JP3250039B2 - レプトスフェリアに対するモノクローナル抗体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は診断植物病理学の分野に
関する。より詳しくは、本発明は病原菌であるレプトス
フェリア(Leptosphaeria) 属の種の検出に有用なモノク
ローナル抗体に関する。さらに、本発明はレプトスフェ
リアの単一種と特異的に反応するモノクローナル抗体を
提供する。

【０００２】

【従来の技術】病原菌 菌類は群として多くの植物の疾病を引き起こす。説明の
ために、菌類は３つの大きな分類学上の綱：担子菌類(B
asidiomycetes)、藻菌類(Phycomucetes)または子嚢菌類
(Ascomycetes)の一つに属するように分類することがで
きる。

【０００３】担子菌類 この綱の構成員は担子器として知られている有性胞子形
成構造の存在により同定される。病気形態には、黒穂病
(smuts) 、さび病(rusts) およびキノコのような肉的外
観(fleshly species)が含まれる。例えば、小麦さび
病、ストロブ松のコブ病(white pine blister)、レバノ
ンすぎ塊状銹(cedar-apple rust)、およびトウモロコ
シ、オート麦、大麦、玉葱および小麦における黒穂病の
原因となる病気が含まれる。

【０００４】子嚢菌類 この綱の構成員は減数分裂と有性胞子形成が起こる特殊
化された生殖構造（子嚢）を有する。子嚢菌類が病因と
して確認されている非常に一般的な植物病の例には；穀
類、果実および多くの他の作物におけるうどんこ病(pow
dery mildows)；オランダにれの木病(Dutch elm diseas
e) ；穀粒の麦角病(ergot) ：桃およびプラムの褐腐病
(brown rot) ；バラの黒星病(black spots) ならびに林
檎腐敗病(apple scab)が含まれる。

【０００５】藻菌類 この綱の構成員は子嚢菌類または担子菌類のどちらの構
成員よりも原始的であると考えられ、それらを区別する
形態学的特徴は菌糸交差壁が無いことである。この綱の
構成員により引き起こされる病気の例には、ブドウおよ
び他の宿主の黄斑性萎縮病(downy mildows) 、馬鈴薯お
よびトマトの根腐病(root rot)およびべと病(late blig
ht）が含まれる。

【０００６】本発明に関しては、子嚢菌類およびプレオ
スポラセアエ(Pleosporaceae) 科、そして特にレプトス
フェリア属の構成員が特に興味深い。この属は経済的に
非常に重大な植物病原体である多くの種を含む大きな属
である。米国における植物病原菌の最近の編集物には植
物病原体として１４０種のレプトスフェリアが挙げられ
ている〔３〕（〔 〕内の数字は下の参考文献一覧の数
字と一致する）。レプトスフェリアの子実体は、３また
はそれ以上の隔膜を備えた８個の子嚢胞子を各々含む二
重膜子嚢を含有する、孔口のある子嚢殻状偽子嚢殻であ
る。多くの場合、子嚢胞子は感受性宿主植物の不存在下
または好ましくない環境条件下での病原性レプトスフェ
リア種の主な生存機構である。また、子嚢胞子は宿主作
物における接種の主な源としてしばしば作用する。レプ
トスフェリア種の多くは無性分生子段階も生じる。分生
子は粉胞子器、分生子堆中、または遊離分生子柄上に生
じ得る。多くの場合、分生子段階が自然界に最も頻繁に
見出される。分生子段階は形態学に基づき有性段階とは
別に分類される。このようにレプトスフェリア属の種は
不完全菌〔ドイテロマイセテス(Deuteromycetes)〕の多
くの異なる属の構成員として分類される分生子段階を有
する。

【０００７】有性段階を自然界に見つけることがしばし
ば困難であり、また純粋培養に誘導することが困難であ
るので、子嚢菌類の無性段階の分類系は一般的に人為的
と考えられているが実用上の理由で続いている。しかし
ながら、相互の種の関連度は有性分類に反映されてい
る。すなわち、レプトスフェリアの２種は、無性段階の
形態学的類似に基づいて命名されているセプトリア(Sep
toria)の２種よりも相互に遺伝的により密接に関連して
いるようである。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】レプトスフェリアの病
原種は植物の地上部分に、最も頻繁には葉および茎に病
気を起こす。症状は作物に応じて不規則的または規則的
なパターンで葉領域の大部分を含むかもしれない病変で
ある。世界的に厳しくそして経済的に損害を与える病気
の多くはレプトスフェリア種によって引き起こされ、耐
性変種および／または防除用殺菌剤の使用を必要として
いる。レプトスフェリア・ノドルム(Leptosphaeria nod
orum) はその無性段階セプトリア・ノドルム(Septoria
nodorum)によりよく知られており、殺菌剤または耐性変
種により防除されなければ、世界的に小麦の著しい収量
低下を引き起こす。

【０００９】レプトスフェリア・ノドルムは感染後数週
間の潜伏期間を示し、その間病原体は組織中で成長する
が、病気の症状（葉および頴の病斑）は現れない。殺菌
剤は、潜伏期間中、重大な損害が生じる前および病気を
広がらせる第二の接種原が生じる前に施用されるなら
ば、この病気に最も効果的である。しかしながら、日常
的な予防殺菌処理は通常経済的にまたは環境的に正当化
されず、そしてこの病原体の非常に早期の、好ましくは
病気進展の潜伏期間中の検出を可能にするシステムは、
殺菌剤が適切に使用され、そして最大の経済的利益を与
えることを確実にすのに非常に有用であろう。本発明
は、レプトスフェリア・ノドルム抗原の存在を検出で
き、それで病気の早期診断を可能にし、そして小麦収穫
の広範な損失を予防できるモノクローナル抗体を提供す
ることにより、上記システムを実施に移すことを可能に
するものである。

【００１０】

【課題を解決するための手段】モノクローナル抗体技術 モノクローナル抗体は培養中の連続細胞系により抗体分
子の産生を供給するあらゆる方法により製造され得る。
これらの方法は、ケーラーおよびミルスタインにより最
初に発見された方法〔７〕、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ
法〔８〕およびヒトモノクローナル抗体を産生するＥＢ
Ｖハイブリドーマ法〔１〕を包含する。各々の細胞系
は、動物が生体内で抗原に応じて合成できる無数のタイ
プの抗体の１つだけを表す均一な免疫グロブリンを合成
する。各々の免疫グロブリン産生クローンは、それが産
生する抗体の単一タイプにより特徴づけられるので、モ
ノクローナル抗体という用語が採用された。モノクロー
ナル抗体は、大量に得ることができる；調製物が抗原反
応性に関して均一であり、そしてその性質は時間が経過
しても残る、という多くの利点を有する。

【００１１】ハイブリドーマ／モノクローナル技術の原
理は、２種の体細胞が融合される時に生成するハイブッ
ドが両方の親細胞タイプの特性を示すという観察に基づ
いている。モノクローナル抗体産生の場合、特定の抗体
を合成する能力は免疫化した供与動物から採取した免疫
適格性細胞（通常は脾臓細胞）から誘導され、一方、細
胞培養における連続的に分裂する能力は他方の融合相手
の腫瘍細胞系（しばしばミエローマ）により与えられ
る。初期の融合は、ミエローマ細胞系もモノクローナル
抗体を産生するという事実により複雑化されていた。従
って、この場合のハイブリッドは、しばしば２タイプの
モノクローナル抗体、ミエローマ起源の１種と免疫適格
性細胞の遺伝情報により指示された別種を産生する。そ
の後、それ自体モノクローナル抗体を産生できない腫瘍
細胞系、例えばＳＰ２／０−Ａｇ１４またはＸ６３−Ａ
ｇ８．６５３が使用され、それによって生成融合体の分
析が簡素化される。

