DE2543994C3

DE2543994C3 - Proteinmodifizierte Verbindungen des schwangerschaftsspezifischen ß, -Glykoproteins und deren Verwendung als Bestandteil von immunisierenden Mitteln

Info

Publication number: DE2543994C3
Application number: DE2543994A
Authority: DE
Inventors: Hans Dr. 3550 Marburg Bohn; Ernst Dr. 3551 Michelbach Weinmann
Original assignee: Behringwerke AG
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 1975-10-02
Filing date: 1975-10-02
Publication date: 1979-10-11
Also published as: SE7610892L; DE2543994B2; IL50589A0; BE846928A; AT352756B; DK444576A; IT1070582B; NZ182193A; IL50589A; ATA731176A; FR2326203A1; JPS5290613A; NL7610688A; LU75913A1; FR2326203B1; GB1560633A; AU511175B2; NO763361L; FI762790A; AU1831876A

Description

Die Erfindung betrifft proteinmodifizierte Verbindungen des schwangerschaftsspezifischen /?i-Glykoproteins, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung als Bestandteil von immunisierenden Mitteln, die als wesentlichen Bestandteil eine proteinmodifizierte Verbindung des schwangerschaftsspezifischen /JpGlykoproteins enthalten. Diese können als Impfstoff zur Verhinderung einer Schwangerschaft verwendet werden.

In der deutschen Offenlegungsschrift 21 57 610 wurde ein schwangerschaftsspezifisches /Ji-Glykoprotein und ein Verfahren zu seiner Isolierung beschrieben. Das schwangerschaftsspezifische /?i-Glykoprotein (SPi) weist

eine elektrophoretische Wanderungsgeschwindigkeit im Agargel im Bereich der^i-Globuline,
einen Extinktionskoeffizienten E IT. =11,0 (278 Γημ; l/15molarer Phosphatpuffer, pH 7,0) und
einen Kohlenhydratgehalt von 26,5—29,6%, davon 10,0-11,0% Hexosen, 9,5-10,5% Hexosamin, 0,5—0,6% Fucose und 6,5—7,5% Neuraminsäure

auf. Es ist herstellbar dadurch, daß man aus einem mit Hilfe einer Salzlösung aus menschlichen Plazenten gewonnenen Extrakt die mit Diaminoäthoxyacridinlactat fällbaren Proteine abtrennt, sodann das im Überstand verbleibende SPi zusammen mit Gamma-Giobulin ausfällt und von diesem das Gamma-Giobulin durch Adsorption an DEAE abtrennt, aus dem Eluat das SPi mit Ammonsulfat ausfällt und das so erhaltene Produkt durch Chromatographie und/oder Elektrophorese reinigt.

Die Ausgangsmaterialien für die Isolierung sind menschliche Organe oder Körperflüssigkeiten, wie Plazenten, Blut oder Urin von schwangeren Frauen.

Bei der Immunisierung von Wirbeltieren mit dem von Menschen stammenden schwangerschaftsspezifischen 0i-Glykoprotein wird im Plasma der immunisierten Tiere ein gegen das schwangerschaftsspezifische /?i-Glykoprotein gerichteter Antikörper gefunden, der mit dem Ausgangsantigen eine spezifische Reaktion einzugehen vermag.

Auf der Grundlage einschlägiger Versuche, wonach mit Antikörpern gegen das schwangerschaftsspezifische /ii-Glykoprotein eine Konzeptionsverhütung bzw. eine Herbeiführung von Fehlgeburten bei Primaten möglich ist, wurde in der deutschen Patentanmeldung P 23 45 953.2 vorgeschlagen, das schwangerschaftsspezifische /?i-G!ykoprotein zur aktiven Immunisierung von Primaten zu verwenden oder die Konzeptionsverhütung bzw. die Herbeiführung der Fehlgeburt durch

ίο passiv applizierte Antikörper zu bewerkstelligen. Während die passive Übertragung von Antikörpern zu befriedigenden Ergebnissen führt, läßt die aktive Immunisierung insoweit zu wünschen übrig, als bei der Verwendung des homologen schwangerschaftsspezifisehen /Ji-GIykoproteins häufig nur geringe Antikörpermengen ausgebildet werden, die zu einer sicheren Schwangerschaftsverhütung nicht ausreichen. Die Wirksamkeit des vorgeschlagenen immunisierenden Agens ist demnach dann nicht ganz befriedigend, wenn

jo das homologe, d. h. das von der gleichen Spezies stammende schwangerschaftsspezifische 0_rGlykoprotein für die Immunisierung Verwendung findet.

