JPH04258286A - レプトスフェリアに対するモノクローナル抗体 - Google Patents

レプトスフェリアに対するモノクローナル抗体

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JPH04258286A
JPH04258286A JP3234065A JP23406591A JPH04258286A JP H04258286 A JPH04258286 A JP H04258286A JP 3234065 A JP3234065 A JP 3234065A JP 23406591 A JP23406591 A JP 23406591A JP H04258286 A JPH04258286 A JP H04258286A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は診断植物病理学の分野に
関する。より詳しくは、本発明は病原菌であるレプトス
フェリア(Leptosphaeria) 属の種の検
出に有用なモノクローナル抗体に関する。さらに、本発
明はレプトスフェリアの単一種と特異的に反応するモノ
クローナル抗体を提供する。
【0002】
【従来の技術】病原菌 菌類は群として多くの植物の疾病を引き起こす。説明の
ために、菌類は3つの大きな分類学上の綱:担子菌類(
Basidiomycetes)、藻菌類(Phyco
mucetes)または子嚢菌類(Ascomycet
es)の一つに属するように分類することができる。
【0003】担子菌類 この綱の構成員は担子器として知られている有性胞子形
成構造の存在により同定される。病気形態には、黒穂病
(smuts) 、さび病(rusts) およびキノ
コのような肉的外観(fleshly species
)が含まれる。例えば、小麦さび病、ストロブ松のコブ
病(white pine blister)、レバノ
ンすぎ塊状銹(cedar−apple rust)、
およびトウモロコシ、オート麦、大麦、玉葱および小麦
における黒穂病の原因となる病気が含まれる。
【0004】子嚢菌類 この綱の構成員は減数分裂と有性胞子形成が起こる特殊
化された生殖構造(子嚢)を有する。子嚢菌類が病因と
して確認されている非常に一般的な植物病の例には;穀
類、果実および多くの他の作物におけるうどんこ病(p
owdery mildows);オランダにれの木病
(Dutch elm disease) ;穀粒の麦
角病(ergot) :桃およびプラムの褐腐病(br
own rot) ;バラの黒星病(black sp
ots) ならびに林檎腐敗病(apple scab
)が含まれる。
【0005】藻菌類 この綱の構成員は子嚢菌類または担子菌類のどちらの構
成員よりも原始的であると考えられ、それらを区別する
形態学的特徴は菌糸交差壁が無いことである。この綱の
構成員により引き起こされる病気の例には、ブドウおよ
び他の宿主の黄斑性萎縮病(downy mildow
s) 、馬鈴薯およびトマトの根腐病(root ro
t)およびべと病(late blight)が含まれ
る。
【0006】本発明に関しては、子嚢菌類およびプレオ
スポラセアエ(Pleosporaceae) 科、そ
して特にレプトスフェリア属の構成員が特に興味深い。 この属は経済的に非常に重大な植物病原体である多くの
種を含む大きな属である。米国における植物病原菌の最
近の編集物には植物病原体として140種のレプトスフ
ェリアが挙げられている〔3〕(〔  〕内の数字は下
の参考文献一覧の数字と一致する)。レプトスフェリア
の子実体は、3またはそれ以上の隔膜を備えた8個の子
嚢胞子を各々含む二重膜子嚢を含有する、孔口のある子
嚢殻状偽子嚢殻である。多くの場合、子嚢胞子は感受性
宿主植物の不存在下または好ましくない環境条件下での
病原性レプトスフェリア種の主な生存機構である。また
、子嚢胞子は宿主作物における接種の主な源としてしば
しば作用する。レプトスフェリア種の多くは無性分生子
段階も生じる。分生子は粉胞子器、分生子堆中、または
遊離分生子柄上に生じ得る。多くの場合、分生子段階が
自然界に最も頻繁に見出される。分生子段階は形態学に
基づき有性段階とは別に分類される。このようにレプト
スフェリア属の種は不完全菌〔ドイテロマイセテス(D
euteromycetes)〕の多くの異なる属の構
成員として分類される分生子段階を有する。
【0007】有性段階を自然界に見つけることがしばし
ば困難であり、また純粋培養に誘導することが困難であ
るので、子嚢菌類の無性段階の分類系は一般的に人為的
と考えられているが実用上の理由で続いている。しかし
ながら、相互の種の関連度は有性分類に反映されている
。すなわち、レプトスフェリアの2種は、無性段階の形
態学的類似に基づいて命名されているセプトリア(Se
ptoria)の2種よりも相互に遺伝的により密接に
関連しているようである。
【0008】
【発明が解決しようとする課題】レプトスフェリアの病
原種は植物の地上部分に、最も頻繁には葉および茎に病
気を起こす。症状は作物に応じて不規則的または規則的
なパターンで葉領域の大部分を含むかもしれない病変で
ある。世界的に厳しくそして経済的に損害を与える病気
の多くはレプトスフェリア種によって引き起こされ、耐
性変種および/または防除用殺菌剤の使用を必要として
いる。レプトスフェリア・ノドルム(Leptosph
aeria nodorum) はその無性段階セプト
リア・ノドルム(Septoria nodorum)
によりよく知られており、殺菌剤または耐性変種により
防除されなければ、世界的に小麦の著しい収量低下を引
き起こす。
【0009】レプトスフェリア・ノドルムは感染後数週
間の潜伏期間を示し、その間病原体は組織中で成長する
が、病気の症状(葉および頴の病斑)は現れない。殺菌
剤は、潜伏期間中、重大な損害が生じる前および病気を
広がらせる第二の接種原が生じる前に施用されるならば
、この病気に最も効果的である。しかしながら、日常的
な予防殺菌処理は通常経済的にまたは環境的に正当化さ
れず、そしてこの病原体の非常に早期の、好ましくは病
気進展の潜伏期間中の検出を可能にするシステムは、殺
菌剤が適切に使用され、そして最大の経済的利益を与え
ることを確実にすのに非常に有用であろう。本発明は、
レプトスフェリア・ノドルム抗原の存在を検出でき、そ
れで病気の早期診断を可能にし、そして小麦収穫の広範
な損失を予防できるモノクローナル抗体を提供すること
により、上記システムを実施に移すことを可能にするも
のである。
【0010】
【課題を解決するための手段】モノクローナル抗体技術
モノクローナル抗体は培養中の連続細胞系により抗体分
子の産生を供給するあらゆる方法により製造され得る。 これらの方法は、ケーラーおよびミルスタインにより最
初に発見された方法〔7〕、ヒトB細胞ハイブリドーマ
法〔8〕およびヒトモノクローナル抗体を産生するEB
Vハイブリドーマ法〔1〕を包含する。各々の細胞系は
、動物が生体内で抗原に応じて合成できる無数のタイプ
の抗体の1つだけを表す均一な免疫グロブリンを合成す
る。各々の免疫グロブリン産生クローンは、それが産生
する抗体の単一タイプにより特徴づけられるので、モノ
クローナル抗体という用語が採用された。モノクローナ
ル抗体は、大量に得ることができる;調製物が抗原反応
性に関して均一であり、そしてその性質は時間が経過し
ても残る、という多くの利点を有する。
【0011】ハイブリドーマ/モノクローナル技術の原
理は、2種の体細胞が融合される時に生成するハイブッ
ドが両方の親細胞タイプの特性を示すという観察に基づ
