DK159276B - Fremgangsmaade til isolering af specifikke antistoffer og enzym-immunbestemmelsesmetode med anvendelse af det isolerede antistof - Google Patents

Fremgangsmaade til isolering af specifikke antistoffer og enzym-immunbestemmelsesmetode med anvendelse af det isolerede antistof Download PDF

Info

Publication number
DK159276B
DK159276B DK137181A DK137181A DK159276B DK 159276 B DK159276 B DK 159276B DK 137181 A DK137181 A DK 137181A DK 137181 A DK137181 A DK 137181A DK 159276 B DK159276 B DK 159276B
Authority
DK
Denmark
Prior art keywords
pro
peptide
antibody
leu
ser
Prior art date
Application number
DK137181A
Other languages
English (en)
Other versions
DK159276C (da
DK137181A (da
Inventor
Susumu Iwasa
Isamu Yoshida
Koichi Kondo
Original Assignee
Takeda Chemical Industries Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from JP4248480A external-priority patent/JPS56138248A/ja
Priority claimed from JP8046780A external-priority patent/JPS576363A/ja
Priority claimed from JP450781A external-priority patent/JPS57118790A/ja
Application filed by Takeda Chemical Industries Ltd filed Critical Takeda Chemical Industries Ltd
Publication of DK137181A publication Critical patent/DK137181A/da
Publication of DK159276B publication Critical patent/DK159276B/da
Application granted granted Critical
Publication of DK159276C publication Critical patent/DK159276C/da

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g.hCG [human chorionic gonadotropin]; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/1008—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atoms, i.e. Gly, Ala
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • G01N33/76—Human chorionic gonadotropin including luteinising hormone, follicle stimulating hormone, thyroid stimulating hormone or their receptors
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/81—Packaged device or kit
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/961—Chemistry: molecular biology and microbiology including a step of forming, releasing, or exposing the antigen or forming the hapten-immunogenic carrier complex or the antigen per se
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/963—Methods of stopping an enzyme reaction or stabilizing the test materials
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/967—Standards, controls, materials, e.g. validation studies, buffer systems
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/971—Capture of complex after antigen-antibody reaction
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/975—Kit
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/811—Test for named disease, body condition or organ function
    • Y10S436/814—Pregnancy
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/806—Antigenic peptides or proteins
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/11—Gonadotropin; related peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

