DE69124317T2

DE69124317T2 - Monoklonale Antikörper gegen Leptosphaeria

Info

Publication number: DE69124317T2
Application number: DE69124317T
Authority: DE
Inventors: Mark Daniel Clymer; Gary David Grothaus; Sally Ann Miller; Frank Peter Petersen; James Harley Rittenburg
Original assignee: Ciba Geigy AG
Current assignee: Syngenta Participations AG
Priority date: 1990-08-21
Filing date: 1991-08-13
Publication date: 1997-11-13
Anticipated expiration: 2011-08-14
Also published as: US5217871A; CA2049472A1; NZ239449A; PT98706B; CA2049472C; IL99222A0; IL99222A; ES2099148T3; JPH04258286A; IE912950A1; EP0472498B1; HK1003006A1; DK0472498T3; GR3022544T3; ATE148163T1; EP0472498A1; PT98706A; AU8264491A; DE69124317D1; AU650037B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der diagnostischen Pflanzenpathologie. Insbesondere betrifft die Erfindung monoclonale Antikörper, die beim Nachweis von Arten der pathogenen Pilzgattung Leptosphaeria nützlich sind. Genauer betrifft die vorliegende Erfindung monoclonale Antikörper, die spezifisch mit einer einzelnen Art von Leptosphaeria reagieren.

Pilze als Krankheitserreger

Pilze als Gruppe erzeugen viele Pflanzenerkrankungen. Zu Diskussionszwecken können die Pilze gemäß ihrer Zugehörigkeit zu einer der drei taxonomischen Hauptklassen klassifiziert werden: Basidiomyzeten, Phycomyzeten oder Ascomyzeten.
Basidiomyzeten: Mitglieder dieser Klasse werden durch die Anwesenheit einer sexuellen sporenbildenden Struktur, die als ein Basidium bekannt ist, identifiziert. Pathogene Formen umfassen Brand-, Rost- und Fleischarten, wie Ständerpilze. Beispiele umfassen Weizenrost, Weißpinien-Kräuselkrankheit, Kieferrost und brandverursachende Erkrankungen bei Getreide, Hafer, Gersten, Zwiebeln und Weizen.
Ascomyzeten: Mitglieder dieser Klasse besitzen eine spezialisierte reproduktive Struktur (einen Ascus), in dem die Meiose und die sexuelle Sporenbildung stattfinden. Beispiele der üblicheren Pflanzenerkrankungen, in denen Ascomyzeten als ätiologische Erreger identifiziert wurden, umfassen: staubförmiger Mehltau auf Getreide, Früchten und vielen anderen Nutzpflanzen, Dutch-Elm-Krankheit, Mutterkombefall von Getreide, braune Pfirsich- und Pflaumen-Wurzelfäule, Schwarzfleckenkrankheit von Rosen sowie Apfelschorf.
Phycomyzeten: Mitglieder dieser Klasse gelten als primitiver als die Mitglieder sowohl der der Ascomyzeten als auch der Basidiomyzeten, wobei ihr unterscheidendes morphologisches Merkmal das Fehlen von Myzelquerwänden ist. Beispiele der von Mitgliedern der Klasse hervorgerufenen Krankheiten umfassen den flaumigen Mehltau von Trauben und anderen Wirten, Wurzelfäule und die Spätfäule von Kartoffeln und Tomaten.
Bezüglich der vorliegenden Erfindung sind Mitglieder der Klasse der Ascomyzeten und der Familie der Pleosporaceae und besonders der Gattung Leptosphaeria von speziellem Interesse. Die Gattung ist eine große, die viele Arten enthält, die Krankheitserreger für Pflanzen von großer wirtschaftlicher Bedeutung sind. Eine jüngst erfolgte Zusammenstellung von pflanzenpathogenen Pilzen in den USA führt 140 Leptosphaeria-Arten als pflanzliche Krankheitserreger auf (Farr et al., Fungi on plants and plant products in the U.S., APS Press, S. 760-764, 1989). Der Fruchtkörper von Leptosphaeria ist ein ostioliertes perithezoides Pseudothecium, das bitunicate Asci enthält, die jeweils acht Ascosporen mit drei oder mehreren Septationen enthalten. In vielen Fällen sind die Ascosporen der primäre Überlebensmechanismus der pathogenen Leptosphaeria-Arten in Abwesenheit einer empfänglichen Wirtspflanze oder unter ungünstigen Umweltbedingungen. Ascosporen dienen oft auch als die primäre Quelle für ein Inokulum in einer Wirtspflanze. Viele Leptosphaeria-Arten produzieren auch nichtsexuelle Konidienstadien. Konidien können in Pycnidien, in Acervuli oder auffreien Konidiophoren gebildet werden. In vielen Fällen kommt das Konidienstadium am häufigsten in der Natur vor. Das Konidienstadium wird üblicherweise getrennt von dem sexuellen Stadium auf morphologischer Basis klassifiziert. So besitzen Arten in der Gattung Leptosphaeria Konidienstadien, die als eine Reihe unterschiedlicher Gattungen der Fungi imperfecti (Deuteromycetes) klassifiziert werden.
Das System der Klassifikation von asexuellen Stadien der Ascomyzeten-Pilze gilt allgemein als ein künstliches Systern, aber es wird aus praktischen Gründen fortgeführt, da die sexuellen Stadien oft schwierig in der Natur zu finden sind und schwierig in Reinkultur zu induzieren sind. Jedoch wird der Grad der Verwandtheit der Arten untereinander in der sexuellen Klassifikation widergespiegelt, d.h. zwei Leptosphaeria-Arten sind wahrscheinlich genetisch miteinander enger verwandt als zwei Septoria-Arten, die auf der Basis morphologischer Ähnlichkeiten des asexuellen Stadium bezeichnet werden.
Die pathogenen Arten von Leptosphaeria verursachen Erkrankungen auf den Pflanzenteilen oberhalb der Erde meistens an den Blättern und den Stämmen. Die Symptome sind Läsionen, die einen großen Anteil der Blattfläche in unregelmäßigen oder regelmäßigen Mustern in Abhängigkeit von der Pflanzen umfassen können. Eine Anzahl von schweren und ökonomisch schädlichen Erkrankungen weltweit wird durch Leptosphaeria- Arten hervorgerufen und benötigt die Verwendung resistenter Sorten und/oder Fungizide zur Bekämpfung. Leptosphaeria nodorum, besser bekannt durch sein asexuelles Stadium septoria nodorum verursacht signifikante Ernteverluste bei Weizen weltweit, außer er wird durch Fungizide oder resistente Sorten bekämpft.
L. nodorum zeigt eine latente Periode von mehreren Wochen nach der Infektion, während der der Krankheitserreger im Gewebe wächst, aber die Krankheitssymptome (Flecken an Blatt und Spelze) werden nicht erzeugt. Fungizide sind bei der Bekämpfung der Krankheit am effektivsten, wenn sie während der Latenzperiode angewendet werden, bevor ein signifikanter Schaden eintritt und sekundär Inokuli gebildet werden, die die Ausbreitung der Krankheit erlauben. Jedoch sind routinemäßige präventive Fungizidbehandlungen üblicherweise ökonomisch oder umweltmäßig nicht gerechtfertigt, und ein System, das einen sehr frühen Nachweis dieses Krankheitserregers, bevorzugt während der Latenzphase der Krankheitsentwicklung, erlaubt, würde sehr nützlich sein, um sicherzustellen, daß die Fungizide in geeigneter Weise angewendet werden und den maximalem ökonomischen Nutzen ergeben. Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Umsetzung eines solchen Systems in die Praxis, indem monoclonale Antikörper bereitgestellt werden, die die Anwesenheit von L. nodorum-Antigenen nachweisen können und somit die frühe Diagnose der Krankheit und die mögliche Verhinderung weitverbreiteter Verluste an der Weizenernte erlauben.

