DK162727B - Monoklonalt antistof overfor spyt-alfa-amylase og fremgangsmaade til fremstilling deraf samt dets anvendelse til specifik bestemmelse af pankreas-alfa-amylase ved siden af spyt-alfa-amylase og reagens til brug ved anvendelsen - Google Patents
Monoklonalt antistof overfor spyt-alfa-amylase og fremgangsmaade til fremstilling deraf samt dets anvendelse til specifik bestemmelse af pankreas-alfa-amylase ved siden af spyt-alfa-amylase og reagens til brug ved anvendelsen Download PDFInfo
- Publication number
- DK162727B DK162727B DK555584A DK555584A DK162727B DK 162727 B DK162727 B DK 162727B DK 555584 A DK555584 A DK 555584A DK 555584 A DK555584 A DK 555584A DK 162727 B DK162727 B DK 162727B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- amylase
- monoclonal antibody
- salivary
- pancreatic
- antibody
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 title description 30
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 title description 30
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 title description 30
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 title description 29
- BKOOMYPCSUNDGP-UHFFFAOYSA-N 2-methylbut-2-ene Chemical compound CC=C(C)C BKOOMYPCSUNDGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 title 1
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 claims abstract description 35
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 claims abstract description 33
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 14
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 claims abstract description 11
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims abstract description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000002183 duodenal effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 102100033770 Alpha-amylase 1C Human genes 0.000 claims description 25
- 108010026386 Salivary alpha-Amylases Proteins 0.000 claims description 25
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 24
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 20
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 20
- 108010029785 Pancreatic alpha-Amylases Proteins 0.000 claims description 17
- 102100026367 Pancreatic alpha-amylase Human genes 0.000 claims description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 16
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 13
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 11
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 9
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims description 7
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 6
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 5
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 claims description 5
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 5
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000008107 starch Substances 0.000 claims description 5
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 4
- 102100024295 Maltase-glucoamylase Human genes 0.000 claims description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 claims description 3
- 108010028144 alpha-Glucosidases Proteins 0.000 claims description 3
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 3
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 claims description 2
- 108010057899 Maltose phosphorylase Proteins 0.000 claims description 2
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 claims description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 2
- 101710081721 Alpha-amylase A Proteins 0.000 claims 3
- 108090001003 Beta-phosphoglucomutases Proteins 0.000 claims 2
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 claims 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims 2
- 239000003392 amylase inhibitor Substances 0.000 claims 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- 125000006501 nitrophenyl group Chemical group 0.000 claims 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 8
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 abstract description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract 4
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 abstract 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 20
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 20
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 19
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 8
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 8
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 6
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 5
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 5
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 5
- LOTKRQAVGJMPNV-UHFFFAOYSA-N 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C(F)C([N+]([O-])=O)=C1 LOTKRQAVGJMPNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PCLIMKBDDGJMGD-UHFFFAOYSA-N N-bromosuccinimide Chemical compound BrN1C(=O)CCC1=O PCLIMKBDDGJMGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 3
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- FSRMLWKBCQFLJA-HTZQGQHSSA-N (2r,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,3s,4r,5r,6r)-6-[(2r,3s,4r,5r,6r)-6-[(2r,3s,4r,5r,6r)-6-[(2r,3s,4r,5r,6r)-6-[(2r,3s,4r,5r,6r)-6-[(2r,3s,4r,5r,6r)-4,5-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-(4-nitrophenoxy)oxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]oxy-4,5-dihyd Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@H](O[C@@H]3[C@H](O[C@H](O[C@@H]4[C@H](O[C@H](O[C@@H]5[C@H](O[C@H](O[C@@H]6[C@H](O[C@H](OC=7C=CC(=CC=7)[N+]([O-])=O)[C@H](O)[C@H]6O)CO)[C@H](O)[C@H]5O)CO)[C@H](O)[C@H]4O)CO)[C@H](O)[C@H]3O)CO)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O FSRMLWKBCQFLJA-HTZQGQHSSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PCDWFBFHIIKIPM-UHFFFAOYSA-N 3-ethyl-2h-1,3-benzothiazole-2-sulfonic acid Chemical compound C1=CC=C2N(CC)C(S(O)(=O)=O)SC2=C1 PCDWFBFHIIKIPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HVBSAKJJOYLTQU-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzenesulfonic acid Chemical compound NC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 HVBSAKJJOYLTQU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100031126 6-phosphogluconolactonase Human genes 0.000 description 1
- 108010029731 6-phosphogluconolactonase Proteins 0.000 description 1
- 108010018962 Glucosephosphate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 229920000881 Modified starch Polymers 0.000 description 1
- 239000004368 Modified starch Substances 0.000 description 1
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- NYTOUQBROMCLBJ-UHFFFAOYSA-N Tetranitromethane Chemical compound [O-][N+](=O)C([N+]([O-])=O)([N+]([O-])=O)[N+]([O-])=O NYTOUQBROMCLBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- MFGSTSNUMVXOHJ-UHFFFAOYSA-M [I+].CC([O-])=O Chemical compound [I+].CC([O-])=O MFGSTSNUMVXOHJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000003610 charcoal Substances 0.000 description 1
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006193 diazotization reaction Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009144 enzymatic modification Effects 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-M hydrogensulfate Chemical compound OS([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 235000019426 modified starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 238000006396 nitration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000033764 rhythmic process Effects 0.000 description 1
- 238000011309 routine diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 229950000244 sulfanilic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 description 1
- -1 β-phosphoglycomutase Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/40—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving amylase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/962—Prevention or removal of interfering materials or reactants or other treatment to enhance results, e.g. determining or preventing nonspecific binding
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/824—Immunological separation techniques
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/828—Protein A
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/808—Materials and products related to genetic engineering or hybrid or fused cell technology, e.g. hybridoma, monoclonal products
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/808—Materials and products related to genetic engineering or hybrid or fused cell technology, e.g. hybridoma, monoclonal products
- Y10S530/809—Fused cells, e.g. hybridoma
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Cephalosporin Compounds (AREA)
Description
i
DK 162727 B
Den foreliggende opfindelse angår et monoklonalt antistof overfor spyt-a-amylase og en fremgangsmåde til fremstilling deraf samt antistoffets anvendelse til specifik bestemmelse af pankreas-a-amylase ved siden af spyt-a-amylase og et reagens 5 til brug ved anvendelsen.
