DK161169B - Fremgangsmaade og reagens til specifik bestemmelse af pankreas-alfa-amylase - Google Patents
Fremgangsmaade og reagens til specifik bestemmelse af pankreas-alfa-amylase Download PDFInfo
- Publication number
- DK161169B DK161169B DK336586A DK336586A DK161169B DK 161169 B DK161169 B DK 161169B DK 336586 A DK336586 A DK 336586A DK 336586 A DK336586 A DK 336586A DK 161169 B DK161169 B DK 161169B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- amylase
- salivary
- monoclonal antibody
- pancreatic
- enzyme
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/40—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving amylase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/81—Packaged device or kit
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
DK 161169 B
i
Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til specifik bestemmelse af pankreas-a-amylase i nærværelse af spyt-a-amy-lase.
5 a-amylase (E.C.2.3.1.1.) nedbryder 1,4-d-glycosidisk bundne oligo- og polysaccharider, overvejende ved tilfældig hydrolyse af de 1,4-oc-glycosidiske bindinger til maltose og malto-oligosaccharider. Enzymet har ud over den industrielle fer-10 menteringsteknik betragtelig betydning inden for rammerne af den kliniske analytik og diagnostik. Ved talrige sygdomme forandres nemlig a-amylaseindholdet betragteligt i legemsvæsker, såsom serum, urin eller duodenalsekret. I legemet forekommer der imidlertid i det væsentlige to a-amylaseenzymer, j5 pankreasenzymet og spytenzymet. Da kun pankreasenzymet har diagnostisk betydning, fremkommer der den opgave at differentiere analytisk mellem disse to (ud over sjældne og kun i ringe mængde optrædende yderligere isoenzymer) a-amylaser. Vanskeligheden består herved i, at de to multiple former ligner 2o hinanden i opbygning og er immunologisk identiske (K. Lorentz,
Laboratoriumsblatter 32:118 (1982)). Til eliminering af spyt-enzymets aktivitet er det kendt at anvende adsorption til anionbyttere, hæmning med et hvedeprotein eller elektrofo-rese eller elektrofokusering. Disse fremgangsmåder er imid-25 lertid enten utilfredsstillende i deres adskillelsesvirkning eller for dyre til en rutinediagnostik. Blandt de kendte metoder er alene den i Clin. Chem. 28/7, 1525-1527 (1982) beskrevne fremgangsmåde til hæmning af enzymet af spyttypen ved hjælp af en fra hvedekim vunden inhibitor forbundet med 30 et til rutinediagnose acceptabelt tidsforbrug, men selekti viteten er utilfredsstillende. Også ved den optimale inhibitorkoncentration bibeholdes ca. 13% af spyttypeenzymets aktivitet, mens pankreasenzymets aktivitet formindskes til ca. 81%.
35 I det europæiske offentliggørelsesskrift nr. 150309 foreslås allerede at bestemme pankreas-a-amylase, når den er til stede
DK 161169 B
2 sammen med spyt-a-amylase, idet man arbejder i nærværelse af et monoklont antistof, som reagerer med spyt-a-amylase og herved udviser en krydsreaktivitet på 5% eller mindre over 5 for pankreas-a-amylase. Med dette monoklone antistof er det ved tilsætning af et præcipiterende middel også muligt at danne et uopløseligt kompleks med spyt-cc-amylasen, som man kan fraskille fra opløsningen, således at kun pankreasenzy-met bliver tilbage i opløsningen og kan bestemmes der. Al-10 ternativt er det muligt at anvende det monoklone antistof i immobiliseret form og på denne måde fraskille spyt-amyla-sen. I begge tilfælde er det imidlertid nødvendigt at danne en uopløselig fase og at skille den fra den opløselige fase.
I DE A-l 35 00 526.2 beskrives derudover en fremgangsmåde 1 o af den angivne art, ved hvilken der i stedet for det bindende monoklone antistof fra den nævnte europæiske patentansøgning anvendes et monoklont antistof, som specifikt hæmmer spyt-isoenzymet. Herved opnås ganske vist en yderligere for-2q bedring af a-amylase-isoenzymbestemmelsen, uden at man herved skal foretage en faseadskillelse, men den maksimalt opnåede hæmning af spytenzymet var imidlertid mindre end 97%, således at man stadig har en uønsket stor unøjagtighed ved bestemmelsen.