Es ist bekannt, daß das dem schwangerschaftsspezifischen /?i-Glykoprotein entsprechende Glykoprotein

:, auch aus Affen isoliert werden kann. Nach dessen Applikation beim Menschen könnten im Blut des Menschen in ausreichender Menge Antikörper erwartet werden, welche mit dem menschlichen schwangerschaftsspezifischen /?i-Glykoprotein reagieren. Das

in Ausgangsmaterial für die Herstellung von schwangerschaftsspezifischem ß\ -Glykoprotein aus Affen steht jedoch nur in begrenzter Menge zur Verfügung. Demgegenüber kann aus menschlichen tiefgefrorenen Plazenten oder aus Serum von schwangeren Frauen das

!■-) schwangerschaftsspezifische j3i-Glykoprotein in befriedigender Menge hergestellt werden.

Es war daher die Aufgabe gestellt, das schwangerschaftsspezifische /ii-Glykoprotein, das von Menschen isolierte, in der Weise zu modifizieren, daß es vom

ίο menschlichen Körper als körperfremd angesehen und damit zur Induktion von gegen das Glykoprotein gerichteten Antikörpern geeignet wird.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß neue Derivate des schwangerschaftsspezifischen

i) j3i-Glykoproteins hergestellt werden, die als Bestandteil von immunisierenden Mitteln zur Konzeptionsverhütung und zur Herbeiführung von Fehlgeburten eingesetzt werden können.
Es wurde überraschend gefunden, daß eine Reihe von

vi Verfahren zur chemischen Veränder-ng des schwangerschaftsspezifischen /?i-Glykoproteins auch zur Veränderung des immunologischen Verhaltens der dabei erhaltenen Derivate führt in der Weise, daß sie Antikörper im homologen System zu induzieren

-,-, vermögen.

Gegenstand der Erfindung sind demnach proteinmodifizierte Verbindungen des schwangerschaftsspezifischen jii-Glykoproteins, das durch Extraktion von menschlichen Plazenten oder aus dem Blut oder Urin

ho schwangerer Frauen nach einer bestimmten Fraktionsmethode erhalten worden ist, dadurch gekennzeichnet, daß das schwangerschaftsspezifische Glykoprotein zur Proteinmodifizierung einem Verfahren zur Oxydation, Reduktion, Alkylierung oder Acylierung von Proteinen,

hi zur Herstellung einer kovalenten Bindung zwischen Protein und Haptenen oder zwischen Proteinen untereinander unterworfen worden ist.

Bei derartigen Umsetzungen ist von zwei Grundprin-

zipien auszugehen. Sie führen beide zur Veränderung der nativen Struktur und damit zu einer Denaturierung des Proteins:

1. Verfahren zur chemischen Veränderung des schwangerschaftsspezifischen /^-Glycoproteins mit Hilfe von Reagenzien, welche zu einer Veränderung vorhandener chemischer Gruppen führen.

2. Verfahren, die zu einer chemischen Veränderung des schwangerschaftsspezifischen ^!-Glycoproteins durch Einführung neuer Gruppen in das Molekül bzw. die zur Verbindung des Moleküls mit niedrig- oder hochmolekularen Verbindungen führen.

Zu den genannten Verfahren sind diejenigen zu rechnen, die in Proteinen eine oder mehrere der folgenden Gruppen zu verändern vermögen: Amino, Guanidyl, Imidazol, Indol, aliphatisches Hydroxyl, Amid, Thioäther, Disuüisi, Sulfhydryl, Phenol und Carboxyl. Hierfür ist eine Reihe von Reaktionen aus der Literatur bekannt, zu denen hauptsächlich die nachfolgend genannten Reagenzien unter den beispielhaft erwähnten Bedingungen einzusetzen sind.

