NO763361L

NO763361L -

Info

Publication number: NO763361L
Application number: NO763361A
Authority: NO
Inventors: H Bohn; E Weinmann
Original assignee: Behringwerke Ag
Priority date: 1975-10-02
Filing date: 1976-10-01
Publication date: 1977-04-05
Also published as: NZ182193A; IT1070582B; ATA731176A; DE2543994A1; IL50589A0; JPS5290613A; AT352756B; NL7610688A; DE2543994C3; DK444576A; IL50589A; DE2543994B2; BE846928A; SE7610892L; AU511175B2; FR2326203B1; FI762790A; GB1560633A; FR2326203A1; AU1831876A

Abstract

Derivater av det svangerskapsspesifikke 3-^-glykoprotein, fremgangsmåte til deres fremstilling og midler som inneholder disse.

Description

Oppfinnelsen vedrører derivater av det svangerskapsspesifikke f^-glykoprotein, fremgangsmåte til deres fremstilling og immuniserende stoffer, som som vesentlig bestand-

del inneholder et derivat av det svangerskapsspesifikke 3^"glykoprotein, som kan anvendes som podningsstoff til å hindre et svangerskap. •I DOS 2.157.610 ble det omtalt et svangerskapsspesifikt B-^-glykoprotein og en fremgangsmåte til dets fremstilling. Utgangsmaéerialene for isoleringen er menneskelige organer eller kroppsvæsker. Ved immunisering av virveldyr med det fra mennesker stammende svangerskapsspesifikke 3-^~glykoprotein finnes i plasmaet.av de immuniserte dyr et mot det svangerskapsspesifikke B-^-glykoprotein rettet antilegeme,

som med utgangsantigenene formår å inngå en spesifikk reaksjon.

Det svangerskapsspesifikke B^-glykoprotein (SP 1)

erkarakterisertav følgende parametre:

a) Elektroforetisk bevegelighet i agargel i 3-j_-globulinom-

rådet av humanplasmaproteiner,

b) en sedimenteringskonstant i ultrasentrifuge på 4,6 0,5S,

c) en ved gelfiltrering bestemt molekylvekt på 100.000 15.000,

d) en ekstinksj onskoeffis'iént på' E, = 11,6 ± 0,5

0* 1 cm '>J

(bestemt ved 278 mu i 1/15 molar fosfatpuffer av pH 7,0),

e) et kullhydratinnhold på 28,05 1,55-

, På grunnlag av egnede forsøk, ifølge hvilke det

med antilegemer mot det svangerskapsspesifikke 3^-glykoprotein er mulig en konsepsjonshindring resp. en tilveiebringelse av abort hos primater, ble det i tysk patentsøknad nr. P 23 45 953.2 foreslått å anvende det svangerskapsspesifikke B^glykoprotein til aktiv immunisering av primater eller bevirke en konsepsjonshindring resp. tilveiebringelse av abort ved passive appliserte antilegemer. Mens den passive overføring av antilegemer fører

til tilfredsstillende resultater lar den aktive immunisering forsåvidt mere å ønske, da det ved anvendelsen av det homologe svangerskapsspesifikke Bj-glykoprotein ofte bare dannes mindre antilegememengder som ikke er tilstrekkelige til en sikker svangerskapshindring. Virkningen av det foreslåtte immuniserende stoff er følgelig da ikke helt tilfredsstillende, når den homologe, dvs. fra samme art stammende svangerskaps-spesifikke B-^-glykoprotein finner anvendelse for immunisering.

Det er kjent at det til det svangerskapsspesifikke 3^-glykoprotein svarende glykoprotein også kan isoleres fra

^åper. Etter dets applikasjon hos mennesker kunne det i men-neskets blod i tilstrekkelig mengde ventes antilegemer som reagerer med det menneskelige svangerskapsspesifikke B-^-glykoprotein Utgangsmaterialet■for fremstilling av svangerskapsspesifikt B-^-glykoprotein fra aper står imidlertid bare til disposisjon i begrensede mengder. Derimot kan det, som det er anført i førstnevnte DOS - fra menneskelige dypfrosne placentaer eller fra serum av svangre kvinner fremstilles det svangerskapsspesifikke g-^-glykoprotein i tilfredsstillende mengde.