Technik der monoclonalen Antikörper

Monoclonale Antikörper können durch jede beliebige Technik hergestellt werden, die die Produktion von Antikörpermolekülen durch kontinuierliche Zellinien in Kultur erlauben. Diese umfassen die ursprünglich von Köhler und Milstein (1980) entwickelte Hybridomatechnik, die menschliche B- Zell-Hybridomatechnik (Kosbor et al., 1983) und die EBV-Hybridomatechnik zur Produktion von menschlichen monoclonalen Antikörpern (Cole et al., 1985). Jede Zellinie synthetisiert ein homogenes Immunglobulin, das nur einen einer Vielzahl von Antikörpertypen darstellt, die ein Tier als Antwort auf ein Antigen in vivo synthetisieren kann. Da jeder Immunoglobulin-produzierende don durch den einzelnen Antikörpertyp, den er produziert, gekennzeichnet ist, wurde der Ausdruck monoclonaler Antikörper angenommen. Die Vorteile monoclonaler Antikörper sind zahlreich. Sie können in sehr großen Mengen erhalten werden, die Herstellung ist bezüglich der Antigenreaktivität homogen und verbleibt so im Verlauf der Zeit.
Das Prinzip der Hybridoma/monoclonaler Antikörper-Technik gründet sich auf die Beobachtung, daß bei Fusion von zwei sornatischen Zellen das so erhaltene Hybrid die Eigenschaften beider Stammzelltypen zeigt. Im Falle der Produktion monoclonaler Antikörper leitet sich die Fähigkeit, den speziellen Antikörper zu synthetisieren, von einer immunkompetenten Zelle (üblicherweise eine Milzzelle), die einem immunisierten Spendertier entnommen wurde, ab, wohingegeben die Fähigkeit zur kontinuierlichen Teilung in einer Zellkultur von dem anderen Fusionspartner, einer Tumor- Zellinie (oft ein Myelom), beigesteuert wird. Frühe Fusionen wurden durch die Tatsache erschwert, daß die Myeloma-Zellinie auch einen monoclonalen Antikörper produzierte. So produziert das Hybrid oft zwei Typen von monoclonalen Antikörpern, einen mit Myelomaursprung und den anderen, der durch die genetische Information der immunkompetenten Zelle gesteuert wurde. Anschließend wurden Tumor-Zellinien, die keine eigenen monoclonalen Antikörper produzieren konnten, verwendet, z.B. SP2/0-Ag14 oder X63- Ag8.653, wodurch die Analyse der so erhaltenen Fusionsprodukte vereinfacht wurde.
Eine weitere technische überlegung betrifft den Weg zur Selektion der erfolgreichen Fusionsereignisse (Hybridzellen) aus den zwei Stammzelltypen. Routinemäßig werden eine Million oder mehr Zellen jedes Typs in dem Fusionsprotokoll verwendet und da die Fusion nicht mit einer Frequenz von 100% eintritt, kann der Versuch, die Fusionsprodukte aus dem hohen Hintergrund nichtfusionierter oder selbstfusionierter Stammzellen zu isolieren, schrecklich sein. Wie erwähnt, werden Hybridome durch die Fusion von kurzlebigen Antikörper-produzierenden Zellen (Milzzellen) und langlebigen Myelomazellen gebildet. Das gewünschte Ergebnis ist eine langlebige Zelle, die den Antikörper produziert. Da die Milzzellen eine begrenzte Lebensspanne in der Kultur besitzen, kann man einfach eine geeignete Zeitspanne abwarten, bis alle nichtfusionierten oder selbstfusionierten Milzzellen sterben. Jedoch muß man noch die langlebigen Antikörper-produzierenden Zellen von den langlebigen, keine Antikörper-produzierenden Zellen aus der so erhaltenen Population isolieren. Ein beliebtes Mittel zur Selektion von Hybridzellen ist das sogenannte HAT-Selektionssystem. Bei diesem System wird das Enzym Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (HGPRT) verwendet. Dieses Enzym wirkt in dem Purin-Salvage-Stoffwechselweg in Säugerzellen. Diese Zellen sind auch zu einer de-novo-Synthese von Purinen befähigt. Unter den häufigsten Bedingungen funktionieren beide Stoffwechselwege wahrscheinlich bis zu einem gewissen Ausmaß. Wenn einer Zelle HGPRT fehlt, ist der Salvage- Stoffwechselweg blockiert, und Purine müssen aus Nichtpurinmaterialien hergestellt werden.
Die Chemikalie 8-Azaguanin ist ein Antimetabolit, der die Stelle des Purins Guanin einnehmen kann und es in einigen seiner normalen Reaktionen ersetzen kann. Azaguanin wird in die DNA eingebaut und stört das normale Wachstumsmuster, was zum Zelltod führt. Da Azaguanin recycelt werden muß, kann jede Zelle, der die HGPRT-Aktivität fehlt, Azaguanin nicht verwerten und wird in dessen Anwesenheit wachsen.
Ein selektives System, das mit dem gleichen Enzym, aber in entgegengesetztem Sinn funktioniert, nämlich, daß HGPRT-positive Zellen selektioniert werden, ist von J.W. Littlefield (1964) beschrieben. Es wird als HAT bezeichnet und enthält Hypoxanthin-Aminopterin und Thymidin (HAT-Medium). Aminopterin ist ein Antimetabolit, der die de-novo-Purinsynthese und die Methylierung von Desoxyuridylat in Thymidylat verhindert. Hypoxanthin kann als recycelbares Purin in dem Fall dienen, daß Aminopterin die de-novo-Purinbiosynthese blockiert, während das Thymidin die Notwendigkeit der Methylierung von Thymidilat überwindet. So proliferiert in Gegenwart von Aminopterin jede Zelle mit einer positiven HGPRT-Aktivität, während Zellen mit negativer HGPRT-Aktivität absterben.
Eine Alternative zu dem HAT-System ist die Verwendung eines HMT-Mediums anstelle von HAT. Bei HMT wird Amethopterin (Methotrexat) anstelle von Aminopterin verwendet. Dieses Verfahren funktioniert nach dem gleichen Prinzip, aber das HMT-Medium ist etwas weniger toxisch für die wachsenden Hybridome, und daher können die Zellen für eine längere Zeitspanne auf dem Medium gelassen werden.
In dem zur Selektion gemäß den erfindungsgemäßen Beispielen verwendeten Hybridsystem sind die Myelomazellen Azaguaninresistent und Aminopterin-empfänglich, d.h. sie sind HGPRT- negativ. So sterben sie in Gegenwart von Amethopterin ab. Die Antikörper-produzierenden Zellen sind HGPRT-positiv. Durch Fusionieren der Zellen und ihre Züchtung in HMT-Medium ohne Azaguanin (HT-Medium) werden die erfolgreich fusionierten Zellen selektioniert, weil die Myelomazellen, die die proliferierende Zellinie darstellen, nur wachsen können, wenn HGPRT-Aktivität vorhanden ist, und diese Aktivität muß durch die HGPRT-positive Zellinie zur verfügung gestellt werden. Die Antikörper-produzierende HGPRT-positive Zellinie wird in diesem Medium nicht abgetötet Sie lebt eine Zeit, aber proliferiert nicht.
So werden durch Fusion von Zellen in HAT- oder HMT-Medium Systeme produziert, in denen Myelomazellen und Antikörperproduzierende Zellen lang genug wachsen können, um Hybridzellen zu produzieren, aber in denen nur die Hybridzellen überleben und proliferieren können. Nach der Selektion wird jeder Hybridomalcon dann auf die Fähigkeit, den speziellen Antikörper von Interesse produzieren zu können, abgesucht.
Die vorliegende Erfindung betrifft Hybridomazellinien, die monoclonale Antikörper produzieren, die spezifisch mit mindestens einer Art der Gattung Leptosphaeria reagieren, aber nicht mit Arten außerhalb der Gattung reagieren. In einer Ausführungsform reagiert der monoclonale Antikörper spezifisch mit einer einzelnen Art von Leptosphaeria. In einer bevorzugten Ausführungsform reagiert der Antikörper spezifisch mit Leptosphaeria (Septoria) nodorum. In der Beschreibung wird der Name Leptosphaeria austauschbar mit dem Namen seines anarnorphen oder asexuellen Stadiums verwendet. So reagiert ein Antikörper, der mit L. nodorum reagiert, auch mit dem asexuellen Stadium Septoria nodorum.
Die Verfügbarkeit dieser monoclonalen Antikörper ergibt ein Mittel zur Diagnose von Leptosphaeria-Infektionen in Pflanzenmaterial. So wird ein Verfahren zur Diagnose solcher Infektionen bereitgestellt, bei dem man eine Pflanzenprobe, die vermutlich Antigene des Krankheitserregers von Interesse enthält, mit einem Antikörper in Kontakt bringt, der für die Krankheitserreger spezifisch ist und die Anwesenheit oder Anwesenheit der Reaktion zwischen dem Antikörper und dem in der Probe vorhandenen Antigen beobachtet. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Assay als ein Sandwichassay oder ein doppelter Antikörperassay durchgeführt. Ein erster Antikörper, der mit dem Krankheitserreger von Interesse reagiert, wird mit der Pflanzenprobe in Kontakt gebracht, und dann wird ein zweiter Antikörper, der auch mit dem Krankheitserreger von Interesse reagiert, zugesetzt, um einen Antikörper-Antigen- Antikörper-Komplex zu bilden, wenn das Antigen in der Probe vorhanden ist.
Ebenfalls in dieser Hinsicht bereitgestellt werden Kits zur Detektion von Leptosphaeria, die einen Antikörper, der bevorzugt immobilisiert ist, der mit der Art von Interesse reagiert, und einen detektierbar markierten Antikörper, der mit der Art von Interesse reagiert, umfassen. Mindestens einer der Antikörper sollte ein erfindungsgemäßer monoclonaler Antikörper sein.