いている。モノクローナル抗体産生の場合、特定の抗体
を合成する能力は免疫化した供与動物から採取した免疫
適格性細胞(通常は脾臓細胞)から誘導され、一方、細
胞培養における連続的に分裂する能力は他方の融合相手
の腫瘍細胞系(しばしばミエローマ)により与えられる
。初期の融合は、ミエローマ細胞系もモノクローナル抗
体を産生するという事実により複雑化されていた。従っ
て、この場合のハイブリッドは、しばしば2タイプのモ
ノクローナル抗体、ミエローマ起源の1種と免疫適格性
細胞の遺伝情報により指示された別種を産生する。その
後、それ自体モノクローナル抗体を産生できない腫瘍細
胞系、例えばSP2/0−Ag14またはX63−Ag
8.653が使用され、それによって生成融合体の分析
が簡素化される。
【0012】別の技術的問題には、2タイプの親細胞か
ら成功した融合結果(ハイブリッド細胞)を選択するた
めの論理的解釈が含まれる。融合プロトコルでは通常各
タイプの百万またはそれ以上の細胞が使用され、そして
融合は100%の頻度で起こらないので、非融合または
自己融合した両親の高いバックグランドから融合生成物
の回収を試みる仕事は手に負えないほどである。上述し
たようにハイブリドーマは短期生存抗体産生(脾臓)細
胞と長期生存ミエローマ細胞との融合により形成される
。所望の結果は抗体を産生する長期生存細胞系である。 脾臓細胞は培養において、有限の寿命を有しているので
、非融合または自己融合脾臓細胞の全てが死滅する適当
な期間、ただ待つだけでよい。しかしながら、依然とし
て、得られた集団から長期生存抗体産生細胞と長期生存
抗体非産生細胞とを区別して回収しなければならない。 ハイブリッド細胞を選択するための普及している手段は
いわゆるHAT−選択系である。この系は酵素ヒポキサ
ンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ
(HGPRT)の使用を含む。この酵素は哺乳動物細胞
内のプリン再利用経路で機能する。また、これらの細胞
はプリンを新たに合成できる。ほとんどの条件下で両経
路はおそらくある程度まで作動する。細胞がHGPRT
を欠いている場合、再利用経路は遮断され、プリンは非
プリン物質から製造されなければならない。
【0013】化学物質8−アザグアニンは、プリンのグ
アニンとして偽装することができ、その通常の反応のい
くつかにおいてそれと置換できる抗代謝物質である。ア
ザグアニンはDNA中に組み込まれ、通常の成長パター
ンに干渉し、細胞を死に導く。アザグアニンは再利用さ
れなければならないので、HGPRT活性を欠くいかな
る細胞もアザグアニンを利用できず、その存在下に成長
するであろう。
【0014】同じ酵素を用いて操作するがHGPRT陽
性細胞が選択されるという意味では反対の選択系はリト
ルフィールドにより記載されている
〔9〕。それはHA
Tと呼ばれており、ヒポキサンチン、アミノプテリンお
よびチミジンを含む(HAT培地)。アミノプテリンは
新たなプリン合成およびチミジレートを生じるデオキシ
ウリジレートのメチル化を防ぐ抗代謝物質である。チミ
ジンがチミジレートのメチル化の必要性を迂回している
間にアミノプテリンが新たなプリン生合成を阻害すると
いう場合に、ヒポキサンチンはで再利用可能なプリンと
して作用し得る。このように、アミノプテリンの存在下
、陽性のHGPRT活性を有するあらゆる細胞が増殖す
るが、陰性のHGPRT活性を有する細胞は死ぬ。
【0015】HAT系の別法はHATの代わりにHMT
培地を使用することである。HMTはアミノプテリンの
代わりにアメトプテリン(メトトレキセート)を用いる
。この方法も同じ原理で作用するが、HMT培地は成長
するハイブリドーマに対してやや毒性が低く、従って細
胞は培地上により長期間放置され得る。
【0016】本実施例に従って選択のために使用される
ハイブリッド系において、ミエローマ細胞はアザグアニ
ンに対して耐性で、アミノプテリンに対して感受性であ
る。すなわち、それらはHGPRT陰性である。従って
、それらはアミノプテリンの存在下で死ぬであろう。 抗体産生細胞はHGPRT陽性である。増殖系を構成す
るミエローマ細胞はHGPRT活性が存在する場合にの
み成長でき、そしてこの活性はHGPRT陽性細胞系に
より供給されなければならないので、細胞を融合しそれ
をアザグアニンの無いHMT培地(HT培地)で成長さ
せることにより、成功裏に融合した細胞が選択される。 抗体産生HGPRT陽性細胞系はこの培地で殺されない
。それらは当分の間生存するが増殖はしないであろう。
【0017】このように、HATまたはHMT培地中で
細胞を融合することにより、ミエローマ細胞および抗体
産生細胞がハイブリッド細胞を生産するのに十分なほど
長く成長できるが、ハイブリッド細胞のみが生き残って
増殖できる系が製造される。選択後、各ハイブリドーマ
クローンは次いで当該の特定の抗体を産生する能力につ
いてスクリーニングされる。
【0018】本発明は、レプトスフェリア属の少なくと
も1種と特異的に反応するが、該属以外の種とは反応し
ないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞
系を提供する。一つの実施態様において、モノクローナ
ル抗体はレプトスフェリアの単一種と特異的に反応する
。好ましい実施態様において、抗体はレプトスフェリア
(セプトリア)・ノドルムと特異的に反応する。本明細
書を通じて、レプトスフェリアという名称はアナモルフ
または無性段階の名称としても使用されるであろう。 従って、レプトスフェリア・ノドルムと反応する抗体は
無性段階セプトリア・ノドルムとも反応する。
【0019】これらのモノクローナル抗体の利用可能性
は植物材料におけるレプトスフェリア感染を診断する手
段を提供する。従って、当該病原体の抗原を有すると推
測される植物試料をその病原体に対して特異性を有する
抗体と接触させ、そして抗体と試料中に存在する抗原と
の間の反応の有無を観察することからなる上記の感染を
診断する方法が提供される。好ましい実施態様において
、アッセイはサンドイッチまたは二重抗体アッセイとし
て操作される。この方法において、当該病原体と反応す
る第1の抗体を植物試料と接触させ、次にこれもまた当
該病原体と反応する第2の抗体を添加し、抗原がもし試
料中に存在するならば抗体−抗原−抗体複合体を形成す
る。
【0020】また、これに関連して、当該の種と反応す
る好ましくは固定化された抗体と、当該の種と反応する
検出可能に標識された抗体とからなるレプトスフェリア
の検出用キットが提供される。少なくとも一方の抗体は
本発明のモノクローナル抗体であるべきである。
【0021】図1は正常な小麦抽出物中のSen1(0
04)の希釈に対する迅速アッセイおよびマルチウエル
アッセイの感度の比較を示す。
【0022】ハイブリドーマ製造 レプトスフェリア抽出物調製 レプトスフェリアに対するモノクローナル抗体の製造に
使用される抗原を含有するレプトスフェリア抽出物はレ
プトスフェリアの培養物から調製され得る。レプトスフ
ェリアは、ツァペック・ドックス(Czapek Do
x)V−8、イーストモルト、ポテトデキストロース、
オートミールを含むが、これに限定されないアガーで固
化された培養培地上および/または液体培養培地中で培
養され得る。 好ましい実施態様においてツァペック・ドックスが好ま
しい〔2〕。培養物は標準的操作を用いて集められ得る
【0023】集められたレプトスフェリア菌類からの抽
出物はこの分野では公知の方法を用いて調製され得る。 下に記載されるであろうような特定の実施態様において
、レプトスフェリアの抽出物はこの分野で公知の方法、
