JPH0949842A - 抗体を用いた牛の血中グルタチオンペルオキシダーゼ、全血セレン濃度、乳汁中体細胞数の測定法及び乳房炎診断法 - Google Patents
抗体を用いた牛の血中グルタチオンペルオキシダーゼ、全血セレン濃度、乳汁中体細胞数の測定法及び乳房炎診断法Info
- Publication number
- JPH0949842A JPH0949842A JP20090795A JP20090795A JPH0949842A JP H0949842 A JPH0949842 A JP H0949842A JP 20090795 A JP20090795 A JP 20090795A JP 20090795 A JP20090795 A JP 20090795A JP H0949842 A JPH0949842 A JP H0949842A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- glutathione peroxidase
- blood
- bovine
- milk
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 牛由来グルタチオンペルオキシダーゼを
免疫抗原として得られる抗血清あるいはモノクローナル
抗体を用いた免疫化学的測定法により、全血中及び乳汁
中グルタチオンペルオキシダーゼを測定すると同時に、
本酵素と高い相関性を持つ全血セレン濃度及び乳汁中体
細胞数を間接的に測定する。また、間接的に測定された
乳汁中体細胞数から、乳房炎の診断を行う。 【効果】 簡易で迅速な牛血中グルタチオンペルオキシ
ダーゼ、全血セレン濃度、及び乳汁中体細胞数の測定が
可能になり、乳房炎の診断が容易になる。
免疫抗原として得られる抗血清あるいはモノクローナル
抗体を用いた免疫化学的測定法により、全血中及び乳汁
中グルタチオンペルオキシダーゼを測定すると同時に、
本酵素と高い相関性を持つ全血セレン濃度及び乳汁中体
細胞数を間接的に測定する。また、間接的に測定された
乳汁中体細胞数から、乳房炎の診断を行う。 【効果】 簡易で迅速な牛血中グルタチオンペルオキシ
ダーゼ、全血セレン濃度、及び乳汁中体細胞数の測定が
可能になり、乳房炎の診断が容易になる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は免疫化学的測定法に
よる牛の血中グルタチオンペルオキシダーゼ、全血セレ
ン濃度、乳汁中体細胞数の測定法及び乳房炎診断法に関
するものである。
よる牛の血中グルタチオンペルオキシダーゼ、全血セレ
ン濃度、乳汁中体細胞数の測定法及び乳房炎診断法に関
するものである。
【０００２】
【従来の技術】グルタチオンペルオキシダーゼはグルタ
チオンによる過酸化水素、脂質過酸化物の分解を触媒す
る酵素であり、牛での本酵素の分子量はおよそ８４ｋ
ｄ、その活性中心にセレノシステインの形でセレン４原
子を含むセレン含有酵素として知られている。このセレ
ンの生理的機能型である本酵素の活性値は、生体内にお
けるセレンの状態を最もよく反映するものであり、セレ
ン状態の評価に広く利用されている。
チオンによる過酸化水素、脂質過酸化物の分解を触媒す
る酵素であり、牛での本酵素の分子量はおよそ８４ｋ
ｄ、その活性中心にセレノシステインの形でセレン４原
子を含むセレン含有酵素として知られている。このセレ
ンの生理的機能型である本酵素の活性値は、生体内にお
けるセレンの状態を最もよく反映するものであり、セレ
ン状態の評価に広く利用されている。
【０００３】図１０はグルタチオンペルオキシダーゼの
反応様式である。本酵素の活性測定法は、還元型グルタ
チオン（ＧＳＨ）を水素供与体とし、Ｈ2Ｏ2または有機
ヒドロペルオキシドを基質としてグルタチオンペルオキ
シダーゼ反応を行わせ、生成される酸化型グルタチオン
（ＧＳＳＧ）を酵母由来グルタチオンレダクターゼによ
りＧＳＨに還元し、このとき消費されるＮＡＤＰＨの減
少を、３４０ｎｍでの吸光度の経時的減少として分光光
度計により測定記録するというものである。
反応様式である。本酵素の活性測定法は、還元型グルタ
チオン（ＧＳＨ）を水素供与体とし、Ｈ2Ｏ2または有機
ヒドロペルオキシドを基質としてグルタチオンペルオキ
シダーゼ反応を行わせ、生成される酸化型グルタチオン
（ＧＳＳＧ）を酵母由来グルタチオンレダクターゼによ
りＧＳＨに還元し、このとき消費されるＮＡＤＰＨの減
少を、３４０ｎｍでの吸光度の経時的減少として分光光
度計により測定記録するというものである。