DK 159276 B
Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til isolering af specifikke antistoffer, ifølge opfindelsen ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del angivne; og tillige en fremgangsmåde til enzym-immunbestemmelse 5 (i det følgende undertiden også for korthedens skyld betegnet EIA) under anvendelse af et antistof som reagens. EIA-metoden er ejendommelig ved det i krav 6's kendetegnende del angivne.
Biobestemmelse og immunbestemmelse er fremgangsmåder 10 der for tiden anvendes til højfølsomme kvantitative bestemmelser af fysiologisk aktive peptider inklusive hormoner, men biobestemmelse har de ulemper, at fremgangsmåden er kompliceret og reproducerbarheden dårlig. På den anden side har immunbestemmelser som repræsenteret ved radioimmunbestemmelse (i det 15 følgende undertiden for korthedens skyld benævnt RIA) og en-zym-immunbestemmelse fordelene ved en mindre kompliceret fremgangsmåde og overlegen kvantitativ nøjagtighed og reproducerbarhed, men kan give varierende resultater alt efter den anvendte type antistof, og kræver nærmere prøvelse af 20 specificiteten. Fx kan der være problemer ved den kvantitative bestemmelse af humant chorior- gonadotropin ( i det efterfølgende for korthedens skyld undertiden benævnt hCG) på grund af dets kryds-reaktivitet med luteiniseringshormonet (i det følgende undertiden betegnet hLH), og ved bestemmelse af pan-25 creatisk glucagon (i det følgende også betegnet PG) kan det kryds-reaktivitet med tarmglucagon (i det følgende undertiden betegnet tarm-GLI) frembyde problemer.
I den senere tid har den kemiske analyse af disse peptid-hormoner gjort et væsentligt skridt fremad, og der er nu 30 akkumuleret betydelig viden om de immunologisk specifikke steder på sådanne peptider såvel som de dele deraf som de deler med andre hormoner.
På basis af sådan viden er der blevet syntetiseret forskellige peptidsegmenter ved kemiske fremgangsmåder, og de 35 frembyder immunologisk specifikke steder på hormoner som skal
DK 159276 B
2 bestemmes kvantitativt, dvs. dele som de ikke har tilfælles med andre hormoner, og det har vist sig at det er muligt at fremstille et antistof med meget høj specificitet til mål-peptidantigenet ved absorption af det specifikke antistof med 5 et sådant specifikt peptidfragment (partielt peptid).
Humant chorio-gonadotropin er et proteohormon der dannes af chorio-celler der dannes ved svangerskab og stimulerer secerneringen af progesteron. Opdagelse af hCG har almindeligt været udnyttet til tidlig diagnose af svangerskab. Des-10 uden er der for nylig opdaget en gruppe maligne tumorer af hCG-oprindelse, navnlig et chorio-carcinom, og hCG er konstateret i høje titere i urin, blod og spinalvæske hos tumorbærende patienter. Det er således blevet klart at den kvalitative og kvantitative bestemmelse af dette hormon er betyd-15 ningsfuldt for diagnosen såvel som til fremskaffelse af et billede af den kliniske tilstand af sådanne sygdomme. En sådan diagnose fordrer imidlertid at man er i stand til at opdage en spormængde af hCG, der er så lille som ca. 100 IE/1, og det problem der er involveret i en immunologisk kryds-reakti-20 vitet af hCG med strukturelt analoge proteohormoner, dvs.
luteiniseringshormon, follicle-stimulerende hormon (hFSH) og thyreoid-stimulerende hormon (hTSH). Specielt gælder det at eftersom hLH i høj grad ligner hCG og koncentrationen af hLH i fysiologisk urin undertiden kan være så høj som 100-150 25 IE/1, må hCG differentieres immunologisk fra hLH for at man kan blive i stand til nøjagtigt at bedømme de små bitte mængder hCG i legemsvæsker.
I den nyeste tid har den kemiske analyse af disse proteohormoner taget yderligere et skridt fremad og det har nu 30 vist sig at kryds-reaktiviteten af disse hormoner stammer fra deres α-underenheder som strukturelt har temmelig meget tilfælles. Man har derfor gjort forsøg på at adskille og rense β-underenheden af hCG (i det følgende også forkortet til hCG-β), som har en forholdsvis distinkt struktur, og på at 35 fremstille et anti-hCG-3-antistof under udnyttelse af underenheden til specifik opdagelse af hCG. Adskillelse og rensning af hCG-β indebærer imidlertid en kompliceret procedure, 3
DK 159276 B
og det er meget vanskeligt at forhindre forurening med hCG og dets α-underenhed (i det følgende hCG-a). På grund af tilstedeværelsen af disse urenheder og den aminosyresekvens, der er fælles for hCG og hLH, overvinder anti-hCG-3-antistoffet 5 ikke fuldstændigt problemet med kryds-reaktivitet mellem hCG og hLH. Desuden er affiniteten af dette anti-h.CG-3-antistof til hCG lavere end affiniteten af anti-hCG-antistof til hCG, hvilket bevirker en nedsættelse af følsomheden.
Den peptiddel, der befinder sig ved C-terminalen af .jq hCG-β og som består af ca. 30 aminosyrerester, har imidlertid en aminosyresekvens som ikke genfindes hos hLH, og det viste sig at denne peptiddel muliggør en distinkt identifikation af hCG over for hLH. På basis af denne strukturanalyse syntetiserede Matsuura et al et C-terminalt peptid af hCG-β, immu- 1 ^ niserede kaniner med peptidet for at vinde et hCG-specifikt antiserum og gennemførte en radioimmunbestemmelse (Endocrinology 104, side 396, 1979). Skønt de opnåede en tilfredsstillende grad af specificitet på denne måde, viste det sig at deres metodes følsomhed ikke var så høj som det kunne øn- 2 q skes.
Under de forannævnte teknologiske omstændigheder blev der foretaget en intensiv forskning for at udvikle et anti-hCG-antistof som kunne være i stand til at opdage hCG med forbedret specificitet og forøget følsomhed. Under udarbejdelse 25 af opfindelsen blev dyr immuniseret med hCG, og man absorberede det resulterende anti-hCG-antistof på en bærer på hvilken der var immobiliseret et vist syntetisk C-terminalt peptid af hCG-β til frembringelse af et anti-hCG-antistof, og det viste sig at dette absorberede anti-hCG-antistof er specifikt til 2Q hCG uden at udvise kryds-reaktivitet med hLH og andre proteo-hormoner. Dette resultat fulgtes op ved yderligere undersøgelser som resulterede i det yderligere resultat at en enzym-im-munbestemmelse under anvendelse af et enzym mærket hCG-β C-terminalt peptid er meget nyttigt for en specifik og højføl-35 som opdagelse af hCG.
Opfindelsen angår følgelig: I) En fremgangsmåde til isolering af specifikke anti-
DK 159276 B
4 stoffer, hvilken fremgangsmåde består i at man bringer et peptid, der har en struktur som er enestående for et peptidantigen og som er uopløseliggjort på en bærer, i kontakt med en legemsvæske som indeholder det specifikke antistof 5 der er reaktivt over for nævnte antigen, hvorpå man eluerer det på denne måde absorberede antistof.
II) En enzym-immunbestemmelsesmetode som indebærer anvendelse af et' antistof som reagens, hvilken metode består i at man som antistof bruger et antistof isoleret ved at 10 et peptid, der har en struktur som er enestående for et peptid-antigen og som er uopløseliggjort på en bærer, er bragt i kontakt med en legemsvæske indeholdende et antistof som er reaktivt over for nævnte antigen og det således absorberede antistof derefter er elueret.
15 Enzym-immunbestemmelse ifølge den foreliggende op findelse kan fx ske i praksis som følger: (1) Tilsætning af en kendt mængde af et peptid-enzym-konjugat og en kendt mængde af en uopløselig form af antistof, som anført foran, til en prøvevæske indeholdende en 20 ukendt mæggde antigen, hvorpå man måler den enzymatiske aktivitet af peptid-enzym-konjugatet i væskefasen eller af det reagerede peptid-enzym-konjugat i deri faste fase til bestemmelse af mængden af antigen i prøvevæsken (FEBS Letters 15, side 232, 1971); 25 (2) Man sætter en kendt mængde af et peptid-enzym-konju gat og en kendt mængde af den opløselige form af antistof til en antigen-indeholdende prøvevæske for at bevirke en konkurrerende bindingsreaktion, hvorpå man tilsætter en kendt mængde af et andet antistof som anført foran, som 30 er uopløseligt i forhold til det første antistof (hvis fx antistoffet var blevet fremstillet ud fra kaninserum, så anti -kanin-immunoglobul in G (IgG) antistof) og på samme måde som ovenfor under (1) måler den enzymatiske aktivitet i væskefase eller fast fase for at bestemme mængden af antigen i 35 prøvevæsken (FEBS Letters, se ovenfor); 5
DK 15 9 2 7 6 B
(3) Man sætter en kendt mængde af et peptid-enzym-kon-jugat og en kendt mængde af en opløselig form for antistof til en antigenholdig prøvevæske for at bevirke en konkurrerende bindingsreaktion på samme måde som ovennævnte 5 bestemmelse (2), hvorpå man tilsætter en kendt mængde af et antistof som anført foran og, hvis det andet antistof er et anti-dyr IgG-antistof, en kendt mængde normalt dyreserum for at bevirke en udfældningsreaktion og, på samme måde som bestemt ved metode (1) måler den enzymatiske aktivitet i væske-10 fasen eller den faste fase for at bestemme mængden af hCG i prøvevæsken (Clinica Chimica Acta §1_, side 283, 1976) .
Ved alle de ovennævnte bestemmelser er det mest fordelagtigt at måle aktiviteten i den faste fase fordi målingen af enzymatisk aktivitet i væskefasen kan lide under in” 15 terferens fra urenheder i prøvevæsken. Med hensyn til reproducerbarhed og følsomhed foretrækkes "dobbeltantistof-prø-verne", dvs. prøverne (2) og (3) foran, fordi disse bestemmelser kun fordrer en ringe mængde antistof.
De peptid-antigener som skal bestemmes kvantitativt 20 i overensstemmelse med tilstedeværende EIA er de peptidhormoner, der forekommer i pattedyrlegemer og som omfatter hCG, hLH, tyroidstimulerende hormon, follikel-stimulerende hormon, PG, insulin, væksthormonet og andre hormoner. Som eksempler på sådanne pattedyr kan nævnes menneske, hornkvæg, hest, får, 25 kanin, rotte, marsvin', hund, svin og aber.
‘Den prøvevæske til hvilken EIA ifølge den foreliggende opfindelse kan appliceres, kan være en hvilken som helst af fx legemsvæskerne urin, serum og spinalvæske; men i almindelighed foretrækkes urin og serum.
30 Det antistof som bruges i EIA til opdagelse af hCG
kan være et hvilket som helst antistof som er reaktivt i forhold til det C-terminale peptid i hCG-β. Eksempler på sådanne antistoffer er det konventionelle anti-hCG-antistof, det specifikke anti-hCG-antistof som kan isoleres ved den ifølge 35 den foreliggende opfindelse udviklede fremgangsmåde, det anti-hCG-serum som kan vindes ved immunisering med hCG, det
DK 159276 B
6 ^anti-hCG-0-serum som kan vindes ved immunisering med hCG-β, det anti-C-terminale peptids serum som kan vindes ved immunisering med det C-terminale peptid fra hCG-β og de γ-globulin-fraktioner som kan vindes fra disse antisera, idet de isole-5 res ved den foreliggende fremgangsmåde.
Ved isolering i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse af et antistof podes et dyr med det pågældende særlige peptid-antigen i dyrets legemsvæske. Dette dyr kan være en hvilken som helst dyreart undtagen menneske, såsom 10 varmblodede pattedyr såsom kanin, får, rotte, mus, marsvin, hornkvæg, hest, svin, ged, en fugleart som fx høns, duer, ænder, gæs, vagtler, eller koldblodede dyr som fx frøer.
Podningen af sådanne dyr med et peptid-antigen kan udføres på den konventionelle måde.
15 Derpå opsamles legemsvæsken indeholdende et sådant an tistof og det bringes i kontakt med et peptid der har en speciel struktur som er enestående for peptid-antigenet og som ikke er fælles med andre, lignende peptidhormoner. Som eksempler på sådanne peptider kan de følgende peptider nævnes: 20 Ved isolering af et specifikt antistof mod hCG, det peptid der har den almene formel
H-R^-Pro-Ser-Asp-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln-OH, I
25 hvor R·*· er et peptidfragment med 1-14 aminosyrer ester inklusive
Gly i 14-stillingen i Ala^-Pro1-Pro2-Pro^-Ser2-Leu^-Pro^-Ser8- 9 10 11 12 13 14
Pro -Ser -Arg -Leu -Pro -Gly ; ved isolering af et specifikt antistof mod PG, det peptid der har den almene formel 30
H-R1-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-R2-Asn-Thr-OH, II
2 hvor R er et peptidfragment med 1-10 aminosyrerester inklusi
DK 159276B
7 og til isolering af et specifikt antistof mod insulin, et peptid med den almene formel
H-E4-Gly-Phe-Phe-R5-OH, III
5 4 hvor R er et peptidfragment med 1-3 aminosyrerester inklusive Arg i 3-stillingeri i Gly^-Glu^-Arg^, og R3 er et peptidfragment med 1-5 aminosyrerester inklusive Tyr i 1-stillingen 1 2 3 4 5 i Tyr -Thr -Pro -rLys -Thr .
10 Som eksempel på peptidfragmenterne med 1-14 aminosyre- υ 11 rester inklusive Gly i 14-stillingen i peptid R (dvs. Ala -
Pro2-Pro3-Pro4-Ser5-Leu6-Pro7-Ser8-Pro9-Ser'*'0-Arg'^-Leu·1'2-13 14
Pro -Gly ), der bruges ved isolering af et specifikt antistof til hCG kan nævnes Gly, Pro-Gly, Leu-Pro-Gly, Arg- 15 Leu-Pro-Gly, Ser-Arg-Leu-Pro-Gly, Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly,
Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly, Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly,
Leu-Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly, Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-
Ser-Arg-Leu-Pro-Gly, Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-
Pro-Gly, Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly, 20 Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly og Ala-Pro-
Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly.
Som eksempler på peptidfragmentet med 1-10 aminosyrere- 2 12 ster inklusive Asp i 10-stillingen i R (dvs. β-Ala -Tyr -
Leu3-Asp4-Ser5-Arg6-Arg7-Ala8-Gln9-Asp10), der anvendes ved 25 isolering af et specifikt antistof til PG, kan nævnes
Asp, Gin-Asp, Ala-Gln-Asp, Arg-Ala-Gln-Asp, Arg-Arg-Ala-Gln-
Asp, Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp, Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp,
Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp, Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-
Gln-Asp og β-Ala-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp.
nn Som eksempler på peptidfragmentet med 1-3 aminosyrere- 4 12 3 ster inklusive Arg i 1-stillingen af R (Gly -Glu -Arg -), der bruges ved isolering af et specifikt antistof til insulin kan nævnes Arg, Glu-Arg og Gly-Glu-Arg. Hvad angår peptidfragmentet med 1-5 aminosyrerester inklusive Tyr i 1-stil-5 1 2 3 4 5 35 lingen i R , dvs. Tyr -Thr -Pro -Lys -Thr -, kan nævnes Tyr, Tyr-Thr, Tyr-Thr-Pro, Tyr-Thr-Pro-Lys og Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr.
DK 159276 B
8
De forskellige peptider som bruges i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse kan fremstilles på i og for sig kendt måde. Selv om der kan bruges både fastfastmetoder og væskefasemetoder til syntesen, er sidstnævnte metode ofte den mest fordelagtige. Sådanne metoder til peptidsyntese omfatter dem der er beskrevet i litteraturen, fx Schroder og Lubke, The Peptides, bind 1 (1966), Academic Press, New York, USA, og Izumiya et al, "Peptide Gosei" (peptidsyntese) (1975), Maruzen Inc., Japan, nemlig azidmetoden, kloridmetoden, syre-anhydridmetoden, den blandede syreanhydridmetode, DCC-meto-den, den aktive estermetode, Woodward's reagens K-metoden, karbodiimidazolmetoden, reduktion-oxydations-metoden, DCC-additiv-metoden (fx HONB, HOBt, HOSu) og så fremdeles.
Det bæremateriale der bruges til isolering af det ^ specifikke antistof i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse omfatter bl.a. gelperler, fx agarosegel såsom "Sepharose" ® 4B, "Sepharose" ® 6B, dextrangel såsom "Sephadex" ® G75, "Sephadex” ® G100, "Sephadex" ® G200, poly-akrylamidgel såsom "Biogel" ® P30, "Biogel" ®P60, "Biogel" ® 2Q P100; partikler af cellulose som fx "Avicel" fra Asahi
Kasei Inc. i Japan, ionbyttercellulose såsom diætylaminoætyl-cellulose og karboxymetylcellulose, fysiske adsorbenter såsom glasperler, glasstave, aminoalkyl-glasperler, aminoalkyl-glasstænger, silikonegummier, styrenharpikser, fx polystyren-22 perler og polystyrenkorn, ionbytterharpikser såsom svagt sure ionbytterharpikser såsom "Amberlite" ® IRC-50, "Zeocarb" ® 226 og svagt basiske ionbytterharpikser såsom, "Amberlite" ® IR-4B og "Dowex" ® 3.
Uopløseliggørelse af peptidet fra en sådan bærer kan 2Q udføres på konventionel måde. Blandt de kendte metoder til fremstilling af uopløseliggjorte peptider er dem der er beskrevet fx i "Metabolism" 8, 1971, side 696. Fx kan man bruge cyanogenbromidmetodén, GLA-metoden og DCC-metoden. Den foretrukne metode består i at aktivere bæreren med cyanogenbro-22 roid og så koble peptidet til den aktiverede bærer.
En legemsvæske indeholdende antistoffet bringes i kontakt med det peptid der har en struktur
DK 159276 B
9 som er enestående for peptid-antigenet som uopløseliggjort på en bærer på følgende måde. Således kan legemsvæsken fx udfældes fraktioneret, hvorpå man direkte eller efter isolation af dets immunoglobulin G-fraktion ved søjlekromatografi ^ bringer fraktionen i kontakt med ovennævnte uopløseliggjorte peptid. Den ovennævnte udsaltningsproces kan udføres ved hjælp af natriumsulfat, ammoniumsulfat, magniumsulfat, kaliumfosfat, natriumcitrat eller lignende salt. Den nævnte søjlekromatografi udføres ved hjælp af fx diætylaminoætylcellulo-se (DEAE-cellulose), karboxymetylcellulose (CM-cellulose), DEAE-"Sephadex", "Sephadex" G 150, "Sephadex" G 200 og lignende materialer.
Elueringen af det specifikt absorberede antistof udføres ved hjælp af en pufferopløsning med lav pH-værdi el-ler høj ρϋ-værdi, eller med en pufferopløsning indeholdende en høj koncentration af et salt. Også andre eluanter kan bru ges.
En pufferopløsning med lav pH-værdi kan fx være en 0,17M glycin-saltsyrepuffer med pH 2,3, eller en 0,1M natri-2q umcitrat-saltsyrepuffer med pH 1,8.
En pufferopløsning med høj pH-værdi kan fx være ammoniakvand ved pH 11 eller 0,2M natriumboratpuffer méd pH 11,7.
En pufferopløsning indeholdende høj koncentration af 25 et salt kan være fx 6M guanidin-hydrokloridopløsning eller en 7M urinstofopløsning.
Den ovennævnte elueringsprocedure kan udføres portionsvis eller ved hjælp af en kolonne.
Det antistofholdige eluat. renses, fx ved dialyse. Fx 30 kan eluatet først neutraliseres, fx med 0,1M natriumkarbonatpuffer (pH 10,5) hvis det har været brugt en pufferopløsning med lav pH-værdi som elueringsmiddel, eller med 0,1M glycin-saltsyrepuffer (pH 3,0) hvis der som elueringsmiddel har været brugt en pufferopløsning med høj pH-værdi, hvorpå der -.c dialyseres mod fx 0,02M fosfat-NaCl (pH 8,0) indeholdende
DD
0,1% NaN-j. Det eluat der vindes med nævnte pufferopløsning og indeholdende eri høj koncentration af NaCl kan dialyseres
DK 159276 B
10 direkte mod ovennævnte fosfat-NaCl-puffer og oplagres som sådan. Desuden kan ovennævnte eluat eller dialysat frysetørres og oplagres som et lyofilisat.
Det specifikke antistof der isoleres ved fremgangs-5 måden ifølge den foreliggende opfindelse kan bruges ved RIA, EIA, latex- og erythrocytagglutinationsreaktioner og lignende reaktioner, og tillader ved alle disse procedurer en specifik opdagelse af target-peptidantigenet uden interferering af krydsreaktive "inhiberende" peptidforbindelser der samtidig Ί0 er til stede i prøvevæsken. Specielt tillader anvendelse af det ifølge opfindelsen isolerede antistof på EIA bestemmelser i kliniske laboratorier som ikke er tilstrækkeligt udstyret til håndtering af radioaktive isotoper, og den er også værdifuld ved at sikre en praktisk gennemførlig, højfølsom 15 bedømmelse af peptid-antigener i urinprøver og blodprøver.
Mere konkret kan man bringe en anti-hCG-antistofhol-dig legemsvæske, vundet ved immunisering af et dyr med hCG, navnlig dyrets serum, i kontakt med det uopløseliggjorte peptid med den almene formel I på bæreren. I dette trin under-20 kastes legemsvæsken en udsaltningsudfældning med fx natriumsulfat eller ammoniumsulfat, og enten direkte eller efter fraskillelse af IgG-fraktionen med søjlekromatografi med DEAE-cellulose eller en lignende substans bringes det ovennævnte uopløseliggjorte peptid i kontakt med nævnte væske 25 eller fraktion for selektivt at absorbere det specifikke anti-hCG-antistof på den faste fase. På denne måde kan man eliminere anti-hCG-antistoffer, der udviser krydsreaktivitet med hLH, hFSH og hTSH. Derefter elueres det specifikke anti-hCG-antistof som er absorberet på den faste fase. Denne elue-30 ring udføres med en pufferopløsning med lav pH-værdi eller høj pH-værdi (fx 0,17M glycin-HCl puffer med pH 2,3; eller ammoniakvand med pH 11) eller en pufferopløsning indeholdende en høj koncentration af et salt (fx 6M guanidin-saltsyre-opløsning eller 7M urinstofopløsning), hvorved den specifik-35 ke antistoffraktion fraskilles. Selv om denne procedure kan udføres ved en portionsvis metode, foretrækkes det at bruge en kolonne.
DK 159276 B
11 Når der bruges et konjugat af et peptid (I): H-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Ser- (S)
Asp-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln-OH og "Sepharose" ^ 4B ved fremstilling af det specifikke antistof, kan der udvindes et i 5 høj grad specifikt anti-hCG-antistof i godt udbytte.
De fysiske egenskaber af dette antistof er som følger.
(1) Ved en sluttelig fortynding på 10-200 ng/ml er det i stand til at binde 10-100% af et hCG-mærkningsenzymkonjugat, et peptid (Ϊ)-mærkningsenzymkonjugat, et peptid (Il)-mærk-1 q ningsenzymkonjugat og et peptid (ΙΙΪ)-mærkningsenzymkonjugat, hvis enzymatiske aktivitet er ca. 2 μΕ; (2) dets optimale pH for antigen-bindingsaktivitet er pH 6-9; (3) det er stabilt i mere end 1 år under køleskabsbetingelser; (4) det har en molekylvægt mellem ca. 140000 og 170000 og indeholder ca.
15 2-7% sukker; (5) det er letopløseligt i vandigt medium ved pH 2-12; (6) dets elektroforetiske opførsel er af type som den hos γ-globulinfraktionen; (7) det har ultraviolet absorptionsspektrum som vist i fig. 1; (8) dets aminosyresammensæt-ning, udtrykt ved antallet af mol af hver aminosyre pr. 100 20 mol glycin, er: lysin 85-97, histidin 35-43, arginin 38-45, asparaginsyre 110-132, threonin 98-107, serin 118-135, glu-taminsyre 138-145, prolin 92-134, glycin 100, alanin 73-79, valin 129-138, methionin 2-10, isoleucin 28-37, leucin 100-112, tyrosin 38-48 og fenylalanin 55-68; (9) dets molekyle 25 er sammensat to H-kæder og to L-kæder sammenkoblet med S-S-bindinger. Peptiderne (II) og (III) fremstilles ifølge omstående referenceeksempler 2 og 3.