Hybridamaherstellung

Herstellung eines Leptosphaeria-Extrakts:

Leptosphaeria-Extrakt, der das bei der Produktion von monoclonalen Antikörpern gegen Leptospbaeria verwendeten Antigen enthält, kann aus einer Leptosphaeria-Kultur hergestellt werden. Leptosphaeria kann auf einem verfestigten Agar-Kulturmedium und/oder in einem Flüssigkulturmedium gezüchtet werden. Beispiele dafür sind ohne Beschränkung Czapek Dox V-8, Hefemalz, Kartoffeldextrose, Hafermehl. In einer bevorzugten Ausführungsform ist Czapek Dox bevorzugt (Eyal et al., 1987). Die Kulturen können unter Verwendung von Standardverfahren geerntet werden.
Extrakte aus den geernteten Leptosphaeria-Pilzen können unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren hergestellt werden. In einer spezifischen Ausführungsform, wie nachstehend beschrieben, können Leptosphaeria-Extrakte nach auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren hergestellt werden, wie beispielsweise durch die Verarbeitung der geernteten Leptosphaeria durch eine Dyno-Mühle oder einen Waring-Mischer, oder durch Beschallen, Homogenisieren oder Zerreißen.

Immunisierung:

Das Programm zur Inokulierung ist nicht kritisch und kann jedes beliebige sein, das normalerweise zu diesem Zweck auf dem Gebiet verwendet wird. Solche Verfahren sind beispielsweise in Goding (1986) beschrieben.
Ein nützliches Programm ist eines, bei dem eine erste Immunisierung des Antigens in Kombination mit einem geeigneten Adjuvans intraperitoneal verabreicht wird. Booster-Injektionen können dann in zweiwöchigen Intervallen verabreicht werden. Zwei oder mehr Booster-Injektionen können gegeben werden. Den Tieren wird aus der Schwanzvene Blut abgenommen, um zu bestimmen, ob das Serum Antikörper, die für das Antigen von Interesse spezifisch sind, enthält. Das Tier wird anschließend getötet und die Milz wird entnommen, um eine Quelle für die Lymphozyten zu ergeben.

Fusion:

Fusionsverfahren zur Erzeugung von Hybridomen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt, und jedes der bekannten Verfahren ist zur Produktion von Hybridomen, die Leptosphaeria-spezifische monoclonale Antikörper produzieren, nützlich. Das Grundverfahren, das in den vorliegenden Beispielen verwendet wurde, ist eine Modifikation, des von Köhler und Milstein (1975) und Hämmerling (1977) entwickelten Verfahrens. Andere Techniken, die jüngst verfügbar wurden, wie die menschliche B-Zell-Hybridomatechnik (Kozbor und Roder, 1983) und die EBV-Hybridomatechnik (Cole et al., 1985) können verwendet werden, um menschliche monoclonale Antikörper zu produzieren und fallen unter den Umfang der Erfindung.
In einer Ausführungsform werden Milzzellen (oder alternativ periphere Blutlymphozyten) aus dem immunisierten Tier isoliert, und die Anzahl der Zellen wird gezählt. T-Zellen können als Feeder-Schicht in einer Konzentration von 10 Millionen Zellen/10 ml Medium verwendet werden. Eine geeignete unsterbliche Zellinie, bevorzugt eine Myelomazellinie, wird ausgewählt und den Lymphozyten in einem Verhältnis von etwa 4:1 Lymphozyten:Myeloma zugesetzt. Eine nützliche Myelomazellinie ist die NS1-Zellinie. Bei Raumtemperatur wird PEG (Polyethylenglykol) 1500 den vereinigten Zellen zugesetzt und dann langsam mit DMEM verdünnt. Nach der Zentrifugation wird vorgewärmtes HAT-Medium dem Pellet zugesetzt, das dann suspendiert wird. Die Probe wird weiter mit HAT-Medium verdünnt, und kleine Proben werden auf die Kavitäten einer Mikrotiterplatte verteilt. Die Platten werden dann bei 9% CO&sub2; mit einer Feuchtigkeit von mindestens 95% inkubiert. Die Zellen werden erneut nach 5 bis 7 Tagen mit HAT-Medium beschickt. Cluster von Hybridomazellen beginnen nach etwa 5 bis 7 Tagen aufzutreten. Weitere Einspeisungen erfolgen mit HAT-Medium.
In einer Ausführungsform können Krankheitserregerextrakte verwendet werden. In einer spezifische Ausführungsform kann Material aus einer mit dem Pilz infizierten Pflanze in einem doppelten Antikörperassay verwendet werden. Ein solcher doppelter Antikörperassay kann mit der Verwendung eines polydonalen Antikörpers gegen Leptosphaeria als Einfangantikörper dem Pflanzenmaterial, einem monoclonalen Antikörperüberstand und einem Anti-Maus-Enzymkonjugat verbunden sein.