1.1 Oxydation mit Jodosobenzoat, Porphyrindin, Ferrocyanid oder Jod, wobei in der Regel eine Konzentration des Oxydationsmittels von 0,001 — 0,01 M, ein pH-Wert von 7, eine Temperatur von 0—25°C und eine Umsetzungsdauer von 5—30 Minuten anzirvtnden sind. Die Oxydation mit Jod wird in Gegenwart von Jodid in hoher Konzentration bei einem pH-Wert von 1—7 ausgeführt Die Oxydation kann auch mi' Wasserstoffperoxyd vorgenommen werden. Die bevoi rügten Bedingungen sind dann: Konzentration des Oxydationsmittels etwa 0,005 M, pH-Wert etwa 6,6, Temperatur etwa 25° und Reaktionsdauer 0,5—40 Stunden.

1.2 Reduktion mit Cystein, Thioglykolsäure, Thioglykol, Cyanid oder Sulfid, vorzugsweise unter folgenden Bedingungen: Konzentration des Reduktionsmittels 0,001—0,1 M, pH-Wert 7—8,Temperatur etwa 25° und Reaktionsdauer 0,5—4 Stunden.

Die Reaktionsbedingungen können im einzelnen der Fachliteratur entnommen werden. Sie sind beispielsweise referiert von H. S. O I c ο 11 und H. F r a e η k e I Conrat, Chem. Rev. 41, S 151ff.(1947). Zudem ist ein Teil der Reagenzien und der Verfahrensbedingungen aus H. E. S c h u 11 ζ e und J. F. H e r e rn a η s, Molecular Biology of Human Proteins (1966), S. 40—41 und den darin auf S. 58ff. angegebenen Referenzen zu ersehen.

Mit der Einführung neuer Gruppen in das schwangerschaftsspezifische /?i-Glykoprotein werden Derivate hergestellt, die vom immunologischen Standpunkt aus in der Regel als Hapten-Verbindungen bezeichnet werden. Nach einer anerkannten Definition ist ein »Hapten« eine proteinfreie Substanz, die mit einem spezifischen gegen seine Konfiguration gerichteten Antikörper reagieren kann, die ihrerseits jedoch nicht zur Bildung nachweisbarer Antikörpermengen befähigt ist. Ein Hapten bewirkt eine Immunantwort nur in Verbindung mit einem Trägerprotein. Die meisten Haptene sind niedermolekulare Verbindungen mit einem Molekulargewicht < 1000. Es werden jedoch auch Makromoleküle wie beispielsweise die Pneumokokkenpolysaccharide als Haptene angesehen. Eine Hapten-Protein-Verbindung führt in der Regel zur Induktion von zwei Typen von Antikörpern, wobei Spezifitäten gegen die Haptengruppierung und gegen den Proteinträger entstehen. Im Falle des schwangerschaftsspezifischen 0|-Glykoproteins gilt, daß dessen Hapten-Verbindungen auch gegen das Trägerprotein im homologen System Antikörper induzieren.

Als Haptene im Sinne der Erfindung kommen die in der Literatur als solche beschriebenen chemischen Gruppen und Verbindungen in Frage. Insbesondere gehören hierzu aromatische Ringsysteme, Steroide, Peptide, Purine, Pyrimidine, Penicillin und dessen Derivate, aber auch Einzelmoleküle wie beispielsweise Jod, und entsprechend einer hier vorgenommenen erweiterten Definition der an den Träger schwangersc ;aftsspezifischen /?i-Glykoprotein zu bindenden Substanzen auch hochmolekulare Körper mit Peptid- bzw. Protein- und Kohlenhydratcharakter, die ihrerseits selbst antigene Eigenschaften haben.

Die Verfahren zur Herstellung der Derivate des schwangerschaftsspezifischen ßi-Glykoproteins nach dem genannten Grundprinzip (2.) unter Verwendung von Haptenen sind als allgemein anwendbare Reaktionen für die Einführung von Proteine modifizierenden chemischen Gruppen und von Haptenen in Eiweißkörper unter Ausbildung kovalenter Verknüpfung zwischen chemischen Substanzen und Proteinen bekannt Insbesondere handelt es sich dabei um Reaktionen, die für die Modifikation einzelner Gruppen in Proteinmolekülen beschrieben sind. Auch diese Reaktionen sind in den Arbeiten von Oleott und Fraenkel-Conrat und von Schultze-Heremans beschrieben. Beispiele solcher Verfahren sind:

2.1 Die Alkylierung mit
Jodacetat, Jodacetamid,

(0,05-0,1 M,pH 7-8,0-25°,0,5-2 Stunden) oder
Dinitrofluorobenzol:

(0,17 M,pH 7-8,25°,Ί Stunden).