【０００４】しかしこの測定法は、１）高価な分光光度
計を必要とする（１分間吸光度モニタリングシステ
ム）、２）用いる試薬が用時調製である、３）試薬が高
価である、４）酵素活性が室温により左右されやすい、
５）多検体処理が困難である、などの問題点を有してい
る。
計を必要とする（１分間吸光度モニタリングシステ
ム）、２）用いる試薬が用時調製である、３）試薬が高
価である、４）酵素活性が室温により左右されやすい、
５）多検体処理が困難である、などの問題点を有してい
る。
【０００５】また、生体内のセレンの測定法には、原子
吸光法、ガスクロマトグラフ法、蛍光光度法及び蛍光検
出高速液体クロマトグラフィー法、などがあるが、いず
れも煩雑な操作を必要とする。
吸光法、ガスクロマトグラフ法、蛍光光度法及び蛍光検
出高速液体クロマトグラフィー法、などがあるが、いず
れも煩雑な操作を必要とする。
【０００６】即ち、原子吸光法では検出感度を高めるた
めに黒鉛炉を用いるなど一般的な仕様では測定できな
い。また、ガスクロマトグラフ法ではセレンを標識し
て、電子捕獲型検出器を用いるが、標識剤がかなり高価
である。蛍光光度法では２，３−ジアミノナフタレン
（ＤＡＮ）に含まれる他の蛍光物質や、ＤＡＮと反応し
て生成するピアセノール（Ｓｅ−ＤＡＮ）以外の蛍光物
質を除去する操作を必要とし多検体処理に適していな
い。一方、蛍光検出高速液体クロマトグラフィー法は他
の測定法に比べ高感度でなおかつ簡易であるが、測定に
長時間かかるなど、臨床の場での実用性は低い。
めに黒鉛炉を用いるなど一般的な仕様では測定できな
い。また、ガスクロマトグラフ法ではセレンを標識し
て、電子捕獲型検出器を用いるが、標識剤がかなり高価
である。蛍光光度法では２，３−ジアミノナフタレン
（ＤＡＮ）に含まれる他の蛍光物質や、ＤＡＮと反応し
て生成するピアセノール（Ｓｅ−ＤＡＮ）以外の蛍光物
質を除去する操作を必要とし多検体処理に適していな
い。一方、蛍光検出高速液体クロマトグラフィー法は他
の測定法に比べ高感度でなおかつ簡易であるが、測定に
長時間かかるなど、臨床の場での実用性は低い。
【０００７】牛の乳汁中体細胞数は、牛の重要な疾病の
一つである乳房炎の判定基準として用いられており、そ
の測定法には、直接顕微鏡で鏡検し細胞数を数えるＢｒ
ｅｅｄ法、蛍光光学式体細胞測定機などによる自動測定
法、またＣＭＴ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｍａｓｔｉｔ
ｉｓ Ｔｅｓｔ）家畜衛生試験場北陸支場変法（ＰＬテ
スト）などのような間接法が一般的に用いられている。
一つである乳房炎の判定基準として用いられており、そ
の測定法には、直接顕微鏡で鏡検し細胞数を数えるＢｒ
ｅｅｄ法、蛍光光学式体細胞測定機などによる自動測定
法、またＣＭＴ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｍａｓｔｉｔ
ｉｓ Ｔｅｓｔ）家畜衛生試験場北陸支場変法（ＰＬテ
スト）などのような間接法が一般的に用いられている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】上記のように、グルタ
チオンペルオキシダーゼ及びセレンの測定には、高価な
試薬や特殊な機材を必要とし、また操作もかなり煩雑で
あるため、実際にセレン欠乏牛及びグルタチオンペルオ
キシダーゼ活性低下牛が問題となる臨床の場での簡易測
定は困難である。また、牛の乳房炎の臨床現場での診断
法としてはＰＬテストが広く普及しているが、ＰＬテス
トには定量性が低いという問題点がある。
チオンペルオキシダーゼ及びセレンの測定には、高価な
試薬や特殊な機材を必要とし、また操作もかなり煩雑で
あるため、実際にセレン欠乏牛及びグルタチオンペルオ
キシダーゼ活性低下牛が問題となる臨床の場での簡易測
定は困難である。また、牛の乳房炎の臨床現場での診断
法としてはＰＬテストが広く普及しているが、ＰＬテス
トには定量性が低いという問題点がある。
【０００９】そこで本発明者らは、上述の問題を解決す
るため、牛のグルタチオンペルオキシダーゼに対する抗
体を用いた免疫化学的測定法を用いてグルタチオンペル
オキシダーゼを測定することにより、全血中の本酵素活
性と高い相関性を持つ全血セレン濃度、及び乳汁におい
て本酵素のほとんどが存在する体細胞を間接的に測定す
る方法について検討を行い、本発明を完成した。
るため、牛のグルタチオンペルオキシダーゼに対する抗
体を用いた免疫化学的測定法を用いてグルタチオンペル