例えば集められたレプトスフェリアをダイノミルまたは
ワーリングブレンダーで処理するか、または超音波、ホ
モジナイゼーションまたは剪断の処理を行うことにより
得られる。
【0024】免疫化 接種のプログラムは重要ではなく、この分野でこの目的
に通常使用されるあらゆる態様であってよい。そのよう
な操作は例えば文献〔4〕に記載されている。
【0025】有用なプログラムは、適当なアジュバント
と配合された抗原の最初の免疫化が腹膜組織内でなされ
るものである。次いで2週間隔で追加免疫注射が行われ
得る。2またはそれ以上の追加免疫が与えられてよい。 その動物は、当該抗原に特異的な抗体が血清中に含まれ
ているかを調べるために、尾採血される。その後動物は
殺され、リンパ球源を提供するために脾臓が取り出され
る。
【0026】融合 ハイブリドーマを創成するための融合操作はこの分野で
よく知られており、公知操作のどれもが、レプトスフェ
リア−特異モノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マの製造に有用である。本実施例で用いられる基本的操
作は、ケーラーおよびミルスタイン〔6〕およびヘンマ
ーリンク〔5〕により開発された方法の変法である。最
近利用可能になったその他の方法、例えばヒトモノクロ
ーナル抗体を製造するために使用され得るヒトB細胞ハ
イブリドーマ法〔8〕およびEBVハイブリドーマ法〔
1〕は本発明の範囲内である。
【0027】一実施態様において、脾臓細胞(または代
わりに末梢血リンパ球)を免疫化した動物から単離し、
細胞数を数える。T細胞は支持細胞層として細胞100
0万個/培地10mlの濃度で使用され得る。適当な不
死細胞系、好ましくはミエローマ細胞系が選択され、リ
ンパ球に、リンパ球:ミエローマ=約4:1の割合で添
加される。1つの有用なミエローマ細胞系はNS1細胞
系である。室温でPEG(ポリエチレングリコール)1
500が一緒にした細胞に添加され、次にDMEMで徐
々に希釈される。遠心分離後、予め温めたHAT培地を
再懸濁されたペレットに加える。その試料をさらにHA
T培地で希釈し、そして少量の試料をマイクロタイター
プレートのウエルに分配する。該プレートは少なくとも
湿度95%の9%CO2 培養下に置かれる。約5〜7
日後、細胞にHAT培地を再び供給する。約5〜7日後
にハイブリドーマ細胞のクラスターが現れ始める。HT
培地がさらに供給される。
【0028】一実施態様において病原体抽出物が使用さ
れてもよい。特定の実施態様において、菌類に感染した
植物からの材料は二重抗原アッセイに使用され得る。そ
のような二重抗原アッセイは捕獲抗体としてレプトスフ
ェリアに対して製造されたポリクローナル抗体、植物材
料、モノクローナル抗体上清および抗マウス酵素複合体
の使用を包含する。
【0029】スクリーニング レプトスフェリアに対する抗体を産生するハイブリドー
マは、当該の特定種の調製された菌材料を用いてエリザ
フォーマットにおいて同定される。一実施態様において
病原体抽出物が使用され得る。特定の実施態様において
、菌類に感染した植物からの材料が二重抗体アッセイに
おいて使用され得る。そのような二重抗原アッセイは捕
獲抗体としてレプトスフェリアに対して製造されたポリ
クローナル抗体、植物材料、モノクローナル抗体上清お
よび抗マウス酵素複合体の使用を包含する。エリザにお
いて陽性応答を示すウエルはハイブリドーマ細胞の純粋
株を選択するためにサブクローン化される。サブクロー
ン化された系は菌成分に対する抗体比活性を求めるため
に再び試験される。
【0030】選択された抗体の特異性の程度を決定する
ために、それらを、レプトスフェリアに関連しても関連
しなくてもよい病原菌の集団(panel) に対して
スクリーニングするのが望ましい。例えばレプトスフェ
リア(セプトリア)・ノドルム特異的抗体を得るために
、選択された抗体はレプトスフェリアの別の種に対して
、並びにより離れた関連または非関連種に対して試験さ
れるべきである。
【0031】本目的に有用な集団(パネル)の例を表1
および表3に示す。ある抗体が一方のフォーマットにお
いて有用でも、他方においてはそうでないこともあり得
るので、単一および二重抗体フォーマットの両方でスク
リーニングを行うことが一般に推奨される。
【0032】抗体の特徴づけ 本発明の範囲内の多くの抗体は上記の方法に従って製造
された。一実施態様において、多くのモノクローナル抗
体はレプトスフェリア(セプトリア)・ノドルムと特異
的に反応するものが製造された。特定の実施態様におい
て、抗体はSen15C6(ATCC  HB  10
185)であり、これは二重抗体フォーマットにおいて
使用され得る高特異性の抗体である。Sen15C6は
また、レプトスフェリア・ノドルムと強く反応性である
。 唯一の例外は「種」セプトリア・アベナエ・トリチセア
品種(S. avenae f. sp. triti
cea) とで観察された陽性反応である。この通常の
種はレプトスフェリア(セプトリア)・ノドルムと形態
学的に実質的に同一であり、感染小麦に同様の症状を引
き起こす。従って、これら2つの種は同一であると考え
られる。それ故に、ハイブリドーマSen15C6によ
り産生された抗体はレプトスフェリア・ノドルム抗原の
正確で特異的な同定に非常に有用である。このモノクロ
ーナル抗体はIgG2a免疫グロブリンサブクラスに属
している。しかしながら、その他の免疫グロブリンサブ
クラスのその他の類似の抗体もまた製造された。
【0033】レプトスフェリア・ノドルムを同定するハ
イブリドーマおよびモノクローナル抗体は好ましい実施
態様を表すけれども、本発明はこれに限定されない。上
記の免疫化、融合および選択方法を利用することにより
、種特異的なモノクローナル抗体が免疫原として適当な
種の抽出物を用いて製造され得る。例えば、以下の種:
レプトスフェリア・コラエ(Leptosphaeri
a  korrae) 、レプトスフェリア・マクラン
ス(L. maculans) 、レプトスフェリア・
プラテンシス(L. pratensis)およびレプ
トスフェリア・サッカリ(L. sacchari) 
に対して特異性を有するモノクローナル抗体もまた本発
明の範囲内である。
【0034】診断方法およびキット 上記したように、当該病原体はそれに感染された植物に
重大な損傷を引き起こすことができ、従って早期の診断
が非常に望まれている。今、本発明の抗体は、何らかの
目に見える病気の症状が植物上に現れる前に病原体を植
物材料中に発見できる方法を提供する。
【0035】上記抗体は植物材料中の特定の種の存在を
決定するための多くの異なるイムノアッセイの基本的試
薬として用いることができる。一般的には、該抗体はど
のタイプのイムノアッセイにも、定性的であれ定量的で
あれ用いることができる。これには、単一サイト(si
ngle site) および二サイト(two−si
te)の両方またはサンドイッチ式の非競合タイプのア
ッセイ、ならびに伝統的な競合結合アッセイが含まれる
【0036】検出の平易さおよびその定量性のためには
、サンドイッチアッセイまたは二重抗体アッセイが特に
好ましく、その数多くの変法が存在し、本発明にはその
全てが含まれることを意図している。
【0037】例えば、典型的な進歩的アッセイにおいて
、非標識抗体は固体基剤上に固定化され、適当な保温期
間の後に結合した分子と試験されるべきサンプルを、抗
体−抗原二重複合体を生成させるのに十分な期間接触さ
せる。次に非結合物質を洗い流す。この時点で、検出可
能なシグナルを誘導できるリポーター分子で標識された