Det således vundne specifikke antistof er efter isolering, nyttigt son reagens i den ovenfor nævnte EIA. I sammenligning med de kon-30 ventionelle fremgangsmåder til opdagelse af peptid-antigen, giver enzym-immunbestemmelsen ifølge den foreliggende opfindelse meget specifikke resultater og er meget nyttig i kraft af at den er fri for interferens fra ledsagestoffer i prøvevæskerne. Følsomheden er høj nok til at gøre fremgangsmåden 35 anvendelig til tidlig diagnose og til prognostisk behandling af chorion-tumorer - og andre sygdomme. Således er EIA i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse praktiserbar
DK 159276B
12 selv i et klinisk laboratorium hvor der ikke let kan anvendes radioaktive isotoper, og den tillader en praktisk og specifik bedømmelse af koncentrationen af det ønskede peptidantigen i prøvevæsken.
Det andet antistof der bruges i EIA ifølge den forelig- 5 gende opfindelse kan fremstilles ved gentagne injektioner af IgG fra et dyr af den art, der bruges ved fremstilling af antistof (fx kanin), i et dyr af en anden art, fx ged. Immuniseringsprocessen kan være en hvilken som helst af dem der rutinemæssigt bruges til fremstilling af antistoffer. Som eksempel kan der indgives ca. 2 mg pr. dosis IgG, sammen med Freund!s fuldstændige adjuvans, subkutant med mellemrum på 3 uger, ialt ca. 4 gange. Denne fremgangsmåde giver et tilfredsstillende antistof. Man kan også bruge det i handelen gående anti-kanin IgG-serum (ged) fra Miles Laboratories, USA.
Det andet uopløselige antistof fremstilles ved fældning af ovennævnte anti-IgG-serum med natriumsulfat eller ammoniumsulfat, fraskillelse af IgG-fraktionen ved DEAE-cellulose-søjlekromatografi og kobling deraf til en fast fase såsom cyanogenbromid-aktiveret cellulose eller "Sephadex" ® (FEBS Letters 15, 1971, side 232). Den ovennævnte antiserum IgG-fraktion kan imidlertid også bringes i kontakt med en silikonegummi eller polystyrenperler for fysisk 2i_ at adsorbere det andet antistof på den faste fase (Kagaku-to-Seibutsu (Kemi og Biologi) 1£ (1976), side 741).
Ved den foreliggende EIA bruges et peptid-mærknings-enzym-konjugat som et af reagenserne.
Peptidet i peptidmærknings-enzymkonjugatet kan være 30 selve peptid-antigenet som sådant, men for at opnå en endnu højere selektivitet bruges der et peptidmærknings-enzymkonju-gat indeholdende et peptid som har en struktur der er enestående for nævnte peptid-antigen. Til kvantitativ -bestemmelse af fx hCG foretrækkes det 35 at bruge et peptid-enzym-konjugat som kan vindes ved en kobling af et mærkningsenzym til et peptid med den almene formel
DK 159276 B
13
H-R^-Pro-Ser-Asp-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln-OH I
hvor R^ har den foran angivne betydning.
Til måling af PG foretrækkes det at bruge et peptid- 5 enzym-konjugat som kan vindes ved kobling af et mærkningsenzym til et peptid med den almene formel
H-R2-Phe-Va1-Gln-Trp-Leu-R3-Asn-Thr-OH II
10 2 3 hvor R og R har de foran angivne betydninger.
Når det stof der skal måles er insulin, foretrækkes det at bruge et peptid-ehzymkonjugat som kan vindes ved kobling af et mærkningsenzym til et peptid med den almene formel 15
H-R4-Gly-Phe-Phe-R5-OH
4 5 hvor R og R har de foran angivne betydninger.
Mærkningsenzymet er hensigtsmæssigt et enzym som er 70 stabilt og har høj specifik aktivitet. Som eksempel herpå kan nævnes (1) karbohydraser såsom glykosidaser (fx β-galak-tosidase, β-glukosidase, β-glukuronidase, β-fruktosidase, a-galaktosidase, a-glukosidase, α-mannosidase), amylaser, fx a-amylase, β-amylase, isoamylase, glukoamylase, Taka-amylase 25 A), cellulaser og lysozym; (2) amidaser (fx urease, asparaginase) } (3) esteraser (fx cholinesteraser såsom acetylcholinesterase, fosfataser såsom alkalisk fosfatase), sulfataser og lipaser); (4) nukleaser såsom desoxyribonuklease, ribo- nuklease; (5) jern-prophyrin-enzymer såsom catalase, peroxy- 30 dase, cytokrom-oxydase·, (6) kobberenzymer såsom tyrosinase, askorbinsyreoxydase; og (7) dehydrogenaser såsom alkohol- dehydrogenase, æblesyredehydrogenase, mælkesyredehydrogenase, isocitronsyredehydrogenase.
Ved fremstilling af et peptid-mærkningsenzym-konju-35 gat til brug i den foreliggende EIA kan man bruge de substituerbare grupper såsom amino-, karboxyl-, hydroxy- og sulf-hydrylgrupper der er til stede i peptidernes aminosyreenhe-
DK 159276 B
14 der samt mærkningsenzymer. Disse substituenter, som forekommer i peptiderne og mærkningsenzymerne, aktiveres ved behandling med fx kondensationsmidler og binder sig til de reaktive substituerbare grupper i det andet materiale til 5 dannelse af tværbindinger.
Koblingsreaktionen af et peptid med et mærkningsenzym kan udføres i nærværelse af et hvilket som helst kondensationsmiddel der vides at være nyttigt til kobling af peptider med enzymer. Fx kan der bruges (1) vandopløselige karbodiimid-10 reagenser såsom ECDI og CMCT, der er i stand til at bevirke en dehydrativ kondensation af den reaktive aminogruppe enten i peptidet eller i enzymet med den reaktive karboxylgruppe på det andet materiale i et vandigt opløsningsmiddel; (2) maleimido-N-hydroxysuccinimid-estere såsom m-MBHS og p-MCHS, 15 der inducerer en reaktion af peptidets reaktive aminogruppe med den aktive N-hydroxysuccinimidester til dannelse af et xnaleimid, og derefter inducere en reaktion med enzymets sulf-hydrylgruppe; og (3) dialdehydreagenser såsom succindialde-hyd og GLA som inducerer en binding af den reaktive aminogrup-20 pe på enten peptidet eller enzymet med den reaktive aminogruppe i det andet af disse to materialer.
Koblingsreaktionen kan udføres i vandigt opløsningsmiddel, der kan udvælges blandt de opløsningsmidler der vides at være nyttige til peptid-enzym-kondensation. Eksempler her-25 på er fosfatpuffer mellem pH 6 og 8 og boratpuffer mellem pH 7 og 9.
Reaktionstiden for denne peptid-enzym-kobling er normalt 30 minutter til 20 timer, men i betragtning af enzymernes stabilitet er en kort varighed på 30 minutter til 3 timer 30 ønskelig. Når koblingsreaktionen imidlertid udføres ved lav temperatur kan reaktionstiden uden risiko være så lang som 2-4 døgn. I almindelighed er reaktionstemperaturen fra ca.
4 til ca. 50°C og fortrinsvis omkring 15 til 30°C.
Efter denne ovennævnte koblingsreaktion renses det 35 resulterende peptid-enzym-konjugat og isoleres ved søjlekromatografi under anvendelse af et gelmedium såsom "Sephadex" ® G100 eller G200, eller "Sepharose" ® 6B eller 4B.
DK 159276 B
15 β-Galaktosidase, forkortet Ø-Gal, et enzym der hydrolyserer laktose til galaktose og bruges mod en sygdom fremkaldt af laktase-deficiens og som mærkningsenzym i EIA, kan til brug i EIA ifølge opfindelsen være af en hvilken son helst op-5 rindelse, men det foretrækkes i almindelighed at bruge et β-Gal stammende fra Escherichia coli, et Ø-Gal der er let tilgængeligt og har høj specifik aktivitet over for syntetiske substrater såsom o-nitrofenyl-Ø-D-galaktopyranosid og 4-metyl'umbelliferyl-Ø-D-galaktopyranosid.
10 β-Gal kan bruges i isoleret tilstand eller i en form konjugeret med et immunaktivt materiale. Det immunaktive materiale kan fx være et antigen, antistof eller haptener såsom lægemidler. Som eksempler på antigener kan nævnes hormoner (fx panereatisk glukagon (PG), dets fragmentpeptider, 15 såsom peptider med formel III, insulin, dets fragmentpepti-der såsom peptider med formel II, parathyroidhormon, calcitonin, adrenocorticoid-hormoner, væksthormonet, humant chorio-gonadotropin (hCG) og dets fragmentpeptider såsom peptider med formel I, luteini-20 seringshormonet, eller det thyroide-stimulerende hormon); proteiner såsom IgG, immunoglobulin A (IgA), immunoglobulin M (IgM), immunoglobulin E (IgE), a-fetoprotein-carcinoembry-onisk antigen; virusantigener såsom rubella virus HA-antigen og sendai. virus HA-antigen. Som eksempler på antistoffer 25 kan nævnes de antistoffer (anti-PG-antistof, anti-hCG-antistof, anti-IgG-antistof, anti-IgM-antistof og anti-IgE-anti-stof) der kan vindes ved immunisering af pattedyr såsom kanin, rotte, marsvin, får, ged eller lignende, eller en fugleart såsom høne, and eller gås, med haptener, som er nævnt 30 nedenfor, i overensstemmelse med velkendt procedure.
Som haptener kan der nævnes steroider, vitaminer, cata-cholaminer, antibiotika og andre lægemidler såsom penicilliner, cephalosporiner og β-adrenerge lægemidler.
Konjugeringen af β-Gal med et immunaktivt materiale 35 kan ske ved covalent binding. Konjugeringen af disse komponenter kan fx udføres ved den fremgangsmåde der er beskrevet i Clinica Acta 81, 1 (1977); eller en metode som består i tværbinding af sulfhydrylgruppen i β-Gal med aminogruppen i et
DK 159276 B
16 immunaktivt materiale ved hjælp af m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimid; en fremgangsmåde som består i tværbinding af sulfhydrylgruppen i β-Gal med sulfhydrylgruppen i et immunaktivt materiale ved hjælp af 0,O-fenylen-dimaleimid; en 5 fremgangsmåde som består i tværbinding af aminogruppen i β-Gal med aminogruppen i et immunaktivt materiale ved hjælp af glutaraldehyd; og en fremgangsmåde som består i kondensation af aminogruppen eller karboxylgruppen i β-Gal med karbo-xylgruppen eller aminogruppen i et immunaktivt materiale ved 10 hjælp af karbodiimid.
Som eksempler på sukker der anvendes ved udøvelse af den foreliggende opfindelse kan nævnes pentoser såsom arabi-nose, xylose og ribose; hexoser som fx glukose, fruktose, mannose, galaktose og rhamnose; disakkarider såsom maltose, 15 cellobiose, trehalose, gentiobiose, laktose og sakkarose og trisakkaroser som fx raffinose og maltotriose. Som eksempler på anvendelige sukkeralkoholer skal nævnes monosakkarider med 5 kulstofatomer såsom xylitol og monosakkarider med 6 kulstofatomer som fx sorbitol, mannitol og inositol. Særlig foretræk-20 kes arabinose, mannitol, inositol, sakkarose og raffinose og i særlig grad sakkarose. De ovennævnte sukkere og sukkeralkoholer kan bruges i form af blandinger.
De β-Gal-holdige vandige præparater kan desuden indeholde albumin foruden nævnte sukker og/eller 25 sukkeralkohol og kan ydermere indeholde magnium- eller/og kalciumion-donorer eller prækursorer. Når man lader den eller disse yderligere komponenter være til stede i-præparatet, bidrager man til at forhindre nedsættelse af enzymatisk aktivitet under lyofiliseringen, og i tilfælde af et konjugat af 30 β-Gal og et immunaktivt materiale forhindrer man nedgang i den immunologiske aktivitet, hvortil kommer den virkning at man bidrager til forbedret facon af lyofilisatet. Som eksempler på ovennævnte albumin kan nævnes sådanne serumalbuminer som humanserumalbumin, hesteserumalbumin, okseserumalbumin 35 og fåreserumalbumin, men okseserumalbumin foretrækkes. De ovennævnte magnium- og/eller kalciumiondonorer eller -prækursorer kan være alle mulige forbindelser med evne til at frigive magniumioner og/eller kalciumioner, men magniumsalte og
DK 159276 B
17 kalciumsalte kan normalt anvendes. Det foretrækkes at bruge magniumklorid og kalciumklorid.
I vandige præparater er indholdet af p-Gal en mængde svarende til 10 pg til 1 mg (eller 0,3 - 5 mikroenheder til 30 millienheder) pr. ml præparat, og fortrinsvis 100 pg til 10 yg (eller 3 mikroenheder til 0,3 millienheder), regnet på samme basis. Indholdet af sukker eller sukkeralkohol er sædvanligvis ækvivalent med en koncentration på 0,01-20% v/r (vægt/rumfang, dvs. med et forhold 10 mellem enheder af fast stof og væske som mellem g og ml) i det vandige præparat og fortrinsvis 0,2-5% v/r på samme basis. Indholdet af albumin svarer i almindelighed til en koncentration på 0,01-5% v/r og fortrinsvis 0,1-1% v/r i det vandige præparat. Koncentrationen af nævnte magnium- eller/og kalcium-15 iondonorer i det vandige præparat er 0,0001-0,1 M/l og fortrinsvis 0,0001-0,01 M/l.
Ved fremstilling af det vandige præparat er rækkefølgen af tilsætningen af komponenterne ikke kritisk.
Det frysetørrede materiale fremstil-20 les ved lyofilisering af ovennævnte vandige præparat ved omkring -30°C til -50°C, hvorefter man fjerner isen ved sublimering under nedsat tryk ved en temperatur på omkring 10-20°C på konventionel måde. Efter denne frysetørringsproces sker der fortrinsvis hermetisk tillukning under nitrogengas eller vakuum 25 for at forhindre ødelæggelse og nedbrydning på grund af sådanne mikroorganismer som svampe og bakterier. Nitrogengas-luknin-gen udføres i almindelighed ved at man skyller lyofilisatet i tilstrækkelig grad med gasformig nitrogen og lukker hermetisk under nitrogenatmosfære. Vakuumlukningen sker i almindelighed 30 ved at man indelukker lyofilisatet hermetisk under nedsat tryk, fx 10-0,01 mm Hg.
Det resulterende frysetørrede materiale, vundet ved frysetørring af det vandige præparat indeholdende 3”Gal og en sukker eller en sukkeralkohol er meget nyttigt som prøverea-35 gens fordi den enzymatiske aktivitet af β-Gal i det væsentlige er bevaret intakt’. Det er nyttigt som diagnostisk middel,
DK 159276 B
18 og er på grund af dets forholdsvis lave pris og høje specifikke aktivitet værdifuldt som reagens for EIA.
Ved bestemmelse af hCG ved immunbestemmelsesmetoden ifølge den foreliggende opfindelse, anvender man fortrinsvis 5 et humant chorio-gonadotropin-EIA-prøvesæt indeholdende nedenstående materialer.
Prøvesættet under anvendelse af det andet uopløselige antistof indeholder: 1) Den del af et antihumant gonadotropin-antistof, 10 isoleret ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, som binder en given mængde, fortrinsvis 5-100%, af peptid-enzym-kon-jugatet og sat til reaktionssystemet; 2) en given mængde, fortrinsvis en portion med en enzymatisk aktivitet på 0,1-500 μΕ, af det eventuelt frysetør- 15 rede peptid-enzym-konjugat; 3) fra 0-500 IE standard humant chorio-gonadotropin; 4) en pufferopløsning, fortrinsvis en fosfatpuffer med pH 6-9, der bruges til fortynding af ovennævnte reagenser 1) til 3) og den til bestemmelse værende prøvevæske; 20 5) en given mængde, tilstrækkelig til at binde hele mæng den af det første antistof 1), af et uopløseligt anti-dyr IgG-bærerkonjugat (idet bæreren kan være en af dem der er nævnt foran); 6) en given mængde, fortrinsvis 1-100 ug, substrat; 25 7) en pufferopløsning, fortrinsvis en fosfatpuffer eller karbonatpuffer,· der bruges til vask af det andet antistofbær er-kon jugat 5) og opløsning af substratet 6), 8) en pufferopløsning, fortrinsvis en karbonatpuffer el ler en tynd vandig opløsning af natriumhydroxyd, der bruges 30 til afslutning af den enzymatiske reaktion.
Dette prøvesæt bruges fortrinsvis på følgende måde: 35
DK 159276B
19
Til 10-300 μΐ reagens 1) sættes der 100-500 μΐ reagens 4) og 5-100 μΐ af en standard humant chorio-gonadotro-pin eller prøvevæsken, efterfulgt af tilsætning af 10-300 μΐ reagens 2). Blandingen får lov til at reagere ved 0-40°C i 1-72 timer. Derefter, med tilsætning af en given mængde rea- 5 gens 5), omrøres systemet godt og reagerer yderligere ved 0-40°C i 0,5-24 timer. Efter denne reaktion vaskes det andet antistof-bærer-konjugat med reagens 7) og derefter tilsættes der 10-1000 μΐ reagens 6) for at igangsætte en enzymatisk re-^ aktion. Reaktionen gennemføres ved 2.0-40°C i 0,5-24 timer, og ved afslutningen af denne periode bringes reaktionen til afslutning ved tilsætning af 1-5 ml reagens 8). Absorbensen eller fluorescensintensiteten af reaktionssysternet måles for at bedømme koncentrationen af humant chorio-gonadotropin i ^ prøvevæsken.
I sammenligning med de konventionelle metoder til fremstilling af et specifikt anti-hCG-antistof indebærer fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse ikke nogen kompliceret procedure til fremstilling af immunogenet, men giver et 2Q højfølsomt og specifikt antistof på bekvem måde.
Desuden giver i sammenligning med de konventionelle metoder til opdagelse af hCG enzym-immunbestemmelse ifølge den foreliggende opfindelse meget specifikke resultater og er meget praktisk i den henseende at den er fri for interferens 25 fra ledsagende hLH, hFSH og hTSH i prøvevæskerne. Metodens følsomhed er høj nok til at gøre den anvendelig til tidlig diagnose og til prognostisk behandling af chorio-carcinomer og andre sygdomme. EIA i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse er således praktiserbar selv i et klinisk labora-2Q torium hvor man ikke let kan udnytte radioaktive isotoper (i det følgende for korthedens skyld betegnet Ri), og den foreliggende fremgangsmåde tillader også bekvem og specifik bestemmelse af serum-hCG-titere. I modsætning til RI-mærkede peptider, der uundgåeligt har halveringstider, er det beskrevne peptid-enzym-konjugat stabilt og kan let fremstilles, 35 hvorfor det kan anvendes med held på et stort antal prøver og giver resultater med høj grad af reproducerbarhed.
DK 159276 B
20 ~ I nærværende beskrivelse er forkortelser, der bruges om aminosyrer, peptider, beskyttelsesgrupper, aktive grupper etc. enten de forkortelser der er angivet af IUPAC-IUB Commission on Biological Nomenclature, eller de forkortelser 5 der almindeligt anvendes på dette tekniske område. I det følgende anføres en partiel liste over de anvendte forkortelser.
Det vil forstås at når der for aminosyrers og andre forbindelsers vedkommende eksisterer optiske isomerer, så menes der L-formen med mindre andet er angivet.
10 Ala: alanin
Pro: prolin
Ser: serin
Leu: leucin
Arg: arginin 15 Gly: glycin
Asp: asparaginsyre
Thr: threonin
Ile: isoleucin
Gin: glutamin 20 Glu: glutaminsyre
Tyr: tyrosin !
Met: methionin
Nle: norleucin
Phe: fenylalanin 25 Val: valin
Trp: tryptofan
Asn: asparagin
Lys: lysin
His: histidin 30 Z: benzyloxykarbonyl OBu : t-butylester HONB: N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dikarboximid ONB: N-hydroxy-5-norbornen-2,3-dikarboximidester DMF: N,N'-dimetylformamid 35 DCC: Ν,Ν'-dicyklohexylkarbodiimid
DK 159276 B
21 DMSO: dimetylsulfoxyd THF: tetrahydrofuran HOBt: 1-hydroxybenzotriazol OSU; N-hydroxysuccinimidester 5 ECDI: l-ætyl-3-(3-dimetylaminopropyi)-karbodiimid CMCT: l-cyklohexyl-3-(2-morfolinoætyl)-karbodiimid- metho-p-toluensulfonat GLA: glutaraldehyd V m-MBHS: , meta-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester 10 p-MCHS: para-maleimidometylcyklohexan-l-karboxyl-N- hydroxysuccinimidester
Nogle eksempler og referenceeksempler tjener til nærmere belysning af opfindelsen.
I de anførte referencéeksempler udførtes tyndlagskro-15 matografi ved hjælp af en silikagelplade 60^254 frå "Merck" ® og følgende elueringsmidler:
Rf·^: kloroform/metanol 95:5 2
Rf : kloroform/metanol/eddikesyre 9:1:0,5 3
Rf : ætylacetat/pyridin/eddikesyre/vand 60:20:6:10 4 20 Rf : n-butanol/pyridin/eddikesyre/vand 30:20:6:24 5
Rf : ætylacetat/n-butanol/eddikesyre/vand 1:1:1:1 g
Rf : n-butanol/eddikesyre/vand 12:3:5
Referenceeksempel 1 H-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-25 Pro-Ser-Asp-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln-OH (i det følgende benævnt peptid I; det C-terminale fragmentpeptid af hCG-β (123-145)) ............. -........
a) Z-Pro-Gln-OBut t 12,5 g Z-Gln-OBu opløses i 500 ml metanol og der ud-30 føres katalytisk reduktion med palladium sort som katalysator. Katalysatoren frafiltreres, opløsningsmidlet afdestilleres cg remanensen opløses i 300 ml ætylacetat. Til denne opløsning sættes der 200 ml af en opløsning i ætylacetat af Z-Pro-ONB (fremstillet ud fra 9,7 g Z-Pro-OH, 8,4 g HONB og 8,8 g 35 DCC), og blandingen omrøres i 5 timer. Reaktionsblandingen vaskes med 0,2N HC1, 4%s vandigt natriumhydrogenkarbonat og '22
DK 159276 B
vand i nævnte rækkefølge, hvorefter der tørres over vandfrit natriumsulfat. Ætylacetatet afdestilleres derefter og remanensen krystalliseres ved tilsætning af petroleumsæter og en ringe mængde diætylæter og omkrystalliseres yderligere 5 fra samme opløsningsmiddelsystem.
Udbytte 13,1 g (81,5%), smp. 86-88°C, [a]26 = -64,8° (c = 0,5 i metanol), Rf1 0,42, Rf2 0,73.
Beregnet for C22®31^6^3: ^ 60/95 H 7,21 N 9,69 Fundet: C 61,04 H 7,20 N 9,49%.
10 b) Z-Leu-Pro-Gln-OBu*' t I 500 ml metanol opløses der 13 g Z-Pro-Gln-OBu og der udføres katalytisk reduktion i en hydrogengasstrøm med anvendelse af palladium sort som katalysator. Katalysatoren frafiltreres, opløsningsmidlet afdestilleres og remanensen op-15 løses i 300 ml ætylacetat. Til denne opløsning sættes der en ætylacetatopløsning af Z-Leu-ONB (fremstillet ud fra 7,9 g Z-Leu-OH, 6,5 g HONB og 6,8 g DCC), og blandingen omrøres i 5 timer. Reaktionsblandingen vaskes med 0,2N HC1, 4%s vandigt natriumhydrogenkarbonat og vand i nævnte rækkefølge, hvoref-20 ter der tørres over vandfrit natriumsulfat og opløsningsmidlet afdestilleres. Remanensen behandles med petroleumsæter og det resulterende pulver opsamles ved filtrering.
Udbytte 10,6 g (66,2%),smp. 74-77°C, [a]23 = -81,4° 1 2 υ (c = 0,6 i metanol), Rf = 0,38, Rf = 0,66.
25 Beregnet for ^23^42^7^4: C 61,52 H 7,74 N 10,25
Fundet: C 61,61 H 7,94 N 9-,92%.
jr c) Z-Iie-Beu-Pro-Gln-OBu t
Der opløses 10,6 g Z-Leu-Pro-Gln-OBu i 500 ml metanol, og der udføres katalytisk reduktion med palladium sort som ka-30 talysator. Metanolen afdestilleres og remanensen opløses i 300 ml ætylacetat. Til denne opløsning sættes der 200 ml af en opløsning af Z-Ile-ONB (fremstillet ud fra 5,1 g Z-Ile-OH, 4,2 g HONB og 4,4 g DCC) i ætylacetat/dioxan 1:1, og blandingen omrøres i 16 timer. Opløsningsmidlet fjernes fra reaktions-35 blandingen ved destillation og remanensen opløses i 400 ml ætylacetat. Reaktionsblandingen vaskes med 0,2N HC1, 4%s van-
DK 159276B
23 digt natriumhydrogenkarbonat og vand i nævnte rækkefølge, efterfulgt af tørring over vandfrit natriumsulfat. Opløsningsmidlet afdestilleres, remanensen behandles med petroleumsæter og det resulterende pulver opsamles ved filtrering.
5 Udbytte 12,1 g (94,5%), smp. 78-80°C (sønderdeling), [a)23 = -87,0° (c = 0,42 i metanol), Rf1 = 0,23, Rf2 = 0,67. Beregnet for C34H53°qN5: C 61,89 H 8,10 N 10,62 Fundet: C 62,35 H 8,31 N 10,16%.