オキシダーゼを測定することにより、全血中の本酵素活
性と高い相関性を持つ全血セレン濃度、及び乳汁におい
て本酵素のほとんどが存在する体細胞を間接的に測定す
る方法について検討を行い、本発明を完成した。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明は、牛由来グルタ
チオンペルオキシダーゼに対する抗体を作製し、その抗
体を利用したグルタチオンペルオキシダーゼ活性、全血
セレン濃度及び乳汁中体細胞数を測定する免疫化学的測
定法であり、また牛由来グルタチオンペルオキシダーゼ
に対する抗体を用いた免疫化学的測定法を利用し、乳汁
中グルタチオンペルオキシダーゼを測定することにより
乳汁中体細胞数を間接的に測定して乳房炎を診断する方
法である。
チオンペルオキシダーゼに対する抗体を作製し、その抗
体を利用したグルタチオンペルオキシダーゼ活性、全血
セレン濃度及び乳汁中体細胞数を測定する免疫化学的測
定法であり、また牛由来グルタチオンペルオキシダーゼ
に対する抗体を用いた免疫化学的測定法を利用し、乳汁
中グルタチオンペルオキシダーゼを測定することにより
乳汁中体細胞数を間接的に測定して乳房炎を診断する方
法である。
【００１１】以下に、本発明の手段を更に詳細に説明す
る。
る。
【００１２】本発明において、免疫化学的測定法とは、
抗原−抗体反応を利用することを特徴とする測定法であ
り、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、蛍光抗体
法、ラテックス凝集反応、酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法）
などを用いることができるが、酵素抗体法を用いること
が特に好ましい。
抗原−抗体反応を利用することを特徴とする測定法であ
り、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、蛍光抗体
法、ラテックス凝集反応、酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法）
などを用いることができるが、酵素抗体法を用いること
が特に好ましい。
【００１３】本測定法に用いるグルタチオンペルオキシ
ダーゼは牛の組織に広く分布している。そのため、市販
品又は様々な材料、例えば赤血球、血小板、血清、肝臓
などの組織から抽出、分画、精製したものを使用するこ
とができる。また、牛には肉用牛、乳用牛など多くの種
類が存在するが、グルタチオンペルオキシダーゼはこれ
らの種間では構造的に共通であるので、本測定法に用い
る本酵素の由来や、その測定対象は、牛の品種に限定さ
れるものではない。
ダーゼは牛の組織に広く分布している。そのため、市販
品又は様々な材料、例えば赤血球、血小板、血清、肝臓
などの組織から抽出、分画、精製したものを使用するこ
とができる。また、牛には肉用牛、乳用牛など多くの種
類が存在するが、グルタチオンペルオキシダーゼはこれ
らの種間では構造的に共通であるので、本測定法に用い
る本酵素の由来や、その測定対象は、牛の品種に限定さ
れるものではない。
【００１４】本発明に利用される抗体には抗血清すなわ
ちポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の２種類が
存在する。
ちポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の２種類が
存在する。
【００１５】一般的に前者抗体の作製については、目的
の抗原、すなわちグルタチオンペルオキシダーゼを適当
な動物に、適量、数回、皮下または筋肉内に投与し、十
分に抗体価が上昇した後、免疫動物より採血し、その採
血した血清から、冷アルコール処理を行うＣｏｈｎ法、
塩析、透析及びカラムクロマトグラフィー法を組み合わ
せた方法により、免疫グロブリンを分離精製して得るこ
とができる。
の抗原、すなわちグルタチオンペルオキシダーゼを適当
な動物に、適量、数回、皮下または筋肉内に投与し、十
分に抗体価が上昇した後、免疫動物より採血し、その採
血した血清から、冷アルコール処理を行うＣｏｈｎ法、
塩析、透析及びカラムクロマトグラフィー法を組み合わ
せた方法により、免疫グロブリンを分離精製して得るこ
とができる。
【００１６】一方、後者については、マウスやヒト由来
のミエローマなどを用いる細胞融合法、ＥＢウィルスに
よりＢ細胞を刺激する方法、またはそれらの組み合わせ