第二抗体が次いで加えられ、抗体−抗原−標識抗体の三
重成分複合体が生成するのに十分な時間保温される。 全ての未反応物質が洗い流され、抗体の存在がシグナル
の観察により決定されるか、または既知量の抗原を含む
対照試料との比較で定量され得る。進歩的アッセイにお
ける変法には、試料および抗体の両方を結合した抗体に
同時に加える同時アッセイ、または標識抗体および試験
されるべき試料を最初に結合させ、培養しそして非標識
表面結合抗体に加える逆アッセイが含まれる。これらの
技術は当業者によく知られており、わずかな変更の可能
性は容易に明らかであろう。ここで使用されている「サ
ンドイッチアッセイ」という用語は基本的な二サイト技
術(two−site technique)に関する
全ての変法を包含することを意図する。
【0038】本発明のイムノアッセイに対して、唯一の
限定的要素は少なくとも一つの抗体が必要な特異性を有
することである。かくして、多くの可能な組合せが可能
である。例えば一方の抗体がポリクローナルで、他方が
モノクローナル抗体であってよい。代わりに、一つの抗
体が当該病原体および他の菌類の両方に結合する一般的
な抗体である一方、第二の抗体が当該病原体に特異的で
あればよい。また、両抗体が当該病原体に特異的であっ
てもよい。
【0039】さらに特別な例として、典型的な進歩的サ
ンドイッチアッセイにおいて、一般的なレプトスフェリ
ア−結合抗体は固体表面に共有結合的か受動的に結合さ
れる。固体表面は通常ガラスまたはポリマーであり、最
も普通に使用されるポリマーはセルロース、ポリアクリ
ルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルま
たはポリプロピレンである。固体支持体材料はチューブ
、ビーズ、ディスクもしくはマイクロプレートの形態、
またはイムノアッセイを行なうのに適するあらゆるその
他の表面であってよい。結合方法は当分野でよく知られ
ている。結合後、固相−抗体複合体は試験試料の製造に
おいて洗浄される。次いで試験される植物抽出物の一部
を固相複合体に加え、適当な温度好ましくは25℃で、
存在する全てのレプトスフェリアを抗体に結合させるの
に十分な時間保温する。培養時間は変えられるが一般的
に2分ないし16時間の範囲である。培養時間経過後、
抗体−レプトスフェリア固相は洗浄され、乾燥され、レ
プトスフェリアに特異的な第二抗体とともに保温される
。第二抗体はリポーター分子に結合され、その視認でき
るシグナルは試料中の抗原に第二抗体が結合したことを
示すために使用される。本明細書で使用されている「レ
ポーター分子」の用語は、その化学的性質により抗原−
結合抗体を検出することを可能にする分析的に検出可能
なシグナルを提供する分子を意味する。検出は試料中の
抗原量の決定を可能にするために少なくとも相対的に定
量可能でなければならない。これは絶対値で計算されて
も、あるいは既知の通常レベルの抗原を含む標準品(ま
たは標準品群)との比較により行なわれてもよい。
【0040】このタイプのアッセイで最も普通に用いら
れるリポーター分子は酵素、蛍光団(fluoroph
ores)または放射性核種含有分子である。酵素免疫
測定法の場合、酵素はしばしばグルタルアルデヒドまた
は過ヨウ素酸塩で第二抗体に抱合される。しかしながら
容易に認識されるように、多様な異なる抱合技術が存在
し、それは熟練技術者によく知られている。常用される
酵素には西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキ
シダーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびアルカリホスフ
ァターゼ等が含まれる。特定の酵素と共に使用される基
質は一般的に、対応する酵素による加水分解に応じて、
検出可能な変色を生じさせるために選択される。例えば
、p−ニトロフェニルホスフェートはアルカリホスファ
ターゼ抱合体と共に使用するのに適している:パーオキ
シダーゼ抱合体には、1,2−フェニレンジアミンまた
はトルイジンが普通に使用される。蛍光基質を使用する
ことも可能であり、それは上記の色素発光基質よりもむ
しろ蛍光生成物を生じる。全ての場合において、酵素で
標識された抗原−特異抗体は最初に抗体−レプトスフェ
リア複合体に加えられ、該複合体に結合され、次いで過
剰の試薬が洗い流される。次いで適当な基質を含む溶液
が抗体−抗原−標識抗体の第三複合体に加えられる。基
質は、第二抗体に結合した酵素と反応し、定性的な可視
シグナルを生じ、それは更に、血清試料中に存在する抗
原の量を評価するために、通常に分光光度的に定量され
てよい。
【0041】他方、フルオレッセンおよびロダミンのよ
うな蛍光化合物は、それらの結合能力を変化させること
なく抗体に化学的に結合されてよい。特定波長の光で照
射することにより活性化された場合、蛍光色素−標識抗
体は光エネルギーを吸収し、分子内に励起状態を導き、
続いて特徴的なより長い波長で光を放出する。その放出
は光顕微鏡で視認できる特徴ある色として現われる。E
IAでのように、蛍光標識PLF−特異抗体は最初に抗
体−フェリチン複合体に結合させられる。非結合試薬を
洗浄した後、残留する三重複合体は次いで適当な波長の
光にさらされ、観察された蛍光は、当該抗原の存在を示
す。蛍光免疫測定法およびEIA技術は両方とも当分野
で非常によく確立されており、本発明方法として特に好
ましい。しかしながら、他のリポーター分子、例えば放
射性同位元素、化学発光性のまたは生物発光性の分子も
また用いられてよい。その操作を要求された用途に合う
ように如何に変えるかは熟練技術者には明白であろう。
【0042】
【実施例】微生物の寄託 ハイブリドーマSen15C6はアメリカ合衆国メリー
ランド州ロックヴィレのアメリカン・タイプ・カルチャ
ー・コレクションに1989年7月25日に寄託され、
受託番号HB  10185と登録されている。
【0043】以下の実施例では本発明に係るハイブリド
ーマおよび抗体の製造方法を説明する。
【0044】実施例1:抗原調製 レプトスフェリア(セプトリア)・ノドルムの生存可能
な培養物からのアガー栓をCD(ツァペック−ドックス
)アガー(ディフコ)またはPDA(ポテト・デキスト
ロース・アガー)(ディフコ)プレート上にひっくり返
し、そしてその栓を表面になすりつける。プレートを室
温および照明下で5〜7日間保温する。
【0045】全てのコロニーをアガープレートから無菌
的に取り出し、そして滅菌250mlオムニ−ミキサー
チャンバー中に置く。滅菌ツァペック培地(ディフコ)
50mlをオムニ−ミキサーチャンバーに添加し、そし
て菌を6000rpmで30秒間ホモジナイズする。
【0046】ツァペック溶液50mlを含有する250
mlエルレンマイヤーフラスコに各々培養ホモジネート
1mlを接種する。接種後のフラスコをシェーカー(通
常の照明下22〜24℃で高速)上に置く。13日後、
培養物を集め、そしてPBSで2回洗浄する。
【0047】菌培養物を0.5mm/無鉛ガラスビーズ
〔インパンデックス(IMPANDEX)〕240ml
含有ダイノ−ミル(DYNO−MILL)・タイプKD
Lの150mlバッチチャンバー中に移す。バッチチャ
ンバーの冷却ジャケットは冷却水道水で8℃まで予め冷
却されている。抽出物を3000rpmで5分間磨砕し
、その後バッチチャンバーの内容物を50ml遠心管に
移し、そしてソルバル(Sorvall) RC−5B
冷却遠心機にてSS−34ローター中13000rpm
で遠心分離する。菌上澄みを少量づつに分け、使用する
まで冷凍する。試料の全タンパク質含量は0.1〜1.