25
Formålet med den foreliggende opfindelse er derfor at fjerne denne ulempe og tilvejebringe en fremgangsmåde og et reagens, som muliggør en hurtigere og mere enkel men også mere nøjagtig bestemmelse af pankreas-a-amylase i nærværelse af a-amy-30 lase af spyttypen i legemsvæsker.
Formålet opnås ifølge opfindelsen ved en fremgangsmåde til specifik bestemmelse af pankreas-a-amylase i nærværelse af spyt-a-amylase i legemsvæsker, især i serum, plasma, duode-35 nalsaft eller urin ved omsætning med et system til påvisning af a-amylase i nærværelse af et monoklont antistof, der inhi-berer spyt-a-amylase, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man som inhibitor anvender et første monoklont antistof, \ 3
DK 161169 B
der hæmmer spytenzymet til mindre end 97%, i kombination med et andet monoklont anti-spyt-a-amylaseantistof, der hæmmer dette enzym til mindre end 10%.
5
Til opfindelsen egner sig især hæmmende antistoffer med <93% hæmning som første monoklone antistof og bindende antistoffer med <, 5% hæmning af spytenzymet som andet monoklone antistof. Som nedre grænseværdi for hæmningen skal anses ca. 70%,
Iq fortrinsvis 80%, for i kombinationen ifølge opfindelsen at opnå en hæmning på over 97%.
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen beror på den meget overraskende iagttagelse, at den inhiberende virkning af et mono-15 klont antistof, som ikke hæmmer spytenzymet fuldstændigt til fredsstillende, forstærkes synergistisk af et udelukkende bindende, men praktisk talt ikke eller fuldstændigt utilstrækkeligt hæmmende monoklont antistof, og at der kan opnås en næsten kvantitativ hæmning af spytenzymet ved 100% bevarelse 2Q af pankreasenzymets aktivitet. Desuden er det muligt således at formindske inkubationstiden væsentligt.
Til fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendes som første monoklone antistof fortrinsvis fra de hos NCACC (National Col-25 lection of Animal Cell Culture, der nu hedder European Collec tion of Animal Cell Culture, Port Down, GB) under numrene (99D12) 84122003 og (89E2) 84122004 deponerede cellekulturer vundne antistoffer. Som andet monoklont antistof anvendes fortrinsvis de i EU-Al 84114172.4 angivne bindende antistoffer 3Q fra de hos ovennævnte NCACC under numrene 84111301, 84111302 deponerede cel lekulturer. Der foretrækkes især NCACC 84111301.
Den respektive nødvendige mængde af første og andet antistof kan til bestemte anti stofpræparater let fastslås ved få for-35 søg. Der anvendes fortrinsvis mindst 5 pg/ml, mere foretruk ket mindst 20 wg/ml af det første monoklone antistof og mindst 1 Mg/ml, mere foretrukket mindst 5 pg/ml af det andet monoklone antistof.
DK 161169 B
4
Monoklone antistoffer, der kan anvendes ifølge opfindelsen, kan opnås ved immunisering af forsøgsdyr med nativ eller modificeret spyt-a-amylase, fusion af B-lymfocytter fra de så-5 ledes opnåede immuniserede dyr med transformerende midler, kloning og dyrkning af de således dannede hybridceller, som producerer de monoklone antistoffer og isolering af sidstnævnte. Særligt egnede dyr til fremstillingen af spyt-a-amylase-anti-stoffer er rotter og mus. Immuniseringen foregår enten med nativ human spyt-a-amylase eller med modificeret spytamylase. Såfremt man anvender nativt enzym, så egner de i handelen værende, elektroforetisk homogene præparater sig hertil. Kemisk modificeret spyt-a-amylase kan ligeledes opnås efter kendte metoder til enzymmodifikation, sådan som de f.eks. j5 er beskrevet nærmere i DE fremlæggelsesskrift nr. 25 43 994.
Egnede modificeringsmidler er f.eks. N-bromsuccinimid (NBS) under oxidation af tryptofangrupper i proteinet (BBA 143 (1967) 462-472), carboxymethylering med jodacetat (IAA), som hovedsageligt angriber histidin eller nitrering med tetranitro-2Q methan (TNM) (J. Biol. Chem. 238 (1963) 3307) samt diazote- ring med diazoteret sulfanilsyre (Meth. Enzymol. 25 (1972) 515-531). Som bedst egnet viste sig derved det med TNM modificerede enzym ved anvendelse af Balb/c-mus eller det native enzym ved anvendelse af Aj-mus.