d) Z-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln-OBu*' t 10 12 g Z-Ile-Leu-Pro-Gln-OBu opløses i 500 ml metanol og der udføres katalytisk reduktion i hydrogengasstrøm med palladium sort som katalysator. Katalysatoren frafiltreres og opløsningsmidlet afdestilleres. Remanensen opløses i 100 ml DMF, der tilsættes 4,7 g Z-Pro-OH og 3,0 g HOBt, blandingen 15 afkøles til 0°C og der tilsættes yderligere 4,3 g DCC. Blandingen omrøres ved 0°C i 4 timer og derefter ved stuetemperatur i 10 timer. Bundfaldet frafiltreres, opløsningsmidlet afdestilleres og remanensen opløses i 400 ml ætylacetat. Opløsningen vaskes med 0,2N HC1, 4%s vandigt natriumhydrogenkarbo-20 nat og vand i nævnte rækkefølge, hvorefter der tørres over vandfrit natriumsulfat. Opløsningsmidlet afdestilleres og der tilsættes diætylæter til remanensen hvorpå blandingen opvarmes. Efter fjernelse af den ovenstående væske behandles remanensen med diætylæter og det resulterende pulver opsamles 25 ved filtrering.
Udbytte 12,6 g (91,5%), smp. 83-87°C (sønderdeling).
[a]23 = -121,0° (c = 0,5 i metanol), Rf1 = 0,31, Rf2 = 0,84. Beregnet for C39Hgo°9N6: C 61,88 H 7,99 N 11,10
Fundet: C 62,04 H 8,21 N 10,70%.
t 30 e) Z-Thr-Pro-I1e-Leu-Pro-Gln-OBu I 500 ml metanol opløses der 12,5 g Z-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln-OBut og der udføres katalytisk reduktion i en hydrogengasstrøm med anvendelse af palladium sort som katalysator. Katalysatoren frafiltreres, opløsningsmidlet afdestilleres og 35 remanensen opløses i 100 ml DMF. Til denne opløsning sættes der 4,2 g Z-Thr-OH og 2,7-g HOBt og opløsningen afkøles til
DK 159276 B
24 0°C. Derefter tilsættes 3,7 g DCC og blandingen omrøres ved 0°C i 4 timer og ved stuetemperatur i 8 timer. Bundfaldet frafilteres. Efter fjernelse af opløsningsmidlet ved destillation ekstraheres remanensen med 400 ml ætylacetat og eks-5 trakten vaskes med 0,2N HC1, 4%s vandigt natriumhydrogenkar-bonat og vand i nævnte rækkefølge, efterfulgt af tørring over vandfrit natriumsulfat. Opløsningsmidlet afdestilleres, remanensen behandles med diætylæter og det resulterende pulver opsamles ved filtrering.
10 Udbytte 11,8 g (86,8%), smp. 101-105°C, [et]23 = -124,3° (c = 0,58 i metanol), Rf"*" = 0,20, Rf2 = 0,68.
Beregnet for C42H67°xiN7: C 60,19 H 7,87 N 11,43 Fundet: C 59,54 H 7,91 N 11,19%.
f) Z-Asp(QBu^)-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln-OBUt t 15 11,8 g Z-Thr.Pro-Ile-Leu-Pro-Gln-OBu opløses i 500 ml metanol og der udføres katalytisk reduktion i en hydrogengasstrøm med palladium sort som katalysator. Katalysatoren fra-filtreres, opløsningsmidlet afdestilleres og remanensen opløses i 100 ml DMF. I denne opløsning opløses der 4,5 g Z-Asp-20 (OBut)-OH og 2,3 g HOBt og opløsningen afkøles til 0°C. Derpå tilsættes der 3,2 g DCC, blandingen omrøres ved 0°C i 4 timer og ved stuetemperatur i 10 timer, bundfaldet frafiltre-res og opløsningsmidlet afdestilleres. Remanensen behandles med 150 ml ætylacetat og det resulterende gelagtige bundfald 25 opsamles ved filtrering, krystalliseres fra ætylacetat/diætyl-æter og opsamles ved filtrering med diætylæter.
Udbytte 12,15 g (85,9%), smp. 94-96°C (sønderdeling), [a]21 =-109,1° (c = 0,59 i metanol), Rf1 = 0,13, Rf2 = 0,47. Beregnet for c5iH80°14N8'H2O: C 58,49 H 7,89 N 10,70 30 Fundet: C 58,60 H 8,07 N 10,71%.
g) Z-Ser-Asp (OBU^j -Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-GIn-QBu*' I 500 ml metanol opløses der 12 g Z-Asp(OBu^-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln-OBut og der udføres katalytisk reduktion i en hydrogengasstrøm med palladium sort som katalysator. Ka-35 talysatoren frafiltreres, opløsningsmidlet afdestilleres, remanensen opløses i 100 ml DMF sammen med 2,93 g Z-Ser-OH og
DK 159276 B
25 2,0 g HOBt. Opløsningen afkøles til 0°C efterfulgt af tilsætning af 2,8 g DCC, og blandingen omrøres ved 0°C i 4 timer og derpå ved stuetemperatur i 12 timer. Bundfaldet frafiltre-res og opløsningsmidlet afdestilleres. Remanensen opløses i 5 500 ml ætylacetat. Opløsningen vaskes med 0,2N HC1, 4%s vandigt natriumhydrogenkarbonat og vand i nævnte rækkefølge efterfulgt af tørring over vandfrit natriumsulfat, og opløsningsmidlet afdestilleres. Remanensen behandles med ætylacetat og diætylæter og det resulterende pulver opsamles ved 10 filtrering.
Udbytte 11,7 g (90,0%), smp. 111-115°C (sønderdeling), [a]21 = -112,3° (c = 0,63 i metanol), Rf1 = 0,06, Rf2 = 0,31.
Beregnet for C54H85016N9/H20: c 57/I7 H 7/73 N 11,11 15 Fundet: C 57,34 H 7,77 N 11,14%.
t t h) Z-Pro-Ser-Asp(OBu )-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln-OBu 11,6 g Z-Ser-Asp (OBu1") -Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln-OBu*" opløses i 500 ml metanol og der udføres katalytisk reduktion i en hydrogengasstrøm med palladium sort som katalysator.
20 Katalysatoren frafiltreres og opløsningsmidlet afdestilleres. Sammen med 4,3 g Z-Pro-OBN opløses remanensen i 100 ml dmf og opløsningen omrøres ved stuetemperatur i 16 timer. Opløsningsmidlet afdestilleres, remanensen ekstraheres med· 500 ml ætylacetat og ekstrakten vaskes med 0,2N HC1, 4%s vandigt na-25 triumhydrogenkarbonat og vand i nævnte rækkefølge. Efter tørring over vandfrit natriumsulfat afdestilleres opløsningsmid let. Remanensen behandles med diætylæter og det resulterende pulver opsamles ved filtrering.
Udbytte 11,1 g (88,1%), smp. 117-120°C, [a]21 = -119,2° 30 (c = 0,61 i metanol), Rf2 = 0,45.
Beregnet for C59H92°i7Nlo'H20: ^ 57,54 H 7,69 N 11,38 Fundet: C 57,44 H 7,69 N 11,38%.
Z-Gly-Pro-Ser-Asp (OBu*") -Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln-OBut 2
Der opløses 10 g Z-Pro-Ser-Asp(ØBu**)-Thr-Pro-Ile-Leu-35 Pro-Gln-OBu*1 i 500 ml metanol og foretages katalytisk reduktion i en hydrogengasstrøm med palladium sort som katalysator.
DK 159276B
26
Katalysatoren frafiltreres og opløsningsmidlet afdestilleres. Remanensen opløses sammen med 4 g Z-Gly-ONB i 80 ml DMF og blandingen omrøres ved stuetemperatur i 12 timer. Opløsningsmidlet afdestilleres, remanensen opløses i 500 ml ætylacetat 5 og opløsningen vaskes med 0,2N HC1, 4%s vandigt natriumhydro-genkarbonat og vand i nævnte rækkefølge. Efter tørring over vandfrit natriumsulfat afdestilleres opløsningsmidlet. Remanensen opløses i 180 ml metanol efterfulgt af tilsætning af 4/5 ml hydrazinhydrat/ blandingen omrøres ved stuetemperatur 10 i 16 timer og opløsningsmidlet afdestilleres. Remanensen opløses i 500 ml ætylacetat/ opløsningen vaskes med vand efterfulgt af tørring over vandfrit natriumsulfat og opløsningsmidlet afdestilleres. Remanensen behandles med diætylæter og det resulterende pulver opsamles ved filtrering.
15 Udbytte 7,35 g (70,2%), smp. 131-135°C (sønderdeling), [et]22 = -119,4° (c = 0,35 i metanol), Rf2 = 0,27.
Beregnet for c6lHg5018N;L1,H20: C 56,86 H 7,59 N 11,96 Pundet: C 56,65 H 7,68 N 12,02%.
j) Z-Leu-Pro-QBu^ 20 I 800 ml metanol opløses der 20,2 g Z-Pro-OBu1· og der udføres katalytisk reduktion i en hydrogengasstrøm med palladium sort som katalysator. Katalysatoren frafiltreres og opløsningsmidlet afdestilleres. Remanensen opløses i 300 ml ætylacetat efterfulgt af tilsætning af 26,3 g Z-Leu-OSu og 25 blandingen omrøres i 16 timer. Reaktionsblandingen vaskes med 0,2N HC1, 4%s vandigt natriumhydrogenkarbonatog vand i nævnte rækkefølge hvorefter der sker tørring over vandfrit natriumsulfat og opløsningsmidlet afdestilleres til frembringelse af et olieagtigt produkt.
30 Udbytte 27,6 g (100%), Rf1 = 0,71, Rf2 = 0,78.
k) Z-Arg (NO„) -beu-Pro-OBu'^ z , 13,8 g Z-Leu-Pro-OBu opløses i 500 ml metanol og der udføres katalytisk reduktion i en hydrogengasstrøm med palladium sort som katalysator. Katalysatoren frafiltreres og 35 opløsningsmidlet afdestilleres. Remanensen opløses sammen med 11,7 g Z-Arg(N02)“OH og 6,7 g HOBt i 200 ml DMF og opløsningen
DK 159276 B
27 afkøles til 0°C. Derpå tilsættes 7,5 DCC, blandingen omrøres ved 0°C i 4 timer og derpå ved stuetemperatur i 12 timer, bundfaldet frafiltreres og opløsningsmidlet afdestilleres. Remanensen ekstraheres med 600 ml ætylacetat, ekstrakten va-5 skes med 0,2N HC1, 4%s vandigt natriumhydrogenkarbonat og vand i nævnte rækkefølge og tørres over vandfrit natriumsulfat hvorpå opløsningsmidlet afdestilleres. Remanensen henstår og de resulterende krystaller behandles med diætylæter. Remanensen opsamles ved filtrering og omkrystalliseres fra meta-10 nol.
Udbytte 12,4 g (60,6%), smp. 170-172°C, [a]i?6 = -67,8°
3 U
(c = 0,48 i metanol), Rf = 0,77.
Beregnet for C29H45°8N7: c 56'20 H 7,32 N 15,82 Fundet: C 55,79 H 7,16 N 15,85%.
15 1) Z-Ser-Arg-Leu-Pro-OBut I 500 ml metanol opløses der 12,3 g Z-Arg(NO„)-Leu- t ^
Pro-OBu efterfulgt af tilsætning af 6,6 ml 6N HC1, og der udføres katalytisk reduktion i en hydrogengasstrøm med palladium sort som katalysator. Katalysatoren frafiltreres og op-20 løsningsmidlet afdestilleres. Remanensen opløses sammen med 2,8 ml triætylamin i 100 ml DMF og triætylamin-hydrokloridet frafiltreres. Til filtratet sættes der 4,8 g Z-Ser-OH og 5,4 g HONB og blandingen afkøles til 0°C. Derpå tilsættes der 4,95 g DCC og blandingen omrøres ved 0°C i 4 timer og ved stuetempe-25 ratur i 16 timer. Bundfaldet frafiltreres, opløsningsmidlet afdestilleres, remanensen ekstraheres med 500 ml ætylacetat. Ekstrakten vaskes godt med mættet vandigt natriumklorid efterfulgt af tørring over vandfrit natriumsulfat, og opløsningsmidlet afdestilleres til frembringelse af en sirupsagtig re- 3 30 manens. Rf =0,53.
t m) Z-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-OBu I 500 ml metanol opløses der 10,5 g Z-Ser-Arg-Leu-Pro-0But og 3 ml 6N HC1 og der udføres katalytisk reduktion i en hydrogengasstrøm med palladium sort som katalysator. Kataly-35 satoren frafiltreres, opløsningsmidlet afdestilleres, remanen sen opløses i 100 ml DMF og opløsningen neutraliseres med
DK 159276 B
28 2,52 ml triætylamin. Triætylamin-hydrokloridet frafiltreres og derefter tilsættes 8,4 g Z-Pro-ONB hvorpå blandingen omrøres ved stuetemperatur i 16 timer. Opløsningsmidlet afdestilleres ,der sættes 300 ml ætylacetat og 300 ml mættet van-5 digt natriumklorid til remanensen og blandingen rystes grundigt. Reaktionsblandingen henstår, der udvindes et olieagtigt bundfald fra det vandige lag og derpå tilsættes der diætyl-æter. Det resulterende pulver opløses i metanol, de uopløselige stoffer frafiltreres og opløsningsmidlet afdestilleres.
10 Remanensen behandles yderligere med diætylæter og det resulterende pulver opsamles ved filtrering.
Udbytte 8,45 g (70,8%), smp. 115-120°C (sønderdeling), [a]22 = -84,7° (c = 0,53 i metanol), Rf3 = 0,41.
Beregnet for C^H^gOgNg,ΗΟΙ,Ε^Ο: C 54,63 H 7,56 N 13,78 Cl 4,36 15 Fundet: C 54,50 H 7,70 N 14,11 Cl 4,21%. i n) Z-Ser-Pr o-Ser-Ar g-Beu-Pro-OBu1' I 200 ml metanol opløses der 3,8 g Z-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-0But og der udføres katalytisk reduktion i en hydrogengasstrøm med palladium sort som katalysator. Katalysatoren fra-20 filtreres, opløsningsmidlet afdestilleres og remanensen opløses i 30 ml DMF. Til denne opløsning sættes der en opløsning (10 ml) af Z-Ser-ONB (fremstillet ud fra 1,37 g Z-Ser-OH, 1,24 g HONB og 1,30 g DCC) i DMF, og blandingen omrøres ved stuetemperatur i 16 timer. Bundfaldet frafiltreres og opløs-25 ningsmidlet afdestilleres. Remanensen opløses ved tilsætning af 1 ml ætylacetat og 1 ml acetonitril og derefter behandles opløsningen med æter og det resulterende pulver udvindes ved filtrering. Dette pulver opløses i 2 ml af en 1:1 blanding af op-løsningsmiddel Rf og ætylacetat, påføres på en kolonne (5,6 x 30 9,0 cm) pakket med silikagel under anvendelse af samme opløs ningsmiddel, og der fremkaldes med samme opløsningsmiddel. Fraktionerne fra 365 ml til 746 ml forenes, opløsningsmidlet afdestilleres, remanensen behandles med diætylæter og det resulterende pulver opsamles ved filtrering.
35 Udbytte 2,12 g (50,2%), smp. 130-135°C (sønderdeling), [alp2 = -83,5° (c = 0,38 i metanol), Rf3 = 0,34.
'29
DK 159276 B
Beregnet for C^H^O^Ng ,HC1,H20: C 53,35 H 7,39 N 14,00 Cl 3,94 Fundet: C 53,67 H 7,45 N 13,72 Cl 3,52%, o) Z-Ser-Leu-Pro-OBu^ t 13,8 g Z-Leu-Pro-OBu opløses i 700 ml metanol og der 5 udføres katalytisk reduktion i en hydrogengasstrøm med palladium sort som katalysator. Katalysatoren frafiltreres og opløsningsmidlet afdestilleres. Remanensen opløses sammen med 7,9 g Z-Ser-OH og 8,9 g HONB i 200 ml acetonitril og opløsningen afkøles til 0°C. Derpå tilsættes der 7,5 g DCC og blan-10 dingen omrøres ved 0°C i 4 timer og ved stuetemperatur i 16 timer. Bundfaldet frafiltreres, opløsningsmidlet afdestilleres og remanensen ekstraheres med 500 ml ætylacetat. Ekstrakten vaskes med 0,2N HC1, 4%s vandigt natriumhydrogenkarbonat og vand i nævnte rækkefølge, efterfulgt af tørring over vandfrit 15 natriumsulfat, hvorpå opløsningsmidlet afdestilleres og giver 17 g af en olie. Denne olie opløses i 15 ml kloroform/metanol 200:3 og påføres en kolonne på 5,4 x 20 cm, pakket med silika-gel og med samme opløsningsmiddel, og der fremkaldes med samme opløsningsmiddel. Fraktionerne fra 1300 til 2100 ml forenes 20 og opløsningsmidlet afdestilleres så der fremkommer et olieag-tigt produkt.
Udbytte 12,2 g (73,1%.), Rf1 = 0,38, Rf2 = 0,69.
p) Z-Ser-Leu-Fro-S,er-Pro-'Ser-Arg-Leu-P'ro-QBut *h 1,0 g Z-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-OBu og 1,2 ml IN HCl 25 opløses i 60 ml metanol og der udføres katalytisk reduktion i en hydrogengasstrøm med palladium sort som katalysator. Katalysatoren frafiltreres, opløsningsmidlet afdestilleres og remanensen opløses i 20 ml DMF. Derefter opløses der 700 mg t Z-Ser-Leu-Pro-OBu i 7 ml trifluoreddikesyre og efter 50 minut-30 ter afdestilleres opløsningsmidlet. Remanensen vaskes med en blanding af diætylæter/petroleumsæter 1:2, vaskevæskerne kasseres og den olieagtige remanens tørres under nedsat tryk med en vakuumpumpe til frembringelse af. et pulver. Pulveret opløses straks i ovennævnte DMF-opløsning sammen med 407 mg HONB.
35 Derpå tilsættes der ved 0°C 466 mg DCC og blandingen omrøres ved 0°C i 6 timer og derpå ved stuetemperatur i 16 timer.
DK 159276 B
30
Bundfaldet frafiltreres og opløsningsmidlet afdestilleres.
3
Remanensen opløses i 5 ml opløsningsmiddel Rf /ætylacetat 4:1 og anbringes på en kolonne (3,6 x 9,0 cm) pakket med sili-kagel og med anvendelse af samme opløsningsmiddel, hvorpå der 5 elueres med samme opløsningsmiddel. Fraktionerne fra 333 til 572 ml forenes, opløsningsmidlet afdestilleres, remanensen behandles med diætylæter og det resulterende pulver opsamles ved filtrering.
Udbytte 450 mg (33,8%), smp. 110-120°C (sønderdeling), 10 [a]24 = -106,6° (c = 0,31 i metanol), Rf5 = 0,71 t g) Z-Pro-Pro-OBu I 500 ml metanol opløses der 10,1 g Z-Pro-OBu1' og der udføres katalytisk reduktion i hydrogengas med palladium sort som katalysator. Katalysatoren frafiltreres og opløsningsmid-15 let afdestilleres. Remanensen opløses sammen med 8,47 g Z-Pro-OH og 5,4 g HOBt i 300 ml ætylacetat og opløsningen afkøles til 0°C. Derpå tilsættes der 7,5 g DCC, blandingen omrøres ved 0°C i 4 timer og derpå ved stuetemperatur i 12 timer og bundfaldet frafiltreres. Filtratet vaskes med 0,2N 20 HCl, 4%s vandigt natriumhydrogenkarbonat og vand i nævnte rækkefølge efterfulgt af tørring over vandfrit natriumsulfat, hvorpå opløsningsmidlet afdestilleres. Den krystallinske remanens behandles med diætylæter og opsamles ved filtrering.
Udbytte 9,85 g (74,1%), smp. 94-96°C, [a]p2 - -116,9° 25 (c = 0,54 i metanol), Rf1 = 0,58, Rf2 = 0,72.
Beregnet for C22H30°5N2: C 6^,65 H 7,51 N 6,96 Fundet: C 65,42 H 7,38 N 7,20%.
r) Z-Pro-Pro-Pro-OBu*' 9 g Z-Pro-Pro-OBu*1 opløses i 300 ml metanol og der udfø-30 res katalytisk reduktion i en hydrogengasstrøm med palladium sort som katalysator. Katalysatoren frafiltreres og opløsningsmidlet sidestilleres. Remanensen opløses sammen med 5,6 g Z-Pro-OH og 3,63 g HOBt i 250 ml ætylacetat og opløsningen afkøles ved 0°C. Derpå tilsættes 5,1 g DCC og blandingen omrøres 35 ved 0°C i 6 timer og ved stuetemperatur i 16 timer. Bundfaldet frafiltreres. Filtratet vaskes med 0,2N HCl, 4%s vandigt
DK 159276 B
31 natriumhydrogenkarbonat og vand i nævnte rækkefølge, hvorefter der tørres over vandfrit natriumsulfat og opløsningsmidlet afdestilleres. Den krystallinske remanens behandles med diætylæter og filtreres.
5 Udbytte 9,6 g (85,9%), smp. 135-157°C, [a]22 = -176,0° (c = 0,55 i metanol), Rf^ = 0,40, Rf2 = 0,69.
Beregnet for C27H3706N3,1/2H20: C 63,76 H 7,53 N 8,26 Fundet: C 63,77 H 7,53 N 8,62%.
s) Z-Ala-Pro-Pro-Pro-OBut 10 I 200 ml metanol opløses der 5 g Z-Pro-Pro-Pro-OBut og der udføres katalytisk reduktion i en hydrogengasstrøm med palladium sort som katalysator. Katalysatoren frafiltre-res og opløsningsmidlet afdestilleres. Remanensen opløses sammen med 2,23 g Z-Ala-OH og 1,62 g HOBt i 20 ml DMF og op-15 løsningen afkøles til 0°C. Til denne opløsning sættes der 2,27 g DCC og blandingen omrøres ved 0°C i 4 timer og derpå ved stuetemperatur i 12 timer. Bundfaldet frafiltreres og opløsningsmidlet afdestilleres. Remanensen opløses i 3 ml 2%s metanol-kloroform og anbringes på en kolonne (3,7 x 10,5 cm) 20 pakket med silikagel og med hjælp af samme opløsningsmiddel, og der fremkaldes også ved hjælp af dette. Fraktionerne fra 170 til 380 ml forenes og opløsningsmidlet afdestilleres og giver 4,05 g (71,0%) olieagtigt produkt. Rf^ = 0,32, .Rf2 = 0,67 t) Z-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-OBu*' 25 I 80 ml metanol opløses der 400 mg Z-Ser-Leu-Pro-Ser-
Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-OBu*· sammen med 0,8 ml IN HC1 og der udføres katalytisk reduktion i en hydrogengasstrøm med palladium sort som katalysator. Katalysatoren frafiltreres og opløsningsmidlet afdestilleres. Remanensen opløses i 10 ml DMF, opløs-30 ningen neutraliseres med 0,11 ml triætylamin og triætylamin-hydrokloridet frafiltreres. 233 mg Z-Ala-Pro-Pro-Pro-OBu*· opløses i 2 ml trifluoreddikesyre og efter 50 minutter sidestilleres opløsningsmidlet. Til remanensen sættes der diætylæter og det resulterende pulver opsamles ved filtrering og tørres.
35 Pulveret opløses sammen med 122 mg HONB i ovennævnte DMF-op-løsning og opløsningen afkøles til 0°C. Til denne opløsning
DK 159276 B
32 sættes der 140 ml DCC, blandingen omrøres ved 0°C i 6 timer og derpå ved stuetemperatur i 12 timer. Bundfaldet fjernes ved filtrering og opløsningsmidlet afdestilleres. Til remanensen sættes der diætylæter og det resulterende pulver opsamles 5 ved filtrering og omkrystalliseres fra acetonitril/ætylacetat.
Udbytte 430 mg (82,1%), smp. 152-155°C (sønderdeling), [et]34 = r-153,6°(c = 0,45 i metanol), Rf3 = 0,10, Rf5 = 0,54.
Beregnet for C72HU2°19N16'HC1'H20: C 55,42 H 7,43 N 14,37 Cl 2,27 10 Fundet: C 56,21 H 7,54 N 14,04 Cl 2,30%.
u) Z-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly- t t
Pro-Ser-Asp(OBU )-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln-QBu_ I 30 ml metanol opløses der 360 mg Z-Gly-Pro-Ser- t t
Asp(OBu )-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln-OBu og der udføres kata- 15 lytisk reduktion i en hydrogengasstrøm med palladium sort som katalysator. Katalysatoren frafiltreres, opløsningsmidlet afdestilleres og remanensen opløses i 10 ml DMF. I 3 ml trifluoreddikesyre opløses der 430 mg Z-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-OBu*' og opløsningen henstår 20 ved stuetemperatur i 45 minutter. Opløsningsmidlet afdestilleres, remanensen behandles med diætylæter og det resulterende pulver opsamles ved filtrering og tørres. Pulveret opløses sammen med 103 mg HONB i ovennævnte DMF-opløsning og den blandede opløsning afkøles til 0°C.Derefter tilsættes der 118 mg 25 DCC og blandingen omrøres ved 0°C i 6 timer og derpå ved stuetemperatur i 40 timer. Bundfaldet frafiltreres og opløsningsmidlet afdestilieres. Remanensen behandles med diætylæter og det resulterende pulver opsamles ved filtrering og genudfældes yderligere fra DMF og diætylæter.
30 Udbytte 700 mg (95,5%), smp. 120-125°C (sønderdeling), [et]33 = -127,7° (c = 0,12 i metanol), Rf5 = 0,62, Rf6 = 0,44.
Beregnet for c^i%9i034N27'HC1'2H20: C 53,12 H 7,80 N 14,94 Cl 1,40
Fundet: C 53,39 H 7,62 N 15,10 Cl 1,54%.
DK 159276 B
33 v) H-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Ser-Asp-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gin-OH (peptid I) (det C-terminale fraqmentpeptid af hCG-β (123-145)) 580 mg Z-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser-Arg- t t 5 Leu-Pro-Gly-Pro-Ser-Asp(OBu )-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln-OBu og 0,45 ml IN HC1 opløses i 50 ml metanol og der udføres katalytisk reduktion i en hydrogengasstrøm med palladium sort som katalysator. Katalysatoren frafiltreres, opløsningsmidlet afdestilleres og der sættes 1 ml vand til remanensen, efter-10 fulgt af gendestillation. Remanensen opløses i 10 ml 90%s vandig trifluoreddikesyre og henstår ved stuetemperatur i 60 minutter. Efter at opløsningsmidlet er afdestilleret opløses remanensen ved tilsætning af 10 ml vand og underkastes søjlekromatografi på "Amberlite" ® IRA-410 (acetatformen; ko-15 lonnestørrelse 1x5 cm). Eluatet opsamles. Harpiksen vaskes godt med 50 ml vand og vaskevæskerne forenes med eluatet og frysetørres til frembringelse af 390 mg hvidt pulver. Dette (r) pulver anbringes på en kolonne (2 x 83 cm) af "Sephadex" ^ LH-20, pakket med IN eddikesyre, og fremkaldes med samme op-20 løsningsmiddel. Fraktionerne fra 70 til 100 ml forenes, frysetørres og søjlekromatograferes på samme måde som ovenfor og med samme fremkaldelses-opløsningsmiddel. De fraktioner som indeholder den ønskede forbindelse forenes og frysetørres til et hvidt pulver.
25 Udbytte 185 mg (35,2%), [<x]33 = -194,5° (c = 0,13 i 0,1N eddikesyre), Rf^ = 0,06, Rf^ (cellulose) = 0,78.
Aminosyreanalyse (med beregnet tal i parentes): Arg 1,00 (1), Asp 1,00 (1), Thr 1,00 (1), Ser 3,74 (4), Glu 1,03 (1), Pro 9,59 (9), Gly 0,98 (1), Ala 0,94 (1), Ile 0,95 (1), 30 Leu 2,97 (3). Gennemsnitlig udvindingsmængde: 79,3%.
Referenceeksempel 2 H-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Ser-Asp-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln-OH (i det følgende betegnet peptid II; det C-termina-le fragmentpeptid af hCG-β (130-145))_ t 35 Der opløses 2,16 g Z-Gly-Pro-Ser-Asp(OBu )-Thr-Pro-Ile- t
Leu-Pro-Gln-OBu i 100 ml metanol og udføres katalytisk reduktion i en hydrogengasstrøm med palladium sort som katalysator.
DK 159276 B
34