Screening:

Diejenigen Hybridomazellen, die Antikörper gegen Leptosphaeria produzieren, werden unter Verwendung von präpariertem Pilzmaterial der speziellen Art von Interesse in einem ELISA-Format identifiziert. In einer Ausführungsform können Krankheitserregerextrakte verwendet werden. In einer spezifischen Ausführungsform kann Material aus einer mit dem Pilz infizierten Pflanze in einem doppelten Antikörperassay verwendet werden. Ein solcher Antikörperassay kann mit der Verwendung eines polydonalen Antikörpers gegen Leptosphaeria als Einfangantikörper, des Pflanzenmaterials, eines monoclonalen Antikörperüberstands und eines Anti- Maus-Enzymkonjugats verbunden sein. Diejenigen Kavitäten, die positive Antworten in dem ELISA zeigen, werden subcloniert, um reine Stämme der Hybridomazellen zu selektionieren. Die subclonierten Zellinien werden auf die spezifische Antikörperaktivität gegen Pilzkomponenten erneut getestet.
Um den Grad der Spezifität der ausgewählten Antikörper zu bestimmen, ist es zweckmäßig, sie weiter gegen eine Reihe von krankheitserregenden Pilzen zu testen, die mit Leptosphaeria entweder verwandt oder nicht-verwandt sein können. Beispielsweise sollten zum Erhalt eines L. (S.) nodorumspezifischen Antikörpers ausgewählte Antikörper gegen andere Leptosphaeria-Arten sowie gegen entfernte verwandte oder nicht-verwandte Arten getestet werden.
Beispiele für die Paletten, die für die erfindungsgemäßen Zwecke nützlich sind, sind in den Tabellen 1 und 3 angegeben. Es wird allgemein empfohlen, die Absuchungen sowohl in einem einfachen als auch einem doppelten Antikörpertest durchzuführen, da bestimmte Antikörper in einem Test, aber nicht in dem anderen nützlich sind.

Charakterisierung der Antikörper:

Eine Reihe von Antikörpern, die unter den Umfang eines oder mehrerer Patentansprüche der Erfindung fallen, wurden nach dem beschriebenen Verfahren produziert. In einer Ausführungsform wurde eine Anzahl von monoclonalen Antikörpern produziert, die spezifisch mit L. (S.) nodorum reagieren. In einer spezifischen Ausführungsform ist der Antikörper Sen15C6 (ATCC HB 10185), ein Antikörper mit hoher Spezifität, der in einem doppelten Antikörperformat verwendet werden kann. Sen15C6 reagiert stark mit L. nodoruin. Die einzige Ausnahme ist eine beobachtete positive Reaktion mit der "Art" S. avenae f. sp. triticea. Diese nominale Art ist in der Tat morphologisch mit L. (S.) nodorum identisch und verursacht ähnliche Symptome bei Infektion von Weizen. So nimmt man an, daß diese beiden Arten die gleichen sind. Daher ist der von dem Hybridom Sen15C6 produzierte Antikörper bei der genauen und spezifischen Identifikation von L. nodorum- Antigenen nützlich. Dieser monoclonale Antikörper gehört der immunglobulären Subklasse IgG2a an. Jedoch wurden andere ähnliche Antikörper anderer Immunoglobulin- Subklassen ebenfalls hergestellt.
Obwohl Hybridome und monoclonale Antikörper, die L. nodorum identifizieren, eine bevorzugte Ausführungsform darstellen, ist die vorliegende Erfindung nicht darauf beschränkt. Unter Verwendung der Immunisierung der Fusions- und Selektionsverfahren, die beschrieben wurden, können speziesspezifische monoclonale Antikörper auch hergestellt werden, wobei der geeignete Speziesextrakt als Immunogen verwendet wird. Beispielsweise fallen monoclonale Antikörper mit Spezifität für die Arten L. korrae, L. maculans, L. pratensis und L. sacchari auch unter den Umfang der Erfindung.