25
Immuniseringen foregår ved sædvanlig indgift af det native eller modificerede enzym, fortrinsvis i kombination med hjælpestof. Som hjælpestof foretrækkes aluminiumhydroxid sammen med Bordatelle pertussis. Såfremt der til immuniseringen an-3Q vendes nativ spyt-a-amylase i AJ-mus eller TNM-modificeret spyt-a-amylase i Balb/c-mus, så foregår immuniseringen fortrinsvis over mindst 9 måneder med mindst 7 immuniseringer (injektioner i.p.).
3g Efter immuniseringen fusioneres B-lymfocytterne fra de immu niserede dyr efter sædvanlige metoder med transformerende midler. Eksempler på transformerende midler, som kan anvendes 5
DK 161169 B
inden for rammerne af opfindelsen, er myelomaceller, transformerende vira som f.eks. Epstein-Barr-virus eller i tysk offentliggørelsesskrift nr. 32 45 665 beskrevne midler. Fusioneringen foregår efter den kendte metode ifølge Koehler og Mil-5 stein (Nature 256 (1975) 495-497). De herved dannede hybrid celler klones på sædvanlig måde, f.eks. under anvendelse af en i handelen værende cellesorterer, og de opnåede kloner, som danner de ønskede monoklone antistoffer, dyrkes. På grund af hybridcellernes kræftagtige vækst kan disse dyrkes videre på ubestemt tid og producerer de ønskede monoklone antistoffer i ønsket mængde.
Til bestemmelsesmetoden ifølge opfindelsen kan de monoklone antistoffer anvendes som sådanne eller som fragmenter (Fab-frag-15 menter), der udviser tilsvarende immunologiske egenskaber.
Ved begrebet "monoklont antistof" forstås herved derfor også fragmenterne. Såvel det komplette antistof som dets fragmenter kan anvendes i immobiliseret form.
Λ Λ
Bestemmelsen af a-amylasen som sådan foregår efter hidtil kendte metoder. Da kombinationen ifølge opfindelsen af monoklone antistoffer selektivt hæmmer α-amylasen af spyttypen og således udelukker den fra enzymaktivitetsbestemmelsen uden at påvirke pankreasenzymet, svarer de ved a-amylasebestemmelsen 25 i nærværelse af det monoklone antistof opnåede værdier til den aktivitet, der alene skyldes pankreasenzymet.
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen gennemføres fortrinsvis med et system til påvisning af a-amylase, der indeholder en 30 maltopolyose med 4 til 7 glucoserester i molekylet, maltose-phosphorylase, /3-phosphoglucomutase, glucose-6-phosphatde-hydrogenase og NAD.
Et yderligere inden for opfindelsens rammer foretrukket an-35 vendt system til påvisning af α-amylasen består af nitrophe-nylmaltopolyose med 4 til 7 glucoserester i molekylet og a-glu-cosidase.
DK 161169 B
6
Et yderligere foretrukket påvisningssystem til a-amylase består af stivelse, som er modificeret med bestemmelige grupper. Begrebet modificeret stivelse omfatter f.eks. stivelse, som er modificeret med bestemmelige grupper, f.eks. det som 5 "Phadebas" i handelen værende produkt fra firma Pharmacia, Sverige, samt det i DE offentliggørelsesskrift nr. 28 12 154 beskrevne produkt samt i nedbrydningsopførslen forandret stivelse, f.eks. carboxymethylstivelse og grænsedekstriner. Alle disse systemer er kendte og behøver derfor ingen nærmere beskrivelse.
Til gennemførelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen inkuberes prøvevæsken enten først med de antistoffer, der skal anvendes ifølge opfindelsen og anvendes derpå direkte i den 15 sædvanlige amylasetest, eller den tilsættes en blanding af antistofferne og amylasepåvisningsreagens uden substrat og startes efter inkubationen ved hjælp af substrattilsætning. Inkubationsvarigheden afhænger af aktiviteten af det anvendte antistof og andrager fortrinsvis 0,5 til 10, især ca. 5 minut- 20 ter.
Såfremt en fraskillelse af spyt-a-amylasen ser ud til at være ønskelig, kan et af de monoklone antistoffer, såvel i komplet form som i form af fragmenterne, også foreligge fikseret på 25 en fast bærer, f.eks. på immunosorptivt papir eller på overfladen af små plastrør eller -slanger. På denne måde bindes a-amy-lasen af spyttypen til bæreren, altså den faste fase.