Fra japansk offentliggørelsesskrift nr. 58-183098 kendes en fremgangsmåde til fraktioneret bestemmelse af isoenzymer, der er karakteriseret ved, at man ved den fraktionerede bestemmel-10 se af isoenzymer i forsøgsmateriale, der indeholder fra forskellige arter sammensatte isoenzymer, ved hjælp af et monoklonalt antistof, som har den egenskab kun specifikt at hæmme en type af isoenzymerne, specifikt hæmmer aktiviteten af denne ene type og specifikt bestemmer i soenzym-akt ivi teterne af de 15 andre typer.
Det har imidlertid vist sig, at det ved fremgangsmåden ifølge nævnte japanske offentliggørelsesskrift benyttede monoklonale antistof ikke har de særlige egenskaber, der karakteriserer 20 det monoklonale antistof ifølge den foreliggende opfindelse, og at det heller ikke er muligt at fremstille det her omhandlede monoklonale antistof på grundlag af den teknik, der fremgår af offentliggørelsesskriftet. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 a-amylase (E.C.3.2.1.1) nedbryder 1,4-d-glycosidisk tilknyttet 2 oligo- og polysaccharid til maltose og malto-oligosaccharider, 3 overvejende ved tilfældig hydrolyse af de 1,4-a-glycosidiske 4 bindinger. Enzymet har udover betydningen inden for den indu 5 strielle fermenteringsteknik væsentlig betydning inden for den 6 kliniske analyse og diagnostik. Ved talrige sygdomme forandrer 7 nemlig a-amylaseindholdet sig i legemsvæskerne, såsom serum, 8 urin eller duodenalsekret. I legemet forekommer imidlertid i 9 det væsentlige to a-amylaseenzymer, pankreasenzymet og spyten- 10 zymet. Da kun pankreasenzymet har diagnostisk betydning, fore- 11 lå der den opgave analytisk at differentiere disse to a-amyla-ser (foruden sjældent og kun i ringe mængde forekommende yderligere isoenzymer). Vanskeligheden herved bestod i, at de to
DK 162727 B
2 multiple former har lignende opbygning og immunologisk er identiske (K. Lorentz, Laboratoriumsblatter 32: 118 (1982)). Det er til eliminering af spytenzymets aktivitet kendt at anvende adsorption til anionbyttere, hæmning ved hjælp af et hvedepro-5 tein eller elektroforese eller elektrofokusering. Disse metoder er imidlertid enten utilfredsstillende i henseende til deres separationsvirkning eller for omstændelige for en rutinediagnostik. Blandt de nævnte metoder er kun den i Clin. Chem.
28/7, 1525-1527 (1982) beskrevne metode til hæmning af et en-10 zym af spyttypen ved hjælp af en fra hvedekim udvundet inhibitor forbundet med et for rutinediagnosen acceptabelt tidsforbrug, men selektiviteten er utilfredsstillende. Også ved den optimale inhibitorkoncentration opnås stadig ca. 13% af aktiviteten af enzymet af spyttypen, medens pankreasenzymets akti-15 vitet formindskes til ca. 81%.
Opfindelsen tager sigte på at afhjælpe denne ulempe og angive et monoklonalt antistof og et reagens, som muliggør en hurtig, enkel og pålidelig bestemmelse af pankreas-a-amy1 asen ved si-20 den af a-amylasen af spyttypen i legemsvæsker.
Dette opnås ifølge opfindelsen ved anvendelse af et hidtil u-kendt monoklonalt antistof, som er karakteriseret ved en krydsreaktivitet på 5% eller mindre overfor pankreas-a-amylase.
25
Anvendelsen af det monoklonale antistof til specifik bestemmelse af pankreas-a-amylase ved siden af spyt-a-amy1 ase i legemsvæsker, især i serum, duodenalsaft eller urin, ved omsætning med et system til påvisning af α-amylase i nærværelse af 30 et hæmstof for spyt-a-amylase er ejendommelig ved, at hæmstof-fet er et monoklonalt antistof mod spyt-a-amy1 ase med en krydsreaktivitet på 5% eller mindre over for pankreas-a-amylase, og at pankreas-a-amylase bestemmes på i øvrigt kendt måde. 1
Anvendelsen ifølge opfindelsen beror på den meget overraskende opdagelse af et monoklonalt antistof med meget ringe krydsreaktivitet overfor pankreasenzymet. Dette var ikke til at for-
DK 162727 B
3 udse, eftersom det var kendt, at spyt- og pankreasenzymet immunologisk er identiske (Gerhard Pfleiderer, Lab. Med. 7, 189-193; K. Lorentz loc. cit.). Således anfører Morton K. Schwartz f.eks. i "Immunoassay of Enzymes - an Overview” (1983), side 5 4-9, at antistoffer over for human spyt-o-amylase hammer enzymet af spyttype til 78% og pankreasenzymet til 75%. Det var derfor ikke til at forudse, at det ville vare muligt at udvikle en fremgangsmåde, som ville muliggøre en praktisk taget kvantitativ adskillelse af de to enzymer på immunologisk basis.
10
Fremgangsmåden til fremstilling af det monoklonale antistof er ejendommelig ved, at det opnås ved immunisering af forsøgsdyr med naturlig eller modificeret spyt-a-amylase, fusion af B-lymfocytter fra de immuniserede dyr med transformerede reagen-15 ser, kloning og dyrkning af de således dannede hybridceller samt isolering af de monoklonale antistoffer fra sidstnævnte.
Det hidtil ukendte til anvendelsen ifølge opfindelsen benyttede monoklonale antistof blev deponeret hos NCACC under nr.