Det var derfor stilt den oppgave å modifisere

det svangerskapsspesifikke Bj-glykoprotein, fortrinnsvis det som var isolert fra mennesker, således at det av det menneskelige legeme anses som kroppsfremmed og dermed er egnet til induksjon av antilegemer rettet mot glykoproteinet.

Oppgaven løses ifølge oppfinnelsen ved at det fremstilles nye derivater av det svangerskapsspesifikke '3-^-glykoprotein, som kan anvendes som bestanddel av immuniserende midler til konsepsjonshindring og til tilveiebringelse av abort.

Det ble overraskende funnet at en rekke fremgangsmåter fører til kjemisk endring av det svangerskapsspesifikke Bj-glykoprotein også til endring av det immunologiske forhold av de derved dannede derivater, således at de formåi?å indusere antilegemer i det homologe system.

Oppfinnelsens gjenstand er i første rekke de ved omsetning med en proteinmodifiserende forbindelse fremstill-bare derivater av det svangerskapsspesifikke B^-glykoprotein.

Ved slike omsetninger er det å gå ut i fra to grunnprinsipper. De fører begge til endring av den native struktur og dermed til en denaturering av proteinet: 1. Fremgangsmåter til kjemisk endring av det svangerskapsspesifikke B-^-glykoprotein ved hjelp av reagenser som

fører til en endring av tilstedeværende kjemiske grupper.

2. Fremgangsmåter som fører til en kjemisk endring av det svangerskapsspesifikke g-^-glykoprotein ved innføring av nye grupper i molekylet resp. som fører til forbindelse av molekylet med lav- eller høymolekylære forbindelser.

Til de nevnte fremgangsmåter er det å regne dem

som i proteinet formår å endre en eller flere av følgende grupper: Amino, guanidyl, imidazol, indol, alifatisk hydroksyl, amid, tioeter, disulfid, sulfhydryl, fenol og karboksyl. Her-

til er det kjent en rekke reaksjoner fra litteraturen, hvortil det hovedsakelig er å anvende de nedenfor nevnte reagenser under de eksempelvis nevnte betingelser.

1.1. Oksydasjon med jodosobenzoat, porfyrindin, ferrocya--

nid eller jod, idet vanligvis er å anvende en konsentrasjon av oksydasjonsmidlet på 0,001 - 0,01 molar, en pH-verdi på 7, en temperatur på 0-25°C og en omsetnings-varighet på 5-30 minutter. Oksydasjonen med jod utføres i nærvær av jodid i høy konsentrasjon ved en pH-verdi på 1-7. Oksydasjonen kan også foretas med hydrogenperok-syd. De foretrukkede betingelser er da: Konsentrasjonen av oksydasjonsmidlet ca. 0,005 molar, .pH verdi ca. 6,6,

temperatur ca. 25°C og reaksjonsvarighet 0,5-40 timer.

1.2. Reduksjon med cystein, tioglykolsyre, tioglykol, cyanid eller sulfid, fortrinnsvis under følgende betingelser:

Konsentrasjon av reduksjonsmidlet 0,001-0,1-molar, pH-

verdi 7-8, temperatur ca. 25°C og reaksjonsvarighet 0,5-

4 timer.

Reaksjonsbetingelsene kan -i detalj utledes av faglitteraturen. De er eksempelvis referert åvaH.S. Olcott og H. Fraenkel-Conrat, Chem. Rev. 4l, side 151 og følgende

(1947). Dessuten kan en del av reagensen, og fr.emgangsmåte-betingelsene uttas av H.E. Schultze og J.F.■Heremans, Mole-

cular Biology of Human Proteins (1966), side 40-41 og de deri på side 58 og følgende angitte referanser.

Med innføring av nye grupper i det svangerskapsspesifikke 3-^-glykoprotein fremstilles derivater, som fra immunologisk standpunkt vanligvis betegnes som Hapten-forbindelser. Ifølge en anerkjent definisjon er en "Hapten" et proteinfritt stoff, som kan reagere med et spesifikt, mot dets konfigurasjon rettet antilegeme, som på sin side imidlertid ikke er i stand til dannelsen av påvisbare antilegememengder. Et hapten be-virker et immunsvar bare i forbindelse med et bæreprotein.