Den ved hjælp af opfindelsen opnåede effekt vises ved hjælp 30 af følgende forsøg:
Monoklone antistoffer (MAS), der hæmmer h-SA specifikt til maksimalt 93%, oprenses ved (NH^)2S0^-fældning og DEAE-kroma- tografi efter anvendelige metoder. Ligeledes oprenses et MAS, 35 der specifikt binder h-SA. Det eller de monoklone antistoffer i opløsning forblandes med human amylase, og denne blanding inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur. Derpå sættes denne blanding til amylasereagens, og amylaseaktiviteten måles.
7
DK 161169 B
Som kontrol tjener amylase, der var blevet forblandet med puffer uden monoklone antistoffer. Alternativt bliver det eller de monoklone antistoffer anbragt i en del af amylase-reagenset - α-glucosidaseopløsningen. Derpå tilsættes amy-
R
laseopløsningen, og der inkuberes i 5 minutter. Reaktionen startes med substratet G^PNP (p-nitrophenylmaltoheptaosid).
Som kontrol tjener en glucosidaseopløsning uden monoklone antistoffer. Fig. 1 viser procent restaktivitet af henholdsvis h-SA eller h-PA med og uden bindende MAS som funktion af slut-10 koncentrationen af hæmmende MAS, fastlagt ved substratstart- metoden. I tabel 1 er angivet resultaterne af serumstartmetoden (et eller flere monoklone antistoffer og amylase forblandet).
Tabel 1 15 Hæmning af human spyt- og pankreas-a-amylase ved hjælp af hæmmende MAS NCACC 84122003 (MAS I) eller 84122004 (MAS II) og/eller bindende MAS NCACC 84111301 (MAS III); serumstart-metode, G-PNP som substrat. SA = samlet aktivitet, A = aktivitet 20 med eller eller flere MAS, RA = %restaktivitet.
Amylase SA MAS I MAS II MAS III MAS'er I/II MAS’er II/III
30 pg/ml 25 Mg/ml 5 μq/ml 30/5 μq/ml 25/5 pg/ml 25
ARA ARA ARA ARA ARA
(U/l) (0/1)(%) (U/l)(%) (0/1)(%) (0/1)(%) (0/1)(%)
Spyt 1476 127 8,6 135 9,1 1430 96,9 40 2,7 37 2,5
Pankre- 30 as 1430 1442 100,81428 99,9 1424 99,6 1405 98,2 1426 99,7
Det viser sig ved hjælp af afbildningen og tabellen, at kombinationen af hæmmende, specifikt MAS samt specifikt h-SA-bin-35 dende MAS bevirker en synergistisk forøgelse af hæmningen.
Denne effekt er uafhængig af substratet. Den bliver fundet
DK 161169 B
8 lige så vel ved et højmolekylært substrat (farvet stivelse) som ved kortkædede substrater, f.eks. G^PNP (p-nitrophenyl-maltopentaosid). Også ved substratet eth-G^PNP blev effek-5 ten iagttaget. Også spytamylase i humane sera hæmmes syner- gistisk ved hjælp af de to monoklone antistoffer.
Opfindelsen angår desuden et reagens til specifik bestemmelse af pankreas-oc-amylase i nærværelse af spyt-a-amylase i legems-2Q væsker, især i serum, duodenalsaft, plasma eller urin, inde holdende et system til påvisning af a-amylase og et monoklont antistof mod spyt-a-amylase, hvilket reagens er ejendommeligt ved, at det indeholder et første monoklont antistof, der hæmmer spytenzymet specifikt til mindre end 97%, i kombination j5 med et andet monoklont anti-spyt-a-amylaseantistof, der hæmmer dette enzym til mindre end 10%.
Med hensyn til det i reagenset ifølge opfindelsen indeholdte system til påvisning af α-amylase og de øvrige betingelser 2o gælder de ovenstående udførelsesformer med hensyn til frem gangsmåden på tilsvarende måde.
Opfindelsen muliggør en enkel og særlig hurtig og meget nøjagtig bestemmelse af pankreas-a-amylase (h-PA) i nærværelse 2g af α-amylase af spyttypen (h-SA) i legemsvæsker og forbedrer dermed mulighederne for den kliniske diagnostik betragteligt.
De følgende eksempler belyser opfindelsen yderligere.
30 Eksempel 1 Hæmning af human pankreas- og spyt-a-amylase ved hjælp af 1. MAS (NCACC 84122004) alene og i kombination med 2. MAS (NCACC 84111301), serumstartmetoden.