20 NCACC 84111305 (klon 79), NCACC 84111304 (klon Ia813el0), NCACC 84111303 (klon la814a 7), NCACC 84111302 (klon 32c516e3) og NCACC 84111301 (klon 32c5l8fll) (National Collection of Animal Cell Cultures, Porton Down, GB). Det kan som nævnt opnås ved immunisering af forsøgsdyr med naturligt eller modifi-25 ceret spyt-a-amylase, fusion af de således opnåede immunifi-cerede dyrs B-lymfocyter med transformerede stoffer, kloning og dyrkning af de således dannede hybridceller, som producerer de monoklonale antistoffer, og isolering af sidstnævnte. Særligt egnede dyr til fremstilling af spyt-a-amylase-antistof-30 ferne er rotter og mus. Immuniseringen sker enten med naturlig human spyt-a-amylase eller med modificeret spyt-amylase. Anvender man naturligt enzym, så egner sig hertil de i handelen gående elektroforetisk homogene præparater. Kemisk modificeret spyt-a-amylase kan ligeledes opnås i overensstemmelse med 35 kendte metoder til enzymmodifikation, således som de f.eks. er nærmere beskrevet i tysk fremlæggelsesskrift nr. 2.543.994.
Egnede modificeringsmidler er eksempelvis N-bromsuccinimid
DK 162727 B
4 (NBS) under oxidation af tryptophangrupper i protein (BBA 143 (1967) 462-472), carboxymethylering roed jodacetat (IAA), der hovedsagelig angriber ved histidin, eller nitrering roed tetra-nitromethan (J. Biol. Chem. 238 (1963) 3307), diazotering med 5 diazoteret sulfanilsyre (Meth. Enzymol. 25 (1972) 515-531) samt omsætning med dinitrofluorbenzen (BNFB) (J. Biol. Chem.
243 (1968) 5344-253). Bortset fra naturligt enzym viste det med DNFB modificerede enzym sig at vare det bedste hertil.
10 Immuniseringen sker ved hjælp af sædvanlig administration af det naturlige eller modificerede enzym, fortrinsvis i kombination med hjælpestof. Som hjælpestof foretrækkes aluminium-hydroxid sammen med Bordatella pertussis.
15 Hvis man til immuniseringen anvender naturlig spyt-a-amy1 ase, sker immuniseringen fortrinsvis i løbet af mindst 9 måneder med mindst 7 immuniseringer (intraperitoneale injektioner). Anvender man modificeret spyt-a-amylase, så viser det sig at være hensigtsmæssigt at gennemføre en del af immuniseringerne 20 in vitro. Imidlertid skal mindst to immuniseringer ske in vivo, før in vitro-immuniseringen foretages. Ved de to sidstnævnte videredyrkes B-lymfocytter fra de immuniserede dyr i et med thymocytter konditioneret medium, og mediet tilsættes antigen.
25
Efter at have foretaget immunisering fusioneres B-lymfocytter-ne fra de immuniserede dyr ifølge sædvanlige metoder med transformerende stoffer. Eksempler på transformerende stoffer, der kan anvendes inden for opfindelsens rammer, er myeloma-30 celler, transformerende vira, såsom eksempelvis Epstein-Barr-virus, eller de i tysk offentliggørelsesskrift nr. 3.245.665 beskrevne stoffer.
Fusioneringen sker i overensstemmelse med de kendte fremgangs-35 måder ifølge Koehler og Milstein (Nature 256 (1975) 495-997).
De herved dannede hybridceller klones på sædvanlig måde, f.eks. under anvendelse af en i handelen gående ce1 lesorterer,
DK 162727B
5 og de opnåede kloner, der danner de ønskede monoklonale antistoffer, dyrkes. På grund af den kræftagtige vækst af hybridcellerne kan disse videredyrkes i ubestemt tid og producerer de ønskede monoklonale antistoffer i vilkårlig mængde. Med de 5 således opnåede monoklonale antistoffer kan spyt-a-amylasen absorberes kvantitativt fra legemsvæsker, så at tilbageværende amylaseaktivitet kan henføres til pankreas-a-amy1 asen.
Svarende til forskriften i det japanske offentliggørelses-10 skrift nr. 58/183 098, side 6, 3. afsnit til side 7, 2. afsnit i oversættelsen blev Balb/C-mus (10 dyr) immuniseret, hver med 100 pg spyt-amylase i Freund's komplette adjuvans (FCA). Efter 2 uger modtog musene en anden indgift af samme sammensætning. Den tredje og fjerde dag derefter blev miltcel-15 lerne isoleret og fusioneret med mus-myelomceller NSI i RPMI-medium. Mus fra immuniseringsgruppen, der ikke blev benyttet til udvindelse af miltcellerne, blev ti dage efter den sidste serumindgift taget fra med henblik på titerbestemmelse. Serumet fra disse dyr viste en lav titer (ca. 1:10.000 i 5 dyr).
20 De fusionerede celler blev fordelt på 96 hul vævskul turplader.
I hver af de således opnåede 96 pletter konstateredes hybridvækst. I ca. 50¾ af alle pletter påvistes antistof mod amylase (af spyt- og pankreastype). Seraenes krydsreaktion over for de to isoenzymer androg 95 til 100%. Hybrider med en krydsreak-25 tion på tydeligt under 80% var ikke til at finde.
Da på denne måde ingen til adskillelsen af isoenzymerne brugbare monoklonale antistoffer kunne opnås, blev kloningen gentaget, og i stedet for anvendelse af de 96 hulvævsplader gen-30 nemførtes en screening med f1uorescens-aktiveret cellesorterer.
Herved er der tale om den bedste i øjeblikket kendte metode til isolering af hybridomer med en bestemt egenskab. Men heller ikke herved lykkedes det at finde frem til hybridomer, hvis krydsreaktion med pankreas-isoenzymet var bedre end 80%.
35
En forbedring af resultaterne i henseende til krydsreaktiviteten kunne heller ikke opnås ved tilsætning af thymus-kir-telceller til kulturerne.
DK 162727 B
6
Til anvendelsen ifølge opfindelsen kan de monoklonale antistoffer som sådanne anvendes eller fragmenter deraf, der udviser tilsvarende immunologiske egenskaber (Fc-fragmenter).