Katalysatoren frafiltreres, opløsningsmidlet afdestilleres og remanensen opløses i 25 ml DMF. Til denne opløsning sættes der Z-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-OH, vundet ved behandling af 1,5 g Z-Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-OBu*" med trifluoreddike-5 syre, samt 1,22 g HONB, hvorefter der afkøles til 0°C. Derefter tilsættes der 701 mg DCC og blandingen omrøres ved 0°C i 6 timer og ved stuetemperatur i 40 timer. Bundfaldet fjernes ved filtrering og opløsningsmidlet afdestilleres. Remanensen udfældes med ætylacetat og diætylæter og filtreres.
3 10 Bundfaldet opløses i 5 ml opløsningsmiddel Rf og anbringes på en silikagelkolonne (5,7 x 9 cm) pakket med nævnte opløsningsmiddel og fremkaldes også med samme opløsningmiddel. Fraktionerne fra 534 til 914 ml forenes, destilleres til fjernelse af opløsningsmidlet, fældes med diætylæter og filtreres. 15 Udbytte 1,1 g (33,9%), Rf3 = 0,20.
Derefter opløses en portion på 70 mg af ovennævnte beskyttede peptid i 10 ml metanol og der udføres katalytisk reduktion i en hydrogengasstrøm med palladium sort som katalysator. Katalysatoren frafiltreres og opløsningsmidlet afdestil-20 leres. Remanensen opløses i 1 ml 90%s trifluoreddikesyre og efter 60 minutter afdestilleres opløsningsmidlet. Remanensen opløses ved tilsætning af 3 ml vand og underkastes søjlekromatografi på "Amberlite" ®IRA-410 (acetatformen; kolonnestørrelse lxl cm), efterfulgt af frysetørring. Derefter opløses 25 lyofilisatet i 0,5 ml IN eddikesyre og anbringes på en kolonne af "Sephadex" ® LH-20 pakket med IN eddikesyre og fremkaldes med samme opløsningsmiddel. De fraktioner som-indeholder den ønskede forbindelse forenes og frysetørres til et hvidt pulver.
Udbytte 22 mg (36,1%), [a]^3 = -159,3° (c = 0,15 i 30 0,1N eddikesyre), Rf3 =0,15.
Aminosyreanalyse (beregnet): Arg 1,01 (1), Asp 1,01 (1), Thr 0,98 (1), Ser 2,57 (3), Glu 0,96 (1), Pro 4,85 (5),
Gly 1,00 (1), Ile 0,96 (1), Leu 2,04 (2), gennemsnitlig udvindingsgrad : 81,1%.
DK 159276 B
35
Referenceeksempel 3 H-Gly-Pro-Ser-Asp-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln-OH (i det følgende betegnet peptid III; det C-terminale fragmentpeptid af hCG-β (136-145)) .....................................
5 150 mg Z-Gly-Pro-Ser-Asp(OBu^)-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-
Gln-OBu*" opløses i 2,5 ml 90%s trifluoreddikesyre og opløsningen henstår ved stuetemperatur i 60 minutter. Derefter afdestilleres opløsningsmidlet, remanensen opløses i 30 ml 50%s eddikesyre og der udføres katalytisk reduktion i en hydrogen-10 gasstrøm med palladium sort som katalysator. Katalysatoren frafiltreres og opløsningsmidlet afdestilleres. Remanensen opløses i 10 ml vand, underkastes søjlekromatografi på "Amberlite" ® IRA-410 (acetatformen; kolonnestørrelse 1x3 cm), og harpiksen vaskes godt med vand. Eluatet og vaskevæskerne 15 forenes og frysetørres. Lyofilisatet anbringes på en kolonne (2 x 83 cm) af "Sephadex" ® LH-20 pakket med IN eddikesyre, og der fremkaldes med nævnte opløsningsmiddel. Fraktionerne fra 90 til 105 ml forenes og frysetørres til et hvidt pulver.
Udbytte 70 mg (57,9%), [α]ί:9 = -150,5° (c = 0,2 i C 4^ 20 0,1N eddikesyre), RfD = 0,29, Rr (cellulose) = 0,55.
Aminosyreanalyse: Asp 1,02 (1), Thr 0,98 (1), Ser 0,92 (1), Glu 1,04 (1), Pro 3,17 (3), Gly 0,99 (1), Ile 0,99 (1),
Leu 1,00 (1). Gennemsnitlig udvindingsgrad: 82,6%.
Referenceeksempel 4 25 Ant i-hCG-antis to f I 1 ml fysiologisk saltopløsning opløses der 1 mg hCG (ca. 10000 IE/mg),· renset fra menneskeurin på den konventionelle måde, og der tilsattes 1 ml af Freund's fuldstændige adju-vans (Tachibana et al, Men-eki-no-Seikagaku (Immunitets-bio-30 kemi), side 26, Kyoritsu Shuppan Inc., Japan (1967)) og der omrørtes godt for at tilberede en emulsion. Denne emulsion injiceredes i begge siders lårmuskler og subkutant på flere steder af ryggen af en kanin. Denne fremgangsmåde gentoges ialt 5 gange med mellemrum på 3 uger, og efter den sidste 35 immunisering blev der udtaget en blodprøve til pilot-bestemmelse. På denne måde opnåedes et anti-hCG-antistof med kraftig
DK 159276 B
36 affinitet til det C-terminale fragmentpeptid af hCG-3/enzym-kon jugatet.
Referenceeksempel 5 hCG-fi-D-Galaktosidase-konjugat 5 I 1 ml 0,05M. fosfatpuffer (pH 7,0) opløstes der 1 mg hCG (ca. 10000 IE/mg) og under omrøring tilsattes der 50 μΐ THF indeholdende 78 ug m-MBHS. Blandingen fik lov til at reagere ved 30°C i 30 minutter hvorefter den straks førtes gennem en kolonne (0,9 x 55 cm) af "Sephadex" ® G-25 for at fjer-10 ne overskydende reagensmængder. Derefter udførtes der eluering med 0,05M citratpuffer (pH 5,5) for at isolere det maleimidere-de hCG. Denne maleimiderede hCG-opløsning (2 ml) sattes dråbevis til 0,5 ml af en tynd opløsning (1 mg/ml) af β-D-galakto-sidase i 0,05M fosfat-NaCl-puffer (pH 7,5) og reaktionen gen-15 nemførtes ved stuetemperatur i 2 timer. Derefter førtes reaktionsblandingen gennem en kolonne på 1 x 15 cm af concanava-lins A-"Sepharose" ® 4B for at adsorbere hCG-3-D-galaktosida-se-konjugatet. Der udførtes derpå eluering med 0,05M fosfat-NaCl-puffer indeholdende 0,2M a-metylmannosid (pH 7,5) og de 20 fraktioner der udviste både enzymatisk aktivitet og hCG-immun-aktivitet forenedes. Dette aktive eluat rensedes yderligere ved søjlekromatografi på "Sepharose" ® 6B med 0,02M fosfat-NaCl-puffer (pH 7,0). Den enzymholdige fraktion fraskiltes og gav et hCG-enzym-konjugat.
25 Referenceeksempel 6 (1) Anti-hCG-ff-C-terminalt fragmentpeptid (123-145) antistof I 4 ml 0,2M fosfatpuffer (pH 7,3) opløstes der 25 mg af det i referenceeksempel 1 fremstillede fragmentpeptid (hCG-3-C-terminalt fragmentpeptid (123-145)) og 50 mg okse-30 thyroglobulin (forkortes herefter til BTG), efterfulgt af tilsætning af 4 ml 5%s vandig opløsning af GLA. Blandingen omrørtes ved stuetemperatur i 3 timer, dialyseredes mod vand (2 1x4) ved 4°C og frysetørredes til frembringelse af et immunogen. 1,5 mg af dette hCG-p-C-terminale fragmentpeptid 35 (123-145)-BTG-konjugat opløstes i 0,75 ml fysiologisk saltop- '37
DK 159276 B
løsning og opløsningen blandedes godt med 0,75 ml af Freund’s fuldstændige adjuvans til tilberedning af en emulsion. Denne emulsion injiceredes i begge siders lårmuskler og subkutant på flere steder på kaniners ryg. Denne procedure gentoges 5 ialt 4 gange med mellemrum på 4 uger, og blodet opsamledes 1 uge efter den sidste immunisering og centrifugeredes til fraskillelse af antiserum. På denne måde vandtes anti-hCG-β-C-terminalt fragmentpeptid (123-145)-serum-F5C.
Dette antiserum F5C fældedes med ammoniumsulfat på 10 rutinemæssig måde og gav en γ-globulinfraktion som derefter førtes gennem en kolonne af 2 mg hCG-konjugeret "Sepharose" ® 4B (0,9 cm i diameter, 4 cm lang).
Kolonnen vaskedes med 0,02M boratpuffer (pH 8,0) indeholdende 0,15M NaCl, og der udførtes eluering med 0,17M gly-15 cin-HCl-puffer (pH 2,3), hvorved der vandtes et anti-hCG-β-C-terminalt fragmentpeptid (123-145) F5CS med høj affinitet til hCG.
(2) Fremstilling af en antistofbundet fast fase
Til 300 polystyrenkugler (diameter 6,4 mm, fra Precision 20 Plastics Ball Co., Chicago, USA) sattes der 50 ml 0,01M fosfatpuffer (pH 7,7) og blandingen opvarmedes til 56°C. Derefter tilsattes der 2 mg F5CS, fremstillet som under afsnit 1), og blandingen inkuberedes ved 56°C i 2 timer. Den vaskedes derpå med 0,05 M fosfatpuffer (pH 7,0) indeholdende 0,1% BSA, og 25 opbevaredes i kulde til brug fandt sted.
(3) Fremstilling af et anti-hCG-antistof-fr-Gal-konjugat I overensstemmelse med den procedure der er beskrevet ovenfor under 1), blev en kanin immuniseret med 1 mg hCG (ca. 10000 IE/mg), renset fra menneskeurin på den konventionelle 30 måde til fremstilling af et anti-hCG-serum. Dette anti-hCG-
serum fældedes fraktioneret med ammoniumsulfat og underkastedes affinitetskromatografi på en kolonne (diameter 0,9 cm, længde 4 cm) af "Sepharose” ®4B, konjugeret med 5 mg hCG-β-C-terminalt fragmentpeptid (123-145). Effluenten udvandtes 35 for at vinde antistof T7CS. 4 mg T7CS opløstes i 2 ml 0,05M fosfatpuffer (pH 7,0) og derefter tilsattes der 200 yl THF
DK 159276 B
38 indeholdende 400 ug m-MBHS. Reaktionen udførtes ved 30°C i Æ) 30 minutter. Reaktionsblandingen førstes over "Sephadex" ^ G-25 (kolonnediameter 0,9 cm, længde 55 cm) ækvilibreret med 0,02M fosfatpuffer for at skille overskydende reagens fra det maleimiderede antistof. Denne maleimiderede antistofopløsning (0,5 ml) sattes gradvist til 0,3 ml af en tynd opløsning 5 (1 mg/ml) af β-D-galaktosidase i 0,02M fosfat-NaCl-puffer (pH 7,5) og reaktionen gennemførtes ved 5°C natten over under lejlighedsvis rystning. Efter reaktionen rensedes blandingen ved søjlekromatografi på "Sepharose" ®6B med 0,02M fosfat-NaCl-puffer (pH 7,0) og de fraktioner der indeholdt enzym- 10 og antistofaktiviteter opsamledes. På denne måde vandtes der et konjugat af anti-hCG-antistof og β-Gal.
Referenceeksempel 7
Fremstilling af peptid Ι-β-galaktosidase-konjugat 2,3 mg peptid I, fremstillet som i referenceeksempel 1, opløstes i en blanding af 0,5 ml 0,05M fosfatpuffer (pH 7,0) og 0,5 ml DMSO, efterfulgt af tilsætning af 50 yl THF indeholdende 780 yg m-MHBS. Blandingen reagerede ved 30°C i 30 minutter. Reaktionsblandingen førtes gennem en kolonne på 0,9 x 55 cm af "Sephadex" ^G-15, ækvilibreret med 0,02M fosfatpuffer for at fraskille overskydende reagenser fra det maleimiderede peptid. Denne maleimiderede peptidopløsning, 0,5 ml, sattes gradvis til 0,5 ml tynd β-D-galaktosidaseop-løsning (1 mg/ml) i 0,02M fosfat-NaCl-puffer (pH 7,5) , og blandingen reagerede ved 5°C natten over under lejlighedsvis rystning.
Efter at reaktionen var fuldført rensedes blandingen (g) ved kromatografi på en "Sepharose" ^ 6B kolonne ved hjælp af ^ 0,02M fosfat-NaCl-puffer (pH 7,0) for at fraskille den enzym- holdige fraktion, hvorved man vandt det ønskede peptid-enzym-konjugat.
De fysiske egenskaber af det således vundne peptid-en-zym-konjugat er som følger.
^ 1) Konjugatet sønderdeler sådanne syntetiske substrater anvendt i EIA som O-nitrofenyl^-D-galaktopyranosid og 4-me-tylumbelliferyl^-D-galaktopyranosid til frigivelse af henholdsvis O-nitrofenol og 4-metylumbelliferon.
DK 159276 B
39 2) Når der anvendes det syntetiske substrat 4-metylumbel-liferyl-p-D-galaktopyranosid, er konjugatets Michaelis-kon-stand lig med den for den intakte β-D-galaktosidase.
3) Den optimale pH-værdi for enzymatisk aktivitet er 6,5 til 7,3.
5 4) Mere end 90% af dette enzymatisk aktive konjugat er reaktivt over for anti-hCG-antistof, og dets immunologiske aktivitet såvel som dets enzymatiske aktivitet er stabile i over 4 måneder under køleskabsbetingelser.
5) Konjugatets molekylvægt er ca. 550000 og déts forhold 10 mellem molært peptid I og enzym er ca. 7.
6) Det er letopløseligt i vandigt medium mellem pH 5 og pH 9.
7) Fig. 2 viser det ultraviolette absorptionsspektrum for peptid ΐ-β-galaktosidase-konjugat; absorptionsmaximum ca.
15 280 nm.
8) Nedenstående tabel 2 viser konjugatets aminosyresammen-sætning.
9) Andre egenskaber af dette konjugat er identisk med den for β-D-galaktosidase (Boyer "The Enzymes", Vol. 7 (1972), 20 side 617, Academic Press, New York-London).
Tabel 2
Aminosyre Antal mol af hver aminosyre i peptid Ι-β-D- _ galaktosidase-konjugat pr. 100 mol g l'y c in 25 LyS 31
His 51
Arg 9 4
Asp 153
Thr 77 30 Ser 80
Glu 159
Pro 99
Gly 100
Ala 109
Val 88
Jb
Met 19
Ile 60
Leu 139
Tyr 34
Phe 55
DK 159276 B
40
Referenceeksempel 8
Fremstilling af peptid ΙΓ-β-D-gaiaktosidase-konjugat
Fremgangsmåden i referenceéksempel 7 gentoges med den forskel at der brugtes 1,7 mg peptid II, fremstillet i referenceek-5 sempel 2, i stedet for 2,3 mg peptid I, hvorved der vandtes en peptid II-{3-D-galaktosidase.
Med undtagelse af nedenstående karakter 5), er de fysiske egenskaber 1), 2), 3), 4), 6), 7), 8) og 9) af dette konjugat identiske med den for det i eksempel 2 vundne konju-10 gat.
5) Dette konjugats molekylvægt er ca. 550000 og dets forhold peptid II/enzym er ca. 9.
Referenceeksempel 9
Fremstilling af peptid ΙΙΧ-β-D-galaktosidase-konjugat 15 Et konjugat af peptid III og β-D-galaktosidase vand tes ved gentagelse af fremgangsmåden i referenceeksempel 7 med den forskel at der brugtes 1,0 mg peptid III ifølge referenceeksempel 3 i stedet for 2,3 mg peptid I.
Med undtagelse af nedenstående karakter 5), er dette 20 konjugats fysiske egenskaber identiske med egenskaberne 1), 2), 3), 4), 6), 7), 8) og 9) af konjugatet ifølge eksempel 2.
5) Konjugatets molekylvægt er ca. 550000 og dets molforhold peptid III/enzym er ca. 11.
Referenceeksempel 10 25 Fremstilling af peptid I-alkalisk fosfatase-konjugat I 1 ml af en tynd opløsning af alkalisk fosfatase (0,5 mg/ml) i 0,1M fosfatpuffer (pH 6,8) opløstes der 1,2 mg peptid I, fremstillet ifølge referenceeksempel 1, efterfulgt af tilsætning af 0,1 ml 2%s opløsning af GLA. Blandingen fik 30 lov til at reagere ved stuetemperatur i 60 minutter hvorefter den dialyseredes mod 0,02M fosfat-NaCl-puffer (pH 6,8) ved ca. 5°C natten over. Derefter fraskiltes den enzymholdige fraktion ved kromatografisk rensning på en "Sephadex" ® G-100
DK 159276 B
41 kolonne under anvendelse af fosfat-NaCl-pufferopløsning (pH 6,8), hvorved man vandt det ønskede peptid-enzym-konjugat. De fysiske egenskaber af dette konjugat er som følger: 1) Konjugatet nedbryder fenylfosforsyre og p-nitrofenyl-5 fosforsyre, der begge er syntetiske substrater anvendt i EIA, til frigivelse af henholdsvis fenol og p-nitrofenol.
2) Det optimale pH-område for den enzymatiske aktivitet er pH 9,3-10,2.
3) Mere end ca. 90% af dette enzymatisk aktive konjugat 10 er reaktivt over for anti-hCG-antistof, og dets immunologiske aktivitet såvel som dets enzymatiske aktivitet er stabile i mere end 3 måneder under køleskabsbetingelser.
4) Det har molekylvægt ca. 130000 og dets molforhold peptid I/enzym er ca. 13.
15 5) Det er letopløseligt i vandigt medium mellem pH 6 og pH 11.
6) Fig. 3 viser ultraviolet absorptionsspektrum for peptid i/alkalisk fosfatase fosfatase-konjugatj absorptionsmaximum ca. 280 nm.
20 7) Aminosyresammensætningen er vist i tabel 3.
8) Andre egenskaber af dette konjugat er identiske med dem for alkalisk fosfatase (Boyer "The Enzymes", bind 4 (1971), side 417, Academic Press, New York-London).
Tabel 3 25 Aminosyre Antal mol af hver aminosyre i peptid I-alkalisk _ fosfatase-konjugat pr. 100 mol glycin_
Lys 49
His 23
Arg 63 30 Asp 109
Thr 70
Ser 81
Glu 123
Pro 83 35 Gly 100
Ala 125
Val 82
Met 42
DK 159276 B
Tabel 3 (fortsat)
Aminosyre Antal mol af hver aminosyre i peptid I-alkalisk _· fosfatase-konjugat pr. 100 mol glycin _
Ile 51
Leu 92 5 Tyr 32
Phe 33
Referenceeksempel 11 1 o Fremstilling af peptid Il-alkalisk fosfatase-konjugat
Et konjugat af peptid II og alkalisk fosfatase fremstilledes ved gentagelse af fremgangsmåden i eksempel 5 med den forskel at der brugtes 0/83 mg peptid II, fremstillet som i referenceeksempel 2, i stedet for 1,2 mg peptid I.
15 Bortset fra nedenstående karakter 4), er dette konjugats fysiske egenskaber identisk med egenskaberne 1), 2), 3), 5), 6), 7) og 8) af konjugatet i eksempel 5.
4) Molekylvægten af dette konjugat er ca. 120000 og dets molforhold peptid II/enzym er ca. 11.
20
Referenceeksempel 12
Fremstilling af peptid Tll-alkalisk fosfatase-konjugat
Et konjugat af peptid III og alkalisk fosfatase frem-25 stilledes ved gentagelse af fremgangsmåden i eksempel 5 med den forskel at der brugtes 0,49 mg peptid III, fremstillet som i referenceeksempel 3 i stedet for 1,2 mg peptid I.
Med undtagelse af nedenstående karakter 4), var dette konjugats fysiske egenskaber identiske med egenskaberne 1), 3q 2), 3), 5), 6), 7) og 8) af konjugatet ifølge eksempel 5.
4) Konjugatets molekylvægt er ca. 120000 og dets molforhold peptid Ill/enzym er ca. 17.
35
DK 159276 B
43
Eksempel 1
Isolering af specifikt anti-hCG-antistof 5 g peptid I, vundet i referenceeksempel 1, opløstes i 8 ml 0/1M NaHC03 indeholdende 0,5M NaCl. Til denne opløs-5 ning sattes der 1 g BrCN-aktiveret "Sepharose" ® 4B, i forvejen vasket med 1/1000 N-HC1. Blandingen omrørtes ved 5°C natten over. Derefter vaskedes "Sepharosen" godt med 0,1M NaHCO^-opløsning indeholdende 0,5M NaCl som anvendt ovenfor, efterfulgt af tilsætning af 10 ml 0,5M ætanolamin reguleret 1 g til pH 8 med saltsyre. Reaktionen udførtes ved stuetemperatur i 1 time hvorefter "Sepharosen" vaskedes med (1) 0,1M acetatpuffer indeholdende 1M NaCl (pH 4,0), (2) 0,1M boratpuffer indeholdende 1M NaCl (pH 8,0) og (3) 0,02M boratpuffer indeholdende 0,15M NaCl (pH 8,0) i nævnte rækkefølge. "Sepharosen" 15 pakkedes derefter i en kolonne.
8 ml af det i referenceeksempel 4 vundne anti-hCG-serum underkastedes fraktioneret fældning med 1,5 g vandfrit natriumsulfat, og den resulterende γ-globulinfraktion overførtes på ovennævnte kolonne af peptid I-"Sepharose" 4B; kolonnestør-20 relse 0,9 x 4 cm.
Kolonnen vaskedes med 0,02M boratpuffer indeholdende 0,15M NaCl (pH 8,0) for at fjerne de anti-hCG-antistoffer der udviste krydsreaktivitet med hLH, hFSH og hTSH. Derefter udførtes der eluering med 0,17M glycin-HCl-puffer (pH 2,3) 25 for at udvinde det specifikke anti-hCG-antistof med stærk affinitet til det C-terminale fraktionpeptid af hCG-β (proteinindhold 1,8 mg).
De fysiske egenskaber af det således vundne specifikke antistof er som følger: 30 1) Efter en sluttelig fortynding til 80 ng/ml er dette antistof i stand til at binde ca. 95% af hCG-mærkningsenzymkon jugatet med ca. 2 yE enzymatisk aktivitet og ca. 35% af peptid II-mærkningsenzymkonjugatet med samme aktivitet.
2) Det optimale pH-område for antigen-bindingsaktiviteten 35 af dette antistof er 6-9.
3) Ved opbevaring under køleskabsbetingelser forbliver dette antistof stabilt i mere end 1 år.
DK 159276 B
44 4) Dette antistof har en molekylvægt på ca. 150000 og indeholder 3% sukker.
5) Det er letopløseligt i vandigt medium mellem pH 2 og pH 12.
6) Dets elektroforetiske opførsel hører til den som udvises 5 af β-globulinfraktionen og udviser vandring hen imod katoden.
7) Pig. 1 viser det ultraviolette absorptionsspektrum for dette specifikke antistof (absorptionsmaximum ca. 280 nm).
8) Aminosyreanalyse af dette antistof er vist i tabel 1.
9) Andre egenskaber hos dette antistof er identiske med dem der udvises af immunoglobulin G (Kikuchi et al, Ika Men-eki Gaku (Medicinsk immunologi), side 61, Nankodo Inc., Japan, 1976).
Tabel 1 15
Aminosyre Antal mol af hver aminosyre i antistoffet _' pr. 100 mol glycin _
Lys 94
His 40
Arg 41 20 Asp 114
Thr 103
Ser 126
Glu 142
Pro 103 25 Gly 100
Ala 77
Val 134
Met 3
Ile 33
Leu 109
Tyr 40
Phe 59
Eksempel 2 35 ----------
BIA af hCG
Ved en foreløbig bestemmelse holdtes en blanding af 100 μΐ af en fortynding af hvert antiserum, 100 μΐ af et pep-
DK 159276 B
45 tid-|3-D-galaktosidase-konjugat og 300 μΐ af en bestemmelses-puffer (0,02M fosfatpuffer, pH 7,3, indeholdende 0,5% humant serumalbumin, 0,5% ætylendiamintetraacetat-dinatrium, 2^0, 0,1% NaN^ og 0,1M NaCl) på 5°C i 48 timer, hvorved den enzy-5 matisk aktive del af peptid-^-D-galaktosidase-konjugatet (der havde en forudbestemt passende enzymatisk aktivitet (på ca. 20 μΕ/ml)) blev bundet til antiserumet. Til dette system sattes der 100 μΐ af en suspension på 2,5% anti-kanin-IgG-antistof-cellulose-komplex, og reaktionen gennemførtes 10 yderligere ved 20°C i 4 timer. Denne blanding centrifugeredes og sedimentet vaskedes og suspenderedes i 500 μΐ af en substratopløsning (en 20 ug/ml opløsning af 4-metylumbelliferyl-β-D-galaktopyranosid i 0,02M fosfatpuffer (pH 7,0) indeholdende 0,1% okse-serumalbumin, 0,1% NaN^, 0,1M NaCl og 1 mM MgC^). 15 Blandingen fik lov til at reagere ved stuetemperatur natten over. Efter denne reaktion måltes fluorescens-intensiteten af 4-metylumbelliferon frigivet ved sønderdeling af substratet ved en excitations-bølgelængde på 365 nm og en fluorescens-bølgelængde på 450 nm.
20 Bestemmelsen af hCG i en prøvevæske udførtes på følgen de måde. Til en blanding af 50 μΐ af prøvevæsken og 250 μΐ af bestemmelsespufferen sattes 100 μΐ af antiserumet med den ovenfor nævnte, forudbestemte fortyndingsgrad og 100 μΐ af peptid-p-D-galaktcsidase-konjugatet. Derefter udførtes samme 25 procedure som ovenfor beskrevet.
Resultaterne fremgår af fig. 4 og 5.
Fig. 4 er et diagram der viser standardkurver for hCG(o) og hLH(x) i den foretagne EIA med anvendelse af anti-hCG-anti- stof fremstillet i referenceeksempel 4 (brudt linje ---) og 30 det specifikke anti-hCG-antistof fremstillet i eksempel 1 (fuldt optrukket linje --) . I begge systemer udførtes be stemmelsen under anvendelse af hCG-mærkningsenzym-konjugatet. Resultaterne viser at mens det bestemmelsessystem, der bruger det specifikke anti-hCG-antistof, er sammenligneligt med det 35 system som bruger anti-hCG-antistoffet med hensyn til følsomheden af hCG-opdagelse, så er krydsreaktiviteten af hLH mindre end 1/1000 i sammenligning med hCG.
Fig. 5 viser standardkurver for hLH i den foretagne
DK 159276 B
46 EIA under anvendelse af anti-hCG-antistof fremstillet i referenceeksempel 4, hvor -o- repræsenterer resultatet for peptid ΙΙ-β-D-galaktosidase-konjugat og -x- repræsenterer resultatet for hCG-3-D-galaktosidase-konjugatet. Det er tydeligt at 5 krydsreaktiviteten af hLH i peptid ΙΙ-β-D-galaktosidase-kon-jugatsy s teinet er meget lav i sammenligning med hCG-enzym-kon-jugatsysternet.
I fig. 4 og 5 såvel som fig. 6-12 angiver B den enzymatiske aktivitet bundet til en fast fase i nærværelse af det 10 · ønskede peptidhormon, mens Bq angiver den enzymatiske aktivi tet bundet til en fast fase under fravær af det ønskede peptidhormon .
Eksempel 3 EIA af hCG
15 Som i eksempel 2 henstod prøver indeholdende forskel lige fortyndingsgrader af antiserum (bestemmelsespuffer 300 μΐ, peptid-alkalisk fosfatase-konjugat 100 μΐ og antiserum 100 μΐ) ved 5°C i 48 timer, hvorved den enzymatisk aktive del af hvert peptid-alkalisk fosfatase-konjugat (der havde en forudbestemt 20 passende aktivitet (ca. 4 mE/ml)) blev bundet til antiserumet. Derefter blev der tilsat 50 μΐ antikanin-IgG-serum (en 10 ganges fortynding af et kommercielt antiserum) og 50 μΐ fosfat-NaCl-puffer (pH 7,5) indeholdende 2% normalt kaninserum, og blandingen henstod ved 5°C natten over. Derefter centrifugere-25 des den og sedimentet vaskedes og gensuspenderedes i 500 μΐ af en substratopløsning (2 mg/ml p-nitrofenylfosforsyre i 0,05M natriumkarbonatpuffer indeholdende 1 mM MgCl2 (pH 9,8)). Reaktionen udførtes ved 37°C natten over. Efter denne reaktion måltes absorptionen ved 405 nm af p-nitrofenol som fri-30 givet ved enzymatisk nedbrydning.