方法などがあるが、最近では遺伝子工学的技術も用いら
れるようになってきた。どの方法を用いるかは、利用す
る対象の動物種によって異なってくるので、適宜良い方
法を選択することが大切である。
のミエローマなどを用いる細胞融合法、ＥＢウィルスに
よりＢ細胞を刺激する方法、またはそれらの組み合わせ
方法などがあるが、最近では遺伝子工学的技術も用いら
れるようになってきた。どの方法を用いるかは、利用す
る対象の動物種によって異なってくるので、適宜良い方
法を選択することが大切である。
【００１７】サンドイッチ酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法）
において、一次抗体を接着させる固相として、抗体を受
動的によく吸着するポリスチレン、ポリカーボネート、
ポリプロピレン、ポリビニール製のマイクロプレート、
ビーズ、スティック、試験管等が一般に用いられてお
り、どのようなものを選択するかは、それぞれ一長一短
があるが、ポリスチレン製やポリビニール製のＥＬＩＳ
Ａ用及びＲＩＡ用のマイクロタイタートレイが良好な結
果を示す。
において、一次抗体を接着させる固相として、抗体を受
動的によく吸着するポリスチレン、ポリカーボネート、
ポリプロピレン、ポリビニール製のマイクロプレート、
ビーズ、スティック、試験管等が一般に用いられてお
り、どのようなものを選択するかは、それぞれ一長一短
があるが、ポリスチレン製やポリビニール製のＥＬＩＳ
Ａ用及びＲＩＡ用のマイクロタイタートレイが良好な結
果を示す。
【００１８】次に、標識抗体について説明する。標識物
質としては、蛍光物質、酵素、放射性物質などを用いる
ことができるが、特に酵素の使用が好ましい。抗体に標
識する酵素は純度が高く、安価で、活性が安定なもの、
分子量が小さいもの、短時間に多くの基質を分解できる
回転率の高いものが望ましい。具体的なものとして、酸
性ホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコ
ースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、アル
カリ性ホスファターゼ（ＡＰ）、ワサビペルオキシダー
ゼ（ＨＲＰ）、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラー
ゼ、チロシナーゼ等が使われているが、その中でも、Ａ
Ｐ、ＨＲＰは良好な結果を示し、かつ数多く市販されて
いるので、比較的両者がよく使用されている。また、抗
体にビオチンを結合させ、さらにこのビオチンにＨＲＰ
等の酵素で標識したアビジンを結合させることにより、
間接的に標識する方法（ＡＢＣ法）も用いることができ
る。酵素を抗体に標識する方法には、グルタルアルデヒ
ドを用いるＡｖｒａｍｅａｓの方法や、ＮａＩＯ4を用
いるＷｉｌｓｏｎやＮａｋａｎｅの方法のように、酵素
と抗体を架橋剤を用いて化学結合させる方法がよく用い
られる。
質としては、蛍光物質、酵素、放射性物質などを用いる
ことができるが、特に酵素の使用が好ましい。抗体に標
識する酵素は純度が高く、安価で、活性が安定なもの、
分子量が小さいもの、短時間に多くの基質を分解できる
回転率の高いものが望ましい。具体的なものとして、酸
性ホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコ
ースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、アル
カリ性ホスファターゼ（ＡＰ）、ワサビペルオキシダー
ゼ（ＨＲＰ）、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラー
ゼ、チロシナーゼ等が使われているが、その中でも、Ａ
Ｐ、ＨＲＰは良好な結果を示し、かつ数多く市販されて
いるので、比較的両者がよく使用されている。また、抗
体にビオチンを結合させ、さらにこのビオチンにＨＲＰ
等の酵素で標識したアビジンを結合させることにより、
間接的に標識する方法（ＡＢＣ法）も用いることができ
る。酵素を抗体に標識する方法には、グルタルアルデヒ
ドを用いるＡｖｒａｍｅａｓの方法や、ＮａＩＯ4を用
いるＷｉｌｓｏｎやＮａｋａｎｅの方法のように、酵素
と抗体を架橋剤を用いて化学結合させる方法がよく用い
られる。
【００１９】基質は、使用する標識物質によっても異な
るが、ＡＰにはｐ−ニトロフェニルリン酸が使用されて
おり、発色反応をＮａＯＨで停止すると安定な黄色を保
ち、４０５ｎｍで比色定量できる。一方ＨＲＰには、Ｈ