【００１２】別の技術的問題には、２タイプの親細胞か
ら成功した融合結果（ハイブリッド細胞）を選択するた
めの論理的解釈が含まれる。融合プロトコルでは通常各
タイプの百万またはそれ以上の細胞が使用され、そして
融合は１００％の頻度で起こらないので、非融合または
自己融合した両親の高いバックグランドから融合生成物
の回収を試みる仕事は手に負えないほどである。上述し
たようにハイブリドーマは短期生存抗体産生（脾臓）細
胞と長期生存ミエローマ細胞との融合により形成され
る。所望の結果は抗体を産生する長期生存細胞系であ
る。脾臓細胞は培養において、有限の寿命を有している
ので、非融合または自己融合脾臓細胞の全てが死滅する
適当な期間、ただ待つだけでよい。しかしながら、依然
として、得られた集団から長期生存抗体産生細胞と長期
生存抗体非産生細胞とを区別して回収しなければならな
い。ハイブリッド細胞を選択するための普及している手
段はいわゆるＨＡＴ−選択系である。この系は酵素ヒポ
キサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラ
ーゼ（ＨＧＰＲＴ）の使用を含む。この酵素は哺乳動物
細胞内のプリン再利用経路で機能する。また、これらの
細胞はプリンを新たに合成できる。ほとんどの条件下で
両経路はおそらくある程度まで作動する。細胞がＨＧＰ
ＲＴを欠いている場合、再利用経路は遮断され、プリン
は非プリン物質から製造されなければならない。

【００１３】化学物質８−アザグアニンは、プリンのグ
アニンとして偽装することができ、その通常の反応のい
くつかにおいてそれと置換できる抗代謝物質である。ア
ザグアニンはＤＮＡ中に組み込まれ、通常の成長パター
ンに干渉し、細胞を死に導く。アザグアニンは再利用さ
れなければならないので、ＨＧＰＲＴ活性を欠くいかな
る細胞もアザグアニンを利用できず、その存在下に成長
するであろう。

【００１４】同じ酵素を用いて操作するがＨＧＰＲＴ陽
性細胞が選択されるという意味では反対の選択系はリト
ルフィールドにより記載されている

〔９〕。それはＨＡ
Ｔと呼ばれており、ヒポキサンチン、アミノプテリンお
よびチミジンを含む（ＨＡＴ培地）。アミノプテリンは
新たなプリン合成およびチミジレートを生じるデオキシ
ウリジレートのメチル化を防ぐ抗代謝物質である。チミ
ジンがチミジレートのメチル化の必要性を迂回している
間にアミノプテリンが新たなプリン生合成を阻害すると
いう場合に、ヒポキサンチンはで再利用可能なプリンと
して作用し得る。このように、アミノプテリンの存在
下、陽性のＨＧＰＲＴ活性を有するあらゆる細胞が増殖
するが、陰性のＨＧＰＲＴ活性を有する細胞は死ぬ。

【００１５】ＨＡＴ系の別法はＨＡＴの代わりにＨＭＴ
培地を使用することである。ＨＭＴはアミノプテリンの
代わりにアメトプテリン（メトトレキセート）を用い
る。この方法も同じ原理で作用するが、ＨＭＴ培地は成
長するハイブリドーマに対してやや毒性が低く、従って
細胞は培地上により長期間放置され得る。

【００１６】本実施例に従って選択のために使用される
ハイブリッド系において、ミエローマ細胞はアザグアニ
ンに対して耐性で、アミノプテリンに対して感受性であ
る。すなわち、それらはＨＧＰＲＴ陰性である。従っ
て、それらはアミノプテリンの存在下で死ぬであろう。
抗体産生細胞はＨＧＰＲＴ陽性である。増殖系を構成す
るミエローマ細胞はＨＧＰＲＴ活性が存在する場合にの
み成長でき、そしてこの活性はＨＧＰＲＴ陽性細胞系に
より供給されなければならないので、細胞を融合しそれ
をアザグアニンの無いＨＭＴ培地（ＨＴ培地）で成長さ
せることにより、成功裏に融合した細胞が選択される。
抗体産生ＨＧＰＲＴ陽性細胞系はこの培地で殺されな
い。それらは当分の間生存するが増殖はしないであろ
う。

【００１７】このように、ＨＡＴまたはＨＭＴ培地中で
細胞を融合することにより、ミエローマ細胞および抗体
産生細胞がハイブリッド細胞を生産するのに十分なほど
長く成長できるが、ハイブリッド細胞のみが生き残って
増殖できる系が製造される。選択後、各ハイブリドーマ
クローンは次いで当該の特定の抗体を産生する能力につ
いてスクリーニングされる。

【００１８】本発明は、レプトスフェリア属の少なくと
も１種と特異的に反応するが、該属以外の種とは反応し
ないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞
系を提供する。一つの実施態様において、モノクローナ
ル抗体はレプトスフェリアの単一種と特異的に反応す
る。好ましい実施態様において、抗体はレプトスフェリ
ア（セプトリア）・ノドルムと特異的に反応する。本明
細書を通じて、レプトスフェリアという名称はアナモル
フまたは無性段階の名称としても使用されるであろう。
従って、レプトスフェリア・ノドルムと反応する抗体は
無性段階セプトリア・ノドルムとも反応する。

【００１９】これらのモノクローナル抗体の利用可能性
は植物材料におけるレプトスフェリア感染を診断する手
段を提供する。従って、当該病原体の抗原を有すると推
測される植物試料をその病原体に対して特異性を有する
抗体と接触させ、そして抗体と試料中に存在する抗原と
の間の反応の有無を観察することからなる上記の感染を
診断する方法が提供される。好ましい実施態様におい
て、アッセイはサンドイッチまたは二重抗体アッセイと
して操作される。この方法において、当該病原体と反応
する第１の抗体を植物試料と接触させ、次にこれもまた
当該病原体と反応する第２の抗体を添加し、抗原がもし
試料中に存在するならば抗体−抗原−抗体複合体を形成
する。

【００２０】また、これに関連して、当該の種と反応す
る好ましくは固定化された抗体と、当該の種と反応する
検出可能に標識された抗体とからなるレプトスフェリア
の検出用キットが提供される。少なくとも一方の抗体は
本発明のモノクローナル抗体であるべきである。

【００２１】図１は正常な小麦抽出物中のＳｅｎ１（０
０４）の希釈に対する迅速アッセイおよびマルチウエル
アッセイの感度の比較を示す。

【００２２】ハイブリドーマ製造 レプトスフェリア抽出物調製 レプトスフェリアに対するモノクローナル抗体の製造に
使用される抗原を含有するレプトスフェリア抽出物はレ
プトスフェリアの培養物から調製され得る。レプトスフ
ェリアは、ツァペック・ドックス(Czapek Dox)Ｖ−８、
イーストモルト、ポテトデキストロース、オートミール
を含むが、これに限定されないアガーで固化された培養
培地上および／または液体培養培地中で培養され得る。
好ましい実施態様においてツァペック・ドックスが好ま
しい〔２〕。培養物は標準的操作を用いて集められ得
る。

【００２３】集められたレプトスフェリア菌類からの抽
出物はこの分野では公知の方法を用いて調製され得る。
下に記載されるであろうような特定の実施態様におい
て、レプトスフェリアの抽出物はこの分野で公知の方
法、例えば集められたレプトスフェリアをダイノミルま
たはワーリングブレンダーで処理するか、または超音
波、ホモジナイゼーションまたは剪断の処理を行うこと
により得られる。

【００２４】免疫化 接種のプログラムは重要ではなく、この分野でこの目的
に通常使用されるあらゆる態様であってよい。そのよう
な操作は例えば文献〔４〕に記載されている。

