SU SU4027915A patent/SU1637670A3/ru active
-
1991
- 1991-09-19 US US07/762,646 patent/US5573918A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE49058T1 (de) | 1990-01-15 |
| AU6031286A (en) | 1987-02-12 |
| EP0209154B1 (de) | 1989-12-27 |
| CS545186A2 (en) | 1989-11-14 |
| ES2000691A6 (es) | 1988-03-16 |
| DK161169B (da) | 1991-06-03 |
| NO167422B (no) | 1991-07-22 |
| IE59301B1 (en) | 1994-02-09 |
| NO167422C (no) | 1991-10-30 |
| JPS632600B2 (cs) | 1988-01-19 |
| IE861920L (en) | 1987-01-19 |
| FI86441C (fi) | 1992-08-25 |
| DK161169C (da) | 1991-11-18 |
| SU1637670A3 (ru) | 1991-03-23 |
| EP0209154A1 (de) | 1987-01-21 |
| DK336586D0 (da) | 1986-07-15 |
| NO862897L (no) | 1987-01-20 |
| DK336586A (da) | 1987-01-20 |
| KR870001471A (ko) | 1987-03-14 |
| FI862975A0 (fi) | 1986-07-18 |
| DE3525926A1 (de) | 1987-01-29 |
| CA1276106C (en) | 1990-11-13 |
| KR910002958B1 (ko) | 1991-05-11 |
| ZA865364B (en) | 1987-03-25 |
| FI86441B (fi) | 1992-05-15 |
| US5573918A (en) | 1996-11-12 |
| AU561326B2 (en) | 1987-05-07 |
| NO862897D0 (no) | 1986-07-18 |
| FI862975A (fi) | 1987-01-20 |
| DE3667858D1 (de) | 1990-02-01 |
| JPS6222600A (ja) | 1987-01-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Yolken | Enzyme immunoassays for the detection of infectious antigens in body fluids: current limitations and future prospects | |
| Terada et al. | Thermus aquaticus ATCC 33923 amylomaltase gene cloning and expression and enzyme characterization: production of cycloamylose | |
| Yother et al. | Generation and properties of a Streptococcus pneumoniae mutant which does not require choline or analogs for growth | |
| Nishikawa et al. | High expression of an N-acetylglucosaminyltransferase III in 3′-methyl DAB-induced hepatoma and ascites hepatoma | |
| US4945043A (en) | Process and reagent for the determination of α-amylase | |
| CS270437B2 (en) | Method of pancreatic alpha-amylase specific determination and reagent for realization of this method | |
| US4939082A (en) | Process and monoclonal antibody for the specific determination of pancreas alpha-amylase in the presence of saliva alpha-amylase | |
| US5071744A (en) | Process and monoclonal antibody for the specific determination of pancreatic α-amylase in the presence of salivary α-amylase | |
| US4863728A (en) | Monoclonal anti-alpha-amylase antibody which non-specifically inhibits the enzyme activity of human alpha-amylase | |
| JP2807949B2 (ja) | α−アミラーゼ活性測定用試薬および測定方法 | |
| JPS5931699A (ja) | α−アミラ−ゼ活性の測定法 | |
| Lawrence et al. | Antigenic cross-reactivities between mammalian hexokinases | |
| Tosi et al. | Effect of trypsin on DNA methylation in isolated nuclei from developing sea urchin embryos | |
| JPH05123193A (ja) | α−アミラーゼ活性の測定法およびα−アミラーゼ活性測定用試薬 | |
| Pan et al. | Transcriptional regulation and the effects of sodium butyrate and glycosylation on catalytic activity of human germ cell alkaline phosphatase | |
| Osland et al. | Immunochemical analysis of the teichoic acid from Staphylococcus hyicus | |
| JPH0970288A (ja) | 新規なアルカリホスファターゼ | |
| Pazur et al. | Action patterns of amylolytic enzymes as determined by the [1-14C] malto-oligosaccharide mapping method | |
| JPH09328500A (ja) | 膵型α−アミラーゼアイソザイムの測定法 | |
| Robyt | Action patterns of some alpha-type amylases | |
| DD248664A5 (de) | Verfahren und Reagenz zur spezifischen Bestimmung von Pankreas-Alpha-Amylase |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20010717 |