Under begrebet "monoklonale antistoffer" forstås derfor her 5 også fragmenterne. Såvel det komplette antistof som dets fragmenter kan anvendes i immobi1iseret form.
Det ifølge opfindelsen benyttede monoklonale antistof har overraskende over for pankreas-a-amylasen en krydsreaktivitet 10 på 5% eller mindre og når i mange tilfælde kun en krydsreaktivitet på 1%. Det egner sig derfor i stedet for det hidtil kendte fra hvedekim udvundne hæmstof til specifik bestemmelse af pankreas-a-amylase i legemsvæsker.
15 Bestemmelsen af a-amylasen som sådan foregår i overensstemmelse med hertil kendte metoder. Da det monoklonale antistof selektivt binder α-amylasen af spyttypen, og dette således fratages fra enzymaktivitetsbestemmelsen, svarer de ved α-amy1asebestem-sen i nærværelse af det monoklonale antistof opnåede værdier 20 til den aktivitet, der alene tilkommer pankreasenzymet.
Anvendelsen ifølge opfindelsen gennemføres fortrinsvis med et system til påvisning af a-amylase, der indeholder en maltopo-lyose med 4-7 glycoserester i molekylet, maltosephosphorylase, 25 β-phosphoglycomutase, glucose-6-phosphatdehydrogenase og NAD.
Et yderligere inden for opfindelsens rammer fortrinsvis benyttet system til påvisning af α-amylase består af nitrophenylmal-topolyose med 4-7 glycoserester i molekylet og a-glucosidase.
30
Et yderligere foretrukket påvisningssystem for α-amylase består af stivelse, der er modificeret med bestemmelige grupper. Begrebet modificeret stivelse omfatter eksempelvis stivelse, der er modificeret med bestemmelige grupper, f.eks. det som 35 "Phadebas" i handelen gående produkt fra firmaet Pharmacia, Sverige, og det i tysk offentliggørelsesskrift nr. 2.812.154 beskrevne produkt samt i nedbrydningsopførsel forandret sti-
DK 162727 B
7 velse, eksempelvis carboxymethylstivelse og grænsedextri ner.
Alle disse systemer kendes og behøver derfor her ingen narmere beskrivelse.
5 Til gennemførelsen af fremgangsmåden ifølge opfindelsen bliver prøvevasken tilsat antistoffet, hensigtsmæssigt i form af en suspension, hvorpå det uopløselige fraskilles, fortrinsvis ved hjalp af kortvarig centrifugering. Den klare ovenstående vaske benyttes derpå i den sædvanlige a-amylasetest.
10
Inden for rammerne af reagenset ifølge opfindelsen kan det monoklonale antistof, såvel i komplet form som i form af fragmenterne, også foreligge fikseret på en fast bærer, eksempelvis på immunosorptivt papir eller overfladen af kunststofrør 15 eller -slanger. På denne måde bindes a-amylasen af spyttypen til bæreren, altså den faste fase, og i den flydende fase kan derfor bestemmelsen af restaktiviteten, som kan tilbageføres til pankreasenzymet, gennemføres uden yderligere separation.
20 Særligt gode resultater opnås inden for opfindelsens rammer, når der anvendes et monoklonalt antistofpræparat, der er blandet ud fra de monoklonale antistoffer, som produceres af flere forskellige kloner.
25 Da det ud fra det monoklonale antistof og dets antigen, spyt-α-amylasen, dannede kompleks er opløseligt, såfremt det monoklonale antistof ikke anvendes i immobi1 i seret form, består en yderligere mulighed for dets fraskillelse i yderligere at tilsætte et udfældende reagens for de monoklonale antistoffer el-30 ler for de af forsøgsdyrene ved immuniseringen dannede antistoffer. Herved dannes et uopløseligt kompleks, der indeholder spyt-a-amylase, monoklonale antistoffer og udfældende reagens.
Som udfældende reagens anvendes fortrinsvis et antistof over 35 for de monoklonale antistoffer eller over for de af forsøgsdyrene ved immuniseringen dannede antistoffer (altså et anti-an-tistof). En anden mulighed består i tilsætning af protein A, fortrinsvis i immobi1iseret form.
DK 162727 B
8
En hensigtsmæssig metode at gennemføre denne udførelsesform for anvendelsen ifølge opfindelsen på består i først at danne et kompleks af monoklonale antistoffer og anti-antistoffer og derpå at sætte dette til den opløsning, der skal undersøges, 5 hvilken opløsning indeholder α-amylaserne. Alternativt kan man imidlertid til at begynde med tilsætte kun de monoklonale antistoffer og efter inkubation til dannelse af antigen-anti-stof-komplekset med spyt-a-amylasen derpå tilsætte anti-anti-stofferne under dannelse af det uopløselige kompleks.
10
Til udførelsesformen for anvendelsen ifølge opfindelsen under anvendelse af et anti-antistof egner sig principielt alle mod de monoklonale antistoffer eller de af forsøgsdyrene dannede antistoffer rettede anti-antistoffer. Fortrinsvis benytter man 15 af får dannede anti-antistof fer ved anvendelsen af mus eller rotter til dannelsen af anti-spyt-a-amylase-serummet.
Reagenset til brug ved anvendelsen ifølge opfindelsen indeholder et system til påvisning af a-amylase og er ejendommeligt 20 ved, at det i stedet for et hæmstof indeholder et monoklonalt antistof med en krydsreaktivitet på 5% eller mindre overfor pankreas-a-amylase.
I henseende til det i reagenset ifølge opfindelsen indeholdte 25 system til påvisning af a-amylase og de øvrige betingelser gælder de ovennævnte angivelser vedrørende fremgangsmåden på tilsvarende måde.
Opfindelsen muliggør enkel og hurtig bestemmelse af pankreas-30 α-amylase ved siden af α-amylase af spyttypen i legemsvæsker med høj specificitet og forbedrer derved mulighederne inden for den kliniske diagnostik.
Opfindelsen belyses yderligere i de følgende eksempler.