2.2 Die Acylierung mit
Keten

(pH 5 - 8,0,25° ,5-30 Min.),
Essigsäureanhydrid

(pH 7-8,0°,30 Min.),
Kohlenstoffsuboxid

(pH 5-8,0-25°, 5-30 Min.),
Aziden, Benzoyl-.Carbobenzoxy- oder
Benzolsulfonylchiorid

(pH 7-9,0-25°, 0,5-2Stunden),
Salpetriger Säure

(1 M, pH 4,30 Min.),
Jod

(pH 5-11, -5°-25°, 0,5-3 Stunden: im Gegensatz zu oben beschriebener Oxydation mit geringerer Jodmenge und niedriger Jodid-

konzentration),
Formaldehyd

(1 -2 M,25°,bei pH 7-8,1 Stunde, bei

pH 11,10 Min.),
Epoxiden

(1 -2 M, pH 5-6,1 -4 Tage),
Senfgas

(pH 5-6,25°,0,5-4 Stunden),
Säiire/Alkohol (Mineralsäure in absolutem
Alkohol)

(0,01-0,1 M,0-25°, 1-2 Tage),

Methyldiazoacetat, Diazoaceiamid

(pH 5 (Ester), pH 6 (Amid), 0°)
p-Chloromercuribenzoat

(ΙΟ-⁵-ΙΟ"² M, pH 7,25°,5-30 Min.),
Diazonium-Verbindungen

(pH7-9,25°,30Min.)oder
o-Methylisoharnstoff

(0,5 M, pH 10,5,0°,3Tage).

Für einige der obengenannten Gruppen ist nachfolgend auf die Verfahren näher eingegangen:

a) Jodierung

(Literatur: Kabat und Mayers Experimental Immunochemistry, sec. edition 1961,816—818).
Jod wird als Jodinat mit Tyrosinresten des Proteins zur Umsetzung gebracht, wobei ein oder zwei Jodatome in das Tyrosinmolekül eingeführt werden und das Jodprotein entsteh! In gleicher Weise kann die Jod-Verbindung des schwangerschaftsspezifischen ß\-Glykoproteins hergestellt werden.

b) Diazotierung und Kupplung

(Literatur: Kabat and Mayers Experimental Immonochemistry, sec. edition 1961,798—799).
Hierzu wird eine Verbindung mit einer aromatischen Aminogruppe, beispielsweise die Arsanilsäure oder Sulfanilsäure, diazotiert und die Diazoniumverbindung sodann mit dem Protein umgesetzt. Dabei gehen vornehmlich Tyrosinreste, aber auch Histidin- und Lysinreste des Proteins eine kovalente Verbindung mit der aromatischen Komponente ein. Nach diesem Verfahren kann die Diazo-Arsanilsäure- oder die Diazobenzol-Sulfonsäure-Verbindung des schwangerschaftsspezifischen /JrGIykoproteins hergestellt werden.

c) Umsetzung mit Vinylsulfonverbindungen

(in Analogie zur Reaktion von Reaktivfarbstoffen, die als Reaktivkomponente die Vinylsulfongruppe enthalten, mit Zellulose oder Wolle).
Aliphatische oder aromatische Vinylsulfonderivate und Schwefelsäurehalbester von /J-Hydroxyäthylsulfon können mit den Aminogruppen und/oder Hydroxylgruppen des Proteins zur Reaktion gebracht werden. Auf diese Weise kann z. B. die Hapten-Verbindung des schwangerschaftsspezifischen /Ji-Glycoproteins mit l-Amino-4/J-Hydroxyäthylsulfon-Schwefelsäureester erhalten werden.

d) Reaktion mit Isocyanat- und Isothiocyanat-Verbindungen

(Literatur: Kabat and Mayers Experimental Immunochemistry, sec. edition 1961,809-811).
Diese Reaktion, die über die freien Aminogruppen des Proteins abläuft, erlaubt in Analogie zu den bekannten Verfahren der Proteinchernie die Umsetzung von Haptenen mit der entsprechenden chemischen Gruppierung auch mit dem schwangerschaftsspezifischen /Ji-Glykoprotein.