0mgタンパク質/mlの範囲内である。
【0048】実施例2:免疫化および融合Balb/c
マウスの免疫化はフロイント完全アジュバント0.2m
l中の単離体Sen1−001の菌抽出物0.2mlを
腹腔内注射して行う。マウスは14日後にフロイント不
完全アジュバント中の同じ菌抽出物を用いて追加免疫を
行う。第2の追加免疫は12日以内に行う。7日後、マ
ウスの尾採決を行い、そしてその血清を免疫原に特異的
な抗体の存在に対して試験した。次の日、マウスを頸部
脱臼により殺し、そしてリンパ球の抽出のために脾臓を
切除する。脾臓を、無菌の使い捨てのペトリ皿中の80
メッシュ無菌篩上に置き、外科用メスで切断し、3cc
注射器の無菌プランジャーでマッサージする。この操作
中、脾臓をDMEMで数回洗浄する。 細胞懸濁液を無菌の50ml使い捨て遠心管に移す。篩
および残留組織断片を再びDMEMで洗浄し、洗浄物を
遠心管に加える。細胞懸濁液を2000rpmで10分
間回転させる(遠心分離は全て室温で行われる)。上澄
みをデカンテーションし、ペレットを赤血球溶菌性溶液
(0.83%NH4 Cl,0.01M  KHCO3
 ,0.1mM  EDTA)4mlで90秒間室温で
洗浄する。溶菌反応はDMEMで遠心管内容物を45m
lに希釈することにより停止させる。内容物を再び20
00rpmで10分間遠心分離する。上澄みをデカンテ
ーションし、ペレットをDMEM10ml中に再懸濁す
る。細胞懸濁液の試料を細胞数計測のために保存する。 懸濁液中の生存細胞の総数は2.26×108 細胞で
ある。
【0049】アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ションから得たミエローマ細胞〔P3NS1/1−Ag
4−1(NS1),ATCC♯TIB−18〕を50m
l遠心管中2000rpmで10分間の遠心分離により
培養培地から取り出す。上澄みをデカンテーションし、
細胞数計測のためにペレットをDMEM10mlに再懸
濁する。5.65×107 個のミエローマ細胞が脾臓
細胞懸濁液に添加される。一緒にした細胞を2000r
pmで10分間遠心分離する。遠心分離に続いて、上澄
みをデカンテーションする。
【0050】PEG1500(1ml)〔ベーリンガー
・マンハイム・バイオケミカルズ(Boehringe
r Mannheim Biochemicals),
カタログ番号783−641〕1mlを室温でペレット
に加える。2mlピペットおよび自動ピペッターで細胞
を非常に穏やかに再懸濁する。細胞を懸濁状態に保つた
めに遠心管をゆっくりかきまぜながらDMEM10ml
を10分間にわたって滴下添加することにより細胞懸濁
液を非常にゆっくりと希釈する。次いで、DMEMで懸
濁液を45mlにゆっくりと希釈し、そして1500r
pmで10分間遠心分離する。上澄みをデカンテション
し、ペレットをDMEM10mlで穏やかに洗浄し、そ
して1500rpmで10分間再び遠心分離する。融合
細胞を洗浄した後に、5%オリジン−HCF(♯IG−
50−0615フィッシャー・サイエンティフィック)
を含有する予め温めたHAT培地中に細胞を再懸濁し、
そしてプリマリア・マイクロテストIIIプレート(フ
ァルコン♯3870)の60ウエルの各々に、外側の列
のウエルを残して懸濁液2滴加える。 外側のウエルにはペニシリン/ストレプトマイシン含有
DMEMを各200μl入れ、そしてプレートをCO2
 保温器中に置く。
【0051】7日後にHAT/5%オリジン−HCF培
地を細胞に再び供給する。ハイブリドーマのクラスター
は5〜7日後に現れ始める。さらに補給する場合はアミ
ングステルンまたはオリジン−HCFなしで行われる。
【0052】実施例3:ハイブリドーマのスクリーニン
グ Sen1−001菌糸体抽出物を炭酸緩衝液(1.59
g/l  Na2 CO3 ,2.93g/l  Na
H2 CO3 ,pH9.6)中に5μg/mlに希釈
し、そして360μlをマイクロタイタープレート(ヌ
ンク,♯468667)の各ウエル中に加える。室温で
3時間保温した後、プレートを炭酸緩衝液で3回洗浄す
る。ウエル上の残留結合部位は脱脂粉乳溶液400μl
をウエルあたり添加することによりブロックされる。3
0分後、脱脂粉乳溶液をプレート外に揺すって出し、プ
レートを紙タオルで拭き、そして37℃対流保温器(プ
レシジョン,モデル4EM,♯31574)中で一晩乾
燥させる。上澄み100μlを各ウエル上に加え、プレ
ートシェーカー(フロー,♯541305)上10分間
保温する。残留溶液を捨て、そしてプレートを洗浄緩衝
液(24.2g/l  トリス,87.7g/l  N
aCl,0.1g/l  チメロサール,50g/l 
 ツイーン80,pH7.87)で5回洗浄する。KP
Lパーオキシダーゼ複合ヤギ抗マウスIgG〔0.1%
BSA−PBS(1μg/l  BSA,2.18g/
l  NaH2 PO4 ,0.56g/l  NaH
2 PO4 ,8.76g/l  NaCl.pH7.
2)中に1:1000希釈〕100μlを次に各ウエル
に添加し、そしてシェーカー上で10分間保温する。残
留溶液を捨て、そしてプレートを洗浄緩衝液で5回洗浄
する。ABTS基質(23g/l  クエン酸,0.5
ml/l30%H2 O2 ,pH4.0;15mg/
ml  ABTS;ABTS濃厚液はクエン酸緩衝液中
に1:25に希釈される)100μlを各ウエル中に加
え、そしてシェーカー上で10分間保温する。 反応は各ウエルに1.5%NaFを50μl添加するこ
とにより停止される。吸収を405nmで読み取る。
【0053】多くのハイブリドーマがレプトスフェリア
・ノドルムと反応する抗体を分泌することが見出される
。広範囲の異なる単離体と抗体との反応性を決定するた
めに、単一抗体スクリーニングがレプトスフェリア・ノ
ドルム単離体の広げられた集団(パネル)と行われる。 表1:レプトスフェリア・ノドルムに対して製造された
6種のモノクローナル抗体のレプトスフェリア・ノドル
ムの単離体に対する単一抗体間接エリザスクリーニング ─────────────────────────
─────          レプトスフェリア(セ
プトリア)・ノドルムに対する単離体    モノクロ
ーナル抗体         8C7  5C6  11E3  6
F3  5C3  7E9─────────────
─────────────────平均    0.
503   0.578     0.263   0
.413   0.237   0.455   Se
n 1   0.426   0.575     0
.150   0.194   0.085   0.
233   Sen 2   0.527   0.1
93     0.355   0.239   0.