35 3
Reagenser: Puffer: 100 mM PO^ , 150 mM NaCl, 6 % okseserum-albumin, pH 7,1
DK 161169B
9 amylasereagens: G^PNP (Boehringer Mannheim, Kat.
best. nr. 568589, 37°C)
MAS-1: 0,63 mg/ml 1. MAS i puffer g MAS-2: 0,63 mg/ml 1. MAS og 0,105 mg/ml 2. MAS
i puffer MAS-3: 0,105 mg/ml 2. MAS i puffer h-SA: ca. 3000 U/l (G^PNP) i puffer h-PA: ca. 3000 U/l (GyPNP) i puffer.
10
Forsøg: 100 μΐ h-SA eller h-PA blandes med 100 μΐ puffer eller de forskellige MAS-opløsninger og inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur. Derpå sættes portioner på 25 μΐ af disse blandinger til 1000 μΐ amylaserea-2g gens, der er fortempereret ved 37°C, og amylaseaktivi- teten bestemmes efter vejledningen. Restaktiviten beregnes ud fra følgende formel:
Restaktivitet <%) = aktivitet med MAS'er χ 1Q0 aktivitet uden MAS'er 20
Resultat: De relevante restaktiviteter for h-SA andrager med 1. MAS 8,6%, med 2. MAS 96,9% og med begge MAS'er 2,7%. h-PA-restaktiviteterne andrager tilsvarende 100,1%, 99,6% og 99,7%.
25
Eksempel 2 Hæmning af amylase ved hjælp af 1. MAS (NCACC 84122003) og/eller 2. MAS (NCACC 84111301), serumstartversion.
30
Reagenser: Som i eksempel 1, kun MAS-1 og MAS-2 er ændrede. MAS-1': 0,525 mg/ml 1. MAS i puffer MAS-2': 0,525 mg/ml 1. MAS og 0,105 mg/ml 2. MAS i puffer.
35
Forsøg: Som i eksempel 1, og ligeledes beregningen af % restaktivitet.
Resultat: Restaktiviteterne af h-SA andrager med 1. MAS 9,1%,
DK 161169 B
10 med 2. MAS 96,9% og med begge MAS'er 2,5%. h-PA-rest-aktiviteterne andrager tilsvarende 99,9%, 99,6 % og 99,7%.
5
Eksempel 3 Hæmning af human spyt- og pankreas-a-amylase ved hjælp af 1. MAS (NCACC 84122004) med og uden 2. MAS (NCACC 84111301), substratstartmetode.
Reagenser: Puffer (som i eksempel 1) h-SA (som i eksempel 1) h-PA (som i eksempel 1) 15 MAS-111: 1. MAS i puffer, forskellige koncentra tioner MAS-21': 2. MAS i puffer, 0,513 mg/ml α-glucosidase: fra amylasereagens (Boehringer Mannheim, kat. best. nr. 568589) substrat: G^PNP fra amylasereagens
Forsøg: Til 880 μΐ α-glucosidase sættes 10 μΐ af en MAS-1''-opløsning samt 10 μΐ MAS-2''-opløsning eller 10 μΐ puffer. Dertil blandes 25 μΐ h-PA eller h-SA. Denne 25 blanding inkuberes i 5 minutter ved 37°C. Derpå føl ger starten ved tilsætning af 100 μΐ substratopløs- ning og bestemmelsen af amylaseaktiviteten efter vejledningen. Som kontrol tjener en blanding af a-glu-cosidase med 20 μΐ puffer samt den relevante amylase.
2Q Aktiviteten af MAS(er), divideret med aktiviteten uden MAS'er giver % restaktivitet.
Resultat: Fig. 1 viser % restaktivitet som funktion af slut-koncentrationen af 1. MAS hos h-SA med og uden 2.
35 MAS og hos h-PA kun med 2. MAS.
Claims (15)
1. Fremgangsmåde til specifik bestemmelse af pankreas-a-amyla-5 se i nærværelse af spyt-a-amylase i legemsvæsker, især i serum, plasma, duodenalsaft eller urin, ved omsætning med et system til påvisning af a-amylase i nærværelse af et mono-klont antistof, der inhiberer spyt-a-amylase, kendetegnet ved, at man som inhibitor anvender et første 10 monoklont antistof, der hæmmer spytenzymet specifikt til mindre end 97%, i kombination med et andet monoklont anti-spyt-a-amylaseantistof, der hæmmer dette enzym til mindre end 10%.