【００２５】有用なプログラムは、適当なアジュバント
と配合された抗原の最初の免疫化が腹膜組織内でなされ
るものである。次いで２週間隔で追加免疫注射が行われ
得る。２またはそれ以上の追加免疫が与えられてよい。
その動物は、当該抗原に特異的な抗体が血清中に含まれ
ているかを調べるために、尾採血される。その後動物は
殺され、リンパ球源を提供するために脾臓が取り出され
る。

【００２６】融合 ハイブリドーマを創成するための融合操作はこの分野で
よく知られており、公知操作のどれもが、レプトスフェ
リア−特異モノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マの製造に有用である。本実施例で用いられる基本的操
作は、ケーラーおよびミルスタイン〔６〕およびヘンマ
ーリンク〔５〕により開発された方法の変法である。最
近利用可能になったその他の方法、例えばヒトモノクロ
ーナル抗体を製造するために使用され得るヒトＢ細胞ハ
イブリドーマ法〔８〕およびＥＢＶハイブリドーマ法
〔１〕は本発明の範囲内である。

【００２７】一実施態様において、脾臓細胞（または代
わりに末梢血リンパ球）を免疫化した動物から単離し、
細胞数を数える。Ｔ細胞は支持細胞層として細胞１００
０万個／培地１０ｍｌの濃度で使用され得る。適当な不
死細胞系、好ましくはミエローマ細胞系が選択され、リ
ンパ球に、リンパ球：ミエローマ＝約４：１の割合で添
加される。１つの有用なミエローマ細胞系はＮＳ１細胞
系である。室温でＰＥＧ（ポリエチレングリコール）１
５００が一緒にした細胞に添加され、次にＤＭＥＭで徐
々に希釈される。遠心分離後、予め温めたＨＡＴ培地を
再懸濁されたペレットに加える。その試料をさらにＨＡ
Ｔ培地で希釈し、そして少量の試料をマイクロタイター
プレートのウエルに分配する。該プレートは少なくとも
湿度９５％の９％ＣＯ₂ 培養下に置かれる。約５〜７日
後、細胞にＨＡＴ培地を再び供給する。約５〜７日後に
ハイブリドーマ細胞のクラスターが現れ始める。ＨＴ培
地がさらに供給される。

【００２８】一実施態様において病原体抽出物が使用さ
れてもよい。特定の実施態様において、菌類に感染した
植物からの材料は二重抗原アッセイに使用され得る。そ
のような二重抗原アッセイは捕獲抗体としてレプトスフ
ェリアに対して製造されたポリクローナル抗体、植物材
料、モノクローナル抗体上清および抗マウス酵素複合体
の使用を包含する。

【００２９】スクリーニング レプトスフェリアに対する抗体を産生するハイブリドー
マは、当該の特定種の調製された菌材料を用いてエリザ
フォーマットにおいて同定される。一実施態様において
病原体抽出物が使用され得る。特定の実施態様におい
て、菌類に感染した植物からの材料が二重抗体アッセイ
において使用され得る。そのような二重抗原アッセイは
捕獲抗体としてレプトスフェリアに対して製造されたポ
リクローナル抗体、植物材料、モノクローナル抗体上清
および抗マウス酵素複合体の使用を包含する。エリザに
おいて陽性応答を示すウエルはハイブリドーマ細胞の純
粋株を選択するためにサブクローン化される。サブクロ
ーン化された系は菌成分に対する抗体比活性を求めるた
めに再び試験される。

【００３０】選択された抗体の特異性の程度を決定する
ために、それらを、レプトスフェリアに関連しても関連
しなくてもよい病原菌の集団(panel) に対してスクリー
ニングするのが望ましい。例えばレプトスフェリア（セ
プトリア）・ノドルム特異的抗体を得るために、選択さ
れた抗体はレプトスフェリアの別の種に対して、並びに
より離れた関連または非関連種に対して試験されるべき
である。

【００３１】本目的に有用な集団（パネル）の例を表１
および表３に示す。ある抗体が一方のフォーマットにお
いて有用でも、他方においてはそうでないこともあり得
るので、単一および二重抗体フォーマットの両方でスク
リーニングを行うことが一般に推奨される。

【００３２】抗体の特徴づけ 本発明の範囲内の多くの抗体は上記の方法に従って製造
された。一実施態様において、多くのモノクローナル抗
体はレプトスフェリア（セプトリア）・ノドルムと特異
的に反応するものが製造された。特定の実施態様におい
て、抗体はＳｅｎ１５Ｃ６（ＡＴＣＣ ＨＢ １０１８
５）であり、これは二重抗体フォーマットにおいて使用
され得る高特異性の抗体である。Ｓｅｎ１５Ｃ６はま
た、レプトスフェリア・ノドルムと強く反応性である。
唯一の例外は「種」セプトリア・アベナエ・トリチセア
品種(S. avenae f. sp. triticea) とで観察された陽性
反応である。この通常の種はレプトスフェリア（セプト
リア）・ノドルムと形態学的に実質的に同一であり、感
染小麦に同様の症状を引き起こす。従って、これら２つ
の種は同一であると考えられる。それ故に、ハイブリド
ーマＳｅｎ１５Ｃ６により産生された抗体はレプトスフ
ェリア・ノドルム抗原の正確で特異的な同定に非常に有
用である。このモノクローナル抗体はＩｇＧ２ａ免疫グ
ロブリンサブクラスに属している。しかしながら、その
他の免疫グロブリンサブクラスのその他の類似の抗体も
また製造された。

【００３３】レプトスフェリア・ノドルムを同定するハ
イブリドーマおよびモノクローナル抗体は好ましい実施
態様を表すけれども、本発明はこれに限定されない。上
記の免疫化、融合および選択方法を利用することによ
り、種特異的なモノクローナル抗体が免疫原として適当
な種の抽出物を用いて製造され得る。例えば、以下の
種：レプトスフェリア・コラエ(Leptosphaeria korra
e) 、レプトスフェリア・マクランス(L. maculans) 、
レプトスフェリア・プラテンシス(L. pratensis)および
レプトスフェリア・サッカリ(L. sacchari) に対して特
異性を有するモノクローナル抗体もまた本発明の範囲内
である。

【００３４】診断方法およびキット 上記したように、当該病原体はそれに感染された植物に
重大な損傷を引き起こすことができ、従って早期の診断
が非常に望まれている。今、本発明の抗体は、何らかの
目に見える病気の症状が植物上に現れる前に病原体を植
物材料中に発見できる方法を提供する。

【００３５】上記抗体は植物材料中の特定の種の存在を
決定するための多くの異なるイムノアッセイの基本的試
薬として用いることができる。一般的には、該抗体はど
のタイプのイムノアッセイにも、定性的であれ定量的で
あれ用いることができる。これには、単一サイト(singl
e site) および二サイト(two-site)の両方またはサンド
イッチ式の非競合タイプのアッセイ、ならびに伝統的な
競合結合アッセイが含まれる。

【００３６】検出の平易さおよびその定量性のために
は、サンドイッチアッセイまたは二重抗体アッセイが特
に好ましく、その数多くの変法が存在し、本発明にはそ
の全てが含まれることを意図している。

【００３７】例えば、典型的な進歩的アッセイにおい
て、非標識抗体は固体基剤上に固定化され、適当な保温
期間の後に結合した分子と試験されるべきサンプルを、
抗体−抗原二重複合体を生成させるのに十分な期間接触
させる。次に非結合物質を洗い流す。この時点で、検出
可能なシグナルを誘導できるリポーター分子で標識され
た第二抗体が次いで加えられ、抗体−抗原−標識抗体の
三重成分複合体が生成するのに十分な時間保温される。
全ての未反応物質が洗い流され、抗体の存在がシグナル
の観察により決定されるか、または既知量の抗原を含む
対照試料との比較で定量され得る。進歩的アッセイにお
ける変法には、試料および抗体の両方を結合した抗体に
同時に加える同時アッセイ、または標識抗体および試験
されるべき試料を最初に結合させ、培養しそして非標識
表面結合抗体に加える逆アッセイが含まれる。これらの
技術は当業者によく知られており、わずかな変更の可能
性は容易に明らかであろう。ここで使用されている「サ
ンドイッチアッセイ」という用語は基本的な二サイト技
術(two-site technique)に関する全ての変法を包含する
ことを意図する。