Diagnastisches Verfahren und Kit

Wie vorstehend gezeigt, können die infragekommenden Krankheitserreger ernsthafte Schädigungen an von ihnen infizierten Pflanzen hervorrufen, und eine frühe Diagnose ist daher in hohem Maße wünschenswert. Die erfindungsgemäßen Antikörper bieten nun ein Verfahren, nach dem Krankheitserreger in Pflanzenmaterial vor dem Auftreten irgendwelcher sichtbarer Krankheitssymptome auf der Pflanze nachgewiesen werden können.
Die vorstehend beschriebenen Antikörper können als die Basisreagentien einer Reihe von unterschiedlichen Immunoassays zur Bestimmung der Anwesenheit einer speziellen Art in Pflanzenmaterial verwendet werden. Allgemein ausgedrückt können die Antikörper in jedem Immunoassaytyp unabhängig davon, ob er qualitativ oder quantitativ ist, verwendet werden. Dies umfaßt sowohl einseitige als auch zweiseitige oder Sandwichassays des nicht-kompetitiven Typs sowie die traditionellen kompetitiven Bindungsassays. Die Antikörper können auch in einem on-site Assayformat verwendet werden, wobei beispielsweise ein Immunoassayfluß durch eine Vorrichtung oder die nachstehend beschriebenen Verfahren verwendet werden.
Besonders bevorzugt wegen der leichten Detektion und der quantitativen Natur ist der Sandwich- oder doppelte Antikörperassay, in dem eine Anzahl von Variationen vorkommen, die alle erfindungsgemäß umfaßt werden sollen.
Beispielsweise wird in einem typischen einfachen Assay ein nichtmarkierter Antikörper auf einem festen Substrat immobilisiert, und die zu testende Probe wird mit dem gebundenen Molekül nach einer geeigneten Inkubationsperiode, d.h. einer Zeitspanne, die ausreicht, die Bildung eines binären Antikörper-Antigen-Komplexes zu erlauben, in Kontakt gebracht. Nichtgebundenes Material wird abgewaschen. Dann wird ein zweiter Antikörper, der mit einem Reportermolekül, das ein nachweisbares Signal induzieren kann, markiert ist, zugesetzt und inkubiert, wobei ausreichend Zeit zur Bildung eines ternären Komplexes aus Antikörper-Antigen-markierter Antikörper gelassen wird. Jedes nichtumgesetzte Material wird abgewaschen, und die Anwesenheit des Antigens wird durch Beobachten eines Signals bestimmt oder kann durch Vergleich mit einer Kontrollprobe, die bekannte Antigenmengen enthält, quantitativ bestimmt werden. Variationen des einfachen Assays umfassen den gleichzeitigen Assay, bei dem sowohl die Probe als auch der Antikörper gleichzeitig dem gebundenen Antikörper zugesetzt werden oder einen umgekehrten Assay, bei dem der markierte Antikörper oder die zu testende Probe zuerst vereinigt werden, inkubiert werden und dem nichtmarkierten oberflächengebundenen Antikörper zugesetzt werden. Diese Techniken sind einem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt, und die Möglichkeit kleinerer Variationen ist leicht offensichtlich. Der hier verwendete Ausdruck "Sandwichassay" soll alle Variationen auf der Grundlage der zweiseitigen Technik umfassen.
Für die erfindungsgemäßen Immunoassays ist der einzige limitierende Faktor, daß mindestens ein Antikörper die benötigte erfindungsgemäße Spezifität haben muß. So ist eine Anzahl möglicher Kombinationen möglich. Beispielsweise kann ein Antikörper polydonal und der andere monoclonal sein. Alternativ kann ein Antikörper ein allgemeiner Antikörper sein, der sowohl den Krankheitserreger von Interesse als auch andere Pilze bindet, während der zweite Antikörper für den Krankheitserreger von Interesse spezifisch ist. Ebenso können beide Antikörper für den Krankheitserreger von Interesse spezifisch sein.
Als ein spezifischeres Beispiel ist in einem typischen einfachen Sandwichassay ein allgemeiner Leptosphaeria-bindender Antikörper entweder covalent oder passiv an eine feste Oberfläche gebunden. Die feste Oberfläche ist üblicherweise Glas oder ein Polymeres, wobei die am häufigsten verwendeten Polymere Cellulose, Polyacrylamid, Nylon, Styrol, Polyvinylchlorid oder Polypropylen sind. Die festen Träger können in Form von Röhrchen, Kügelchen, Scheibchen oder Mikroplatten oder jeder anderen Oberfläche, die zur Durchführung eines Immunoassays geeignet ist, vorliegen. Die Bindungsverf ahren sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Nach der Bindung wird der Festphasenantikörperkomplex als Vorbereitung für die Testprobe gewaschen. Ein Aliquot des zu testenden Pflanzenextrakts wird dann dem Festphasenkomplex zugesetzt und bei 25ºC für eine Zeitspanne inkubiert, die ausreicht, die Bindung jedes vorhandenen Leptosphaerias an den Antikörper zu erlauben. Die Inkubationsperiode variiert, aber liegt im allgemeinen im Bereich von etwa 2 Minuten bis etwa 16 Stunden. Nach der Inkubationsperiode wird der Komplex Antikörper-Leptosphaeria-feste Phase gewaschen und getrocknet, mit einem zweiten Antikörper, der für Leptosphaeria spezifisch ist, inkubiert. Der zweite Antikörper ist mit einem Reportermolekül verbunden, dessen sichtbares Signal verwendet wird, um die Bindung des zweiten Antikörpers an jedes Antigen in der Probe anzuzeigen. Der hier verwendete Ausdruck "Reportermolekül" bedeutet ein Molekül, das aufgrund seiner chemischen Natur ein analytisch nachweisbares Signal ergibt, das die Detektion von Antigen-gebundenem Antiklrper erlaubt. Die Detektion muß mindestens relativ quantifizierbar sein, um die Bestimmung der Antigenmenge in der Probe zu erlauben. Dies kann in absoluten Ausdrücken berechnet werden oder kann im Vergleich mit einem Standard (oder einer Reihe von Standards), der eine bekannte normale Antigenmenge enthält, erfolgen.
Die am häufigsten verwendeten Reportermoleküle bei diesem Assaytyp sind entweder Enzyme, Fluorophore oder Radionuklid-enthaltende Moleküle. Im Falle eines Enzymimmunoassays wird ein Enzym an den zweiten Antikörper oft mittels Glutaraldehyd oder Periodat konjugiert. Wie jedoch leicht klar ist, gibt es eine breite Vielzahl von unterschiedlichen Konjugationstechniken, die einem Fachmann gut bekannt sind. Üblicherweise verwendete Enzyme umfassen unter anderem Meerrettichperoxidase, Glucoseoxidase, β-D-Galactosidase und alkalische Phosphatase. Die mit den spezifischen Enzymen zu verwendenden Substrate werden im allgemeinen wegen der Erzeugung einer nachweisbaren Farbveränderung nach Hydrolyse durch das entsprechende Enzym ausgewählt. Beispielsweise eignet sich p-Nitrophenylphosphat zur Verwendung mit alkalischen Phosphatase-Konjugaten. Für Peroxidase-Konjugate werden üblicherweise 1,2-Phenylendiamin oder Toluidin verwendet. Es ist auch möglich, fluorogene Substrate, die ein fluoreszierendes Produkt ergeben, anstelle der vorstehend genannten chromogenen Substrate zu verwenden. In allen Fällen wird der enzymmarkierte antigenspezifische Antikörper dem Komplex aus erstem Antikörper und Leptosphaeria zugesetzt, an den Komplex binden gelassen, und dann wird überschüssiges Reagens abgewaschen. Eine Lösung, die das geeignete Substrat enthält, wird dann dem ternären Komplex aus Antikörper-Antigen-markierter Antikörper zugesetzt. Das Substrat reagiert mit dem an den zweiten Antikörper gebundenen Enzym, wobei ein qualitatives sichtbares Signal erhalten wird, das weiter quantitativ bestimmt werden kann, üblicherweise spektrophotometrisch, wodurch eine Bewertung der Antigenmenge, die in der Serumprobe vorhanden ist, erhalten wird.
Alternativ können fluoreszierende Verbindungen, wie Fluorescein und Rhodamin, chemisch an Antikörper gekoppelt werden, ohne ihre Bindungskapazität zu ändern. Bei Aktivierung durch Bestrahlung mit Licht einer speziellen Wellenlänge absorbiert der Fluorochrom-markierte Antikörper die Lichtenergie, wobei ein Zustand der Erregbarkeit des Moleküls induziert wird, worauf eine Lichtemission in einer charakteristischen längeren Wellenlänge erfolgt. Die Emission erscheint als eine charakteristische Farbe, die sichtbar mit einem Lichtmikroskop detektierbar ist. Bei dem EIA läßt man den fluoreszierenden markierten PIF-spezifischen Antikörper an den ersten Antikörper-Ferritin-Komplex binden. Nach Waschen des nichtgebundenen Reagenses wird der verbleibende ternäre Komplex Licht der geeigneten Wellenlänge exponiert, und die beobachtete Fluoreszenz zeigt die Anwesenheit von Interesse an. Immunfluoreszens- und EIA-Techniken sind beide auf dem Fachgebiet sehr etabliert und werden für das erfindungsgemäße Verfahren besonders bevorzugt. Jedoch können auch andere Reportermoleküle, wie Radioisotope, chemilumineszierende oder biolumineszierende Moleküle verwendet werden. Es ist einem Fachmann leicht offensichtlich, wie das Verfahren zur variieren ist, um es an die gewünschte Verwendung anzupassen.

Beispiele

Hinterlegung der Mikroorganismen: Das Hybridom Sen15C6 wurde bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, am 25. Juli 1989 hinterlegt und erhielt die aufgeführte Hinterlegungsnummer HB 10185.
Die folgenden Beispiele erläutern Verfahren zur Herstellung der Hybridome und Antikörper gemäß der Erfindung.

Beispiel 1: Antigenherstellung

Ein Agarzylinder aus einer lebenden Kultur von L. (S.) nodorum wird auf einen C-D-(Czapek-Dox)Agar umgedreht gegeben: (Difco) oder PDA (Kartoffeldextroseagar) (Difco)- Platte, und der Zylinder wird auf der Oberfläche ausgestrichen. Die Platte wird bei Umgebungstemperatur und Licht 5 bis 7 Tage lang inkubiert.
Alle Kolonien werden aseptisch von der Agarplatte entnommen und in eine sterile 250-ml-Omni-Mixkammer gegeben. 50 ml steriles Czapek-Medium (Difco) werden der Omni-Mixkammer zugesetzt, und die Pilze werden bei 6000 UpM 30 Sekunden lang homogenisiert.
Dann werden 250-ml-Erlenmeyer-Kolben, die 50 ml Czapek-Lösung enthalten, mit jeweils 1 ml Kulturhomogenat inokuliert. Die inokulierten Kolben werden auf einen Schüttler (hohe Geschwindigkeit bei 22 bis 24ºC unter Umgebungslicht) gegeben. Nach 13 Tagen werden die Kulturen abgeerntet und zweimal mit PBS gewaschen.
Die Pilzkulturen werden in eine 150-ml-chargenkammer einer Dyno-Mühle Typ KDL, die 240 ml 0,50 mm/bleifreie Glaskügelchen [IMPANDEX] enthält, überführt. Der Kühlmantel der chargenkammer wird auf 8ºC mit kaltem Leitungswasser vorgekühlt. Der Extrakt wird 5 Minuten lang bei 3000 UpM gemahlen, wonach der Inhalt der Chargenkammer in 50 ml Zentrifugenröhrchen überführt wird und bei 13.000 UpM in einer gekühlten Sorvall RC-5B-Zentrifuge in einem SS-34-Rotor zentrifugiert wird. Der Pilzüberstand wird in Aliquote aufgeteilt und bis zum Gebrauch gefroren. Der Gesamtproteingehalt der Proben liegt im Bereich von 0,1 bis 1,0 mg Protein/ml.