e) Dinitrophenylierung

(Literatur: Carsten, M, E,; Eisen, H, N., J, Am. Chem. Soc. 77,1273 f 1955]).
Die in der Regel mit Dinitrobenzolsulfonat oder Dinitrofluorbejizol durchgeführte Reaktion führt zur Umsetzung der freien Aminogruppen des Protein3 unter Bildung von DinitrophenylderivUen. Auf diese Weise wird dinitrophenylieites schwangerscha-tsspezifisches /Ji-Glykoprotein erhalten.

f) Reaktion mit gemischten Anhydriden
(Literatur: Kabat und Mayers Experimental Immunochemistry, sec. edition 1961,813—815).

Dieses Verfahren ist geeignet, um eine Reihe verschiedener Haptene, die zunächst durch Acylierung in ein gemischtes Anhydrid überführt werden müssen, mit Aminogruppen des Proteins zu verknüpfen. Zudem lassen sich durch direkte Umsetzung von Proteinen mit Anhydriden in bekannter Weise Säureamide der allgemeinen Formel

R-CO-NHCH₂-Protein

herstellen, wobei R ein beliebiges Hapten sein kann. Mit Hilfe dieser Reaktion läßt sich beispielsweise die schwangerschaftsspezifische /J,-Glykoprotein-Hapten-Verbindung mit R = Benzyl als Hapten herstellen.

g) Reaktion mit Carbodiimiden

(Literatur: M a k i η ο, Τ., '.-.. al. Contraception 8(2).

133 [1973]).

Die Cardodiimide der allgemeinen Formel

R-N=C=N-R

(R = ein beliebiger organischer Rest) sind geeignet. um Carboxyl-Gruppen enthaltende Haptene mit Aminogruppen von Proteinen zu verknüpfen. Auch hierbei wird als Reaktionsprodukt die Verbindung R—CO-NH-Protein erhalten, wobei R jedes beliebige Hapten, das eine Carboxylgruppe besitzt. sein kann. Mit Hilfe dieser Reaktion wird beispielsweise die Hapten-Verbindung des schwangerschaftsspezifisc; en /Ji-Glykoproteins mit Cyclohexane?rbonsäure als Hapten erhalten.

Das immunologische Verhalten des schwangerschaftsspezifischen /ii-Glykoproteins läßt sich erfindungsgemäß auch durch Verknüpfung des Glykoproteins mit einem Peptid oder Protein verändern. Die Verknüpfung kann entweder kovalent oder durch Komplexbildung vorgenommen werden. Als Reaktionspartner sind hier Peptide, beispielsweise auch solche mit eigener biologischer Funktion, verwendbar, z. B. Dekapeptide wie der LRF (Luteinisierendes Hormon Releasing Factor). Der LRF ist beispielsweise in der gleichen Weise mit dem schwangerschaftsspezifischen /Ji-Glykoprotein zu verknüpfen, wie dies für dessen Verknüpfung mit Albumin von T. Makino u. a. in Contraception 8, 2 (1973), S. 133ff., beschrieben ist. Die zugrunde liegende Reaktion geht auf die Carbodiimid-Aktivierung der Carboxylgruppen mit Carbod'imid-Verbindungen zurück.

Tine weitere Möglichkeit zur Veränderung des immunologischen Verhaltens des schwangerschaftsspezifischen /Ji-Glykoproteins besteht in der Verknüpfung des Proteins mit einer zweiten Proteinsubstanz in der Weise, wie dies beispielsweise für die Verknüpfung von Enzymen mit Proteinen bekannt ist, wobei das schwangerscliaftsspezifische /Ji-Glykoprotein in der Reaktion einen der beiden Partner ersetzen kann. Für die Verbindung der beiden Proteine miteinander sind eine Reihe von Verfahren geläufig. Sie verwenden einzelne Gruppen von aktivierenden Substanzen wie beispielsweise Carbodiimide, Cyanurchlorid, p,p-Difluor-m,m-dinitrophenylsu!fon oder Glutardialdehyd. Das schwangerschaftsspezifische /Ji-Glykoprotein kann z. B. mit Hilfe von Glutardialdehyd in einer Reaktion analog der. die von S. Avrjmeas: Immnnnrhpmiurv fi

1969, 43 — 52, für die Kopplung von Gammaglobulin mit Peroxydase beschrieben ist, mit einer Reihe von Proteinen durchgeführt werden. Vorzugsweise wird im Sinne der vorliegenden Erfindung das als immunisierendes Agens vorgesehene schwangerschaftsspezifische ßi-Glykoprotein mit einer Proteinsubstanz verbunden, die selbst als Impfstoffkomponente wirksam ist, wie /.. B. Tetanustoxoid.