【００３８】本発明のイムノアッセイに対して、唯一の
限定的要素は少なくとも一つの抗体が必要な特異性を有
することである。かくして、多くの可能な組合せが可能
である。例えば一方の抗体がポリクローナルで、他方が
モノクローナル抗体であってよい。代わりに、一つの抗
体が当該病原体および他の菌類の両方に結合する一般的
な抗体である一方、第二の抗体が当該病原体に特異的で
あればよい。また、両抗体が当該病原体に特異的であっ
てもよい。

【００３９】さらに特別な例として、典型的な進歩的サ
ンドイッチアッセイにおいて、一般的なレプトスフェリ
ア−結合抗体は固体表面に共有結合的か受動的に結合さ
れる。固体表面は通常ガラスまたはポリマーであり、最
も普通に使用されるポリマーはセルロース、ポリアクリ
ルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルま
たはポリプロピレンである。固体支持体材料はチュー
ブ、ビーズ、ディスクもしくはマイクロプレートの形
態、またはイムノアッセイを行なうのに適するあらゆる
その他の表面であってよい。結合方法は当分野でよく知
られている。結合後、固相−抗体複合体は試験試料の製
造において洗浄される。次いで試験される植物抽出物の
一部を固相複合体に加え、適当な温度好ましくは２５℃
で、存在する全てのレプトスフェリアを抗体に結合させ
るのに十分な時間保温する。培養時間は変えられるが一
般的に２分ないし１６時間の範囲である。培養時間経過
後、抗体−レプトスフェリア固相は洗浄され、乾燥さ
れ、レプトスフェリアに特異的な第二抗体とともに保温
される。第二抗体はリポーター分子に結合され、その視
認できるシグナルは試料中の抗原に第二抗体が結合した
ことを示すために使用される。本明細書で使用されてい
る「レポーター分子」の用語は、その化学的性質により
抗原−結合抗体を検出することを可能にする分析的に検
出可能なシグナルを提供する分子を意味する。検出は試
料中の抗原量の決定を可能にするために少なくとも相対
的に定量可能でなければならない。これは絶対値で計算
されても、あるいは既知の通常レベルの抗原を含む標準
品（または標準品群）との比較により行なわれてもよ
い。

【００４０】このタイプのアッセイで最も普通に用いら
れるリポーター分子は酵素、蛍光団(fluorophores)また
は放射性核種含有分子である。酵素免疫測定法の場合、
酵素はしばしばグルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸塩
で第二抗体に抱合される。しかしながら容易に認識され
るように、多様な異なる抱合技術が存在し、それは熟練
技術者によく知られている。常用される酵素には西洋ワ
サビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−
ガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼ等が含
まれる。特定の酵素と共に使用される基質は一般的に、
対応する酵素による加水分解に応じて、検出可能な変色
を生じさせるために選択される。例えば、ｐ−ニトロフ
ェニルホスフェートはアルカリホスファターゼ抱合体と
共に使用するのに適している：パーオキシダーゼ抱合体
には、１，２−フェニレンジアミンまたはトルイジンが
普通に使用される。蛍光基質を使用することも可能であ
り、それは上記の色素発光基質よりもむしろ蛍光生成物
を生じる。全ての場合において、酵素で標識された抗原
−特異抗体は最初に抗体−レプトスフェリア複合体に加
えられ、該複合体に結合され、次いで過剰の試薬が洗い
流される。次いで適当な基質を含む溶液が抗体−抗原−
標識抗体の第三複合体に加えられる。基質は、第二抗体
に結合した酵素と反応し、定性的な可視シグナルを生
じ、それは更に、血清試料中に存在する抗原の量を評価
するために、通常に分光光度的に定量されてよい。

【００４１】他方、フルオレッセンおよびロダミンのよ
うな蛍光化合物は、それらの結合能力を変化させること
なく抗体に化学的に結合されてよい。特定波長の光で照
射することにより活性化された場合、蛍光色素−標識抗
体は光エネルギーを吸収し、分子内に励起状態を導き、
続いて特徴的なより長い波長で光を放出する。その放出
は光顕微鏡で視認できる特徴ある色として現われる。Ｅ
ＩＡでのように、蛍光標識ＰＬＦ−特異抗体は最初に抗
体−フェリチン複合体に結合させられる。非結合試薬を
洗浄した後、残留する三重複合体は次いで適当な波長の
光にさらされ、観察された蛍光は、当該抗原の存在を示
す。蛍光免疫測定法およびＥＩＡ技術は両方とも当分野
で非常によく確立されており、本発明方法として特に好
ましい。しかしながら、他のリポーター分子、例えば放
射性同位元素、化学発光性のまたは生物発光性の分子も
また用いられてよい。その操作を要求された用途に合う
ように如何に変えるかは熟練技術者には明白であろう。

【００４２】

【実施例】微生物の寄託 ハイブリドーマＳｅｎ１５Ｃ６はアメリカ合衆国メリー
ランド州ロックヴィレのアメリカン・タイプ・カルチャ
ー・コレクションに１９８９年７月２５日に寄託され、
受託番号ＨＢ １０１８５と登録されている。

【００４３】以下の実施例では本発明に係るハイブリド
ーマおよび抗体の製造方法を説明する。

【００４４】実施例１：抗原調製 レプトスフェリア（セプトリア）・ノドルムの生存可能
な培養物からのアガー栓をＣＤ（ツァペック−ドック
ス）アガー（ディフコ）またはＰＤＡ（ポテト・デキス
トロース・アガー）（ディフコ）プレート上にひっくり
返し、そしてその栓を表面になすりつける。プレートを
室温および照明下で５〜７日間保温する。

【００４５】全てのコロニーをアガープレートから無菌
的に取り出し、そして滅菌２５０ｍｌオムニ−ミキサー
チャンバー中に置く。滅菌ツァペック培地（ディフコ）
５０ｍｌをオムニ−ミキサーチャンバーに添加し、そし
て菌を６０００ｒｐｍで３０秒間ホモジナイズする。

【００４６】ツァペック溶液５０ｍｌを含有する２５０
ｍｌエルレンマイヤーフラスコに各々培養ホモジネート
１ｍｌを接種する。接種後のフラスコをシェーカー（通
常の照明下２２〜２４℃で高速）上に置く。１３日後、
培養物を集め、そしてＰＢＳで２回洗浄する。

【００４７】菌培養物を０．５ｍｍ／無鉛ガラスビーズ
〔インパンデックス(IMPANDEX)〕２４０ｍｌ含有ダイノ
−ミル(DYNO-MILL)・タイプＫＤＬの１５０ｍｌバッチ
チャンバー中に移す。バッチチャンバーの冷却ジャケッ
トは冷却水道水で８℃まで予め冷却されている。抽出物
を３０００ｒｐｍで５分間磨砕し、その後バッチチャン
バーの内容物を５０ｍｌ遠心管に移し、そしてソルバル
(Sorvall) ＲＣ−５Ｂ冷却遠心機にてＳＳ−３４ロータ
ー中１３０００ｒｐｍで遠心分離する。菌上澄みを少量
づつに分け、使用するまで冷凍する。試料の全タンパク
質含量は０．１〜１．０ｍｇタンパク質／ｍｌの範囲内
である。