2Ｏ2とこれにより酸化される物質、０−フェニレンジア
ミンまたは２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾ
チアゾリン−６−スルホン酸）二アンモニウム塩（ＡＢ
ＴＳ）が感度が高いため使用されている。反応をＨ2Ｓ
Ｏ4またはＮａＦで停止させると、０−フェニレンジア
ミンの場合は黄褐色を呈し４９２ｎｍで、またＡＢＴＳ
の場合は緑色を呈し４１４ｎｍで比色定量できる。
るが、ＡＰにはｐ−ニトロフェニルリン酸が使用されて
おり、発色反応をＮａＯＨで停止すると安定な黄色を保
ち、４０５ｎｍで比色定量できる。一方ＨＲＰには、Ｈ
2Ｏ2とこれにより酸化される物質、０−フェニレンジア
ミンまたは２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾ
チアゾリン−６−スルホン酸）二アンモニウム塩（ＡＢ
ＴＳ）が感度が高いため使用されている。反応をＨ2Ｓ
Ｏ4またはＮａＦで停止させると、０−フェニレンジア
ミンの場合は黄褐色を呈し４９２ｎｍで、またＡＢＴＳ
の場合は緑色を呈し４１４ｎｍで比色定量できる。
【００２０】本発明によれば、血液や乳汁の様に多くの
蛋白質や脂肪が含まれるサンプルであっても、その中の
グルタチオンペルオキシダーゼのみを特異的に測定する
ことができるので、測定前に遠心分離などの操作により
夾雑物を除く必要がない。ただし、血液をサンプルとし
て測定する場合、赤血球中の本酵素を測定可能な状態に
するため、血液を完全に溶血させる必要があるが、これ
は凍結融解、低張あるいは高張処理、種々の溶血剤の使
用などにより容易に行うことができる。また乳汁をサン
プルとする場合も、体細胞中の本酵素を測定可能な状態
にするため、体細胞を破壊する必要があるが、これも凍
結融解などにより容易に行うことができる。
蛋白質や脂肪が含まれるサンプルであっても、その中の
グルタチオンペルオキシダーゼのみを特異的に測定する
ことができるので、測定前に遠心分離などの操作により
夾雑物を除く必要がない。ただし、血液をサンプルとし
て測定する場合、赤血球中の本酵素を測定可能な状態に
するため、血液を完全に溶血させる必要があるが、これ
は凍結融解、低張あるいは高張処理、種々の溶血剤の使
用などにより容易に行うことができる。また乳汁をサン
プルとする場合も、体細胞中の本酵素を測定可能な状態
にするため、体細胞を破壊する必要があるが、これも凍
結融解などにより容易に行うことができる。
【００２１】以下、本発明の作用を明らかにするため、
次のような試験を行った。
次のような試験を行った。
【００２２】試験１（マウスモノクローナル抗体を用い
たサンドイッチＥＬＩＳＡ法による牛血中グルタチオン
ペルオキシダーゼ活性及び全血セレン濃度の測定） ａ．グルタチオンペルオキシダーゼに対するモノクロー
ナル抗体の作製及び酵素活性阻害能の測定 牛赤血球由来グルタチオンペルオキシダーゼ（ＴＯＹＯ
ＢＯ社）２００μｇ／ｍｌを等量のフロイント完全アジ
ュバントと混合し、５週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔
内に２週間間隔で４回免疫後、ブースター接種を行い、
３日後に５０％ポリエチレングリコール１０００（和光
社）を用いて、免疫マウスの脾臓細胞とマウスミエロー
マ細胞（Ｘ６３−Ａｇ８−６．５．３）とで、Ｋｏｅｈ
ｌｅｒａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ ２５
６：４９５ １９７５）らの方法により細胞融合を行っ
た。スクリーニングには、ＥＬＩＳＡ法を用いてグルタ
チオンペルオキシダーゼに強く反応するモノクローナル
抗体産生細胞を選び、限界希釈法でクローニング後、１
２株２３クローンのハイブリドーマを樹立した（表
１）。
たサンドイッチＥＬＩＳＡ法による牛血中グルタチオン
ペルオキシダーゼ活性及び全血セレン濃度の測定） ａ．グルタチオンペルオキシダーゼに対するモノクロー
ナル抗体の作製及び酵素活性阻害能の測定 牛赤血球由来グルタチオンペルオキシダーゼ（ＴＯＹＯ
ＢＯ社）２００μｇ／ｍｌを等量のフロイント完全アジ
ュバントと混合し、５週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔
内に２週間間隔で４回免疫後、ブースター接種を行い、
３日後に５０％ポリエチレングリコール１０００（和光
社）を用いて、免疫マウスの脾臓細胞とマウスミエロー