35
DK 162727 B
9
Eksempel 1 A) Balb/c-mus immuniseres med 100 Mg human spyt-amylase i aluminiumhydroxid med BORDETELLA PERTUSSIS. Der videreimmu-niseres tre til fire gange i ca. 8 ugers rytme, hver gang 5 med 50 Mg human spyt-amylase i det samme hjælpestof. Fire dage før fusion gennemføres den sidste immunisering intravenøst med 50 Mg spyt-amylase i fysiologisk kogsaltopløsning.
B) Fusionen af miltcellerne med Ag8.653 (ATCC CRL 1580) eller 10 SP2/0 (ATCC CRL 1581) myelomceller gennemføres i overens stemmelse med standardmetoden ifølge J. of Imm. Meth., bind 39, 285-308. Fusionsforholdet mellem miltceller og myelomcel ler er 5:1. Fusionsprodukterne udsås på 10 24'er-kultur- 4 skåle (fra Costar) og ernaeres med 5 x 10 peritoneal-eksu-15 datceller pr. kulturskål. Positive primærkulturer (se eksem pel 3) klones 3-4 uger efter fusion ved hjælp af en fluorescens-aktiveret cellesorterer. Cellerne afsættes enkeltvis 4 i 96'er Costar-plader og ernæres med 2 x 10 peritoneal-eksu-dat-celler.
20 Eksempel 2
Modificering af a-amylase med dinitrofluorbenzen.
20 pmol spyt-amylase/liter og 20 mmol dinitrofluorbenzen/1 (opløst i en smule ethanol) blandes og inkuberes ved stuetemperatur i 10 min. Opløsningen dialyseres derpå i 20 timer 25 mod phosphatpuffer (50 mmol/1, pH 6,8) (kølerum). Dialysatet viser derefter i differensspektret en ekstinktionsforøgelse på 0,070 ved bølgelængden 360 nm. Opløsningen indfryses indtil immuniseringen. Proteinkoncentrationen i dialysatet andrager 15 μιηοΐ/liter.
DK 162727 B
10
Med den således opnåede modificerede α-amylase blev mus immuniseret som beskrevet i eksempel 1. De med modificeret amylase immuniserede mus dør alle efter den anden immunisering. Derfor bliver miltcellerne fra disse mus efter det 5 første boost bragt under dyrkning og efterimmuniseret i over ensstemmelse med metoden ifølge Luben (Molec. Immunology, bind 17 (1980) 635-639) i yderligere 4 dage "in vitro" i nærværelse af 100 μ g antigen i 30 ml medium. Efter 4 dage bliver cellerne ligesom de ifølge eksempel 1 opnåede milt-10 celler fusioneret og viderebehandlet.
Eksempel 3
For at fastslå koncentrationen og specificiteten af amylase-bindende antistof i serum fra immuniserede mus eller i kulturresten fra hybridceller eller i Ascites, anvendes en ELISA 15 som testprincip. Dertil overtrækkes 96'er ELISA-plader (Fa.
NUNC) med fåre-anti-mus-Fc-antistof. Til reduktion af uspecifik binding efterovertrækkes med kvægserumalbumin (2% i fysiologisk kogsaltopløsningX Derefter inkuberes der sammen med den antistofholdige prøve eller med forskellige for-2 0 tyndinger deraf.
Den derpå følgende inkubation gennemføres enten med spyt-amy-lase-peroxidase-(POD)-konjugat eller med pankreasamylase-POD-konjugat. Aktiviteten af den bundne POD bestemmes med ABTS (2,2'-azinodi-/3-ethylben2thiazolinsulfonat(6)/ (pH 25 4,4), og ekstinktionen tages direkte som mål for det bundne muse antistof. Til bestemmelse af krydsreaktionen bliver for hver prøve bindingen af spyt- og pankreasamylase-POD bestemt separat, og den med spyt-amylase-POD opnåede ekstinktion sættes til 100% binding. Den samtidig opnåede ekstinktion med 30 pankreas-amylase-POD giver prøvens krydsreaktion i procent af den med spyt-amylase-POD opnåede ekstinktion.
Der blev fundet fire kloner, med hvilke der overhovedet ikke skete nogen binding af pankreas-a-amylase-POD, og fem klo-
DK 162727B
11 ner med krydsreaktioner mellem 1,5 og under 5%. De efter sorteringen udsøgte kloner ekspanderes.
RPMI-medium er beskrevet i J.A.M.A. 199 (1957) 519 og fås i handelen.
5 Eksempel 4
Immobilisering af det monoklonale antistof (MAK) ved hjælp af fåre-anti-mus-AK og efterfølgende binding af spyt-amyla-sen.
Ascites fra mus 10 Fåre-anti-mus-AK (IgGFcy): 19 g/liter phosphatpuffer, pH = 7,0; 0,05 mol/liter phosphatpuffer, pH = 7,0; 0,05 mol/liter med 2% kvægserumalbumin human spyt-amylase: 1000 U/liter (μπιοί substratomsaetning/ 15 . ml/min. (37°C) med 4-nitrophenylmalto- heptaosid som substrat) human pankreas-amylase: 1000 U/liter
Eddikesyre: 0,5 mol/liter
Dikaliumhydrogensulfatopløsning: 2 mol/liter. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 MAK fra Ascites blandes med fåre-anti-mus-antistof i for 2 holdet 1:100. Denne blanding fortyndes med phosphatpuffer 3 i forholdet 1:2 og rystes i 15 min. ved 37°C. Det dannede 4 præcipitat vaskes to gange med puffer og opløses derpå i 5 eddikesyre (ca. 1/5 af begyndelsesvolumenet). Efter 5 min.
6 rystning tilsættes ^HPO^-opløsning i forholdet 1:2. Præ- 7 cipitatet dannes atter. Dette vaskes to gange med phosphatpuf- 8 fer med RSA (kvægserumalbumin) og derefter to gange kun med 9 puffer. Derpå suspenderes præcipitatet i 1/5 af startvolu 10 menet med puffer. 50 μΐ af præcipitatet sættes til 50 μΐ 11 spyt- eller pankreas-amylase og inkuberes i 15 min. ved stuetemperatur. Derefter fracentrifugeres præcipitatet, og resten videreforarbejdes ifølge eksempel 7. Som kontrol tjener en amylaseprøve, der i stedet for at blive behandlet med præcipitat blev behandlet med 50 μΐ puffer.