【００４８】実施例２：免疫化および融合 Ｂａｌｂ／ｃマウスの免疫化はフロイント完全アジュバ
ント０．２ｍｌ中の単離体Ｓｅｎ１−００１の菌抽出物
０．２ｍｌを腹腔内注射して行う。マウスは１４日後に
フロイント不完全アジュバント中の同じ菌抽出物を用い
て追加免疫を行う。第２の追加免疫は１２日以内に行
う。７日後、マウスの尾採決を行い、そしてその血清を
免疫原に特異的な抗体の存在に対して試験した。次の
日、マウスを頸部脱臼により殺し、そしてリンパ球の抽
出のために脾臓を切除する。脾臓を、無菌の使い捨ての
ペトリ皿中の８０メッシュ無菌篩上に置き、外科用メス
で切断し、３ｃｃ注射器の無菌プランジャーでマッサー
ジする。この操作中、脾臓をＤＭＥＭで数回洗浄する。
細胞懸濁液を無菌の５０ｍｌ使い捨て遠心管に移す。篩
および残留組織断片を再びＤＭＥＭで洗浄し、洗浄物を
遠心管に加える。細胞懸濁液を２０００ｒｐｍで１０分
間回転させる（遠心分離は全て室温で行われる）。上澄
みをデカンテーションし、ペレットを赤血球溶菌性溶液
（０．８３％ＮＨ₄ Ｃｌ，０．０１Ｍ ＫＨＣＯ₃ ，
０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）４ｍｌで９０秒間室温で洗浄す
る。溶菌反応はＤＭＥＭで遠心管内容物を４５ｍｌに希
釈することにより停止させる。内容物を再び２０００ｒ
ｐｍで１０分間遠心分離する。上澄みをデカンテーショ
ンし、ペレットをＤＭＥＭ１０ｍｌ中に再懸濁する。細
胞懸濁液の試料を細胞数計測のために保存する。懸濁液
中の生存細胞の総数は２．２６×１０⁸ 細胞である。

【００４９】アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ションから得たミエローマ細胞〔Ｐ３ＮＳ１／１−Ａｇ
４−１（ＮＳ１），ＡＴＣＣ♯ＴＩＢ−１８〕を５０ｍ
ｌ遠心管中２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により
培養培地から取り出す。上澄みをデカンテーションし、
細胞数計測のためにペレットをＤＭＥＭ１０ｍｌに再懸
濁する。５．６５×１０⁷ 個のミエローマ細胞が脾臓細
胞懸濁液に添加される。一緒にした細胞を２０００ｒｐ
ｍで１０分間遠心分離する。遠心分離に続いて、上澄み
をデカンテーションする。

【００５０】ＰＥＧ１５００（１ｍｌ）〔ベーリンガー
・マンハイム・バイオケミカルズ(Boehringer Mannheim
Biochemicals)，カタログ番号７８３−６４１〕１ｍｌ
を室温でペレットに加える。２ｍｌピペットおよび自動
ピペッターで細胞を非常に穏やかに再懸濁する。細胞を
懸濁状態に保つために遠心管をゆっくりかきまぜながら
ＤＭＥＭ１０ｍｌを１０分間にわたって滴下添加するこ
とにより細胞懸濁液を非常にゆっくりと希釈する。次い
で、ＤＭＥＭで懸濁液を４５ｍｌにゆっくりと希釈し、
そして１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。上澄み
をデカンテションし、ペレットをＤＭＥＭ１０ｍｌで穏
やかに洗浄し、そして１５００ｒｐｍで１０分間再び遠
心分離する。融合細胞を洗浄した後に、５％オリジン−
ＨＣＦ（♯ＩＧ−５０−０６１５フィッシャー・サイエ
ンティフィック）を含有する予め温めたＨＡＴ培地中に
細胞を再懸濁し、そしてプリマリア・マイクロテストＩ
ＩＩプレート（ファルコン♯３８７０）の６０ウエルの
各々に、外側の列のウエルを残して懸濁液２滴加える。
外側のウエルにはペニシリン／ストレプトマイシン含有
ＤＭＥＭを各２００μｌ入れ、そしてプレートをＣＯ₂
保温器中に置く。

【００５１】７日後にＨＡＴ／５％オリジン−ＨＣＦ培
地を細胞に再び供給する。ハイブリドーマのクラスター
は５〜７日後に現れ始める。さらに補給する場合はアミ
ングステルンまたはオリジン−ＨＣＦなしで行われる。

【００５２】実施例３：ハイブリドーマのスクリーニン
グ Ｓｅｎ１−００１菌糸体抽出物を炭酸緩衝液（１．５９
ｇ／ｌ Ｎａ₂ ＣＯ₃ ，２．９３ｇ／ｌ ＮａＨ₂ ＣＯ
₃ ，ｐＨ９．６）中に５μｇ／ｍｌに希釈し、そして３
６０μｌをマイクロタイタープレート（ヌンク，♯４６
８６６７）の各ウエル中に加える。室温で３時間保温し
た後、プレートを炭酸緩衝液で３回洗浄する。ウエル上
の残留結合部位は脱脂粉乳溶液４００μｌをウエルあた
り添加することによりブロックされる。３０分後、脱脂
粉乳溶液をプレート外に揺すって出し、プレートを紙タ
オルで拭き、そして３７℃対流保温器（プレシジョン，
モデル４ＥＭ，♯３１５７４）中で一晩乾燥させる。上
澄み１００μｌを各ウエル上に加え、プレートシェーカ
ー（フロー，♯５４１３０５）上１０分間保温する。残
留溶液を捨て、そしてプレートを洗浄緩衝液（２４．２
ｇ／ｌ トリス，８７．７ｇ／ｌ ＮａＣｌ，０．１ｇ
／ｌ チメロサール，５０ｇ／ｌ ツイーン８０，ｐＨ
７．８７）で５回洗浄する。ＫＰＬパーオキシダーゼ複
合ヤギ抗マウスＩｇＧ〔０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳ（１μ
ｇ／ｌ ＢＳＡ，２．１８ｇ／ｌ ＮａＨ₂ ＰＯ₄ ，
０．５６ｇ／ｌ ＮａＨ₂ ＰＯ₄ ，８．７６ｇ／ｌ Ｎ
ａＣｌ．ｐＨ７．２）中に１：１０００希釈〕１００μ
ｌを次に各ウエルに添加し、そしてシェーカー上で１０
分間保温する。残留溶液を捨て、そしてプレートを洗浄
緩衝液で５回洗浄する。ＡＢＴＳ基質（２３ｇ／ｌ ク
エン酸，０．５ｍｌ／ｌ３０％Ｈ₂ Ｏ₂ ，ｐＨ４．０；
１５ｍｇ／ｍｌ ＡＢＴＳ；ＡＢＴＳ濃厚液はクエン酸
緩衝液中に１：２５に希釈される）１００μｌを各ウエ
ル中に加え、そしてシェーカー上で１０分間保温する。
反応は各ウエルに１．５％ＮａＦを５０μｌ添加するこ
とにより停止される。吸収を４０５ｎｍで読み取る。