108   0.255   Sen 4   0.3
50   0.702     0.452   0.
223   0.128   0.266   Sen
 6   0.087   0.086     0.
070   0.182   0.029   0.0
59   Sen 7   0.179   0.23
3     0.411   0.839   0.0
19   0.072   Sen 8   0.73
8   0.979     0.627   0.8
04   0.214   0.404   Sen 
9   0.888   1.264     0.7
26   0.377   0.571   0.83
6   Sen10   0.391   0.349
     0.619   0.368   0.19
2   0.361   Sen11   1.396
   2.000     0.499   0.58
2   0.536   0.873   Sen14
   0.037   0.025     0.01
7   0.295   0.013   0.023
   Sen16   0.000   0.000 
    0.080   0.423   0.000
   0.000   Sen17   0.044 
  0.073     0.041   0.212
   0.037   0.044   Sen31 
  0.339   0.291     0.104
   0.250   0.119   0.496 
  Sen32   0.348   0.591  
   0.015   0.493   0.155 
  0.402   Sen33   0.190  
 0.118     0.111   0.473 
  0.159   0.171   Sen34  
 0.801   1.005     0.305 
  0.669   0.576   0.934  
 Sen41   0.456   0.451   
  0.052   0.327   0.225  
 0.541   Sen42   0.430   
0.544     0.066   0.423  
 0.243   0.548   Sen44   
0.433   0.768     0.293  
 0.893   0.267   0.580   
Sen45   2.000   1.310    
 0.275   0.000   1.064   
2.000   ─────────────────
─────────────
【0054】二重抗体サン
ドイッチエリザアッセイを用いて、適当な抗体が選択さ
れた病原体抽出物に対する交差反応性スクリーニングの
ために選択される。マイクロウエルは炭酸緩衝液中の5
μg/mlであるモノクローナル抗体を捕獲抗体として
ウエルあたり100μl用いて感作される。ブロック操
作は上記のように行われる。 モノクローナル抗体の病原体抽出物への結合はヒツジ抗
Sen−HP(西洋ワサビペルオキシダーゼ)複合体を
用いて検出される。これらの結果を表2に示す。 表2:選択された病原体抽出物に対する初期交差反応性
スクリーニング──────────────────
──────────────────       
                         
病原体抽出物a 抗体      Set3  Set
3G   Set4  Set4G   Sen1  
  Ptr1  Mf1   非感作  クラス───
─────────────────────────
────────Sen15C6   0.02  0
.03    0.03  0.02    2.25
+   0.02  0.01   0.01   I
gG2a Sen17E9   0.00  0.01
    0.02  0.00    0.34   
 0.01  0.00   0.01   IgG1
Sen18C7   0.03  0.05    0
.06  0.04    0.45    0.03
  0.01   0.00   IgG1─────
─────────────────────────
──────a:Set=セプトリア・トリチシ;Se
n=セプトリア・ノドルム;Ptr=ピレノホラ・トリ
チシ・レペンチス;Mf1=マイコスフェレラ・フィジ
エンシス
【0055】選択されたモノクローナル抗体上澄みは間
接エリザにおいて関連および非関連菌単離体の広げられ
た集団(パネル)に対して試験される。単離体抽出物は
5μg/mlでマイクロタイタープートに結合される。 このスクリーニングの結果は表3に示されている。 表3:レプトスフェリア(セプトリア)・ノドルムモノ
クローナル抗体上澄みの関連および非関連菌単離体の広
げられた集団(パネル)に対する間接エリザによるスク
リーニング ─────────────────────────
──────              平均吸光度
(405nm)±標準偏差種a   単離体  Sen
15C6  Sen18C7  Sen11E3───
─────────────────────────
─── 1       9      0.71±0
.62      0.54±0.40      0
.43±0.22 2       2      0
.02±0.0       0.01±0.01  
    0.01±0.02 3       4  
    0.02±0.01      0.01±0
.0       0.0  4       5  
    0.01±0.02      0.01±0
.01      0.0  5       3  
    0.02±0.01      0.01±0
.01      0.0  6       1  
    0.03            0.0  
           0.0  7       2
      0.02±0.02      0.0 
            0.01±0.01 8  
     2      0.0          
   0.0             0.01±0
.01 9       1      0.02  
          0.0            
 0.0 10       1      0.0 
            0.0          
   0.0 11       2      0.
0             0.0        
     0.0 12       1      
0.03            0.02     
       0.0113       4    
  0.0             0.0    
         0.02±0.0314     
  4      0.03±0.03      0
.02±0.04      0.03±0.0415
       1      0.0        
     0.03            0.0 
16       1      0.05     
       0.0             0.
0 17       3     0.023±0.
03      0.01±0.01      0.
01±0.0118       2      0.
02±0.0       0.0         
    0.0 19       2      0
.03±0.02      0.01±0.0   
    0.0       20       1 
     0.0             0.0 
            0.0 21       
4      0.03±0.03      0.0
1±0.01      0.0       22 
      1      0.0         
    0.0             0.0 2
3       1      0.01      
      0.0             0.0
 24       3      0.03±0.0
1      0.01±0.01      0.0
7±0.0125      10      0.0
2±0.02      0.01±0.01    
  0.0       26      10   
   0.01±0.01      0.0    
         0.0 27       2  
    0.0             0.01±
0.01      0.0       28   
    3      0.01±0.01     
 0.0             0.01±0.0
129       3      0.01±0.0
2      0.0             0.
01±0.0130       2      0.