Beispiel 2: Immunisierung und Pusion

Eine Balb/C-Maus wird intraperitoneal mit 0,2 ml Pilzextrakt des Isolats Sen1-001 in 0,2 ml komplettem Freundschem Adjuvans immunisiert. Die Maus wird 14 Tage später mit dem gleichen Pilzextrakt in inkomplettem Freundschem Adjuvans auffrischend geimpft. Die zweite Booster-Impfung erfolgt nach 12 Tagen. Der Maus wird 7 Tage später aus der Schwanzvene Blut entnommen, und das Serum wird auf die Anwesenheit von für das Immunogen spezifischen Antikörpern getestet. Die Maus wird durch zervikale Dislokation am nächsten Tag getötet, und die Milz wird zur Extraktion der Lymphozyten herausgeschnitten. Die Milz wird auf ein steriles 80-mesh-Sieb in einer sterilen Einweg-Petrischale gegeben, mit einem Skalpell geschnitten und mit einem sterilen Plümper aus einer 3-cc-Spritze verrieben. Während dieses Verfahrens wird die Milz mehrere Male mit DMEM gespült. Die Zellsuspension wird in ein steriles 50-ml-Einweg-Zentrifugenröhrchen überführt. Das Sieb und die verbleibenden Gewebsfragmente werden erneut mit DMEM gewaschen, und die Waschlösungen werden dem Röhrchen zugesetzt. Die Zellsuspension wird bei 2000 UpM für 10 Minuten zentrifugiert (die Zentrifugationen erfolgen alle bei Raumtemperatur). Der Überstand wird dekantiert, und das Pellet wird mit 4 ml Erythrozyten-Lyselösung (0,83% NH&sub4;cl, 0,01 M KHCO&sub3;, 0,1 mM EDTA) für 90 Sekunden bei Raumtemperatur gewaschen. Die Lysereaktion wird durch Verdünnen des Inhalts des Röhrchens auf 45 ml mit DMEM gestoppt. Der Inhalt wird erneut bei 2000 UpM für 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wird dekantiert, und das Pellet wird in 10 ml DMEM resuspendiert. Eine Probe der Zellsuspension wird zur Zellzählung zurückbehalten. Die Gesamtzahl der lebenden Zellen in der Suspension beträgt 2,26 x 10&sup8; Zellen.
Myelomazellen (P3Ns1/1-Ag4-1) (NS1), erhalten von der American Type Culture Collection, ATCC #TIP-18) werden durch lorninütige Zentrifugation in einem sterilen 50-ml-Zentrifugenröhrchen bei 2000 UPM von dem Kulturmedium entfernt. Der Überstand wird dekantiert, und das Pellet wird in 10 ml DMEM zur Zellzählung resuspendiert. 5,65 x 10&sup7; Myelomazellen werden der Milzzellsuspension zugesetzt. Die vereinigten Zellen werden 10 Minuten lang bei 2000 UPM zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wird der Überstand dekantiert.
1 ml PEG 1500 (1 ml) (Boehringer Mannheim Biochemicals, Kat. #783-641) bei Raumtemperatur wird dem Pellet zugesetzt. Die Zellen werden sehr vorsichtig mit einer 2-ml-Pipette und einer automatischen Pipettiervorrichtung resuspendiert. Die Zellsuspension wird sehr langsam durch tropfenweise Zugabe von 10 ml DMEM im Verlauf von 10 Minuten unter sanftem Verwirbeln des Röhrchens verdünnt, um die Zellen in Suspension zu halten. Die Suspension wird dann langsam auf 45 ml mit DMEM verdünnt und 10 Minuten lang bei 1500 UpM zentrifugiert. Der überstand wird dekantiert, das Pellet wird sanft mit 10 ml DMEM gewaschen und erneut 10 Minuten lang bei 1500 UpM zentrifugiert. Nach der Waschung der fusionierten Zellen werden die Zellen in vorgewärmten HAT-Medium, das 5% Origin-HCF (#IG-50-0615 Fisher Scientific) enthält, resuspendiert, und zwei Tropfen der Suspension werden in 60 Kavitäten jeweils von Primaria Microtest-III-Platten (Falcon #3870) gegeben, wobei die äußere Reihe der Kavitäten leer gelassen wird. In die äußeren Kavitäten werden je 200 µl DMEM, das Penicillin/Streptomycin enthält, gegeben, und die Platten werden in einen CO&sub2;-Inkubator gegeben.
Die Zellen werden nach 7 Tagen mit HAT/5% Origin-HCF-Medium erneut beschickt. Cluster von Hybridomen beginnen nach 5 bis 7 Tagen aufzutreten. Weitere Einspeisungen werden ohne Amingstern oder origin-HCF vorgenommen.