【００５３】多くのハイブリドーマがレプトスフェリア
・ノドルムと反応する抗体を分泌することが見出され
る。広範囲の異なる単離体と抗体との反応性を決定する
ために、単一抗体スクリーニングがレプトスフェリア・
ノドルム単離体の広げられた集団（パネル）と行われ
る。 表１：レプトスフェリア・ノドルムに対して製造された６種のモノクローナル抗 体のレプトスフェリア・ノドルムの単離体に対する単一抗体間接エリザスクリー ニング ────────────────────────────── レプトスフェリア（セプトリア）・ノドルムに対する 単離体 モノクローナル抗体 ８Ｃ７ ５Ｃ６ １１Ｅ３ ６Ｆ３ ５Ｃ３ ７Ｅ９ ────────────────────────────── 平均 0.503 0.578 0.263 0.413 0.237 0.455 Sen 1 0.426 0.575 0.150 0.194 0.085 0.233 Sen 2 0.527 0.193 0.355 0.239 0.108 0.255 Sen 4 0.350 0.702 0.452 0.223 0.128 0.266 Sen 6 0.087 0.086 0.070 0.182 0.029 0.059 Sen 7 0.179 0.233 0.411 0.839 0.019 0.072 Sen 8 0.738 0.979 0.627 0.804 0.214 0.404 Sen 9 0.888 1.264 0.726 0.377 0.571 0.836 Sen10 0.391 0.349 0.619 0.368 0.192 0.361 Sen11 1.396 2.000 0.499 0.582 0.536 0.873 Sen14 0.037 0.025 0.017 0.295 0.013 0.023 Sen16 0.000 0.000 0.080 0.423 0.000 0.000 Sen17 0.044 0.073 0.041 0.212 0.037 0.044 Sen31 0.339 0.291 0.104 0.250 0.119 0.496 Sen32 0.348 0.591 0.015 0.493 0.155 0.402 Sen33 0.190 0.118 0.111 0.473 0.159 0.171 Sen34 0.801 1.005 0.305 0.669 0.576 0.934 Sen41 0.456 0.451 0.052 0.327 0.225 0.541 Sen42 0.430 0.544 0.066 0.423 0.243 0.548 Sen44 0.433 0.768 0.293 0.893 0.267 0.580 Sen45 2.000 1.310 0.275 0.000 1.064 2.000 ──────────────────────────────

【００５４】二重抗体サンドイッチエリザアッセイを用
いて、適当な抗体が選択された病原体抽出物に対する交
差反応性スクリーニングのために選択される。マイクロ
ウエルは炭酸緩衝液中の５μｇ／ｍｌであるモノクロー
ナル抗体を捕獲抗体としてウエルあたり１００μｌ用い
て感作される。ブロック操作は上記のように行われる。
モノクローナル抗体の病原体抽出物への結合はヒツジ抗
Ｓｅｎ−ＨＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）複合体を
用いて検出される。これらの結果を表２に示す。 表２：選択された病原体抽出物に対する初期交差反応性スクリーニング ──────────────────────────────────── 病原体抽出物^a 抗体 Set3 Set3G Set4 Set4G Sen1 Ptr1 Mf1 非感作 クラス ──────────────────────────────────── Sen15C6 0.02 0.03 0.03 0.02 2.25⁺ 0.02 0.01 0.01 IgG2a Sen17E9 0.00 0.01 0.02 0.00 0.34 0.01 0.00 0.01 IgG₁ Sen18C7 0.03 0.05 0.06 0.04 0.45 0.03 0.01 0.00 IgG₁ ──────────────────────────────────── ａ：Ｓｅｔ＝セプトリア・トリチシ；Ｓｅｎ＝セプトリア・ノドルム；Ｐｔｒ＝ ピレノホラ・トリチシ・レペンチス；Ｍｆ１＝マイコスフェレラ・フィジエンシ ス

【００５５】選択されたモノクローナル抗体上澄みは間
接エリザにおいて関連および非関連菌単離体の広げられ
た集団（パネル）に対して試験される。単離体抽出物は
５μｇ／ｍｌでマイクロタイタープートに結合される。
このスクリーニングの結果は表３に示されている。 表３：レプトスフェリア（セプトリア）・ノドルムモノクローナル抗体上澄みの 関連および非関連菌単離体の広げられた集団（パネル）に対する間接エリザによ るスクリーニング ─────────────────────────────── 平均吸光度（４０５ｎｍ）±標準偏差 種^a 単離体 Ｓｅｎ１５Ｃ６ Ｓｅｎ１８Ｃ７ Ｓｅｎ１１Ｅ３ ─────────────────────────────── 1 9 0.71±0.62 0.54±0.40 0.43±0.22 2 2 0.02±0.0 0.01±0.01 0.01±0.02 3 4 0.02±0.01 0.01±0.0 0.0 4 5 0.01±0.02 0.01±0.01 0.0 5 3 0.02±0.01 0.01±0.01 0.0 6 1 0.03 0.0 0.0 7 2 0.02±0.02 0.0 0.01±0.01 8 2 0.0 0.0 0.01±0.01 9 1 0.02 0.0 0.0 10 1 0.0 0.0 0.0 11 2 0.0 0.0 0.0 12 1 0.03 0.02 0.01 13 4 0.0 0.0 0.02±0.03 14 4 0.03±0.03 0.02±0.04 0.03±0.04 15 1 0.0 0.03 0.0 16 1 0.05 0.0 0.0 17 3 0.023±0.03 0.01±0.01 0.01±0.01 18 2 0.02±0.0 0.0 0.0 19 2 0.03±0.02 0.01±0.0 0.0 20 1 0.0 0.0 0.0 21 4 0.03±0.03 0.01±0.01 0.0 22 1 0.0 0.0 0.0 23 1 0.01 0.0 0.0 24 3 0.03±0.01 0.01±0.01 0.07±0.01 25 10 0.02±0.02 0.01±0.01 0.0 26 10 0.01±0.01 0.0 0.0 27 2 0.0 0.01±0.01 0.0 28 3 0.01±0.01 0.0 0.01±0.01 29 3 0.01±0.02 0.0 0.01±0.01 30 2 0.0 0.0 0.0 ─────────────────────────────── ａ：用いた種は以下のとおりである １＝セプトリア・ノドルム，２＝アルテルナリア(Alter
naria)種，３＝アスペルギルス(Aspergillus) 種，４＝
ビポラリス(Bipolaris) 種，５＝ボトチリス(Botrytis)
種，６＝コリジウム・ムサエ(Choridium musae) ，７＝
クラドスポリウム(Cladosporium)種，８＝コレトトリク
ム・グラミニコラ(Colletotrichum graminicola)，９＝
クルブラリア・ルナタ(Curvularia lunata) ，１０＝ジ
プロディア・ゴッシピナ(Diplodia gossypina)，１１＝
ドレクスレラ(Drechslera)種，１２＝エピコッカム・ニ
グラム(Epicoccum nigrum)，１３＝フサリウム(Fusariu
m)種，１４＝ヘルミントスポリウム・サチバム(Helmint
hosporium sativum)，１５＝ランベルテラ(Lambertell
a) 種，１６＝ランジア・レテオ−ビレッセンス(Lanzia
luteo-virescens)，１７＝レプトスフェリア・コラエ
(Leptosphaeria korrae)，１８＝モニリア(Monillia)
種，１９＝モルチエラ(Mortierella) 種，２０＝ミリオ
スクレロチニア・デンニシイ(Myriosclerothinia denni
sii)，２１＝ペニシリウム(Penicillium) 種，２２＝フ
ィアロホラ・グラミニコラ(Phyalophora graminicol
a))，２３＝シュードセルコポレラ・ヘルポトリコイデ
ス(Pseudocercosporella herportrichoides)，２４＝ピ
レノホラ・トリチシ−レペンチス(Pyrenophora tritici
-repentis)，２５＝ピチウム(Pythium) 種，２６＝リゾ
クトニア(Rhizoctonia) 種，２７＝リゾプス・ストロニ
フェール(Rhizopus stolonifer) ，２８＝スクレロチウ
ム(Sclerotium)種，２９＝セプトリア・トリチシ(Septo
riatritici)，３０＝ステムフィリウム・ベシカリウム
(Stemphylium vesicarium)