マ細胞（Ｘ６３−Ａｇ８−６．５．３）とで、Ｋｏｅｈ
ｌｅｒａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ ２５
６：４９５ １９７５）らの方法により細胞融合を行っ
た。スクリーニングには、ＥＬＩＳＡ法を用いてグルタ
チオンペルオキシダーゼに強く反応するモノクローナル
抗体産生細胞を選び、限界希釈法でクローニング後、１
２株２３クローンのハイブリドーマを樹立した（表
１）。
【００２３】
【表１】
【００２４】これらのハイブリドーマは、増殖後、免疫
抑制剤プリスタン（Ａｌｄｒｉｃｈ社）で前処理した１
０週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に５×１０6ｃｅ
ｌｌｓ／ｍｌ ＰＢＳ／マウスの濃度で移植させた。１
週間後、得られた腹水をＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ
（１．５Ｍグリシン−３Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ８．９）で
希釈し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（ファルマシア Ｌ
ＫＢ社、２５×２００ｍｍ）に充填後、上記緩衝液で十
分洗浄し、１００ｍＭクエン酸緩衝液 ｐＨ５．０で抗
体を溶出した。溶出された抗体を蒸留水で透析し、凍結
乾燥したものを精製抗体とした。
抑制剤プリスタン（Ａｌｄｒｉｃｈ社）で前処理した１
０週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に５×１０6ｃｅ
ｌｌｓ／ｍｌ ＰＢＳ／マウスの濃度で移植させた。１
週間後、得られた腹水をＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ
（１．５Ｍグリシン−３Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ８．９）で
希釈し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（ファルマシア Ｌ
ＫＢ社、２５×２００ｍｍ）に充填後、上記緩衝液で十
分洗浄し、１００ｍＭクエン酸緩衝液 ｐＨ５．０で抗
体を溶出した。溶出された抗体を蒸留水で透析し、凍結
乾燥したものを精製抗体とした。
【００２５】得られたモノクローナル抗体の中でグルタ
チオンペルオキシダーゼに対する反応性の強かったＧＰ
Ｆ−１、ＧＰＩ−２及びＧＰＪ−１の３種類のモノクロ
ーナル抗体について、それらが酵素本来の活性を阻害す
るかどうか検討を行った（図１）。０．５５μｇのグル
タチオンペルオキシダーゼに対し、３種類の精製モノク
ローナル抗体を、それぞれ抗体量を変えて３７℃で１時
間反応させた後、酵素活性をＰａｇｌｉａ ａｎｄ Ｖ
ａｌｅｎｔｉｎｅのＳｃｈｏｌｚらによる変法（Ａｍ．
Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．４０：２４５ １９７９）により
測定した。この結果、最も強い酵素活性阻害作用を示し
たモノクローナル抗体であるＧＰＪ−１を用いて、以下
に示すようなサンドイッチＥＬＩＳＡ系を作出した。
チオンペルオキシダーゼに対する反応性の強かったＧＰ
Ｆ−１、ＧＰＩ−２及びＧＰＪ−１の３種類のモノクロ
ーナル抗体について、それらが酵素本来の活性を阻害す
るかどうか検討を行った（図１）。０．５５μｇのグル
タチオンペルオキシダーゼに対し、３種類の精製モノク
ローナル抗体を、それぞれ抗体量を変えて３７℃で１時
間反応させた後、酵素活性をＰａｇｌｉａ ａｎｄ Ｖ
ａｌｅｎｔｉｎｅのＳｃｈｏｌｚらによる変法（Ａｍ．
Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．４０：２４５ １９７９）により
測定した。この結果、最も強い酵素活性阻害作用を示し
たモノクローナル抗体であるＧＰＪ−１を用いて、以下
に示すようなサンドイッチＥＬＩＳＡ系を作出した。
【００２６】ｂ．モノクローナル抗体を用いた牛血中グ
ルタチオンペルオキシダーゼ及び全血セレン濃度測定用
サンドイッチＥＬＩＳＡ系の作出 ９６穴イムノプレート（Ｎｕｎｃ社）に、０．１５Ｍリ
ン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）で２．５μｇ／ｍｌに調整し
た精製ＧＰＪ−１を１ウェルあたり１００μｌ加え、３