Beispiel 3: screening der Kybridome

Senl-001-Myzelextrakt wird auf 5 µg/ml in Carbonatpuffer (1,59 g/l Na&sub2;CO&sub3;, 2,93 g/l NaH&sub2;CO&sub3;, pH 9,6) verdünnt, und 360 µl werden in jede Kavität einer Mikrotiterplatte (Nunc #468667) gegeben. Nach 3stündiger Inkubation bei Raumtemperatur werden die Platten dreimal mit Carbonatpuffer gewaschen. Die verbleibenden Bindungsstellen auf den Kavitäten werden durch Zugabe von 400 µl pro Kavität einer fettarmen Trockenmuchlösung blockiert. Nach 30 Minuten wird die fettarme Trockenmilchlösung von den Platten geschüttelt, die Platten werden auf Papiertücher geblottet und über Nacht in einem 37ºC warmen Konvektionsinkubator (Precision, Model 4EM, #31574) getrocknet. 100 µl Überstand werden in jede Kavität gegeben und 10 Minuten auf einem Plattenschüttler (Flow, #541305) inkubiert. Die verbleibende Lösung wird verworfen, und die Platten werden 5mal mit Waschpuffer (24,2 g/l Tris, 87,7 g/l NaCl, 0,1 g/l Thimerosal, 50 g/l Tween-80, pH 7,87) gewaschen. 100 µl KPL-Peroxidasekonjugiertes Ziege-anti-Maus IgG (verdünnt 1:1000 in 0,1% BSA-PBS (1 µg/l BSA, 2,18 g/l NaH&sub2;PO&sub4;, 0,56 g/l NaH&sub2;PO&sub4;, 8,76 gil NaCl, pH 7,2) werden dann jeder Kavität zugesetzt, und es wird 10 Minuten auf dem Schüttler inkubiert. Die verbleibende Lösung wird verworfen, und die Platten werden 5mal mit Waschpuffer gewaschen. 100 µsl ABTS-Substrat (23 g/l Citronensäure, 0,5 ml/l 30% H&sub2;O&sub2;, pH 4,0; 15 mg/ml ABTS; das ABTS-Konzentrat ist 1:25 in dem citronensäurepuffer verdünnt) werden in jede Kavität gegeben, und es wird 10 Minuten auf dem Schüttler inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 50 µl 1,5% NaF pro Kavität gestoppt. Die Absorption wird bei 405 nm abgelesen.
Es wurde gefunden, daß eine Anzahl von Hybridomen Antikörper sezerniert, die mit L. nodorum reagieren. Ein Einzelantikörperscreening wird mit einer erweiterten Palette von L. nodorum-Isolaten durchgeführt, um die Reaktivität der Antikörper mit einer breiten Reihe unterschiedlicher Isolate zu bestimmen (Tabelle 1). Tabelle 1: Indirektes Einzelantikörper-ELISA-Screening von sechs monoclonalen Antikörpern gegen L. nodorum gegenüber L. nodorum-Isolaten
Unter Verwendung eines doppelten Antikörper-Sandwich-ELISA- Assays wurden geeignete Antikörper für Kreuzreaktivitätsscreenings gegen ausgewählte Krankheitserregerextrakte selektiert. Die Mikrokavitäten werden unter Verwendung eines monoclonalen Antikörpers in einer Konzentration von 5 µg/ml in Carbonatpuffer, 100 µl pro Kavität als Einfangantikörper sensibilisiert. Das Blockierverfahren wird wie beschrieben durchgeführt. Die Bindung des monoclonalen Antikörpers an die Krankheitserregerextrakte wird unter Verwendung von Schaf-anti-Sen-HP-(Meerrettichperoxidase) Konjugat detektiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben. Tabelle 2: Frühes Kreuzreaktivitätsscreening gegen ausgewählte Krankheitserregerextrakte
a Set = Septoria tritici; Sen = S. nodorum; Ptr = Pyrenophora tritici repentis; Mfl = Mycosphaerella fijiensis
Überstände ausgewählter monoclonaler Antikörper werden gegen eine erweiterte Palette verwandter und nichtverwandter Pilzisolate in einem indirekten ELISA getestet. Die Isolatextrakte werden an Mikrotiterplatten in einer Konzentration von 5 µg/ml gebunden. Die Ergebnisse dieses Screenings sind in Tabelle 3 angegeben. Tabelle 3: Screening durch indirekten ELISA von monoclonalen L. (S.) nodorum-Antikörperüberständen gegen eine erweiterte Palette von verwandten und nichtverwandten Pilzisolaten.
Nach mehreren Screenings wird der Antikörper Sen15C6 auf der Basis seiner Leistungsfähigkeit in einem doppelten Antikörper-Sandwich-Assay ausgewählt. Sen15C6 wird aus dem Überstand unter Verwendung von Protein A-Affinitätschromatographie gereinigt. Die Mikrokavitäten werden unter Verwendung des Antikörpers in einer Konzentration von 5 µg/ml in Carbonatpuffer mit 100 µl pro Kavität sensibilisiert. Der Assay wird gegen L. nodorum-Antigenextrakt, L. nodoruminfiziertes Weizenblattmaterial, gesundes Weizenblatt und Puffer zur Kontrolle durchgeführt. Die Ergebnisse des doppelten Antikörperassays sind in Tabelle 4 angegeben. Schafanti-S.-nodorum-Meerrettichperoxidase-Konjugat wird als der markierte Antikörper verwendet. Tabelle 4:
* Verdünnung der infizierten Weizenblätter in einer Lösung von 0,1% BSA in PBS-Puffer
Diese Ergebnisse zeigen an, daß der Sen15C6-Antikörper in Immunoassays verwendet werden kann, um L. nodorum in einem Antigenextrakt sowie in infizierten Blättern nachzuweisen.

Beispiel 4: Monoclonaler Antikörper "L. korrae"

Forscher an der Ohio State Universität berichteten jüngst über die Produktion von monoclonalen Antikörper gegen L. korrae (Shane und Nameth, 1988). Dieser Antikörper wird in einem indirekten ELISA getestet, um die Kreuzreaktivität gegen eine Palette, bestehend aus drei Isolaten von L. korrae und 21 Isolaten anderer mit Leptosphaeria verwandter und nicht-verwandter Pilze, zu bestimmen (Tabelle 5). Tabelle 5: Screening auf Kreuzreaktivität in einem indirekten ELISA einer 1/16-Verdünnung des Überstands des monoclonalen L. korrae-Antikörpers (LKc50) gegen mit Leptosphaeria verwandte und nicht-verwandte Pilze
a Ablesung der Netto-Absorption = Absorptionswert des Probenabsorptionswerts von Puffer A
Die Ergebnisse zeigen klar, daß der andere bekannte monoclonale Antikörper gegen eine Art von Leptosphaeria starke Kreuzreaktivität mit Pilzen außerhalb der Gattung Leptosphaeria zeigt. Eine solche Kreuzreaktivität ist bei Pilzen der Gattung Epicoccum besonders nachteilig. Der zuletztgenannte ist ein allgemeiner Saprophyt von Gräsern und könnte Probleme verursachen, wenn Gräser mit fortgeschrittenen Symptomen versehentlich beprobt würden. So kann dieser Antikörper für diagnostische Zwecke ungeeignet sein.