【００５６】数回のスクリーニングの後、抗体Ｓｅｎ１
５Ｃ６が二重抗体サンドイッチアッセイの性能に基づい
て選択される。Ｓｅｎ１５Ｃ６はプロテインＡアフィニ
ティークロマトグラフィーを用いて上澄みから精製され
る。マイクロウエルは炭酸緩衝液中の５μｇ／ｍｌであ
るモノクローナル抗体を捕獲抗体としてウエルあたり１
００μｌ用いて感作される。アッセイはレプトスフェリ
ア・ノドルム抗原抽出物、レプトスフェリア・ノドルム
感染小麦葉材料、正常小麦葉および緩衝液対照に対して
行われる。二重抗体アッセイの結果は表４に示されてい
る。ヒツジ抗セプトリア・ノドルム−西洋ワサビペルオ
キシダーゼ複合体が指標化抗体として使用される。 表４： ───────────────────────────────── 抗原 モノクローナル抗体 Ｓｅｎ１５Ｃ６ Ｓｅｎ１７Ｅ９ Ｓｅｎ１８Ｃ７ ───────────────────────────────── Ｓｅｎ１−００１ １０μｇ／ｍｌ ２．００＋ ２．００＋ ２．００＋ １μｇ／ｍｌ ０．６８３ ０．６３７ ０．３５５ 0.5μｇ／ｍｌ ０．１７９ ０．３０３ ０．１６９ Ｓｅｎ感染葉 １：１^* １．４８９ ０．５７６ ０．３３２ １：１０^* ０．３４９ ０．２９８ ０．２０８ １：１００^* ０．１４７ ０．２６８ ０．１５２ 正常葉 非希釈 ０．１０２ ０．２４３ ０．１７９ ──────────────────────────────── ＊＝ＰＢＳ緩衝液中の０．１％ＢＳＡ溶液への感染小麦葉の希釈

【００５７】これらの結果は、Ｓｅｎ１５Ｃ６抗体が抗
原抽出中ならびに感染葉中のレプトスフェリア・ノドル
ムを検出するためのイムノアッセイに使用され得ること
を示す。

【００５８】実施例４：「レプトスフェリア・コラエ」
モノクローナル抗体 オハイオ州立大学の研究者はレプトスフェリア・コラエ
に対するモノクローナル抗体の製造を以前報告した〔１
０〕。この抗体は間接エリザにおいてレプトスフェリア
・コラエの３単離体およびその他のレプトスフェリア関
連および非関連菌類の２１単離体からなる集団（パネ
ル）に対して交差反応性を決定するために試験される
（表５）。 表５：レプトスフェリア関連および非関連菌類に対する
レプトスフェリア・コラエモノクローナル抗体（ＬＫｃ
５０）の上澄みの１／１６希釈の間接エリザにおける交
差反応性のスクリーニング ａ：真の吸光度＝（試料の吸光度）−（緩衝液Ａの吸光
度） ＊：使用された単離体の種は以下のとおりである １＝レプトスフェリア・コラエ，２＝アルテルナリア
種，３＝ボトリチス・シネレア(Botrytis cinerea)，４
＝ビポラリス・ソロキニアナ(Bipolaris sorokiniana)
，５＝クルブラリア・ルナタ，６＝ドレクスレラ・ギ
ガンテア(Drechsleragigantea) ，７＝エピコッカム・
ニグラム，８＝エピコッカム種，９＝ヘルミントスポリ
ウム・サチバム，１０＝モルチエレラ・エピガマ(Morti
erella epigama) ，１１＝ピチウム・アファニデルマツ
ム(Pythium aphanidermatum)，１２＝ピチウム・グラミ
ニコラ(P. graminicola)，１３＝ピチウム・イレグラレ
(P. irregulare) ，１４＝ピチウム・ミリオチルム(P.
myriotylum) ，１５＝ピチウム・トルロサム(P. torulo
sum)，１６＝ピチウム・ウルチマム(P. ultimum)，１
７，１８＝セプトリア・ノドルム，１９＝ステムフィリ
ウム・ベシカリウム

【００５９】結果は、レプトスフェリアの種に対するそ
の他の公知モノクローナル抗体がレプトスフェリア属以
外の菌種と強い交差反応性であることを明らかに示す。
そのような交差反応性はエピコッカム属の菌類とで特に
不都合である。エピコッカム属は芝生中の一般的な腐生
菌であり、もし進展した症状の芝生が不注意にサンプリ
ングされれば問題を引き起こす。従って、この抗体は診
断には不適当である。

【００６０】実施例５：オンサイトアッセイ オンサイトアッセイは、抽出緩衝液２ｍｌ含有のボトル
中に入れられ、そして震盪した後に０．０２μｍフィル
ターでろ過される磨砕用研磨パッドを用いることにより
１枚の葉の上で行われる。ろ過した抽出物６滴を捕獲抗
体で被覆した吸着装置上に加える。各々の酵素指標化抗
体２滴、すすぎ溶液および酵素基質を次々に添加した
後、菌の抗原が試料中に存在するとき試験サークルは青
に変わる。仕上げ溶液２滴の添加は呈色反応を停止す
る。存在する抗原の量はＸ−ライト(X-Rite)メーターお
よび／またはアグリメーター(Agrimeter) を用いてＸ−
ライト単位で存在する相対的反射率を測定することによ
り測定され得る。

【００６１】感度の比較は迅速（オンサイト）アッセイ
とマルチウエルアッセイの間で正常小麦抽出物中のＳｅ
ｎ１抗原の希釈物に対して行われる。

【００６２】オンサイトアッセイの性能はまた、セプト
リア・ノドルムに感染した農園小麦を用いて評価される
（表６およひ７）。使用された小麦変種ツワイン(Twai
n) およびトラベラー(Traveler)は試験鉢中でセプトリ
ア・ノドルムに自然に感染させる。６植物体から最も下
の３枚の葉（依然分げつ段階にある植物）を除去し、そ
してエクストラック・パッド(Extrak pads) ２個／２ｍ
ｌ緩衝液Ｚ−５を用いて個々に抽出する。抽出物を０．
０２μｍ登録商標アノトップ(Anotop)フィルターでろ過
し、１９９０セプトリア・ノドルムおよびセプトリア・
トリチシ・マルチウエルキットでアッセイする。セプト
リア・ノドルム・マルチウエルキット中で強く反応する
試料はまたオンサイトキットにおいてアッセイされる。

【００６３】植物試料マトリックス作用はオンサイトア
ッセイでは観察されず、マルチウエイアッセイでスケー
ル外の値となる試料に対してＸ−ライトメーターの値は
３１〜８６の範囲である。

【００６４】 表６：１９９０セプトリア・ノドルム・マルチウエルキットおよび１９９０セプ トリア・ノドルム・オンサイトキットでのセプトリア・ノドルム感染小麦（ツワ イン栽培品種）のアッセイ ────────────────────────────── 粉胞子器 Ｓｎ^* Ｓｎ 試料 葉 組織死％ の有無 吸光度 Ｘ−ライト ４０５ｎｍ の値^a ────────────────────────────── ツワイン１ １ ４０ ＋ ２．０＋ ５３ ２ ０−１ − ０．００ −^a ３ ０ − ０．００ − ツワイン２ １ ５０ ＋ ２．０＋ ４０ ２ ０−１ − ０．００ − ３ ０ − ０．１９ − ツワイン３ １ ３０ ＋ ２．０＋ ５６ ２ ０−１ − ０．００ − ３ ０ − ０．１９ − ツワイン４ １ ４０ ＋ ２．０＋ ４５ ２ ０−１ − ０．００ − ３ ０ − ０．００ − ツワイン５ １ ２０ ＋ １．６４ ２５ ２ ０−１ − ０．３４ ８ ３ ０ − ０．１８ − ツワイン６ １ ３０ ＋ ２．０＋ ４６ ２ ０−１ − ０．００ − ３ ０ − ０．００ − ───────────────────────────── ａ：−＝試験されず ＊：Ｓｎ＝セプトリア・ノドルム