De fleste hapter er lavmolekylære forbindelser med en molekylvekt under 1000. Som haptener anses imidlertid også makromole-kylære som eksempelvis'pneumokokkpolysakkaridene. En hapten-protein-forbindelse fører vanligvis til induksjon, av to typer antilegemer, idet det oppstår spesifiteter mot hovedgrupper-ingen og mot proteinbæreren. I tilfellet det svangerskaps-' spesifikke B-^-glykoprotein gjelder at dets haptenforbindelser også induserer antilegemer mot bærerproteinet i det homologe system.

Som haptener innen oppfinnelsens ramme kommer

det på tale de i litteraturen som sådanne omtalte kjemiske grupper og forbindelser. Spesielt hører hertil aromatiske ringsystemer, steroider, peptider, puriner, pyrimidiner, peni-cillin og dets derivater, men også enkeltmolekyler som eksempelvis jod og tilsvarende av en her foretatt utvidet definisjon de stoffer som skal bindes til bæreren av det svangerskapsspesifikke 3-]_-glykoprotein også høymolekylære legemer med peptid- resp. prote„in- og kullhydratkarakter, som på sin side har antigene egenskaper.

Fremgangsmåten til fremstilling av derivater av det svangerskapsspesifikke 3^-glykoprotein etter det nevnte grunnprinsipp (2.) under anvendelse av haptener er kjent som generelt anvendbare reaksjoner for innføring av proteinmodifiserende kjemiske grupper og av haptener i eggehvitelegemer under dannelse av kovalente bindinger mellom kjemiske stoffer og proteiner. Spesielt dreier det seg derved om reaksjoner som er omtalt for modifikasjon av enkelte grupper i proteinmole-kylene. Også disse reaksjoner er omtalt i arbeidene av Olcott og Fraenkel-Conrat og av Schultze-Heremans. Eksempler på slike fremgangsmåter er:

2.1. Alkylering med

jodacetat, jodacetamid, (0,05-0,1 molar, pH 7~8, 0-25°C, 0,5-2 timer) eller

dinitrofluorobenzen: (0,17 molar, pH 7-8, 25°C, 2 timer).

2.2. Acylering med

keten (pH 5-8, 0,25°C, 5-30 minutter), eddiksyreanhydrid (pH 7-8, 0°C, 30 minutter), karbonsuboksyd (pH 5-8, 0-25°C, 5"30 minutter), åziden, benzoyl-, karbo-

benzoksy- eller benzen-

sulfonylklorid (pH 7~9, 0-2£°C,' 0,5-2 timer), salpetersyrling (1 molar, pH 4, 30 minutter), jod (pH 5-11, -5°-25°C, 0,5-3 timer:

i motsetning til overnevnte oksy-das jon med mindre jodmengde og lavere jodkonsentrasjon), formaldehyd (1-2 molar, 25°C, ved pH 7-8, 1 time, ved pH 11, 10 minutter), epoksyder (1-2 molar, pH 5-6, 1-4.dager), sennepsgass (pH 5-6, 25°C, 0,5-4 timer),

syre/alkohol (mineralsyre i absolutt alkohol) (0,01-0,1 molar, 0-25°C, 1-2 dager) metyldiazoacetat, diazoacetamid XpH 5 (ester), pH 6 (amid), 0°C) p-kloromercuribenzoat (10 _ c -10 _p molar, pH 7, 25 oC,

5-30 minutter),

diazonium-forbindelser (pH 7-9, 2-5°C, 30 minutter) eller o-metylisourinstoff (0,5 molar, pH 10,5, 0°C, 3 dager).

Por noen av de overnevnte grupper er det i det følgende gått nærmere inn på fremgangsmåten: a) Jodering (Litteratur: Kabat og Mayer's Experimental Immunochemistry, sec. edition 1961, 816-818).