0             0.0        
     0.0 ────────────────
───────────────a:用いた種は以下の
とおりである 1=セプトリア・ノドルム,2=アルテルナリア(Al
ternaria)種,3=アスペルギルス(Aspe
rgillus) 種,4=ビポラリス(Bipola
ris) 種,5=ボトチリス(Botrytis)種
,6=コリジウム・ムサエ(Choridium mu
sae) ,7=クラドスポリウム(Cladospo
rium)種,8=コレトトリクム・グラミニコラ(C
olletotrichum graminicola
),9=クルブラリア・ルナタ(Curvularia
 lunata) ,10=ジプロディア・ゴッシピナ
(Diplodia gossypina),11=ド
レクスレラ(Drechslera)種,12=エピコ
ッカム・ニグラム(Epicoccum nigrum
),13=フサリウム(Fusarium)種,14=
ヘルミントスポリウム・サチバム(Helmintho
sporium sativum),15=ランベルテ
ラ(Lambertella) 種,16=ランジア・
レテオ−ビレッセンス(Lanzia luteo−v
irescens),17=レプトスフェリア・コラエ
(Leptosphaeria korrae),18
=モニリア(Monillia)種,19=モルチエラ
(Mortierella) 種,20=ミリオスクレ
ロチニア・デンニシイ(Myriosclerothi
nia dennisii),21=ペニシリウム(P
enicillium) 種,22=フィアロホラ・グ
ラミニコラ(Phyalophora gramini
cola)),23=シュードセルコポレラ・ヘルポト
リコイデス(Pseudocercosporella
 herportrichoides),24=ピレノ
ホラ・トリチシ−レペンチス(Pyrenophora
 tritici−repentis),25=ピチウ
ム(Pythium) 種,26=リゾクトニア(Rh
izoctonia) 種,27=リゾプス・ストロニ
フェール(Rhizopus stolonifer)
 ,28=スクレロチウム(Sclerotium)種
,29=セプトリア・トリチシ(Septoriatr
itici),30=ステムフィリウム・ベシカリウム
(Stemphylium vesicarium)

0056】数回のスクリーニングの後、抗体Sen15
C6が二重抗体サンドイッチアッセイの性能に基づいて
選択される。Sen15C6はプロテインAアフィニテ
ィークロマトグラフィーを用いて上澄みから精製される
。マイクロウエルは炭酸緩衝液中の5μg/mlである
モノクローナル抗体を捕獲抗体としてウエルあたり10
0μl用いて感作される。アッセイはレプトスフェリア
・ノドルム抗原抽出物、レプトスフェリア・ノドルム感
染小麦葉材料、正常小麦葉および緩衝液対照に対して行
われる。二重抗体アッセイの結果は表4に示されている
。ヒツジ抗セプトリア・ノドルム−西洋ワサビペルオキ
シダーゼ複合体が指標化抗体として使用される。 表4: ─────────────────────────
────────  抗原             
         モノクローナル抗体       
           Sen15C6  Sen17
E9  Sen18C7──────────────
───────────────────Sen1−0
01   10μg/ml    2.00+      2
.00+      2.00+    1μg/ml
    0.683      0.637     
 0.355   0.5μg/ml    0.17
9      0.303      0.169Se
n感染葉   1:1*           1.489   
   0.576      0.332  1:10
*         0.349      0.29
8      0.208  1:100*     
  0.147      0.268      0
.152正常葉   非希釈            0.102   
   0.243      0.179──────
─────────────────────────
─*=PBS緩衝液中の0.1%BSA溶液への感染小
麦葉の希釈
【0057】これらの結果は、Sen15C
6抗体が抗原抽出中ならびに感染葉中のレプトスフェリ
ア・ノドルムを検出するためのイムノアッセイに使用さ
れ得ることを示す。
【0058】実施例4:「レプトスフェリア・コラエ」
モノクローナル抗体 オハイオ州立大学の研究者はレプトスフェリア・コラエ
に対するモノクローナル抗体の製造を以前報告した〔1
0〕。この抗体は間接エリザにおいてレプトスフェリア
・コラエの3単離体およびその他のレプトスフェリア関
連および非関連菌類の21単離体からなる集団(パネル
)に対して交差反応性を決定するために試験される(表
5)。 表5:レプトスフェリア関連および非関連菌類に対する
レプトスフェリア・コラエモノクローナル抗体(LKc
50)の上澄みの1/16希釈の間接エリザにおける交
差反応性のスクリーニング a:真の吸光度=(試料の吸光度)−(緩衝液Aの吸光
度) *:使用された単離体の種は以下のとおりである1=レ
プトスフェリア・コラエ,2=アルテルナリア種,3=
ボトリチス・シネレア(Botrytis ciner
ea),4=ビポラリス・ソロキニアナ(Bipola
ris sorokiniana) ,5=クルブラリ
ア・ルナタ,6=ドレクスレラ・ギガンテア(Drec
hsleragigantea) ,7=エピコッカム
・ニグラム,8=エピコッカム種,9=ヘルミントスポ
リウム・サチバム,10=モルチエレラ・エピガマ(M
ortierella epigama) ,11=ピ
チウム・アファニデルマツム(Pythium aph
anidermatum),12=ピチウム・グラミニ
コラ(P. graminicola),13=ピチウ
ム・イレグラレ(P. irregulare) ,1
4=ピチウム・ミリオチルム(P. myriotyl
um) ,15=ピチウム・トルロサム(P. tor
ulosum),16=ピチウム・ウルチマム(P. 
ultimum),17,18=セプトリア・ノドルム
,19=ステムフィリウム・ベシカリウム
【0059】結果は、レプトスフェリアの種に対するそ
の他の公知モノクローナル抗体がレプトスフェリア属以
外の菌種と強い交差反応性であることを明らかに示す。 そのような交差反応性はエピコッカム属の菌類とで特に
不都合である。エピコッカム属は芝生中の一般的な腐生
菌であり、もし進展した症状の芝生が不注意にサンプリ
ングされれば問題を引き起こす。従って、この抗体は診
断には不適当である。
【0060】実施例5:オンサイトアッセイオンサイト
アッセイは、抽出緩衝液2ml含有のボトル中に入れら
れ、そして震盪した後に0.02μmフィルターでろ過
される磨砕用研磨パッドを用いることにより1枚の葉の
上で行われる。ろ過した抽出物6滴を捕獲抗体で被覆し
た吸着装置上に加える。各々の酵素指標化抗体2滴、す
すぎ溶液および酵素基質を次々に添加した後、菌の抗原
が試料中に存在するとき試験サークルは青に変わる。仕
上げ溶液2滴の添加は呈色反応を停止する。存在する抗
原の量はX−ライト(X−Rite)メーターおよび/
またはアグリメーター(Agrimeter) を用い
てX−ライト単位で存在する相対的反射率を測定するこ
とにより測定され得る。
【0061】感度の比較は迅速(オンサイト)アッセイ
とマルチウエルアッセイの間で正常小麦抽出物中のSe
n1抗原の希釈物に対して行われる。
【0062】オンサイトアッセイの性能はまた、セプト
リア・ノドルムに感染した農園小麦を用いて評価される
(表6およひ7)。使用された小麦変種ツワイン(Tw
ain) およびトラベラー(Traveler)は試
験鉢中でセプトリア・ノドルムに自然に感染させる。6
植物体から最も下の3枚の葉(依然分げつ段階にある植
物)を除去し、そしてエクストラック・パッド(Ext
rak pads) 2個/2ml緩衝液Z−5を用い
て個々に抽出する。抽出物を0.02μm登録商標アノ
トップ(Anotop)フィルターでろ過し、1990
セプトリア・ノドルムおよびセプトリア・トリチシ・マ
ルチウエルキットでアッセイする。セプトリア・ノドル
ム・マルチウエルキット中で強く反応する試料はまたオ
ンサイトキットにおいてアッセイされる。
【0063】植物試料マトリックス作用はオンサイトア
ッセイでは観察されず、マルチウエイアッセイでスケー
ル外の値となる試料に対してX−ライトメーターの値は
31〜86の範囲である。
【0064】 表6:1990セプトリア・ノドルム・マルチウエルキ
ットおよび1990セプトリア・ノドルム・オンサイト
キットでのセプトリア・ノドルム感染小麦(ツワイン栽
培品種)のアッセイ ─────────────────────────
─────                    
      粉胞子器  Sn*       Sn 
         試料        葉  組織死
%  の有無    吸光度      X−ライト 
                         
          405nm  の値a ────
─────────────────────────
─ツワイン1  1    40      +   
   2.0+    53            
2  0−1      −      0.00  
    −a             3     
 0      −      0.00      
−ツワイン2  1    50      +   
   2.0+    40            
2  0−1      −      0.00  
    −            3      0
      −      0.19      −ツ
ワイン3  1    30      +     
 2.0+    56            2 
 0−1      −      0.00    
  −            3      0  
    −      0.19      −ツワイ
ン4  1    40      +      2
.0+    45            2  0
−1      −      0.00      
−            3      0    
  −      0.00      −ツワイン5
  1    20      +      1.6
4    25            2  0−1
      −      0.34      8 
           3      0      
−      0.18      −ツワイン6  
1    30      +      2.0+ 
   46            2  0−1  
    −      0.00      −   
         3      0      − 
     0.00      −─────────
────────────────────a:−=試
験されず *:Sn=セプトリア・ノドルム
【0065】葉は植物の下部から上に向けて1〜3と番
号が付される。真のMW吸光度は式(試料の450nm
での吸光度−緩衝液Z−5の450nmでの吸光度)を
用いて計算される。緩衝液Z−5はセプトリア・ノドル
ムキットにおいて0.332の吸光度を与える。セプト
リア・ノドルム対する陽性対照の吸光度は0.829で
ある。アッセイ当時の植物はおよそ生長段階♯24であ
る。
【0066】 表7:1990セプトリア・ノドルムおよび1990セ
プトリア・ノドルム・オンサイトキットでのセプトリア
・ノドルム感染小麦(トラベラー栽培品種)のアッセイ ─────────────────────────
──────                   
         粉胞子器  Sn*       
Sn試料          葉  組織死%  の有
無    吸光度      X−ライト      
                         
       405nm  の値a ───────
────────────────────────ト
ラベラー1  1    50      +    
  2.0+    86             
 2    10      −      0.51
      −a               3 
     0      −      0.13  
    −トラベラー2  1    30     
 +      2.0+    48       
       2  0−1      −     
 0.17      −             
 3      0      −      0.0
0      −トラベラー3  1    30  
    +      2.0+    55    
          2      0      −
      0.00      −        
      3      0      −    
  0.00      −トラベラー4  1   
 50      +      2.0+    6
8              2  0−1    
  −      0.20      −     
         3      0      − 
     0.24      −トラベラー5  1
    30      +      2.0+  
  65              2      
5      −      0.24      −
              3  0−5     
 −      0.04      −トラベラー6
  1    25      +      2.0
+    31              2   
   0      −      0.00    
  −              3      0
      −      0.00      −正
常1        1      0      −
      0.00      1(ND495) 
      2      0      −    
  0.00      0            
  3      0      −      0.