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, 1 5 at det første antistof hæmmer spytenzymet til mindre end 93% og det andet antistof til mindre end 5%.
3. Fremgangsmåde ifølge krav eller 2, kendetegnet 20 ved, at man anvender monoklone antistoffer, som opnås ved immunisering af AJ-mus med nativ eller modificeret spyt-a-amylase, fusion af B-lymfocytter fra de immuniserede dyr med transformerende midler, kloning og dyrkning af de således dannede hybridceller og isolering af de monoklone antistof-25 fer fra sidstnævnte.
4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at man som første monoklone antistof anvender NCACC nr. 84122003 eller NCACC 84122004. 30
5. Fremgangsmåde ifølge krav 2 eller 3, kendetegnet ved, at man som andet monoklone antistof anvender NCACC 84111301 eller 84111302.
6. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 2-5, k e n - v O detegnet ved, at man anvender mindst 5 ug/ml af det DK 161169B første monoklone antistof og mindst 1 μ9/πι1 af det andet monoklone antistof.
7. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-6, ken detegnet ved, at man anvender mindst 20 pg/ml af det første monoklone antistof og mindst 5 Mg/ml af det andet monoklone antistof.
8. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de forudgående krav, kendetegnet ved, at man som system til påvisning af pankreas-a-amylase anvender en maltopolyose med 4.til 7 glucoserester, maltosephosphorylase, β-phosphoglucomutase, glucose-6-phosphatdehydrogenase og NAD. 15
9. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-7, kendetegnet ved, at man som system til påvisning af pankreas-a-amylase anvender nitrophenylmaltopolyose med 4 til 7 glucoseenheder i molekylet sammen med a-glucosidase. 20
10. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-7, kendetegnet ved, at man som system til påvisning af a-amylase anvender stivelse, som er modificeret med bestemme-lige grupper. 25
11. Reagens til specifik bestemmelse af pankreas-a-amylase i nærværelse af spyt-a-amylase i legemsvæsker, især i serum, duodenalsaft, plasma eller urin, indeholdende et system til påvisning af α-amylase og et monoklont antistof mod spyt-a-3g amylase, kendetegnet ved, at det indeholder et første monoklont antistof, der hæmmer spytenzymet specifikt til mindre end 97%, i kombination med et andet monoklont an-ti-spyt-a-amylaseantistof, der hæmmer dette enzym til mindre end 10%. 35
12. Reagens ifølge krav 11, kendetegnet ved, at det som system til påvisning af pankreas-a-amylase indeholder en maltopolyose med 4 til 7 glucoserester, maltosephos- DK 161169 B phorylase, β-phosphoglucomutase, glucose-6-phosphatdehydro-genase og NAD.
13. Reagens ifølge krav 11, kendetegnet ved, at det som system til påvisning af pankreas-a-amylase indeholder en nitrophenylmaltopolyose med 4 til 7 glucoseenheder og cc-glucosidase.
14. Reagens ifølge krav 11, kendetegnet ved, at det som system til påvisning af pankreas-a-amylase indeholder en stivelse, som er modificeret med bestemmelige grupper.