Mit der vorgegebenen Aufzählung von Verfahrensweisen soll lediglich beispielhaft gezeigt werden, daß alle in der Literatur für die Derivatisierung von Proteinen als geeignet beschriebene Reaktionen für die Herstellung der erfindungsgemäßen Produkte eingesetzt werden können.

Gegenstand der Erfindung .sind ganz allgemein die Verfahren zur Herstellung von Derivaten des schwangerschaftsspczifischcn /Ji-Glykoproteins. bei denen das schwangcrschaftsspezifische ßi-Glykoprotein einem Verfahren zur Oxydation, Reduktion, Alkylierung oder Acylierung von Proteinen, zur Herstellung einer kovalenten Bindung zwischen Proteinen und Haptenen oder zwischen Proteinen untereinander unterworfen wird.

Die erhaltenen Reaktionsprodukte werden entsprechend bekannten Techniken in die für die parenterale Injektion geeignete Zubereitung überführt und wie bei Impfstoffen üblich gegebenenfalls mit stabilisierenden Zusätzen und anorganischen oder organischen Immunadjuvantien versehen, um auf diese Weise als aktiv immunisierendes Agens für die Geburtenkontrolle eingesetzt werden zu können.

Die Verwendung der Verbindungen als Bestandteil von immunisierenden Agenzien sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Als stabilisierende Zusätze kommen Stoffe in Frage, welche die Haltbarkeit der Präparate verbessern, insbesondere niedrigmolekulare Kohlenhydrate oder Eiweißstoffe oder deren Derivate wie abgebautes und wiedereingesetztes Kollagen, beispielsweise das unter dem Warenzeichen ^Haemaccel erhältliche Gelatine-Produkt, gegebenenfalls mit weiteren Zusätzen wie

.__: — . r\:~ Xg —

ge derartiger Zusätze beträgt zweckmäßig 0.5% bis 5%, zuweilen bis zu 10%. Das immunisierende Agens kann danach flüssig oder in trockener zweckmäßig in gefriergetrockneter Form, zur Verfügung gestellt werden. Letzteres wird vor der Applikation im Wasser oder einem physiologisch verträglichen Medium aufzulösen sein.

Die folgenden Versuche, die mit Produkten ausge- > führt werden, die gemäß Beispiel I oder 2 erhalten werden können, zeigt den Erfolg der aktiven Immunisierung von Affen mit den erfindungsgemäßen Derivaten des schwangerschaftsspezifischen /Ji-Glykoproteins.