DK 162727 B
12
Eksempel 5
Binding af MAK til spyt-amylase og efterfølgende udfældning med fåre-anti-mus-antistof.
Ascites med monoklonale antistoffer fortyndes med puffer 5 i forholdet 1:50. 50 μΐ af denne opløsning ryste med 50 μΐ spyt- eller pankreas-amylase i 15 min. ved stuetemperatur.
Som kontrol tjener for det første en blanding af Ascites-fortynding med puffer (blindværdi for Ascites) og for det andet en blanding af amylase og puffer (kontrol af amylase-10 aktivitet). Derpå tilsættes 50 μΐ af det udfældende anti-antistof. Efter 10 min. ved stuetemperatur fracentrifugeres præcipitatet, og resten videreforarbejdes ifølge eksempel 7.
Eksempel 6 15 Immobilisering af MAK ved hjælp af fåre-anti-mus-antistof og efterfølgende binding af human spyt-amylase fra en blanding af spyt- og pankreas-amylase.
Svarende til eksempel 5 inkuberes en blanding af human pan-kreas- og spyt-amylase (hver 1000 U/liter) med forbehand-20 let præcipitat. Efter centrifugering videreforarbejdes resten i overensstemmelse med eksempel 7.
Eksempel 7
Bestemmelse af den tilbageblivende pankreas-amylase.
50 μΙ^βΓ rest ifølge eksempel 4-6 sættes til 1 ml i han-25 delen gående reagens til bestemmelse af a-amylase med 4-nitro-phenylmaltoheptaosid som substrat (Boehringer Mannheim, kata-logbestillingsnr. 568589). Restens aktivitet bestemmes ifølge anvisning ved 37°C. Restaktiviteterne konstateres som procent aktivitet i forhold til de medgående kontroller.
30 Restaktiviteten i eksempel 4 andrager for spyt-amylase 0-5%
Claims (20)
1. Monoklonalt antistof overfor spyt-a-amy1 ase, kendetegnet ved en krydsreaktivitet på 5% eller mindre over for pankreas-a-amylase.
2. Fremgangsmåde til fremstilling af et monoklonalt antistof ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det opnås ved immunisering af forsøgsdyr med naturlig eller modificeret spyt-a-amy1 ase, fusion af B-lymfocytter fra de immuniserede dyr med transformerede reagenser, kloning og dyrkning af de 20 således dannede hybridceller samt isolering af de monoklonale antistoffer fra sidstnævnte.
3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at der som forsøgsdyr anvendes rotter eller mus. 25
4. Fremgangsmåde ifølge krav 2 eller 3, kendetegnet ved, at immuniseringen gennemføres med aluminiumhydroxid og Bordetella pertussis som hjælpestof.
5. Fremgangsmåde ifølge krav 2, 3 eller 4, kendeteg net ved, at man immuniserer med naturlig spyt-a-amy1 ase og gennemfører immuniseringen mindst syv gange i løbet af mindst ni måneder. 1
6. Fremgangsmåde ifølge krav 2, 3 eller 4, kendeteg net ved, at man foretager immuniseringen med modificeret spyt-a-amylase og gennemfører mindst to immuniseringer in vivo DK 162727 B efterfulgt af mindst én immunisering in vitro, ved hvilken B-lymfocytterne dyrkes i af thymocytter konditioneret medium.
7. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 2-6, kende-5 tegnet ved, at der som transformerende reagenser anvendes myelomaceller.
8. Anvendelse af et monoklonalt antistof ifølge krav 1 til specifik bestemmelse af pankreas-a-amylase ved siden af spyt- 10 a-amylase i legemsvæsker, især i serum, plasma, duodenalsaft eller urin, ved omsætning med et system til påvisning af a-amylase i nærværelse af et hæmstof for spyt-a-amylase, kendetegnet ved, at hæmstoffet er et monoklonalt antistof med en krydsaktivitet på 5% eller mindre over for 15 pankreas-a-amylase, og at pankreas-a-amylase bestemmes på i øvrigt kendt måde.
9. Anvendelse ifølge krav 8, kendetegnet ved, at man anvender de monoklonale antistoffer i immobiliseret form. 20
10. Anvendelse ifølge krav 8 eller 9, kendetegnet ved, at man yderligere tilsætter et udfældende reagens og skiller det dannede uopløselige kompleks af spyt-a-amylase, monoklonalt antistof og det udfældende reagens fra opløsnin- 25 gen.
11. Anvendelse ifølge krav 10, kendetegnet ved, at man som udfældende reagens tilsætter et antistof (anti-antistof) for det monoklonale antistof. 30
12. Anvendelse ifølge krav 10, kendetegnet ved, at man som udfældende reagens tilsætter protein A. 1 2 3 Anvendelse ifølge krav 11, kendetegnet ved, at 2 35 man tilsætter et forud dannet kompleks af monoklonalt antistof 3 og anti-antistof. DK 162727 B
14. Anvendelse ifølge krav 11, kendetegnet ved, at man først tilsætter det monoklonale antistof, inkuberer og derpå gør komplekset uopløseligt ved tilsætning af anti-anti-stoffet. 5
15. Anvendelse ifølge ethvert af kravene 11, 13 og 14, kendetegnet ved, at man anvender anti-antistof fra f år.
16. Anvendelse ifølge ethvert af kravene 8-15, kende tegnet ved, at der som system til påvisning af a-amylase anvendes en maltopolyose med 4-7 glycoserester, maltophospho-rylase, β-phosphoglucomutase, giucose-6-phosphatdehydrogenase og NAD.
17. Anvendelse ifølge ethvert af kravene 8-15, kendetegnet ved, at der som system til påvisning af pankreas-α-amylase anvendes nitrophenylmaltopolyose med 4-7 glycose-enheder i molekylet sammen med α-glucosidase. 20
18. Anvendelse ifølge ethvert af kravene 8-15, kendetegnet ved, at der som system til påvisning af a-amylase anvendes stivelse, der er modificeret med bestemme!ige grupper . 25
19. Reagens til brug ved anvendelsen ifølge krav 8, hvilket reagens indeholder et system til påvisning af a-amylase, kendetegnet ved, at det i stedet for et hæmstof indeholder et monoklonalt antistof med en krydsreaktivitet på 30 5% eller mindre over for pankreas-a-amy1 ase.