15 20 25 30 35
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3525926 | 1985-07-19 | ||
| DE19853525926 DE3525926A1 (de) | 1985-07-19 | 1985-07-19 | Verfahren und reagenz zur spezifischen bestimmung von pankreas-alpha-amylase |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK336586D0 DK336586D0 (da) | 1986-07-15 |
| DK336586A DK336586A (da) | 1987-01-20 |
| DK161169B true DK161169B (da) | 1991-06-03 |
| DK161169C DK161169C (da) | 1991-11-18 |
Family
ID=6276259
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK336586A DK161169C (da) | 1985-07-19 | 1986-07-15 | Fremgangsmaade og reagens til specifik bestemmelse af pankreas-alfa-amylase |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5573918A (da) |
| EP (1) | EP0209154B1 (da) |
| JP (1) | JPS6222600A (da) |
| KR (1) | KR910002958B1 (da) |
| AT (1) | ATE49058T1 (da) |
| AU (1) | AU561326B2 (da) |
| CA (1) | CA1276106C (da) |
| CS (1) | CS270437B2 (da) |
| DE (2) | DE3525926A1 (da) |
| DK (1) | DK161169C (da) |
| ES (1) | ES2000691A6 (da) |
| FI (1) | FI86441C (da) |
| IE (1) | IE59301B1 (da) |
| NO (1) | NO167422C (da) |
| SU (1) | SU1637670A3 (da) |
| ZA (1) | ZA865364B (da) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3621271A1 (de) * | 1986-06-25 | 1988-01-07 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren und reagenz zur bestimmung von alpha-amylase |
| DE3903114A1 (de) * | 1989-02-02 | 1990-08-09 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur bestimmung eines enzyms aus einem isoenzymgemisch sowie hierfuer geeigneter testtraeger und dessen verwendung |
| DE3929355A1 (de) * | 1989-09-04 | 1991-03-07 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur spezifischen bestimmung von pankreas-(alpha)-amylase |
| JPH085919B2 (ja) * | 1989-11-10 | 1996-01-24 | 日本商事株式会社 | 唾液―α―アミラーゼ活性阻害モノクローナル抗体およびそれを用いる膵臓―α―アミラーゼの分別定量法 |
| JPH04106694U (ja) * | 1991-02-26 | 1992-09-14 | 尚大 西村 | 浄水装置 |
| JPH11299498A (ja) * | 1998-02-19 | 1999-11-02 | Toyobo Co Ltd | アミラ―ゼアイソザイム活性測定用試薬 |
| RU2671580C2 (ru) * | 2016-06-21 | 2018-11-02 | Государственное Бюджетное Образовательное Учреждение Высшего Профессионального Образования "Амурская Государственная Медицинская Академия" Министерства Здравоохранения Российской Федерации | Объективная оценка наличия тревоги и стресса у беременных путём определения изменения концентрации α-амилазы слюны во время операции кесарево сечение |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2543994C3 (de) | 1975-10-02 | 1979-10-11 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Proteinmodifizierte Verbindungen des schwangerschaftsspezifischen ß, -Glykoproteins und deren Verwendung als Bestandteil von immunisierenden Mitteln |
| DE2812154C3 (de) | 1978-03-20 | 1980-09-11 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur Bestimmung von a -Amylase |
| JPS5885899A (ja) * | 1981-11-16 | 1983-05-23 | Fujirebio Inc | アミラ−ゼインヒビタ−およびその製造法 |
| DE3245665A1 (de) | 1982-05-04 | 1983-11-10 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur herstellung permanenter tierischer und humaner zellinien und deren verwendung |
| US4514505A (en) * | 1982-05-21 | 1985-04-30 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Monoclonal antibody mixtures and use thereof for enhanced sensitivity immunoassays |
| DE3323245A1 (de) * | 1983-06-28 | 1985-01-10 | Merck Patent Gmbh, 6100 Darmstadt | Verfahren und reagenz zur bestimmung von (alpha)-amylase |
| DE3342736A1 (de) | 1983-11-25 | 1985-06-05 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Hybridoma-antikoerper |
| DE3404876A1 (de) * | 1984-02-11 | 1985-09-05 | Gödecke AG, 1000 Berlin | Verfahren zur verbesserung der selektiven aktivitaetshemmung von humaner pankreas- und speichelamylase sowie eine hierfuer geeignete inhibitorzubereitung |
| DE3500526A1 (de) | 1985-01-09 | 1986-07-10 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Spezifisch hemmender s-amylase-mak |
-
1985
- 1985-07-19 DE DE19853525926 patent/DE3525926A1/de not_active Withdrawn
-
1986
- 1986-07-14 KR KR1019860005664A patent/KR910002958B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1986-07-15 DK DK336586A patent/DK161169C/da not_active IP Right Cessation
- 1986-07-17 CS CS865451A patent/CS270437B2/cs not_active IP Right Cessation