Beispiel 5: On-site-Assays

Die on-site-Assays werden an Einzelblättern unter Verwendung von abgespaltenen Stücken zur Vermahlung durchgeführt, die in Flaschen, die 2 ml Extraktionspuffer enthalten, gegeben werden, und nach Schütteln werden sie durch ein 0,02 µm-Filter filtriert. Sechs Tropfen des filtrierten Extrakts werden auf eine Absorptionsvorrichtung, die mit dem Einfangantikörper beschichtet ist, gegeben. Nach einer anschließenden Zugabe von zwei Tropfen jeweils des enzymmarkierten Antikörpers einer Spüllösung und eines Enzymsubstrats wird der Testkreis blau, wenn das Pilzantigen in der Probe vorhanden ist. Die Zugabe von zwei Tropfen einer Finish-Lösung beendet die Farbreaktion. Die Menge des vorhandenen Antigens kann durch Messen der relativen Reflexion, die in X-Rite-Einheiten vorhanden ist, gemessen werden, wobei ein X-Rite-Meter und/oder ein Agrimeter verwendet werden.
Ein Empfindlichkeitsvergleich wird zwischen dem raschen (on-site-Assay) und dem Assay in vielen Kavitäten für Verdünnungen des Sen1-Antigens in gesunden Weizenextrakten durchgeführt.
Die Leistungsfähigkeit der on-site-Assays wird ebenfalls unter Verwendung von Feldweizen, der mit S. nodorum infiziert ist, bewertet (Tabellen 6 und 7). Die verwendeten Weizensorten, Twain und Traveler, werden in den Testplots natürlicherweise mit S. nodorum infiziert. Die drei untersten Blättern (die Pflanzen befinden sich noch in dem Stadium, in dem sie Schößlinge treiben) von jeder der sechs Pflanzen werden entnommen und einzeln unter Verwendung von drei Extrak pads/2 ml-Puffer Z-5 extrahiert. Die Extrakte werden durch ein 0,02 µm Anotop -Filter filtriert und in den 1990 S. nodorum- und Septoria tritici-Kits mit vielen Kavitäten getestet. Die Proben, die stark mit den S. nodoruin-Kits mit den vielen Kavitäten reagieren, werden ebenfalls in dem on-site-Kit getestet.
Keine wirkungen der Pflanzenprobenmatrix werden für die onsite-Assays beobachtet und X-Rite-Meter-Ablesungen im Bereich von 31 bis 86 für Proben, die Ablesungen außerhalb der Skala in dem Assay mit vielen Kavitäten ergeben, werden beobachtet. Tabelle 6: Assays von S. nodorum-infiziertem Weizen (c.v. Twain) in dem 1990 S. nodorum-Kits mit vielen Kavitäten und in dem 1990 S. nodorum-on-site- Kit
a = nicht getestet
Die Blätter werden als 1 bis 3, beginnend vom Boden der Pflanze und mit aufwärtiger Zählung numeriert. Die Netto- MG-Absorptionen werden unter Verwendung der Formel (Probenabsorption 405 nm - Puffer Z-5-Absorption 405 nm) berechnet. Der Puffer Z-5 ergibt eine Absorption von 0,332 in dem S. nodorum-Kit. Die positive Kontrollabsorption für S. nodorum beträgt 0,829. Die Pflanzen befinden sich zur Zeit der Assays etwa im Wachstumsstadium #24. Tabelle 7: Assays von Septoria nodorum-infiziertem Weizen (c.v. Traveler) in dem 1990-S. nodorum- und dem 1990-S. nodorum-on-site-Kit
a nicht getestet
Die Blätter werden als 1 bis 3, beginnend vom Boden der Pflanze und mit aufwärtiger Zählung numeriert. Die Netto- MG-Absorptionen werden unter Verwendung der Formel (Probenabsorption 405 nm - Puffer Z-5-Absorption 405 nm) berechnet. Der Puffer Z-5 ergibt eine Absorption von 0,332 in dem S. nodorum-Kit. Die positive Kontrollabsorption für S. nodorum beträgt 0,829 Die Pflanzen befinden sich zur Zeit der Assays etwa im Wachstumsstadium #24.
Diese Ergebnisse zeigen an, daß das S. nodorum-Antigen unter Verwendung von sowohl Platten mit vielen Kavitäten als auch eines on-site-Kits nachgewiesen werden kann. Daher kann S. nodorum leicht auf dem Feld detektiert werden.
Die hier beschriebene und beanspruchte Erfindung wird in ihrem Umfang nicht durch die hier offenbarten spezifischen Ausführungsformen beschränkt, da diese Ausführungsformen als Illustrationen mehreren Gesichtspunkten der Erfindung dienen. Alle äquivalenten Ausführungsformen sollen unter den Umfang der Erfindung fallen. In der Tat sind verschiedene Modifikationen der Erfindung zusätzlich zu den hier gezeigten und beschriebenen einem Fachmann auf dem Gebiet aus der vorstehenden Beschreibung offensichtlich. Solche Modifikationen sollen auch unter den Umfang der beigefügten Patentansprüche fallen.

Literaturangaben

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Kozbor, D., Roder, J.C., Immunology Today 4:72-79 (1983)
Littlefield, J.W., Science 145:709 (1964)
Shane, W.W., Nameth, S.T, Phytopathology 78:1521(1988)

Claims

1. Hybridomazellinie, die einen monoclonalen Antikörper, der spezifisch mit mindestens einer Art der Pilzgattung Leptosphaeria reagiert, aber nicht mit Arten außerhalb der Gattung reagiert, produziert.

2. Hybridomazellinie nach Anspruch 1, wobei der Antikörper spezifisch mit einer einzelnen Leptosphaeria-Art reagiert.

3. Hybridomazellinie nach Anspruch 2, wobei der Antikörper spezifisch mit Leptosphaeria nodorum reagiert.

4. Hybridomazellinie nach Anspruch 2, die bei der American Type Culture Collection unter der Hinterlegungsnummer ATCC HB 10185 hinterlegt ist.

5. Monoclonaler Antikörper, der spezifisch mit mindestens einer Art der Gattung Leptosphaeria reagiert, aber nicht mit einer Art außerhalb der Gattung reagiert.

6. Antikörper nach Anspruch 5, der spezifisch mit einer einzelnen Leptosphaeria-Art reagiert.

7. Antikörper nach Anspruch 5, der spezifisch mit Leptosphaeria nodorum reagiert.

8. Monoclonaler Antikörper nach Anspruch 7, der durch die bei der American Type Culture Collection unter der Hinterlegungsnummer ATCC HB 10185 hinterlegte Hybridomazellinie produziert werden kann.

9. Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit von Pilzen der Gattung Leptospbaeria in einer Probe, wobei man die Probe mit einem monoclonalen Antikörper, der spezifisch mit mindestens einer Art der Gattung Leptosphaeria reagiert, der aber nicht mit Arten außerhalb der Gattung reagiert, in Kontakt bringt und die Anwesenheit oder Abwesenheit einer Antikörper-Antigen-Bindungsreaktion beobachtet.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei man die Probe mit zwei Antikörpern in Kontakt bringt, wovon mindestens einer ein monoclonaler Antikörper ist, der spezifisch mit mindestens einer Leptosphaeria-Art reagiert, wobei ein Antikörper immobilisiert ist und der andere mit einem Reportermolekül markiert ist.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei einer der Antikörper ein polyclonaler Antikörper ist.

12. Verfahren nach Anspruch 9, 10 oder 11, wobei der monoclonale Antikörper spezifisch mit nur einer Leptosphaeria-Art reagiert.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei der monoclonale Antikörper spezifisch mit L. nodorum reagiert.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Antikörper von der bei der American Type Culture Collection unter der Hinterlegungsnummer ATCC HB 10185 hinterlegten Hybridomazellinie produzierbar ist.

15. Diagnostisches Kit, umfassend einen an einen festen Träger gebundenen Antikörper und einen mit einem Reportermolekül markierten Antikörper, wobei beide Antikörper mit Arten der Pilzgattung Leptosphaeria reagieren können, und mindestens einer ein monoclonaler Antikörper ist, der spezifisch mit mindestens einer Art der Gattung Leptosphaeria reagiert, aber nicht mit Arten außerhalb der Gattung reagiert.

16. Kit nach Anspruch 15, wobei das Kit ein on-site-Kit ist.

17. Kit nach Anspruch 15, wobei einer der Antikörper ein polydonaler Antikörper ist.

18. Kit nach Anspruch 15 oder 17, wobei der monoclonale Antikörper spezifisch mit nur einer Leptosphaeria-Art reagiert.

19. Kit nach Anspruch 18, wobei der monoclonale Antikörper spezifisch mit L. nodorum reagiert.

20. Kit nach Anspruch 19, wobei der monoclonale Antikörper von der bei der American Type Culture Collection unter der Hinterlegungsnummer ATCC HB 10185 hinterlegten Hybridomazellinie produziert werden kann.

21. Verfahren zur Herstellung einer Hybridomazellinie, die einen monoclonalen Antikörper, der spezifisch mit mindestens einer Art der Pilzgattung Leptosphaeria reagiert, produziert, wobei man

(a) ein Spendertier mit einem Leptosphaeria-Extrakt immunisiert;

(b) immunkompetente B-Zellen aus dem immunisierten Spendertier isoliert;

(c) die B-Zellen mit Zellen einer unsterblichen Zellinie fusioniert; und

(d) Fusionsprodukte absucht und diejenigen identifiziert, die Antikörper mit Leptospbaeria-Spezifität produzieren.

22. Verfahren zur Herstellung eines monoclonalen Antikörpers, der spezifisch mit mindestens einer Leptosphaeria-Art reagiert, wobei man eine Hybridomazellinie, die solche Antikörper produzieren kann unter Bedingungen, die zur Antikörperproduktion führen, züchtet und die so produzierten Antikörper nach herkömmlichen Methoden isoliert.