７℃で１時間静置して固相化した。次に、１％牛血清ア
ルブミン加ＰＢＳ（ＢＳＡ−ＰＢＳ）を１ウェルあたり
１００μｌ添加し、３７℃で１時間反応させ、ブロッキ
ングを行った。このように作製した抗体固相化済みプレ
ートは、測定時まで−２０℃で保存した。測定時には、
プレートを数分間室温に放置後、１ウェル当たり１００
μｌ〜３００μｌの０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０加ＰＢ
Ｓ（Ｔｗ２０−ＰＢＳ）で１回洗浄し、市販の牛赤血球
由来グルタチオンペルオキシダーゼ（ＴＯＹＯＢＯ
社）、または福島県内で飼養されていたホルスタイン種
牛６２頭及び黒毛和種牛５９頭、計１２１頭の全血サン
プルを１ウェルあたり５０μｌ加え３７℃で１時間反応
させた。これらの全血サンプルは、牛の頸静脈からヘパ
リン加真空採血管を用いて採血し、さらに溶血後ＰＢＳ
で３２０倍に希釈したものを用いた。Ｔｗ２０−ＰＢＳ
で３回洗浄後、ＢＳＡ−ＰＢＳで２００倍に希釈したペ
ルオキシダーゼ標識ＧＰＪ−１を１ウェルあたり５０μ
ｌ加え、３７℃で１時間反応させた。ペルオキシダーゼ
標識ＧＰＪ−１は、試験１のａで精製したＧＰＪ−１の
モノクローナル抗体を、Ｎａｋａｎｅ ａｎｄ Ｋａｗ
ａｏｉ（Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．
２２：１０８４ １９７４）の方法によりＨＲＰとカッ
プリングさせ作製し、使用するまで−８０℃に保存し
た。再びＴｗ２０−ＰＢＳで３回洗浄後、基質液［０．
０６７５％（Ｗ／Ｖ）ＡＢＴＳ（シグマ社）及び０．０
２５％（Ｖ／Ｖ）Ｈ2Ｏ2加１００ｍＭクエン酸緩衝液
ｐＨ ４．０］を５０μｌ加え、３７℃で１０分間反応
させた後、０．３２％ＮａＦ溶液をさらに５０μｌ加え
て反応を停止させ、４１４ｎｍでの吸光度を測定した。
また、同じ１２１頭の全血サンプルについてＰａｇｌｉ
ａ ａｎｄＶａｌｅｎｔｉｎｅのＳｃｈｏｌｚらによる
変法を用いてグルタチオンペルオキシダーゼ活性の測
定、及び蛍光検出高速液体クロマトグラフィー法による
セレン濃度の測定を行った。
ルタチオンペルオキシダーゼ及び全血セレン濃度測定用
サンドイッチＥＬＩＳＡ系の作出 ９６穴イムノプレート（Ｎｕｎｃ社）に、０．１５Ｍリ
ン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）で２．５μｇ／ｍｌに調整し
た精製ＧＰＪ−１を１ウェルあたり１００μｌ加え、３
７℃で１時間静置して固相化した。次に、１％牛血清ア
ルブミン加ＰＢＳ（ＢＳＡ−ＰＢＳ）を１ウェルあたり
１００μｌ添加し、３７℃で１時間反応させ、ブロッキ
ングを行った。このように作製した抗体固相化済みプレ
ートは、測定時まで−２０℃で保存した。測定時には、
プレートを数分間室温に放置後、１ウェル当たり１００
μｌ〜３００μｌの０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０加ＰＢ
Ｓ（Ｔｗ２０−ＰＢＳ）で１回洗浄し、市販の牛赤血球
由来グルタチオンペルオキシダーゼ（ＴＯＹＯＢＯ
社）、または福島県内で飼養されていたホルスタイン種
牛６２頭及び黒毛和種牛５９頭、計１２１頭の全血サン
プルを１ウェルあたり５０μｌ加え３７℃で１時間反応
させた。これらの全血サンプルは、牛の頸静脈からヘパ
リン加真空採血管を用いて採血し、さらに溶血後ＰＢＳ
で３２０倍に希釈したものを用いた。Ｔｗ２０−ＰＢＳ
で３回洗浄後、ＢＳＡ−ＰＢＳで２００倍に希釈したペ
ルオキシダーゼ標識ＧＰＪ−１を１ウェルあたり５０μ
ｌ加え、３７℃で１時間反応させた。ペルオキシダーゼ
標識ＧＰＪ−１は、試験１のａで精製したＧＰＪ−１の
モノクローナル抗体を、Ｎａｋａｎｅ ａｎｄ Ｋａｗ
ａｏｉ（Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．
２２：１０８４ １９７４）の方法によりＨＲＰとカッ
プリングさせ作製し、使用するまで−８０℃に保存し
た。再びＴｗ２０−ＰＢＳで３回洗浄後、基質液［０．
０６７５％（Ｗ／Ｖ）ＡＢＴＳ（シグマ社）及び０．０
２５％（Ｖ／Ｖ）Ｈ2Ｏ2加１００ｍＭクエン酸緩衝液
ｐＨ ４．０］を５０μｌ加え、３７℃で１０分間反応
させた後、０．３２％ＮａＦ溶液をさらに５０μｌ加え
て反応を停止させ、４１４ｎｍでの吸光度を測定した。
また、同じ１２１頭の全血サンプルについてＰａｇｌｉ
ａ ａｎｄＶａｌｅｎｔｉｎｅのＳｃｈｏｌｚらによる
変法を用いてグルタチオンペルオキシダーゼ活性の測