Jod bringes som jodinat til reaksjon med tyrosinrester av proteiner, idet ett eller tp. jpdatomer føres i tyro-sinmolekylet og jodproteinet oppstår. På samme måte kan jod-forbindelsen av det svangerskapsspesifikke 3-^-glykoprotein

fremstilles.

b) Diazotering og kopling (Litteratur: Kabat og Mayer's

■ Experimental Immunochemistry,

sec. edition 1961, 798-799).' Hertil diazoteres en forbindelse med en aromatisk aminogruppe, eksempelvis arsanilsyren eller sulfanilsyren, og diazoniumforbindelsene omsettes deretter med proteinet. Derved inngår -spesielt tyrosinrester, men også histidin- og lysin-rester av proteinet en kovalent forbindelse med den- aromatiske komponent. Ifølge denne fremgangsmåte kan diazo-arsanilsyre-eller diazobenzen-sulfonsyre-forbindelsen av det svangerskapsspesifikke 3-[_-glykoprotein fremstilles.

c) Omsetning med vinylsulfonforbindelser (i analogi til reaksjon av reaktivfarvestoffer, som som reaktivkomponenter

inneholder vinylsulfongruppen, med cellulose eller ull). Alifatiske eller aromatiske vinylsulfonderivater og svovel-syrehalvestere av g-hydroksyetylsulfoner kan bringes "til reaksjon med aminogruppene og/eller hydroksylgruppene av proteinet. På denne måte kan det f.eks. fåes haptenfor-bindelsen av det svangerskapsspesifikke 6^-glykoprotein

med l-aminobenzen-43-hydroksyetylsulfon-svovelsyreestere.

d) Reaksjon med isocyanat- og isotiocyanat- forbindelsene (Litteratur: Kabat og Mayer's Experimental Immunochemistry,

sec. edition 1961, 809-811). Denne reaksjon som forløper over proteinets frie aminogrupper muliggjør i analog til de kjente fremgangsmåter fra proteinkjemien omsetning av haptener med de tilsvarende kjemiske grupperinger også med

det.svangerskapsspesifikke 3^-glykoprotein.

e) Pinitrofenylering (Litteratur: Carsten, M.E.; Eisen, H.N., J. Am. Chem. Soc. 77, 1273 (1955). Den vanligvis med di-nitrobenzensulfonat eller dinitrofluorbenzen gjennomførte reaksjon fører til omsetning av de fri aminogrupper av protein under dannelse av dinitrofenyIderivater. På denne måte fåes dinitrofenylert svangerskapsspesifikt 3-L_glykoprotein. f) Reaksjon med blandede anhydrider (Litte>ratur: Kabat og Mayer's, Experimental Immunochemistry, sec. edition 1961,

813-815). Denne fremgangsmåte ereegnet til å sammenbinde

en rekke forskjellige haptener, som i første rekke ved i acylering må. overføres i et blandet anhydrid med aminogrupper av proteinet. Dessuten lar det seg ved direkte omsetning av proteiner med anhydrider på kjent måte fremstilles syreamider med den generelle formel -R-CO-NH-CI^-protein, idet R kan være et ønskelig hapten. Ved hjelp av denne reaksjon lar det seg eksempelvis fremstille den svangerskapsspesifikke 3^-glykoprotein-hapten-forbindeIse

med R = benzyl som hapten.

g) Reaksjon med karbodiimider (Litteratur: Makino, T. et al., Contraception 8 (2), 133 (1973). Karbodiimidene med den

generelle formel R-N=C=N-R (R = en vilkårlig organisk rest) er egnet til å sammenknytte karboksylgruppeholdige haptener med aminogrupper av proteiner. Også herved fåes som reak-

sjonsprodukt forbindelsen R-CO-NH-protein, idet R kan være et hvilket som helst ønskelig hapten som har en karboksyl-gruppe. Ved hjelp av denne reaksjon fåes eksempelvis hap-tenforbiridelse av det svangerskapsspesifikke 3-^-glykoprotein med cykloheksankarboksylsyre som hapten.