Versuchsbeschreibung

Geschlechtsreife weibliche Affen (Cynomolgen) wurden über einen Zeitraum von 6 Wochen durch intravenöse und/oder subkutane Gabe von insgesamt 3 mg eines Derivates des schwangcrschaftsspezifischen /ii-Glykoproteins in isotonischer Kochsalzlösung mit fein verteiltem Aluminiumhydroxyd als Adjuvans abwechselnd intravenös und subkutan immunisiert. Alle Tiere entwickelten Antikörper gegen das schwaneerschaftsspezifische /ii-Giykoprotein, die im Ge'iuifiusionstsst mit Hilfe von schwangerschaftsspezifischem /Ji-Glykoprotein qualitativ nachgewiesen und quantitativ mit der radialen Immundiffusion bestimmt wurden. Im Durchschnitt wurde hierbei ein Titer von 0,09 mg Antikörper/ml erhalten. Nach der Immunisierung wurden die weiblichen Tiere jeweils zum Zeitpunkt der Ovulation für 3 Tage mit einem befruchtungsfähigen männlichen Tier zur Paarung zusammengebracht und dann das Ergebnis der Kopulation untersucht. Die Hälfte der Tiere erhielt monatlich zwischen den Kopulationen bzw. während der Schwangerschaft Boosterinjektionen (0,4 mg Protein). Die gegen schwangerschaftsspezifisches /Ji-Giykoprotein immunisierten weiblichen Affen waren gegenüber nichtbehandelten Kontrolltieren in ihrer Fortpflanzungsfähigkeit stark gehemmt. Das Ergebnis bei den immunisierten Tieren zeigt Tab. 1. Bei einigen Affen trat auch nach mehrfacher Kopulation keine Schwangerschaft ein. andere wurden erst nach der 3. oder 4. Paarung trächtig. Diejenigen Affen, die bei der ersten oder aber auch bei einer der nachfolgenden Kopulationen trächtig wurden, abortierten fast alle im ersten oder im zweiten Drittel der SdvsP^^^aft Nur finpr vnn Hp.n Affpn die bei der ersten Kopulation trächtig geworden waren, zeigte eine normale Schwangerschaft mit einer normalen Geburt. Ein zweiter hat nach der 3. Kopulation eine Schwangerschaft normal ausgetragen.

Tabelle

Antigen	Allen	Anti	Paarung und	LrIoIg	+ A	Abort
	Nr.	körper-			(34-45	Tage der Trächtigkeit
		titer	Empfängnis	+ ja A =
				- nein ( I =		+ A
		mg/ml				(35)
Derivat des schwanger-	2	0,10	_	_ _	- _
schaHsspe/ifisehen					-
/J:-G!>koproteins	3	0,05	_	- —
nach Beispiel 2	4	0.09	-	-
	5	0.05	+ A	+ A	-i- A
			(40-135)		) (29-36)
	6	0.15	-

	7	0.29	₊

Geburt

ιο

Amigen	Allen	Anli-	l'iiarung um!	ItIoIi;	Α hört	f'.phiir
	Nr.	kiirpor-			I ;ige der I Richtigkeit
		iiler	ImnP.ingnis	t pi Λ
				nein ( ι
		•ιιμ/ηιΙ
Derivat dps schwänger	IO	UOS	+ Λ
st ha Itsspc/i Use hen			(110)
/ί,-Glycoproteins	12	0,09	+ Λ
nach Beispiel 1			(104)
	13	0,05	-
	14	0,05	+ Λ	+ A
			(20-34)	(21-29)
	15	0.05	+ A
			(92)
	, /■ I U	0.05		-ι-

Vergleichbare Ergebnisse werden erhalten, wenn das schwangerschaftsspezifische βι-Glykoprotein einer Oxidation mit Jod, einer Reduktion mit Thioglykolsäure, einer Alkylierung mit Jodazetamid, einer Acylierung mit anderen Diazoniumverbindungen, einer Verknüpfung mit einem anderen Hapten oder einer Verknüpfungsreaktion mit einem Protein wie z. B. Tetanus-Toxoid unterworfen wird.

Kontrollen zum Vergleich

\ on 39 Affen waren nach spätestens 3 Kopulationen 31, d.h. 80%, trächtig. Von diesen Schwangerschaften endete nur eine mit einem spontanen Abort, die anderen verliefen alle normal.

Mit den nachfolgenden Beispielen soll die Erfindung näher erläutert werden:

Beispiel 1

Modifizierung von schwangerschaftsspezifischem
ßi-Glykoprotein mit diazotierter Sulfanilsäure

a) Herstellung des Diazoniumsalzes

1 g Sulfanilsäure werden bei Zimmertemperatur in 100 ml 0,1 N HCl gelöst, dann in Eiswasser gestellt und unter Rühren auf 0°C abgekühlt Die Sulfanilsäure fällt dabei als Salz aus. In die Suspension läßt man dann 50 ml einer kalten l%igen Lösung von Natriumnitrit in Wasser langsam (im Verlauf von 1 Stunde) unter Rühren eintropfen; das Ende der Reaktion wird durch die Blaufärbung von Kaliumjodid-Stärkepapier angezeigt.