20. Reagens ifølge krav 19, kendetegnet ved, at det som system til påvisning af α-amylase indeholder et malto-polyose med 4-7 glycoserester, mal tosephosphorylase, /3-phos- 35 phoglucomutase, giucose-6-phosphatdehydrogenase og NAD. 1 Reagens ifølge krav 19, kendetegnet ved, at det som system "til påvisning af α-amylase indeholder en nitro- DK 162727 B phenylmaltopolyose med 4-7 giucoseenheder og α-glucosidase.
22. Reagens ifølge krav 19, kendetegnet ved, at det som system til påvisning af a-amylase indeholder en med 5 bestemmelige grupper modificeret stivelse. 10 15 20 25 30 35
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19833342736 DE3342736A1 (de) | 1983-11-25 | 1983-11-25 | Hybridoma-antikoerper |
| DE3342736 | 1983-11-25 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK555584D0 DK555584D0 (da) | 1984-11-22 |
| DK555584A DK555584A (da) | 1985-05-26 |
| DK162727B true DK162727B (da) | 1991-12-02 |
| DK162727C DK162727C (da) | 1992-05-11 |
Family
ID=6215298
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK555584A DK162727C (da) | 1983-11-25 | 1984-11-22 | Monoklonalt antistof overfor spyt-alfa-amylase og fremgangsmaade til fremstilling deraf samt dets anvendelse til specifik bestemmelse af pankreas-alfa-amylase ved siden af spyt-alfa-amylase og reagens til brug ved anvendelsen |
| DK257690A DK257690A (da) | 1983-11-25 | 1990-10-25 | Monoklonalt antistof overfor spyt-alfa-amylase og fremgangsmaade til fremstilling deraf |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK257690A DK257690A (da) | 1983-11-25 | 1990-10-25 | Monoklonalt antistof overfor spyt-alfa-amylase og fremgangsmaade til fremstilling deraf |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4939082A (da) |
| EP (1) | EP0150309B1 (da) |
| JP (2) | JPS60155134A (da) |
| AT (1) | ATE44320T1 (da) |
| AU (1) | AU550266B2 (da) |
| CA (1) | CA1313150C (da) |
| CS (1) | CS256383B2 (da) |
| DD (1) | DD233142A5 (da) |
| DE (2) | DE3342736A1 (da) |
| DK (2) | DK162727C (da) |
| ES (1) | ES8507568A1 (da) |
| FI (1) | FI83669C (da) |
| YU (1) | YU45971B (da) |
| ZA (1) | ZA849140B (da) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4757001A (en) * | 1984-02-16 | 1988-07-12 | Fujirebio Kabushiki Kaisha | Method of measuring biological ligand by utilizing amylase |
| DE3500526A1 (de) * | 1985-01-09 | 1986-07-10 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Spezifisch hemmender s-amylase-mak |
| DE3508384A1 (de) * | 1985-03-08 | 1986-11-06 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Hemmung humaner speichel- und pankreasamylase durch monoklonale antikoerper |
| DE3525926A1 (de) * | 1985-07-19 | 1987-01-29 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren und reagenz zur spezifischen bestimmung von pankreas-alpha-amylase |
| JPS63500421A (ja) * | 1985-07-26 | 1988-02-18 | ザ ユニバ−シイテイ オブ バ−ジニア アルミニ パテンツ フアンデ−シヨン | 人のアミラ−ゼアイソチ−ムの免疫化学検定法及び関連する単クロ−ン抗体、ハイブリド−マ細胞系及びそれらの製造方法 |
| DE3903114A1 (de) * | 1989-02-02 | 1990-08-09 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur bestimmung eines enzyms aus einem isoenzymgemisch sowie hierfuer geeigneter testtraeger und dessen verwendung |
| DE3929355A1 (de) * | 1989-09-04 | 1991-03-07 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur spezifischen bestimmung von pankreas-(alpha)-amylase |
| JPH085919B2 (ja) * | 1989-11-10 | 1996-01-24 | 日本商事株式会社 | 唾液―α―アミラーゼ活性阻害モノクローナル抗体およびそれを用いる膵臓―α―アミラーゼの分別定量法 |
| GB9024970D0 (en) * | 1990-11-16 | 1991-01-02 | Genzyme Uk Ltd | Assay |
| KR20030079382A (ko) * | 2002-04-04 | 2003-10-10 | 최태부 | 소화 효소-지방산 복합체를 항원으로하여 생산된 항체 및이의 이용 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2258822A1 (de) * | 1972-12-01 | 1974-06-06 | Merck Patent Gmbh | Verfahren und mittel zur analyse von isoenzymmustern |
| JPS58183098A (ja) * | 1982-04-20 | 1983-10-26 | Wako Pure Chem Ind Ltd | アイソザイム分別定量法 |
| DE3245665A1 (de) * | 1982-05-04 | 1983-11-10 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur herstellung permanenter tierischer und humaner zellinien und deren verwendung |
| US4474892A (en) * | 1983-02-16 | 1984-10-02 | Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Two-site immunoassays using monoclonal antibodies of different classes or subclasses and test kits for performing same |
| DE3508384A1 (de) * | 1985-03-08 | 1986-11-06 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Hemmung humaner speichel- und pankreasamylase durch monoklonale antikoerper |
-
1983
- 1983-11-25 DE DE19833342736 patent/DE3342736A1/de not_active Ceased
-
1984