Det immunologiske forhold av det svangerskapsspesifikke g-^glykoprotein lar seg ifølge oppfinnelsen også endre ved sammenknytning av glykoproteinet med et peptid eller protein. Sammenknytningen kan enten foretas kovalent eller ved kompleksdannelse. Som reaksjonsdeltagere er det her an-vendbart peptider, eksempelvis også slike med egen biologisk funksjon, f.eks. dekapeptider som LRP (luteiniserende hormon releasing faktor). LRP er eksempelvis å sammenknytte på samme måte med det svangerskapsspesifikke g-i^-glykoprotein som dette er omtalt for dets sammenknytning med albumin av T. Makino og andre i Contraception 8, 2 (1973)»side 133 og følgende.

Den til grunn liggende reaksjon går tilbake på karbodiimid-aktiveringen av karboksylgruppene med karbodiimid-forbindelsene.

En ytterligere mulighet til endring av det immunologiske forhold av det svangerskapsspesifikke 6-^-glykoprotein består i sammenknytning av proteinet med et annet•proteinstoff, således slik dette eksempelvis er kjent for sammenknytning av enzymer med proteiner, idet det svangerskapsspesifikke 3-j_-glykoprotein i reaksjonen kan erstatte en av de to deltagere.. For forbindelsen av de to proteiner med hverandre er det vanlig en rekke fremgangsmåter. De anvender enkelte grupper av akti-verende stoffer som eksempelvis karbodiimider, cyanurklorid, p.,p-difluor-m,m-dinitrofenylsulfon eller glutardialdehyd.

Det svangerskapsspesifikke 3-L~SlykoProte:i-n kan f «eks. ved hjelp av glutardialdehyd i en reaksjon analogt den som er omtalt av S. Avrameas: Immunochemistry 6, 1969, 43~52, for koplingen av gammaglobulin med peroksydase gjennomføres med en rekke proteiner. Fortrinnsvis forbindes innen oppfinnelsens ramme det som immuniserende stoff foreskrevne svangerskapsspesifikke glykoprotein med et proteinstoff, som selv er virksomt som podningsstoffkomponent, som f.eks. tetanus-toksoid.

Med den foran gitte oppramsing av fremgangsmåter skal det bare eksempelvis vises at alle reaksjoner s.om er omtalt i litteraturen som egnet for derivatisering. av proteiner kan anvendes for fremstilling av produktene ifølge oppfinnelsen.

Oppfinnelsens gjenstand er generelt fremgangs-måtene til fremstilling av derivater av det svangerskapsspesifikke Bj-glykoprotein, idet disse erkarakterisert vedat det som svangerskapsspesifikke B^-glykoprotein underkastes en fremgangsmåte til oksydering, reduksjon, alkylering eller acylering av proteiner, til fremstilling av en kovalent binding mellom protein og haptener og mellom proteiner med hverandre.

De dannede reaksjonsprodukter overføres tilsvarende kjente teknikker i de for den parenterale injeksjon egnede til-beredninger og blir som ved podningsstoffer vanlige eventuelt utstyrt med stabiliserende tilsetninger og uorganiske eller organiske immunadjuvantier, for på denne måte å kunne anvende som immuniserende agens for fødselskontroll. Disse immuniserende stoffer er likeledes gjenstand for foreliggende oppfin-nelse. Som stabiliserende tilsetninger kommer det på tale stoffer som forbedrer preparatenes holdbarhet, spesielt lavmolekylære kullhydrater eller eggehvitestoffer eller deres derivater som avbygget og igjenfornettet kollagen, eksempelvis det under varebetegnelsen "Haemaccel" oppnåelige gelatinprodukt, eventuelt med ytterligere tilsetninger som aminosyresalter, f.eks. natriumglutamifiat. Mengden av slike tilsetninger utgjør hensiktsmessig 0,5 til 5$, under tiden inntil 10%. Det .immuniserende stoff kan deretter stilles til disposisjon flytende eller i tørr, hensiktsmessig i frysetørket form. Sistnevnte er å oppløse før applikasjon i vann eller et fysiologisk tålbart medium.

Følgende forsøk som utføres med produktene som

kan fåes ifølge eksemplene 1 eller 2 viser resultatet av den aktive immunisering av aper med derivatene ifølge oppfinnelsen av det svangerskapsspesifikke B-j^-glykoprotein.

Forsøksbeskrivelse.