b) Herstellung der Hapten-Verbindung

Die Konjugation von schwangerschaftsspezifischem /Ji-Glykoprotein mit der diazotierten Suifaniisäure erfolgt bei schwach alkalischem pH. Man löst dazu 100 mg schwangerschaftsspezifisches jS_rGlykoprotein in 10 ml eines 0,2 M-Natriumphosphatpuffers von pH 8,2 und kühlt die Lösung auf 4° C ab. Dann gibt man 0,57 ml der Diazoniumsalzlösung hinzu (das molare Verhältnis von schwangerschaftsspezifischem 0_rProtein zu diazotierter Sulfanilsäure im Reaktionsgemisch beträgt in diesem Fall 1 :20) und rührt 4 Stunden bei 4° C. Der pH-Wert, der nicht unter 8,0 absinken soll, wird dabei durch Zugabe von 0,2 N NaOH korrigiert. Anschließend läßt man die Lösung 15 Stunden bei 4° C stehen. Das modifizierte Protein wird dann mehrere Tage gründliche gegen Wasser dialysiert und schließlich lyophilisiert

Die Umsetzung von schwangerschaftsspezifischem j9i-Glykoprotein mit der diazotierten Sulfanilsäure hat eine Orangefärbung des Proteins zur Folge. Außerdem wird durch die Einführung saurer Gruppen die elektrophoretische Beweglichkeit verändert. Bei der Elektrophorese in Agar oder im Polyacrylamid-(PAA-) Gel wandert das modifizierte Protein schneller zur Anode als das native schwangerschaftsspezifische jSi-Glykoprotein.

Eine Dosis des immunisierenden Agens hat folgende Zusammensetzung:

0,2 mg des Derivates des schwangerschaftsspezifischen 01-Glykoproteins gelöst in 3 ml isotonischer Kochsalzlösung enthaltend 0,05% Al(OH₃), 5% Haemaccel* und als Konservierungsmittel 0,15 mg Natriumtimerfonat.

Beispiel 2

Herstellung der Hapten-Verbindung mit 1 -Aminobenzol-4/J-HydroxyäthylsuIfon-Schwefelsäureester

Ausgangsmaterial ist der ]-Aminobenzo!-4/?-Hydroxyäthylsulfon-Schwefeisäureester, der im alkalischen pH-Bereich (pH 9—10) Schwefelsäure abspaltet und dabei eine reaktionsfähige aromatische Vinylsulfon-Verbindung, die sogenannte »Parabase« liefert, die dann mit den Amino- oder Hydroxygruppen im Protein reagiert.

100 mg schwangerschaftsspezifisches /JpGlykoprotein werden in 10 ml einer 2,5%igen Lösung von Na₂HPO₄ · 2 H₂O (pH 9,25) gelöst Dazu gibt man unter Rühren bei Zimmertemperatur 3,1 rnl einer i%igen Lösung des »Parabase«-Esters in Wasser (molares Verhältnis: schwangerschaftsspezifisches /ii-Giykoprotein zu »Parabase«= 1 :100). Man rührt 4 Stunden bei Zimmertemperatur und hält dabei durch Zugabe von 0,1 N NaOH den pH-Wert konstant bei 9,2. Anschließend läßt man 15 Stunden bei 4° C stehen, dialysiert dann gründlich gegen H₂O und lyophilisiert das modifizierte Protein.

Eine Dosis des immunisierenden Agens hat folgende Zusammensetzung:

1 mg schwangerschaftsspezifisches jSi-Giykoprotein-Hapten-Verbindung gelöst in 5 ml isotonischer Kochsalzlösung.

Claims

Patentansprüche:

1. Proteinmodifizierte Verbindungen des schwangerschaftsspezifischen /Ji-Glykoproteins, das durch Extraktion von menschlichen Plazenten oder aus dem Blut oder Urin schwangerer Frauen nach einer beitimmten Fraktionsmethode erhalten worden ist, dadurch gekennzeichnet, daß das schwangerschaftsspezifische G'ykoprotein zur Proteinmodifizierung einem Verfahren zur Oxydation, Reduktion, Alkylierung oder Acylierung von Proteinen, zur Herstellung einer kovalenten Bindung zwischen Protein und Haptenen oder zwischen Proteinen untereinander unterworfen worden ist

2. Verwendung der Verbindungen nach Anspruch 1 als Bestandteil von immunisierenden Mitteln zur Konzeptionsverhütung und zur Herbeiführung von Fehlgeburten.