00      8────────────────
──────────────a:−=試験されず *:Sn=セプトリア・ノドルム
【0067】葉は植物の下部から上に向けて1〜3と番
号が付される。真のMW吸光度は式(試料の450nm
での吸光度−緩衝液Z−5の450nmでの吸光度)を
用いて計算される。緩衝液Z−5はセプトリア・ノドル
ムキットにおいて0.332の吸光度を与える。セプト
リア・ノドルム対する陽性対照の吸光度は0.829で
ある。アッセイ当時の植物はおよそ生長段階♯24であ
る。
【0068】これらの結果は、セプトリア・ノドルム抗
原がマルチウエルプレートキットおよびオンサイトキッ
トの両方を用いて検出され得ることを示す。
【0069】本明細書に記載した特定の実施態様は本発
明のいくつかの面を説明するためのものであるから、本
発明はそれらの実施態様の範囲に限定されない。あらゆ
る同等の実施態様が本発明の範囲内であると理解される
べきである。実際に、ここに示したものの他に本発明の
種々の変形はこれまでの記載から当業者に明らかであろ
う。そのような変形もまた本発明の範囲である。
【0070】
【図面の簡単な説明】
【図1】正常な小麦抽出物中のSen1(004)の希
釈に対する迅速アッセイおよびマルチウエルアッセイの
感度の比較を示す。

Claims (22)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】  レプトスフェリア属の菌類の少なくと
    も1種と特異的に反応するが、該属以外の種とは反応し
    ないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞
    系。
  2. 【請求項2】  抗体がレプトスフェリアの単一種と特
    異的に反応する請求項1記載のハイブリドーマ細胞系。
  3. 【請求項3】  抗体がレプトスフェリア・ノドルムと
    特異的に反応する請求項2記載のハイブリドーマ細胞系
  4. 【請求項4】  アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
    レクションに受託番号ATCC  HB  10185
    として寄託されている請求項2記載のハイブリドーマ細
    胞系。
  5. 【請求項5】  レプトスフェリア属の少なくとも1種
    と特異的に反応するが、該属以外の種とは反応しないモ
    ノクローナル抗体。
  6. 【請求項6】  レプトスフェリアの単一種と特異的に
    反応する請求項5記載の抗体。
  7. 【請求項7】  レプトスフェリア・ノドルムと特異的
    に反応する請求項5記載の抗体。
  8. 【請求項8】  アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
    レクションに受託番号ATCC  HB  10185
    として寄託されているハイブリドーマ細胞系により産生
    される請求項7記載のモノクローナル抗体。
  9. 【請求項9】  レプトスフェリア属の少なくとも1種
    と特異的に反応するが、該属以外の種とは反応しないモ
    ノクローナル抗体と試料を接触させ、そして抗体−抗原
    結合反応の有無を観察することからなる試料中のレプト
    スフェリア属の菌類の有無を検出する方法。
  10. 【請求項10】  試料を2種の抗体と反応させること
    からなり、該抗体の少なくとも1種がレプトスフェリア
    の少なくとも1種と特異的に反応するモノクローナル抗
    体であり、一方の抗体が固定化され、そして他方がリポ
    ーター分子で標識されている請求項9記載の方法。
  11. 【請求項11】  抗体の一方がポリクローナル抗体で
    ある請求項10記載の方法。
  12. 【請求項12】  モノクローナル抗体がレプトスフェ
    リアの1種だけと特異的に反応する請求項9、10また
    は11記載の方法。
  13. 【請求項13】  モノクローナル抗体がレプトスフェ
    リア・ノドルムと特異的に反応する請求項12記載の方
    法。
  14. 【請求項14】  抗体がアメリカン・タイプ・カルチ
    ャー・コレクションに受託番号ATCC  HB  1
    0185として寄託されているハイブリドーマ細胞系に
    より産生される請求項13記載の方法。
  15. 【請求項15】  固体支持体に結合した抗体およびリ
    ポーター分子で標識された抗体からなり、両方の抗体が
    レプトスフェリア属の菌類の種と反応し得、そして少な
    くとも一方がレプトスフェリア属の少なくとも1種と特
    異的に反応するが、該属以外の種とは反応しないモノク
    ローナル抗体である診断用キット。
  16. 【請求項16】  キットがオンサイトキットである請
    求項15記載のキット。
  17. 【請求項17】  抗体の一方がポリクローナル抗体で
    ある請求項15記載のキット。
  18. 【請求項18】  モノクローナル抗体がレプトスフェ
    リアの1種だけと特異的に反応する請求項15または1
    7記載のキット。
  19. 【請求項19】  モノクローナル抗体がレプトスフェ
    リア・ノドルムと特異的に反応する請求項18記載のキ
    ット。
  20. 【請求項20】  モノクローナル抗体がアメリカン・
    タイプ・カルチャー・コレクションに受託番号ATCC
      HB  10185として寄託されているハイブリ
    ドーマ細胞系により産生される請求項19記載のキット
  21. 【請求項21】(a)レプトスフェリアの抽出物で供与
    動物を免疫化し、(b)該免疫化供与動物から免疫適格
    性B細胞を単離し、(c)該B細胞と不死細胞系の細胞
    を融合し、そして(d)融合物をスクリーニングし、そ
    してレプトスフェリアに対して特異性を有する抗体を産
    生する融合物を同定する、ことからなるレプトスフェリ
    ア属の菌類の少なくとも1種と特異的に反応するモノク
    ローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系の製造方
    法。
  22. 【請求項22】  レプトスフェリアの少なくとも1種
    と特異的に反応するモノクローナル抗体を産生し得るハ
    イブリドーマ細胞系を抗体産生誘導条件下で培養し、そ
    してそのようにして産生された抗体を慣用の方法により
    単離することからなる上記モノクローナル抗体の製造方
    法。
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