hCG i en prøvevæske bestemtes på følgende måde. Til en blanding af 50 μΐ af prøvevæsken og 250 μΐ af bestemmelsespufferen sattes der 100 μΐ af antiserumet med den som ovenfor angivet bestemte fortyndingsfaktor og 100 μΐ af peptid-35 alkalifosfatasen, og bestemmelsen udførtes som beskrevet ovenfor. Resultaterne er vist i fig. 6.
DK 159276 B
47
Fig. 7 er et lignende diagram som fig. 5 og viser standardkurver for hLH i den foretagne EIA under anvendelse af anti-hCG-antistof fremstillet i referenceeksempel 4, hvor -o- angiver resultatet for peptid I-alkalifosfatase-kon-5 jugatet og -x- repræsenterer resultatet for hCG-alkalifosfa-tase-konjugatet. Det er tydeligt at krydsreaktionen af hLH er forsvindende i det system hvor der anvendes peptid I-alkalif osf atase-kon jugatet .
Fig. 6 viser standardkurver for hCG (gengivet ved kur-10 ven mærket -o-) og hLH (kurven med -x-) i den EIA hvor der anvendes det specifikke anti-hCG-antistof fremstillet i eksempel 1 og peptid II-mærknings-alkalifosfatase-konjugatet i kombination. I dette bestemmelsessystem er krydsreaktiviteten af hLH praktisk talt forsvindende. Det vil også tydeligt ses at 15 følsomheden af hCG-opdagelsen er sammenlignelig med den der kan opnås med det sædvanlige bestemmelsessystem, og repræsenteret af---o---i fig. 4.
Eksempel 4
Specifik enzym-immumbestemmelse for PG 20 1) Fremstilling af anti-PG-serum I 4 ml 0,2M fosfatpuffer (pH 7,3) blev der opløst 10 mg PG og 20 mg okseserumalbumin (BSÅ), efterfulgt at tilsætning af en 5%s vandig opløsning af glutaraldehyd. Blandingen omrør-tes ved stuetemperatur i 3 timer hvorefter den dialyseredes 25 mod vand (2x41 vand) ved 4°C og frysetørredes til frembringelse af et immunogen. Dette PG-BSA-konjugat, 2 mg, opløstes i 1 ml fysiologisk kogsaltopløsning og blandedes godt med 1 ml Freund's fuldstændige adjuvans til frembringelse af en emulsion. Denne emulsion injiceredes i begge lårene og subkutant på flere 30 steder af ryggen af kaninen. Ovennævnte fremgangsmåde gentoges ialt 5 gange med mellemrum på 2 uger, og 1 uge efter sidste injicering blev der taget en blodprøve til pilotbestemmelse.
På denne måde vandtes der et anti-PG-serum som var reaktivt over for PG og tarm-GLI.
DK 159276 B
48 2) Fremstilling af et specifikt anti-PG-antistof I stedet for 5 mg hCG-3~C-terminalt peptid som beskrevet i eksempel 1, behandledes 5 mg PG-C-terminalt peptid (15-29) (H-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-5 Met-Asn-Thr-OH; se europæisk offentliggjort patentansøgning, skrift nr. 9147, referenceeksempel 1) på den måde der er beskrevet i eksempel 1 til frembringelse af et PG-C-terminalt peptid (15-29)-"Sepharose" 4B-komplex.
Derefter udsaltes 3 ml af det under 1) nævnte anti-PG-10 serum med vandfrit natriumsulfat og den resulterende γ-globu-linfraktion førtes gennem en kolonne (0,9 x 4 cm) af nævnte C-terminale peptid (15-29)-"Sepharose" 4B-komplex.
Kolonnen vaskedes med 0,02M boratpuffer (pH 8,0) indeholdende 0,15M NaCl for at eliminere det antistof som var 15 krydsreaktivt over for tarm-GLI. Derefter udførtes eluering med 0,17M glycin-saltsyrepuffer (pH 2,3) for at give et specifikt anti-PG-antistof (proteinindhold 0,35 mg) med stærk affinitet til det C-terminale peptid af PG.
De fysiske egenskaber af dette antistof er som følger.
20 Med undtagelse af karaktererne nr. 1) og 8) er de fysiske egenskaber af ovennævnte antistof analoge med egenskaberne nr. 2), 3), 4), 5), 6), 7) og 9) af antistoffet ifølge eksempel 1.
1) Ved en sluttelig fortynding på 180 ng/ml er dette 25 antistof i stand til at binde 53% af PG-3-D-galaktosidase-konjugatet (europæisk offentliggjort patentansøgning nr.
9147, referenceeksempel 9) og 18% af det PG-C-terminale peptid (21-29)-β-D-galaktosidase-konjugat (samme skrift nr. 9147, eksempel 3), hvis enzymatiske aktivitet er ca. 1 μΕ.
30 8) Aminosyresammensætningen af dette antistof er angi vet i tabel 4.
3) Bestemmelsesmetode
Ved en foreløbig prøve for hver antistofholdig legemsvæske holdtes en blanding af 100 μΐ antiserum med varieren-35 de fortynding, 100 μΐ peptid-β-D-galaktosidase-konjugat, 50 μΐ "Antagosan" ® (Hoechst, 10000 enheder/ml) og 250 μΐ bestemmelsespuffer (0,02M fosfatpuffer pH 7,3, indeholdende 0,5% humant serumalbumin (i det følgende kaldt HSÅ), 0,5%
DK 159276 B
49 ætylendiamintetraacetat-dinatrium^^O, 0,1% NaN^ og 0,1M j
NaCl) på 5°C i 96 timer, hvorved den enzymatiske aktivitet er hvert peptid-3-D-galaktosidase-konjugat (der havde en forudbestemt passende enzymatisk aktivitet på ca. 10 μΕ/ml) 5 blev bundet til antiserumet. Derefter tilsattes der 100 μΐ
af en 5%s anti-kanin-IgG-antistof-cellulose-konjugat-suspen-sion og reaktionen gennemførtes yderligere ved 30°C i 4 timer. Blandingen centrifugeredes og sedimentet vaskedes og suspenderedes i 500 μΐ af en substratopløsning (en 20 μg/ml opløs-10 ning af 4-metylumbelliferyl-3-D-galaktopyranosid i 0,01M
fosfatpuffer (pH 7,0) indeholdende 0,1% BSA, 0,1% NaN^/ 0,1M NaCl og 1 mM MgC^), og suspensionen inkuberedes ved stuetemperatur natten over. Efter afslutning af reaktionen måltes intensiteten af fluorescensen af den 4-metylumbelliferon som 15 var frigivet ved enzymatisk spaltning, idet målingen fandt sted ved en excitations-bølgelængde på 365 nm og en fluorescens-bølgelængde på 450 nm.
Til kvantitativ bestemmelse af pancreatisk glucagon i en prøvevæske sattes 100 μΐ af antiserumet med en fortyn-20 dingsfaktor bestemt som ovenfor angivet og 100 μΐ af peptid-β-D-galaktosidase-konjugatet til en blanding af 50 μΐ af prøvevæsken, 50 μΐ "Antagosan” og 200 μΐ bestemmelsespuffer, og bestemmelse udførtes på den ovenfor beskrevne måde.
Resultaterne er vist i fig. 8.
25 Fig. 8 viser standardkurver for PG (-o-) og tarm-GLI
(-X-) i EIA under anvendelse af anti-PG-serum fremstillet som beskrevet ovenfor under 1), og PG-mærknings-ft-D-galakto-sidase-konjugat ("Igaku-no-Ayumi" (Fremskridt i Medicinsk Videnskab), bind 103 (1977), side 25; punkteret linje) og 30 det specifikke anti-PG-antistof fremstillet i eksempel 10 (2) samt PG-C-terminalt peptid (21-29)-mærknings-£-D-galak-tosidase-konjugat (Journal of Biochemistry, bind 86 (1979), side 943; fuldt optrukket linje). Disse resultater viser at følsomheden af PG-opdagelse med det system i hvilket der ud-35 nyttes specifikt anti-PG-antistof er højere end den der sker med systemet som anvender anti-PG-serumet; samt mens anti-PG-serumet udviser en kraftig krydsreaktivitet med tarm-GLI, så udviser det specifikke anti-PG-antistof praktisk talt ingen
DK 159276 B
50 krydsreaktivitet med tarm-GLI.
Tabel 4
Aminosyre Antal mol af hver aminosyre i antistoffet _ pr, 100 mol qlycin_ 5 Lys 98
His 40
Arg 42
Asp 112
Thr 101 10 Ser 132
Glu 140
Pro 107
Gly 100
Ala 77 15 Val 135
Met 3
Ile 33
Leu 111
Tyr 41 20 Phe 57
Eksempel 5 β-D-Galaktosidase (fra Boehringer-Manheim, Forbundsrepublikken Tyskland) opløstes i følgende puffere a) og b) (vandige opløsninger), Koncentrationen af β-Gal i hver opløs-25 ning var 500 ng/ml.
a) 0,05M fosfatpuffer (pH 7,0) indeholdende 5% v/r sukker eller sukkeralkohol (sukkerarterne og sukkeralkoholarterne er angivet i tabel 5), 0,2% okseserumalbumin og 0,001M MgC^.
b) Puffer som ovenfor, med den forskel at der hverken var 30 inkorporeret sukker eller sukkeralkohol.
Hvert af de ovennævnte β-Gal-indeholdende vandige præparater blev frosset ved -40°C og derefter lyofiliseret ved 10°C og = 10 mm Hg til frembringelse af et frysetørret materiale. Hvert præparat henstod ved stuetemperatur i 2 uger 35 hvorefter det blev rekonstitueret og dets β-Gal-aktivitet mål tes. Det omsattes med 4-metylumbelliferyl^-D-galaktopyrano-
DK 159276B
51 sid ved 25°C i 10 minutter. Resultater fremgår af tabel 5.
Tabel 5
Sukker eller sukkeralkohol ' Enzymatisk aktivitet* (a) Arabinose 87 5 Xylose 79
Xylitol 79
Ribose 76
Glukose 86
Sorbitol 88 10 Fruktose 84
Mannose 84
Mannitol 93
Inositol 95
Rhamnose 86 15 Sakkarose 96
Maltose 83
Cellobiose 82
Trehalose 88
Gentiobiose 85 20 Raffinose 91
Maltotriose 82 (b) Ej tilsat 8 x Relative værdier med oprindelig aktivitet ansat til 100.
Det ses af ovenstående resultater at de præparater 25 der er rekonstitueret fra lyofilisaterne af (3-Gal-holdige vandige præparater å) alle udviser enzymatiske aktiviteter der ikke er under 76% af den oprindelige aktivitet. På den anden side har det præparat der er rekonstitueret fra det β-Gal-holdige vandige præparat b) en enzymatisk aktivitet der kun 30 er på 8% af den oprindelige aktivitet.
Eksempel 6
Det pancreatiske glukagon-C-terminale fragmentpeptid (21-29)-β-Gal-konjugat (offentliggjort europæisk patentansøgning nr. 9147) opløses i vandige opløsninger af følgende puf-
DK 159276 B
52 fere a) og b). Koncentrationen af β-Gal i begge opløsningerne var 100 nm/ral.
a) 0,05M fosfatpuffer (pH 7,0) indeholdende 5%v/r sakkarose, 0,2% okse serumalbumin og 0,001M MgC^.
5 b) Samme puffer som ovenfor med den forskel at der ikke var slikker til stede.
Begge de ovennævnte vandige præparater indeholdende β-Gal blev frosset ved -40°C og derefter frysetørret ved 10°C og = 10 mm Hg. Det frysetørrede præparat skylledes godt med 10 nitrogengas og indelukkedes hermetisk i nitrogenatmosfære.
Dette lyofilisat opbevaredes ved 10°C.
Efter 20 uger lukkedes lyofilisatet op. Den enzymatiske aktivitet af et præparat rekonstitueret fra lyofilisat a) var i det væsentlige det samme som den oprindelige aktivitet. En 15 fortynding (100 yl) af denne væske (der havde en forudbestemt passende enzymatisk aktivitet på ca. 10 μΕ/ml) blandedes med 100 μΐ af en varierende fortynding af antiserum (N6E: offentliggjort europæisk patentansøgning nr. 9147), 50 μΐ "Antago-san'r (100000 enheder/ml) og 250 μΐ bestemmelsespuffer (0,02M 20 fosfatpuffer (pH 7,3) indeholdende 0,5% humant serumalbumin og 0,5% ætylendiamintetraacetat-dinatrium^^O, 0,1% NaN^ og 0,1M NaCl). Blandingen holdtes på en temperatur på 5°C på 24 x 4 timer hvorved den enzymatiske aktivitet i den vandige rekonstituerede β-D-galaktosidase-holdige præparat blev bundet 25 til antiserumet. Derefter tilsattes der 100 μΐ af en 5%s suspension af antikanin-IgG-antistof-cellulose-konjugat og reaktionen gennemførtes yderligere ved 30°C i 4 timer. Denne reaktionsblanding centrifugeredes, sedimentet vaskedes og suspenderedes i 500 μΐ af en substratopløsning (20 μg/ml 4-metylum-30 belliferyl^-D-galaktopyranosid i 0,01M fosfatpuffer (pH 7,0) indeholdende 0,1% okseserumalbumin, 0,1% NaN^, 0,1M NaCl og 1 mM MgC^)· Reaktionen gennemførtes ved stuetemperatur natten over. Efter denne reaktion måltes den fluorescens-intensitet af 4-metylumbelliferon, der var frigivet ved enzymatisk hydro-35 lyse, idet målingen skete ved en excitations-bølgelængde på 365 nm og en fluorescens-bølgelængde på 450 nm.
Bestemmelsen af pancreatisk glukagon i prøvevæsken udførtes på følgende måde. Den ovennævnte forudbestemte fortyn-
DK 159276 B
53 ding af antiserum (100 μΐ) og 100 μΐ af det β-D-galaktosidase-holdige vandige præparat sattes til en blanding af 50 μ1 af prøvevæsken, 50 μΐ "Antagosan” og 200 μΐ af bestemmelsespufferen, hvorpå der fulgtes samme procedure som beskrevet oven-5 for for at bestemme titeren af PG.
Fig. 9 viser resultaterne af EIA ved den konkurrerende bindingsmetode der er beskrevet ovenfor. I fig. 9 betegner -o- de resultater der opnåedes med det præparat som var dannet ved rekonstitution fra lyofilisat a)? -·- viser resultaterne 10 med det β-Gal-holdige præparat, der ikke havde været underkastet frysetørring. Det ses af fig. 9 at det præparat som vindes ved rekonstitution af lyofilisat a) giver resultater som er identiske med dem som opnås med det ikke-lyofiliserede β-Gal-præparat. Det præparat der vindes ved rekonstitution af • 15 lyofilisat b) viser en enzymatisk aktivitet på ikke over 0,1% af den oprindelige aktivitet og kan ikke bruges til EIA.
Eksempel 7
Konjugatet af det hCG^-C-terminale fragmentpeptid
mt V
(130-145) (peptid II) og β-Gal, fremstillet i referenceeksempel 8, behandledes på den i eksempel 6 beskrevne måde til fremstilling af lyofilisater a) og b).
Efter 16 uger blev pakningerne med disse to lyofilisa-ter lukket op. Den enzymatiske aktivitet af det præparat som vandtes ved rekonstituering af lyofilisat å) var i det væsentlige den samme som dets oprindelige aktivitet. En forudbestemt fortynding (100 μ1)3ί denne væske, der havde en forudbestemt passende enzymatisk aktivitet på ca. 20 μΕ/ml, blev blandet 2Q med 100 μΐ af en varierende fortynding af antiserum (det specifikke anti-hCG-antistof) og 300 μΐ bestemmelsespuffer (0,02M fosfatpuffer pH 7,3 indeholdende 0,5% humant serumalbumin, 0,5% ætylendiamintetraacetat-dinatrium,2H20, 0,1% NaN^ og 0,1M NaCl), og blandingen henstod ved 5°C i 48 timer hvorved den enzymatiske aktivitet af β-D-galaktosidase blev bundet til an-tiserumet. Derefter tilsattes der 100 μΐ af en 2,5%s suspension af antikanin-IgG-antistof-cellulosekonjugat og reaktion-nen gennemførtes yderligere ved 20°C i 4 timer. Denne blanding
DK 159276B
54 centrifugeredes og sedimentet og suspenderes i 500 μΐ af en substratopløsning (20 yg/ml 4-metylumbelliferyl-p-D-galakto-pyranosid opløst i 0,02M fosfatpuffer (pH 7,0) indeholdende 0,1% okseserumalbumin, 0,1% NaN^r 0,1M NaCl og 1 mM MgC^).
5 Reaktionen gennemførtes ved stuetemperatur natten over. Derefter måltes fluorescensintensiteten for frigivet 4-metylum-belliferon ved enzymatisk hydrolyse,' idet målingen skete ved excitations-bølgelængden 365 nm og fluorescens-bølgelængden 450 nm.
10 Titeren af hCG i en prøvevæske bestemtes på følgende måde. Ovennævnte forudbestemte antiserumfortynding (100 μΐ) og det β-D-galaktosidaseholdige vandige præparat (100 μΐ) sattes til en blanding af 50 μΐ prøvevæske og 250 μ.1 bestemmelsespuffer, og der udførtes den samme bestemmelsesprocedure 15 som beskrevet foran.
Fig. 10 viser resultaterne af EIA gennemført ved denne konkurrerende bindingsmetode. I fig. 10 viser -o- de resultater der opnåedes med præparatet rekonstitueret fra lyofilisat a) og -·- viser resultaterne med det ikke-lyofiliserede β-Gal-20 holdige vandige præparat. Det ses at præparatet fra lyofilisat a) giver resultater der er sammenlignelige med dem der kan opnås med det ikke-lyofiliserede β-Gal-holdige vandige præparat. Det præparat der er rekonstitueret fra lyofilisatet b) viser en enzymatisk aktivitet der svarer til kun en smule over 10% 25 af den oprindelige aktivitet, og kan ikke bruges til EIA.
Eksempel 8
Det i referenceeksempel 5 fremstillede hCG-ft-Gal-konj u-gat behandledes på den måde der er beskrevet i eksempel 6 til frembringelse af lyofilisater a) og b).
30 Efter 20 ugers forløb blev begge lyofilisater rekonsti tueret. Den enzymatiske aktivitet af præparatet fra lyofilisat a) var ikke meget anderledes end den oprindelige værdi.
Fig. 11 viser resultaterne af hCG målt ved EIA i det konkurrerende bindingssystem. I fig. 11 viser kurven med -o-35 resultater med præparatet fra lyofilisat a), mens kurven med -·- viser resultater med det β-Gal-holdige vandige præparat.
Det ses således af fig. 11 at det præparat der er rekonstitue-
DK 159276 B
55 ret fra lyofilisat a) giver bestemmelsesresultater der er identiske med dem der kan opnås med det ikke-lyofiliserede β-Gål-holdige præparat. Præparatet fra lyofilisat b) har en enzymatisk aktivitet på ikke over 10% af den oprindelige aktivitet 5 og kan ikke bruges til EIA.
Eksempel 9
Konjugatet af β-adrenergt lægemiddel (trans-5-hydroxy-metyl-6-hydroxy-2-isopropylamino-l,2,3,4-tetrahydronaftalen-l-ol) og β-Gal (Immunopharmacology, bind 1, side 3, 1979) 10 behandledes på den måde der er beskrevet i eksempel 6 til frembringelse af lyofilisatet a) og b).
Efter 12 uger blev begge lyofilisaterne rekonstitueret. Den enzymatiske aktivitet af præparatet fra lyofilisat a) var praktisk talt identisk med den oprindelige aktivitet.
15 Fig. 12 viser resultater af EIA af det β-adrenerge læ gemiddel ved den konkurrerende bindingsmetode som er beskrevet i eksempel 13. I fig. 12 repræsenterer kurven -o- de resultater der blev opnået med præparatet fra lyofilisat a) og -o- gengiver de resultater der opnåedes med det ikke-lyofili-20 serede β-Gal-holdige vandige præparat. Præparatet fra lyofilisat a) gav resultater der var identiske med dem der kan opnås med det ikke-lyofiliserede β-Gal-holdige vandige præparat. Præparatet ud fra lyofilisatet b) havde en enzymatisk aktivitet der var så lav som ikke over 10% af den oprindelige akti-25 vitet, og det kan ikke bruges til EIA.
Eksempel 10
Det anti-hCG-antistof-3-Gal-konjugat, der fremstilledes ifølge referenceeksempel 6, behandledes på den måde der er beskrevet i eksempel 6 og gav lyofilisater a) og b).
30 Efter 23 uger blev disse lyofilisater rekonstitueret.
Den enzymatiske aktivitet af præparatet dannet ud fra lyofilisat a) var praktisk talt ikke anderledes end den oprindelige værdi.
DK 159276 B
56
Eksempel 11
Et konjugat af anti-humant XgG-antistof (Miles Laboratories, USÅ) og β-Gal (Journal of Immunology 116, 1554, 1976) blev behandlet på den måde der er beskrevet i eksempel 5 6 til frembringelse af lyofilisater a) og b).
Efter 12 uger blev disse lyofilisater rekonstitueret.
Den enzymatiske aktivitet af det præparat der dannedes ud fra lyofilisat a) var i alt væsentligt uændret i forhold til den oprindelige værdi.
10 Eksempel 12
Det i henhold til referenceeksempel 6 fremstillede konjugat af anti-hCG-antistof og β-Gal blev behandlet på den i eksempel 12 beskrevne måde,dog med den forskel at 5% v/r sakkarose i puffer a) udskiftedes med 3% v/r laktose eller galak-15 tose til frembringelse af lyofilisatet a) og b).
Efter 23 uger blev lyofilisaterne rekonstitueret. Den enzymatiske aktivitet af det præparat der var rekonstitueret ud fra det laktoseholdige eller galaktoseholdige lyofilisat (a) udviste overhovedet ingen ændring.
20 Eksempel 13
Koncentrationen af hCG i urin eller serum fra en normal person og fra en gravid kvinde blev målt på følgende måde under anvendelse af det nedenfor beskrevne hCG-enzym-immunbe-stemmelsessæt. Resultaterne er vist i tabel 6. hCG-Enzym-immun-25 bestemmelsessættet består af: 1) Den del af det specifikke anti-humane chorio-gonadotro-pin-antistof, vundet i henhold til eksempel 1, der binder ca.
40% af den enzymatiske aktivitet af peptid (I)-β-D-galaktosi-dase-konjugat, sat til reaktionssystemet.
30 2) Den del af peptid (ΙΪ)-β-D-galaktosidase-konjugatet som har en enzymatisk aktivitet på ca. 0,4 μΕ.
3) Fra 0 til 100 IE standard humant chorio-gonadotropin.
4) 0,02M fosfatpuffer indeholdende 0,15M NaCl, 0,5% humant serumalbumin, 0,5% EDTA og 0,1% NaN^, der bruges til for-
DK 159276 B
57 tynding af ovennævnte reagenser 1) til 3) og prøvevæske.
5) En 2,5% v/r suspension af anti-kanin-lgG-cellulosekom-plex.
6) 10 yg 4-metylumbelliferyl-3-D-galaktosid.
5 7) 0,02M fosfatpuffer (pH 7,0) indeholdende 0,1M NaCl, 1 mM MgC^, 0,1% okseserumalbumin og 0,1% NaN^, der bruges til vask af cellulosen (5) og til opløsning af substratet (6).
8) 0,1M karbonatpuffer, pH 10,5.
1 o Fremgangsmåde;
Til 100 yl reagens 1) sattes der 250 yl reagens 4) og 50 yl af enten standard humant chorio-gonadotropin eller den til bestemmelse værende prøve, efterfulgt af tilsætning af 100 yl reagens 2). Blandingen henstod til reaktion ved 4°C i 75 40 timer. Derefter tilsattes der 100 yl reagenssuspension 5), og efter omhyggelig omrøring fortsattes reaktionen ved 20°C i 4 timer. Derpå vaskedes cellulosen med reagens 7) og så tilsattes der 500 yl reagens 6) for at igangsætte den enzymatiske reaktion. Denne reaktion gennemførtes ved 20°C i 16 timer, 20 og ved afslutningen af dette tidsrum bragtes reaktionen til afslutning med 3 ml reagens 8). Intensiteten af fluorescensen i reaktionssysternet måltes for at bedømme koncentrationen af humant chorio-gonadotropin i prøvevæsken. Resultaterne fremgår af tabel 6.
25
Tabel 6
Prøve Titer af hCG
______(mIE/ml)_
Normal menneskeurin 1 26 ™ 2 <3 30 -
Urin fra gravid kvinde 1 2.800 2 >100.000
Normalt menneskeserum 1 16 2 <3 35 3 4 4 <3 _5_11
DK 159276 B
58
Tabel 6 (fortsat)
Prøve Titer af hCG
_(mIE/ml)_
Serum fra gravid kvinde 1 28.000 5 2 18.800 _3_ 49.200
Serum fra kvinder der 1 210 har fået pergonale meno- 0 ...
tropiner og hCG
10 3 250 4 80 5 40 6 92 7 400 15 _8_325
Serum fra gravid kvinde 1 195 i tidligt stadium 2 130 3 115 4 270 20 _5_280
Eksempel 14
Koncentrationen af hCG i urin eller serum fra en nor-25 mal person og fra en gravid kvinde måltes på følgende måde ved hjælp af det nedenfor beskrevne hCG-enzym-immunbestemmel-sessæt. Resultaterne er vist i tabel 7.
hCG-enzym-immunbestemmelsessættet består af: 1) Den ifølge eksempel 1 vundne portion af det specifikke 30 anti-humane chorio-gonadotropin-antistof, som binder ca. 40% af den enzymatiske aktivitet af peptid (i)-β-D-galaktosidase-konjugatet sat til reaktionssystemet.
2) Den portion af det i henhold til eksempel 13 vundne lyofilisat af peptid (II)-β-D-galaktosidase-konjugat, der 35 har en enzymatisk aktivitet på ca. 0,4 μΕ.
3) Fra 0 til 100 IE standard humant chorio-gonadotropin.
4) 0,02M fosfatpuffer indeholdende 0,15M NaCl, 0,5% humant serumalbumin, 0,5% EDTA og 0,1% NaN^, der bruges til for-
DK 159276B
59 tynding af ovennævnte reagenser 1) til 3) samt prøvevæsken.
5) En 2,5% v/r suspension af anti-kanin-IgG-cellulosekom-plex.
6) 10 yg 4-metylumbelliferyl-3-D-galaktosid.
5 7) 0/02M fosfatpuffer (pH 7,0) indeholdende 0,1M NaCl, 1 mM MgC^* 01% okseserumalbumin og 0,1% NaN^/ <^er bruges til vask af cellulosen (5) og til opløsning af substratet (6).
8) 0,1M karbonatpuffer, pH 10,5.
EIA-fremgangsmåden gennemførtes i overensstemmelse 1 o med den fremgangsmåde der er beskrevet i eksempel 13, og resultaterne er vist i tabel 7.
Tabel 7
Prøve Titer af hCG (mIE/ml) 15 Normal menneskeurin 1 26 _2_<3_
Urin fra gravid kvinde 1 2.800 2 >100.000 2Q Normalt menneskeserum 1 16 2 <3 3 4 4 <3 __5_11_ 25 Serum fra gravid kvinde 1 28.000 2 18.800 3 49.200
Serum fra gravid kvinde 1 61 på tidligt stadium 2 54 30 3 285 4 185 5 76
Serum fra kvinde der har 1 54 fået en mol ekstraheret 0 on 35 2 80 3 41 4 100 _ 5_265_