- 1984-11-21 ES ES537835A patent/ES8507568A1/es not_active Expired
- 1984-11-22 DK DK555584A patent/DK162727C/da not_active IP Right Cessation
- 1984-11-22 YU YU196984A patent/YU45971B/sh unknown
- 1984-11-22 CS CS848967A patent/CS256383B2/cs unknown
- 1984-11-22 CA CA000468445A patent/CA1313150C/en not_active Expired - Fee Related
- 1984-11-22 JP JP59246409A patent/JPS60155134A/ja active Granted
- 1984-11-22 DD DD84269782A patent/DD233142A5/de not_active IP Right Cessation
- 1984-11-23 DE DE8484114172T patent/DE3478821D1/de not_active Expired
- 1984-11-23 AT AT84114172T patent/ATE44320T1/de not_active IP Right Cessation
- 1984-11-23 ZA ZA849140A patent/ZA849140B/xx unknown
- 1984-11-23 EP EP84114172A patent/EP0150309B1/de not_active Expired
- 1984-11-23 FI FI844608A patent/FI83669C/fi not_active IP Right Cessation
- 1984-11-26 AU AU35874/84A patent/AU550266B2/en not_active Ceased
-
1989
- 1989-03-21 US US07/326,885 patent/US4939082A/en not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-10-25 DK DK257690A patent/DK257690A/da not_active Application Discontinuation
-
1991
- 1991-06-07 JP JP3136054A patent/JPH05232117A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0150309A3 (en) | 1985-08-21 |
| JPH05232117A (ja) | 1993-09-07 |
| DE3478821D1 (en) | 1989-08-03 |
| FI83669C (fi) | 1991-08-12 |
| CS896784A2 (en) | 1987-08-13 |
| CA1313150C (en) | 1993-01-26 |
| ES537835A0 (es) | 1985-09-16 |
| DK162727C (da) | 1992-05-11 |
| ZA849140B (en) | 1985-07-31 |
| EP0150309A2 (de) | 1985-08-07 |
| DK257690D0 (da) | 1990-10-25 |
| DE3342736A1 (de) | 1985-06-05 |
| ATE44320T1 (de) | 1989-07-15 |
| AU550266B2 (en) | 1986-03-13 |
| DK257690A (da) | 1990-10-25 |
| YU196984A (en) | 1989-12-31 |
| DK555584A (da) | 1985-05-26 |
| US4939082A (en) | 1990-07-03 |
| DK555584D0 (da) | 1984-11-22 |
| CS256383B2 (en) | 1988-04-15 |
| FI83669B (fi) | 1991-04-30 |
| JPH0436343B2 (da) | 1992-06-15 |
| FI844608L (fi) | 1985-05-26 |
| AU3587484A (en) | 1985-05-30 |
| EP0150309B1 (de) | 1989-06-28 |
| ES8507568A1 (es) | 1985-09-16 |
| JPS60155134A (ja) | 1985-08-15 |
| YU45971B (sh) | 1992-12-21 |
| DD233142A5 (de) | 1986-02-19 |
| FI844608A0 (fi) | 1984-11-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2935741B2 (ja) | 出生前診断を可能にする母体血液からの胎児細胞の分離 | |
| DK165326B (da) | Monoklonale antistoffer mod humanrenin og derivater deraf samt fremgangsmaade til deres fremstilling, hybridoma-cellelinier samt fremgangsmaade til deres fremstilling, anvendelse af de monoklonale antistoffer og deres derivater samt testsaet indeholdende antistofferne og/eller deres derivater | |
| DK162727B (da) | Monoklonalt antistof overfor spyt-alfa-amylase og fremgangsmaade til fremstilling deraf samt dets anvendelse til specifik bestemmelse af pankreas-alfa-amylase ved siden af spyt-alfa-amylase og reagens til brug ved anvendelsen | |
| US4945043A (en) | Process and reagent for the determination of α-amylase | |
| US5071744A (en) | Process and monoclonal antibody for the specific determination of pancreatic α-amylase in the presence of salivary α-amylase | |
| US6531578B1 (en) | Immunoassay method employing monoclonal antibody reactive to human iNOS | |
| US5573918A (en) | Process and reagent for specific determination of pancreatic alpha amylase | |
| JP2742406B2 (ja) | ヒトサイトメガロウイルスによって誘発され且つプロテインキナーゼ活性をもつポリペプチド | |
| KR100207351B1 (ko) | 항 인체 플라스민-알파2-플라스민 억제물질 복합체 항체, 하이브리도마 및 면역학적 측정방법 | |
| JP3250039B2 (ja) | レプトスフェリアに対するモノクローナル抗体 | |
| JPS6210100A (ja) | 火落菌に対するモノクロ−ナル抗体 | |
| WO2010090079A1 (ja) | ストロムライシン１と特異的に反応するモノクローナル抗体 | |
| JPS61245060A (ja) | ヒト補体１ｑ定量用キツト及び定量法 | |
| EP0264489A2 (en) | Monoclonal antibody against human pancreatic amylase, process for preparing the same and process for determining human pancreatic amylase by using the same | |
| JPS61502350A (ja) | アルカリ性ホスフアタ−ゼのイソ酵素を鑑別して測定する方法及び試薬並びにこのために適当なモノクロナ−ル抗体 | |
| JP2002253230A (ja) | モノクローナル抗体、ハイブリドーマおよびその用途 | |
| AU782922B2 (en) | Immunoassay method employing monoclonal antibody reactive to human iNOS | |
| WO1986006636A1 (en) | Monoclonal antibody | |
| JPH03183953A (ja) | ヒト膵臓α―アミラーゼの測定方法 | |
| JPH03277295A (ja) | 人体液中に存在する分子量７万〜３０万のコリンエステラーゼに反応するモノクローナル抗体 | |
| JPS62186798A (ja) | 小麦α−アミラ−ゼ阻害蛋白質に対するモノクロ−ナル抗体 | |
| JPS63158463A (ja) | ヒト膵型アミラ−ゼに対するモノクロ−ナル抗体及びその製造方法ならびにそれを用いるヒト膵型アミラ−ゼの定量方法 | |
| JPH06133794A (ja) | ヒラメインターフェロンに対するモノクローナル抗体並びに該抗体を製造するためのハイブリドーマ及び方法 | |
| JPH05244986A (ja) | モノクローナル抗体、該抗体を製造する方法及び該抗体 を用いた測定方法 | |
| JPS6391563A (ja) | 細菌由来蛋白特異抗原の検査法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PBP | Patent lapsed |