- 1986-07-18 EP EP86109899A patent/EP0209154B1/de not_active Expired
- 1986-07-18 AT AT86109899T patent/ATE49058T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-07-18 SU SU4027915A patent/SU1637670A3/ru active
- 1986-07-18 ES ES8600378A patent/ES2000691A6/es not_active Expired
- 1986-07-18 DE DE8686109899T patent/DE3667858D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-07-18 JP JP61168213A patent/JPS6222600A/ja active Granted
- 1986-07-18 FI FI862975A patent/FI86441C/fi not_active IP Right Cessation
- 1986-07-18 ZA ZA865364A patent/ZA865364B/xx unknown
- 1986-07-18 NO NO862897A patent/NO167422C/no not_active IP Right Cessation
- 1986-07-18 CA CA000514128A patent/CA1276106C/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-07-18 AU AU60312/86A patent/AU561326B2/en not_active Ceased
- 1986-07-18 IE IE192086A patent/IE59301B1/en not_active IP Right Cessation
-
1991
- 1991-09-19 US US07/762,646 patent/US5573918A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI86441B (fi) | 1992-05-15 |
| JPS6222600A (ja) | 1987-01-30 |
| KR910002958B1 (ko) | 1991-05-11 |
| DK336586D0 (da) | 1986-07-15 |
| DK161169C (da) | 1991-11-18 |
| FI86441C (fi) | 1992-08-25 |
| DK336586A (da) | 1987-01-20 |
| NO862897D0 (no) | 1986-07-18 |
| DE3667858D1 (de) | 1990-02-01 |
| ZA865364B (en) | 1987-03-25 |
| CS545186A2 (en) | 1989-11-14 |
| SU1637670A3 (ru) | 1991-03-23 |
| NO862897L (no) | 1987-01-20 |
| AU6031286A (en) | 1987-02-12 |
| DE3525926A1 (de) | 1987-01-29 |
| IE861920L (en) | 1987-01-19 |
| ATE49058T1 (de) | 1990-01-15 |
| IE59301B1 (en) | 1994-02-09 |
| CA1276106C (en) | 1990-11-13 |
| EP0209154A1 (de) | 1987-01-21 |
| NO167422C (no) | 1991-10-30 |
| FI862975A0 (fi) | 1986-07-18 |
| AU561326B2 (en) | 1987-05-07 |
| ES2000691A6 (es) | 1988-03-16 |
| KR870001471A (ko) | 1987-03-14 |
| US5573918A (en) | 1996-11-12 |
| NO167422B (no) | 1991-07-22 |
| JPS632600B2 (da) | 1988-01-19 |
| EP0209154B1 (de) | 1989-12-27 |
| CS270437B2 (en) | 1990-06-13 |
| FI862975A (fi) | 1987-01-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Dake et al. | Purification and properties of the major nuclease from mitochondria of Saccharomyces cerevisiae. | |
| CA1086224A (en) | Neisseria meningitides antigens sorbent compositions for neisseria gonorrhoeae test | |
| US4945043A (en) | Process and reagent for the determination of α-amylase | |
| DK161169B (da) | Fremgangsmaade og reagens til specifik bestemmelse af pankreas-alfa-amylase | |
| DK162727B (da) | Monoklonalt antistof overfor spyt-alfa-amylase og fremgangsmaade til fremstilling deraf samt dets anvendelse til specifik bestemmelse af pankreas-alfa-amylase ved siden af spyt-alfa-amylase og reagens til brug ved anvendelsen | |
| JP2925117B2 (ja) | 体液中の唾液アルファアミラーゼを除く膵液アルファアミラーゼを特異的に定量する方法および試薬 | |
| Davies et al. | The assimilation of amino-acids by micro-organisms. 16. Changes in sodium and potassium accompanying the accumulation of glutamic acid or lysine by bacteria and yeast | |
| KR0125934B1 (ko) | 크레아틴 키나제 활성 측정용시약 및 그의 측정방법 | |
| Lawrence et al. | Antigenic cross-reactivities between mammalian hexokinases | |
| Pitt | Purification of a ribonuclease from potato tubers and its use as an antigen in the immunochemical assay of this protein following tuber damage | |
| Demirevska-Kepova et al. | Barley leaf Rubisco, Rubisco binding protein and Rubisco activase and their protein/protein interactions | |
| Losa | Enzymatic properties in pericellular membranes of leukemic cells | |
| Baker et al. | Purification and partial characterization of rat factor D | |
| FUJIOKA et al. | Immunochemical studies of а-amylase from germinating wheat seeds | |
| JPS5817600B2 (ja) | α↓２−プラスミンインヒビタ−の測定方法 | |
| White | Biochemical Events Accompanying Cellular Slime Mold Development | |
| JPH11299498A (ja) | アミラ―ゼアイソザイム活性測定用試薬 | |
| JPH03123864A (ja) | クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼの測定方法 | |
| JPS63158463A (ja) | ヒト膵型アミラ−ゼに対するモノクロ−ナル抗体及びその製造方法ならびにそれを用いるヒト膵型アミラ−ゼの定量方法 | |
| DD248664A5 (de) | Verfahren und Reagenz zur spezifischen Bestimmung von Pankreas-Alpha-Amylase |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PBP | Patent lapsed |
Country of ref document: DK |