Claims (10)

1. Fremgangsmåde til isolering af specifikke antistoffer, kendetegnet ved at man bringer et på en 5 bærer uopløseliggjort peptid, der har en struktur som er enestående for et peptid-antigen, i kontakt med en legemsvæske som indeholder det specifikke antistof der er reaktivt over for nævnte antigen, hvorpå man eluerer det således absorberede antistof.
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved at det specifikke antistof er et anti-humant chorio-gona-dotropin-antistof og fremstilles ved at et peptid med formlen .jtj H-R^-Pro-Ser-Asp-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln-OH, I hvor R^ er et peptidfragment bestående af 1-14 aminosyrere- 12 3 ster inklusive Gly i 14-stillingen i peptidet Ala -Pro -Pro -Pro4-Ser5-Leu6-Pro7-Ser8-Pro9-Ser10-Arg11-Leu12-Prol3-Gly'1'4, 2q uopløseliggjort på en bærer, bringes i kontakt med en legemsvæske indeholdende et anti-humant chorio-gonadotropin-antistof, hvorefter det således absorberede anti-humane chorio-gonadotropin-antistof elueres.
3. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet 25 ved at peptidet er H-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro- Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Ser-Asp-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln-OH.
4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved at det specifikke antistof er pancreatisk glukagon-anti-stof og fremstilles ved at man bringer et på en bærer uoplø- 3q seliggjort peptid med formlen H-R2-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-R3-Asn-Thr-OH 11 2 hvor R er et peptidfragment med 1-10 aminosyrerester inklusi- 1 2 3 4 5 6 oc ve Asp i 10-stillingen af β-Ala -Tyr -Leu -Asp -Ser -Arg - 33. o q i n o Arg -Ala -Gin -Asp , og R er Met eller Nle, i kontakt med en legemsvæske indeholdende et anti-pancreatisk glukagon-an- DK 159276 B 61 tistof og derefter eluerer det således absorberede anti-pancreatiske glukagon-antistof.
5 Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH.
5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved at peptidet er H-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-
6. Fremgangsmåde til enzym-immunbestemmelse under anvendelse af et antistof som reagens, kendetegnet ved at man som antistof bruger et antistof, der er isoleret i henhold til krav 1 ved at et på en bærer uopløselig- 10 gjort peptid, der har en struktur som er enestående for et peptid-antigen, er bragt i kontakt med en legemsvæske indeholdende et antistof som er reaktivt over for nævnte antigen og det således absorberede antistof derpå er elue- ret.
7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved at antistoffet er pancreatisk glukagon-antistof og isoleret ved at et på en bærer uopløseliggjort peptid med formlen
20 H-R2-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-R3-Asn-Thr-OH, II 2 hvor R er et peptidfragment med 1-10 aminosyrerester inklusive Asp i 10-stillingen i 3-Ala^-Tyr2-Leu3-Asp^-Ser3-Arg^-789 10 3 Arg -Ala -Gin -Asp - og R er Met eller Nle, og bragt i kon-25 takt med en legemsvæske indeholdende et anti-pancreatisk glukagon-antistof, hvorpå det således absorberede anti-pancreatiske glukagon-antistof er elueret.
8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved at peptidet er H-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-
30 Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH.
9. Fremgangsmåde ifølge krav 6 til enzym-immunbestemmelse af humant chorio-gonadotropin under anvendelse af antistoffet som reagens i en tilstand hvor det er konjugeret med et mærkningsenzym, kendetegnet ved at 35 peptidet er det i krav 2 angivne peptid med den almene formel i 62 DK 159276 B H-R-Pro-Ser-Asp-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln-OH I hvor R er et peptidfragment indeholdende 1-14 aminosyre- 1 2 rester inklusive Gly i 14-stillmgen i peptidet Ala -Pro -5 Pro3-Pro4-Ser5-Leu6-Pro7-Ser8-Pro9-Ser1°-Arg11-Leu12-Pro13- Gly14.
10 15 20 25 30 35
DK137181A 1980-03-31 1981-03-26 Fremgangsmaade til isolering af specifikke antistoffer og enzym-immunbestemmelsesmetode med anvendelse af det isolerede antistof DK159276C (da)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP4248480 1980-03-31
JP4248480A JPS56138248A (en) 1980-03-31 1980-03-31 Enzyme immunity measuring method of artificial woolen gonadotropine
JP8046780A JPS576363A (en) 1980-06-13 1980-06-13 Production of specific antibody
JP8046780 1980-06-13
JP450781A JPS57118790A (en) 1981-01-14 1981-01-14 Freeze-dried substance containing beta-d-galactosidase
JP450781 1981-01-14