Kjønnsmodne hunaper (Cynomolger) ble over et tids-rom på 6 uker ved intravenøs og/eller subkutan inngivning av tilsammen 3 mg av et derivat av det svangerskapsspesifikke ftj-glykoprotein i isotonisk koksaltoppløsning med finfordelt aluminiumhydroksyd som adjuvans avvekslende immunisert intra-venøst og subkutant. Alle dyr utviklet antilegemer mot det svangerskapsspesifikke B-[_-glykoprotein som i geldiffusj onsprøve ved hjelp av svangerskapsspesifikke 8-^-glykoprotein ble påvist kvalitativt og bestemt kvantitativt med den radiale immundiffu-

■sjon. Gjennomsnittlig ble det herved oppnådd en titer på 0,09 mg antilegeme/ml. Ef<r>ter immuniseringen ble hundyrene hver gang for tidspunktet for ovulasjonen i 3 dager bragt sammen med et befruktningsdyktig handyr til parring og at deretter undersøkt resultatet av kopulasjonen. Halvparten av dyrene fikk månedlig mellom kopulasjonen resp. under svangerskapet Boosterinjeksjon (0,4 mg protein). De mot svangerskapsspesifikt 6^-glykoprotein immuniserte hunaper var i forhold til ikke behandlede kontrolldyr sterkt hemmet i deres forplantningsevne. Resultatet ved de immuniserte dyr viser tabell 1. Ved noen aper inntrådte også etter flere kopulasjoner ingen svangerskap, andre ble først drektige etter tredje eller fjerde parring. De aper som ble drektige ved første eller også ved en av de følgende kopulasjoner aborterte omtrent alle i første eller annen tredje-del av svangerskapet. Bare en av apene som var blitt drektige ved første kopulasjon viste et normalt svangerskap med normal fødsel. En annen hadde etter tredje kopulasjon.utført et normalt svangerskap.

Kontroll til sammenligning:

Av 39 aper var etter senest tredje kopulasjon

31, dvs. Q0% drektige. Av disse svangerskap endte bare en med en spontan abort, de andre forløp alle normalt.

Oppfinnelsen skal forklares nærmere ved hjelp

av noen eksempler.

Eksempel 1.

Modifisering av svangerskapsspesifikt B-^-glykoprotein med diazotert sulfanilsyre .

a) Fremstilling av diazoniumsaltet.

1 g sulfanilsyre oppløses ved værelsestemperatur

i 100 ml 0,1 N HC1, stilles deretter i isvann og avkjøles under omrøring til Ooc. Sulfanilsyren faller derved ut som salt. I suspensjonen lar man deretter langsomt (i løpet av en time) under omrøring inndryppe 50 ml av en kald 1%- ig oppløsning av natriumnitrit i vann; slutten av reaksjonen vises ved blåfarvning av kaliumjodid-stivelsespapir.

b) Fremstilling av hapten-forbindelse.

Konjugasjon av svangerskapsspesifikt Bj-glykoprotein med den diazoterte sulfanilsyre foregår ved svak alkalisk pH. Man oppløser dertil 100 mg svangerskapsspesi-

fikt 8i~glykoprotein i 10 ml av en 0,2 molar natriumfosfat^puffer av pH 8,2 og avkjøler oppløsningen til 4°C. Deretter tilsetter man 0,57 ml av diazoniumsaltoppløsningen (det molare forhold mellom svangerskapsspesif ikt 8-^-protein og diazotert sulfanilsyre i reaksjonsblandingen utgjør i dette'tilfellet 1:20) og omrøres 4 timer ved 4°C. pH-verdien som■ikke 'bør synke under 8,0, korrigeres derved ved'tilsetning av 0,2 N

NaOH. Deretter lar man oppløsningen stå 15 timer ved 4°C.

Det modifiserte protein dialyseres deretter flere dager

grundig mot vann og lyofiliseres.

Omsetningen av svangerskapsspesif ikt B-^~glykoprotein med den diazoterte sulfanilsyre har til følge en orange-fargning av proteinet. Dessuten endres ved innføring av sure grupper den elektroforetiske bevegelighet. Ved elektroforesen i agar eller i polyakrylamid-(PAA-)) gel vandrer det modifiserte protein hurtigere til anoden enn det negative svangerskapsspesifikke B-[_-glykoprotein.