【００６５】葉は植物の下部から上に向けて１〜３と番
号が付される。真のＭＷ吸光度は式（試料の４５０ｎｍ
での吸光度−緩衝液Ｚ−５の４５０ｎｍでの吸光度）を
用いて計算される。緩衝液Ｚ−５はセプトリア・ノドル
ムキットにおいて０．３３２の吸光度を与える。セプト
リア・ノドルム対する陽性対照の吸光度は０．８２９で
ある。アッセイ当時の植物はおよそ生長段階♯２４であ
る。

【００６６】 表７：１９９０セプトリア・ノドルムおよび１９９０セプトリア・ノドルム・オ ンサイトキットでのセプトリア・ノドルム感染小麦（トラベラー栽培品種）のア ッセイ ─────────────────────────────── 粉胞子器 Ｓｎ^* Ｓｎ 試料 葉 組織死％ の有無 吸光度 Ｘ−ライト ４０５ｎｍ の値^a ─────────────────────────────── トラベラー１ １ ５０ ＋ ２．０＋ ８６ ２ １０ − ０．５１ −^a ３ ０ − ０．１３ − トラベラー２ １ ３０ ＋ ２．０＋ ４８ ２ ０−１ − ０．１７ − ３ ０ − ０．００ − トラベラー３ １ ３０ ＋ ２．０＋ ５５ ２ ０ − ０．００ − ３ ０ − ０．００ − トラベラー４ １ ５０ ＋ ２．０＋ ６８ ２ ０−１ − ０．２０ − ３ ０ − ０．２４ − トラベラー５ １ ３０ ＋ ２．０＋ ６５ ２ ５ − ０．２４ − ３ ０−５ − ０．０４ − トラベラー６ １ ２５ ＋ ２．０＋ ３１ ２ ０ − ０．００ − ３ ０ − ０．００ − 正常１ １ ０ − ０．００ １ (ND495) ２ ０ − ０．００ ０ ３ ０ − ０．００ ８ ────────────────────────────── ａ：−＝試験されず ＊：Ｓｎ＝セプトリア・ノドルム

【００６７】葉は植物の下部から上に向けて１〜３と番
号が付される。真のＭＷ吸光度は式（試料の４５０ｎｍ
での吸光度−緩衝液Ｚ−５の４５０ｎｍでの吸光度）を
用いて計算される。緩衝液Ｚ−５はセプトリア・ノドル
ムキットにおいて０．３３２の吸光度を与える。セプト
リア・ノドルム対する陽性対照の吸光度は０．８２９で
ある。アッセイ当時の植物はおよそ生長段階♯２４であ
る。

【００６８】これらの結果は、セプトリア・ノドルム抗
原がマルチウエルプレートキットおよびオンサイトキッ
トの両方を用いて検出され得ることを示す。

【００６９】本明細書に記載した特定の実施態様は本発
明のいくつかの面を説明するためのものであるから、本
発明はそれらの実施態様の範囲に限定されない。あらゆ
る同等の実施態様が本発明の範囲内であると理解される
べきである。実際に、ここに示したものの他に本発明の
種々の変形はこれまでの記載から当業者に明らかであろ
う。そのような変形もまた本発明の範囲である。

【００７０】

【図面の簡単な説明】

【図１】正常な小麦抽出物中のＳｅｎ１（００４）の希
釈に対する迅速アッセイおよびマルチウエルアッセイの
感度の比較を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マーク ダニエル クライマー アメリカ合衆国 ペンシルベニア 19401 ノリスタウン フォレスト ア ベニュー 450 アパートメント アー ル308 (72)発明者 サリー アン ミラー アメリカ合衆国 ニュージャージー 08109 ペンソウケン ウィンダム ロ ード 6313 (72)発明者 ジェームス ハーレイ リッテンバーグ アメリカ合衆国 ペンシルベニア 18944 パーカシー イースト ロック ロード 2360 (72)発明者 ギャリー デービッド グロサウス アメリカ合衆国 ニュージャージー 08016 バーリントン タウンシップ ランコカス ロード 2614 (56)参考文献 Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ, 1988，Ｖｏｌ．78，Ｎｏ．12，ｐ．1521 Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｅｔ．Ｍｙｃｏｌ．, 1989，Ｖｏｌ．27，Ｎｏ．５，ｐ．303 −312 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12P 21/08 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (14)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 レプトスフェリア・ノドルムと特異的に
   反応するが、レプトスフェリア属以外の種とは反応しな
   いモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞
   系。
2. 【請求項２】 アメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
   クションに受託番号ＡＴＣＣ ＨＢ １０１８５として
   寄託されている請求項１記載のハイブリドーマ細胞系。
3. 【請求項３】 レプトスフェリア・ノドルムと特異的に
   反応するが、レプトスフェリア属以外の種とは反応しな
   いモノクローナル抗体。
4. 【請求項４】 アメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
   クションに受託番号ＡＴＣＣ ＨＢ １０１８５として
   寄託されているハイブリドーマ細胞系により産生される
   請求項３記載のモノクローナル抗体。
5. 【請求項５】 レプトスフェリア・ノドルムと特異的に
   反応するが、レプトスフェリア属以外の種とは反応しな
   いモノクローナル抗体と試料を接触させ、そして抗体−
   抗原結合反応の有無を観察することからなる試料中のレ
   プトスフェリア属の菌類の有無を検出する方法。
6. 【請求項６】 試料を２種の抗体と反応させることから
   なり、該抗体の少なくとも一方がレプトスフェリア・ノ
   ドルムと特異的に反応するモノクローナル抗体であり、
   一方の抗体が固定化され、そして他方がリポーター分子
   で標識されている請求項５記載の方法。
7. 【請求項７】 抗体の一方がポリクローナル抗体である
   請求項６記載の方法。
8. 【請求項８】 モノクローナル抗体がアメリカン・タイ
   プ・カルチャー・コレクションに受託番号ＡＴＣＣ Ｈ
   Ｂ １０１８５として寄託されているハイブリドーマ細
   胞系により産生される請求項５、６または７に記載の方
   法。
9. 【請求項９】 固体支持体に結合した抗体およびリポー
   ター分子で標識された抗体からなり、両方の抗体がレプ
   トスフェリア属の菌類の種と反応し得、そして少なくと
   も一方がレプトスフェリア・ノドルムと特異的に反応す
   るが、レプトスフェリア属以外の種とは反応しないモノ
   クローナル抗体である診断キット。
10. 【請求項１０】 キットがオンサイトキットである請求
    項９記載のキット。
11. 【請求項１１】 抗体の一方がポリクローナル抗体であ
    る請求項９記載のキット。
12. 【請求項１２】 モノクローナル抗体がアメリカン・タ
    イプ・カルチャー・コレクションに受託番号ＡＴＣＣ
    ＨＢ １０１８５として寄託されているハイブリドーマ
    細胞系により産生される請求項９、１０または１１に記
    載のキット。
13. 【請求項１３】 （ａ）レプトスフェリア・ノドルムの
    抽出物で供与動物を免疫化し、 （ｂ）該免疫化供与動物から免疫適格性Ｂ細胞を単離
    し、 （ｃ）該Ｂ細胞と不死細胞系の細胞を融合し、そして （ｄ）融合物をスクリーニングし、そしてレプトスフェ
    リア・ノドルムに対して特異性を有する抗体を産生する
    融合物を同定する、 ことからなるレプトスフェリア・ノドルムと特異的に反
    応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細
    胞系の製造方法。
14. 【請求項１４】 レプトスフェリア・ノドルムと特異的
    に反応するモノクローナル抗体を産生し得るハイブリド
    ーマ細胞系を抗体産生誘導条件下で培養し、そしてその
    ようにして産生された抗体を慣用の方法により単離する
    ことからなるレプトスフェリア・ノドルムと特異的に反
    応するモノクローナル抗体の製造方法。