Publications (3)

Publication Number Publication Date
DK137181A DK137181A (da) 1981-10-01
DK159276B true DK159276B (da) 1990-09-24
DK159276C DK159276C (da) 1991-02-18

Family

ID=27276313

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DK137181A DK159276C (da) 1980-03-31 1981-03-26 Fremgangsmaade til isolering af specifikke antistoffer og enzym-immunbestemmelsesmetode med anvendelse af det isolerede antistof

Country Status (5)

Country Link
US (1) US4517290A (da)
EP (1) EP0037110B1 (da)
CA (1) CA1162848A (da)
DE (1) DE3173597D1 (da)
DK (1) DK159276C (da)

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3174064D1 (en) * 1980-10-15 1986-04-17 Takeda Chemical Industries Ltd Method for immunochemical assay and kit therefor
FR2516078B1 (fr) * 1981-11-12 1985-07-12 Toyo Jozo Kk Nouveau peptide du type gonadotropine chorionique humaine
DK76983A (da) * 1982-03-05 1983-09-06 Takeda Chemical Industries Ltd Fremgangsmaade og reagens til immunkemisk bestemmelse af humant choriogonadotropin
US4543339A (en) * 1982-03-16 1985-09-24 Oneill Christopher Early pregnancy detection by detecting enhanced blood platelet activation
JPS5990054A (ja) * 1982-11-15 1984-05-24 Takeda Chem Ind Ltd ヒト絨毛性ゴナドトロピンの免疫化学的測定法および試薬
US4508643A (en) * 1983-02-08 1985-04-02 Baxter Travenol Laboratories, Inc. Rat antibody to hCG
FR2550799B1 (fr) * 1983-08-17 1986-02-21 Commissariat Energie Atomique Compose marque par une enzyme, son procede de preparation et son utilisation en enzymoimmunologie
US5120653A (en) * 1985-04-08 1992-06-09 Microgenics Corporation Vector comprising DNA sequence coding for enzyme-donor polypeptide
GB8500698D0 (en) * 1985-01-11 1985-02-13 Unilever Plc Preparation of reagents
WO1986006742A1 (en) * 1985-05-07 1986-11-20 California Biotechnology Inc. Fused proteine for enzyme immunoassay system
US4745055A (en) * 1985-05-07 1988-05-17 California Biotechnology Inc. Fused protein for enzyme immunoassay system
US4931385A (en) * 1985-06-24 1990-06-05 Hygeia Sciences, Incorporated Enzyme immunoassays and immunologic reagents
US4844895A (en) * 1985-11-01 1989-07-04 New York University Composition containing a peptide fragment of platelet factor four and method for restoring suppressed immune responses
FR2623715B1 (fr) * 1987-11-26 1990-12-21 Lafon Labor Structures peptidiques, immunogenes les contenant et leurs applications au controle de la fertilite
KR910003092A (ko) * 1988-07-20 1991-02-26 챨스 엠. 브록 항체 정제 방법에 사용하기 위한 hcg펩티드
GB8927365D0 (en) * 1989-12-04 1990-01-31 Ici Plc Reagent
US5270057A (en) * 1990-03-20 1993-12-14 Akzo N.V. Stabilized gonadotropin containing preparations
US6632613B1 (en) * 1993-06-02 2003-10-14 University Of Utah Research Foundation Compositions and kits for fluorescence polarization assay of large molecules
US5602264A (en) * 1994-11-28 1997-02-11 The Regents Of The University Of California Highly reactive, water soluble carbodiimides, intermediates and derivatives thereof
US5985593A (en) * 1996-10-11 1999-11-16 Integrated Research Technology, L.L.C. Compositions and methods for enzymatic decontamination
US20010023070A1 (en) * 1998-05-29 2001-09-20 Reinhard Ebner Interleukins-21 and 22
US6689566B1 (en) 1999-01-14 2004-02-10 Scantibodies Laboratory, Inc. Methods, kits, and antibodies for detecting parathyroid hormone
US7820393B2 (en) * 1999-01-14 2010-10-26 Scantibodies Laboratory, Inc. Methods, kits and antibodies for detecting parathyroid hormone
US6821738B2 (en) * 1999-01-20 2004-11-23 The Board Of Regents For Oklahoma State University Broad spectrum bio-detection of nerve agents, organophosphates, and other chemical warfare agents
US7632929B2 (en) * 2000-04-20 2009-12-15 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Methamphetamine-like hapten compounds, linkers, carriers and compositions and uses thereof
US20040096893A1 (en) * 2000-11-16 2004-05-20 Rabah Boukherroub Functionalised silicon surfaces, and method for their production
CN1306029C (zh) * 2001-07-02 2007-03-21 旭化成制药株式会社 稳定碱性磷酸酶的方法
GB0625671D0 (en) * 2006-12-21 2007-01-31 Oxford Biosensors Ltd Protein formulation
EP2140263B1 (en) * 2007-04-20 2017-01-04 The Board of Trustees of The University of Arkansas Hapten compounds and compositions and uses thereof
WO2012142659A1 (en) * 2011-04-19 2012-10-26 Baker Idi Heart And Diabetes Institute Holdings Limited Site-selective modification of proteins
CN104114183A (zh) * 2011-12-20 2014-10-22 印第安纳大学研究及科技有限公司 用于治疗糖尿病的基于ctp的胰岛素类似物
US9023353B2 (en) 2013-03-13 2015-05-05 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Anti-(+)—methamphetamine monoclonal antibodies

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US29169A (en) * 1860-07-17 Improvement in gang-plows
US3133001A (en) * 1959-11-26 1964-05-12 Muset Pedro Puig Stabilization of enzymes
USRE29169E (en) 1971-02-10 1977-04-05 Akzona Incorporated Process for the demonstration and determination of reaction components having specific binding affinity for each other
DE2311809B2 (de) * 1973-03-09 1974-12-19 Siemens Ag, 1000 Berlin Und 8000 Muenchen Stecker
JPS54895A (en) * 1977-06-03 1979-01-06 Sharp Corp Tuning fork type piezoelectric oscillator
JPS5781447A (en) * 1980-11-11 1982-05-21 Toyo Jozo Co Ltd Human chorionic gonadotropic hormone c-terminal fragment

Also Published As

Publication number Publication date
EP0037110B1 (en) 1986-01-29
CA1162848A (en) 1984-02-28
DK159276C (da) 1991-02-18
DE3173597D1 (en) 1986-03-13
EP0037110A2 (en) 1981-10-07
EP0037110A3 (en) 1982-08-04
US4517290A (en) 1985-05-14
DK137181A (da) 1981-10-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK159276B (da) Fremgangsmaade til isolering af specifikke antistoffer og enzym-immunbestemmelsesmetode med anvendelse af det isolerede antistof
US4496658A (en) Method for enzyme immunoassay and production of antibody
EP0111216A2 (en) Method for enzyme immunoassay and peptide-enzyme conjugate, its lyophilizate, antibody and kit therefor
Fuks et al. Carcinoembryonic antigen (CEA): Molecular biology and clinical significance
Cochrane et al. Polymorphonuclear leukocytes in immunologic reactions: the destruction of vascular basement membrane in vivo and in vitro
Grimmelikhuijzen et al. Gastrin/CCK-like immunoreactivity in the nervous system of coelenterates
Gregory et al. Aminoacid constitution of two gastrins isolated from Zollinger-Ellison tumour tissue
Spirer et al. Radioimmunoassay of the phagocytosis‐stimulating peptide tuftsin in normal and splenectomized subjects
Scott et al. Purification and characterization of porcine corticotrophin-like intermediate lobe peptide
SUZUKI et al. Purification of bovine bradykininogen
WO1997012913A1 (en) Tumor derived carbohydrate binding protein
US4725557A (en) Production of fucosyl antigens and antibodies for recognizing same determination of cancer associated carbohydrate linkage using same and kit for the determination
EP0421392B1 (en) Anti-hCG-beta core monoclonal antibody, its production and use
US5451527A (en) HCG peptides for use in antibody purification procedures
Jamaluddin et al. A comparison of kinetic parameters of polypeptide substrates for protein methylase II
Ravid et al. Grafting of triggering sites onto lymphocytes. Requirement of multivalency in the stimulation of dinitrophenyl‐modified thymocytes by anti‐dinitrophenyl antibody
Leung et al. Colonic tumor membrane-associated glycoprotein: Isolation of antigenically-active peptides after chemical cleavage
JPH0136065B2 (da)
Atkins et al. Studies on the structure and distribution of immunoglobulin A-containing cells in the gut of the pig.
JPH0218836B2 (da)
JPS6311626B2 (da)
JPS6341424B2 (da)
GOTTSCHALK et al. Immunological properties of ovine submaxillary glycoprotein
JPS6362698B2 (da)
JPH0249162A (ja) がんの血清測定法