En dosis av det immuniserende agens har følgende sammensetning:' 0,2 mg av derivatet av det svangerskapsspesifikke

B-^-glykoprotein oppløst i 3 ml isotonisk koksalt oppløsning inneholdende 0,05% A1(0H)^, 5% "Haemaccel" og som konserver-ingsmiddel 0,15 mg natriumtimerfonat.

Eksempel 2.

Fremstilling av hapten-forbindelsen med l-aminobenzen-4B-hydroksyetylsulf on- svovelsyreester.

Utgangsmaterial er l-aminobenzen-48-hydroksyetyl-sulfonsvovelsyreesteren, som i alkalisk pH-område (pH 9-10) avspalter svovelsyre og derved gir en reaksjonsdyktig aromatisk vinylsulfon-forbindelse, den såkalte "Parabase", som deretter reagerer med amino- eller hydroksylgrppen i proteinet.

100 mg av det svangerskapsspesifikke g-^-glykoprotein oppløses i 10 ml av en 2,5%-ig oppløsning av ^2^0^.2 HoO (pH 9,25). Hertil har man under omrøring ved værelsestemperatur 3,1 ml av en 15?-ig oppløsning av "Parabase"-esteren i vann (molart forhold: Svangerskapsspesifikt B^-glykoprotein til "Parabase" = 1:100). Man omrører 4 timer ved værelsestemperatur og holder derved ved tilsetning av 0,1 N NaOH pH-verdien konstant ved 9,2. Deretter lar man det stå 15 timer ved 4°C, dialyserer deretter grundig mot H2O og lyofiliserer det modifiserte protein.

En dosis av det immuniserende agens har følgende sammensetning: 1 mg svangerskapsspesif ikt g-^-glykoprotein-hapten-forbindelse oppløst i 5 ml isotonisk koksaltoppløsning. E ksempel 3.

Kopling av det svangerskapsspesifikke B^-glykoprotein med tetanus- toksoid .

19 mg svangerskapsspesifikt B^-glykoprotein

og 54 mg tetanus-toksoid (formalinbehandlet tetanus-toksin) oppløses i 5,4 ml vann, ved tilsetning av 1/10 N saltsyre innstilles til pH 5,0 og deretter blandes under omrøring med 6,3 mg N-etyl-N' (3-dimetylaminopropyl)-karbodiimid-HCl. Blandingen omrøres 3 timer ved ca. 2o8c og deretter 15 timer ved 4°C, nøytraliseres deretter og dialyseres mot isoton koksaltoppløsning.

Ved en immunisering av aper (cynomolger) med dette koplingsprodukt innen området for forsøksbeskrivelsen hemmes disse dyrs forplantningsevne.

En dosis av den immuniserende agens har følgende sammensetning: 0,5 mg protein i 3 ml isotonisk koksaltoppløs-ning og 1,5 mg y-Al(OH)

Claims

1. Derivatet av det svangerskapsspesifikke 8-j^-glykoprotein som er fremstillbåre ved omsetning med en proteinmodifiserende forbindelse og som er å karakterisere ved parameterne a) elektroforetisk bevegelighet i agargel i B-^ -globulinom-rådet av humanplasmaproteiner, b) en sedimentasjonskonstant i ultrasentrifuge på 4,6 ± 0,5S,. c) en ved gelfiltrering bestemt molekylvekt på 100.000 ± ^ qQq d) en ekstinksjonskoeffisåént på E, = 11,6 ±0,5 (bestemt ved 278 mu i 1/15 molar fosfatpuffer av pH 7,0),. e) et kullhydratinnhold på 28,05 ± 1,55..

2. Fremgangsmåte til fremstilling av forbindelser ifølge krav 1, karakterisert ved at det svangerskapsspesifikke 6^ -glykoprotein underkastes en fremgangsmåte til oksydasjon, reduksjon,.alkylering eller acylering av proteiner, til fremstilling av en kovalent binding mellom proteiner og haptener eller mellom proteiner med hverandre .

3. Immuniserende agens for den parenterale applikasjon inneholdende en forbindelse ifølge krav 1 i blanding med et for podningsstoffet farmasøytisk vanlig bærestoff.