定、及び蛍光検出高速液体クロマトグラフィー法による
セレン濃度の測定を行った。
【００２７】市販のグルタチオンペルオキシダーゼをサ
ンプルとして測定した結果を、標準曲線として図２に示
した。また、１２１頭の全血について、ＥＬＩＳＡでの
測定値と酵素活性値との相関関係を示したものが図３、
及び全血セレン濃度との相関関係を示したものが図４で
あり、酵素活性値との相関係数Ｒは０．９６１、全血セ
レン濃度との相関係数Ｒは０．９３０と、両者ともかな
り高い値であった。この結果求められたＹ＝７．０４９
Ｘ＋１．７６７６及びＹ＝１４９．７Ｘ＋２９．０９と
いう式を用いることにより、ＥＬＩＳＡ測定値から酵素
活性値及び全血セレン濃度への換算が可能であることが
明らかになった。
ンプルとして測定した結果を、標準曲線として図２に示
した。また、１２１頭の全血について、ＥＬＩＳＡでの
測定値と酵素活性値との相関関係を示したものが図３、
及び全血セレン濃度との相関関係を示したものが図４で
あり、酵素活性値との相関係数Ｒは０．９６１、全血セ
レン濃度との相関係数Ｒは０．９３０と、両者ともかな
り高い値であった。この結果求められたＹ＝７．０４９
Ｘ＋１．７６７６及びＹ＝１４９．７Ｘ＋２９．０９と
いう式を用いることにより、ＥＬＩＳＡ測定値から酵素
活性値及び全血セレン濃度への換算が可能であることが
明らかになった。
【００２８】試験２（抗血清を用いたサンドイッチＥＬ
ＩＳＡ法による全血セレン濃度の測定） ａ．グルタチオンペルオキシダーゼに対するウサギ抗血
清の作製 市販の牛赤血球由来グルタチオンペルオキシダーゼ（Ｔ
ＯＹＯＢＯ社）１００μｇ／ｍｌ ＰＢＳを同量のフロ
イント完全アジュバントと混合し、日本白色系ウサギ
（５〜６週齢）の背部皮下の数箇所に０．２〜０．４ｍ
ｌずつ投与した。この操作を２週間間隔で３〜５回行
い、十分に抗体価が上昇したところで、ウサギの頸静脈
より全採血を行い、血液約１００ｍｌを得た。得られた
血液を室温に放置し、血餅が形成された後、３０００回
転、３０分の遠心分離により、約５０ｍｌの血清を得る
ことができた。この５０ｍｌの血清にＢｉｎｄｉｎｇ
ｂｕｆｆｅｒ（１．５Ｍグリシン−３Ｍ Ｎａｃｌ ｐ
Ｈ８．９）４５０ｍｌを加えて希釈し、試験１のａと同
様の操作を行い、抗体（ＩｇＧとして約５００ｍｇ）を
精製した。
ＩＳＡ法による全血セレン濃度の測定） ａ．グルタチオンペルオキシダーゼに対するウサギ抗血
清の作製 市販の牛赤血球由来グルタチオンペルオキシダーゼ（Ｔ
ＯＹＯＢＯ社）１００μｇ／ｍｌ ＰＢＳを同量のフロ
イント完全アジュバントと混合し、日本白色系ウサギ
（５〜６週齢）の背部皮下の数箇所に０．２〜０．４ｍ
ｌずつ投与した。この操作を２週間間隔で３〜５回行
い、十分に抗体価が上昇したところで、ウサギの頸静脈
より全採血を行い、血液約１００ｍｌを得た。得られた
血液を室温に放置し、血餅が形成された後、３０００回
転、３０分の遠心分離により、約５０ｍｌの血清を得る
ことができた。この５０ｍｌの血清にＢｉｎｄｉｎｇ
ｂｕｆｆｅｒ（１．５Ｍグリシン−３Ｍ Ｎａｃｌ ｐ
Ｈ８．９）４５０ｍｌを加えて希釈し、試験１のａと同
様の操作を行い、抗体（ＩｇＧとして約５００ｍｇ）を
精製した。
【００２９】ｂ．ウサギ精製抗体を用いた牛全血セレン
濃度測定用サンドイッチＥＬＩＳＡ系の作出 試験２のａで調整した精製抗体を固相化抗体及びペルオ
キシダーゼ標識抗体として用い、試験１のｂと同様の方
法でサンドイッチＥＬＩＳＡ系を作出した。ただし、固
相化抗体の濃度は５μｇ／ｍｌ、またペルオキシダーゼ
標識抗体は、試験１のｂの通り作製したものをさらにＢ
ＳＡ−ＰＢＳで１０００倍に希釈し使用した。測定用サ
ンプルとして、市販の牛赤血球由来グルタチオンペルオ
キシダーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社）、及び福島県内で飼養さ
れていたホルスタイン種牛７７頭の全血を用いた。さら
に同サンプルについて蛍光検出高速液体クロマトグラフ
ィー法によるセレン濃度の測定も行った。
濃度測定用サンドイッチＥＬＩＳＡ系の作出 試験２のａで調整した精製抗体を固相化抗体及びペルオ
キシダーゼ標識抗体として用い、試験１のｂと同様の方
法でサンドイッチＥＬＩＳＡ系を作出した。ただし、固
相化抗体の濃度は５μｇ／ｍｌ、またペルオキシダーゼ
標識抗体は、試験１のｂの通り作製したものをさらにＢ
ＳＡ−ＰＢＳで１０００倍に希釈し使用した。測定用サ
ンプルとして、市販の牛赤血球由来グルタチオンペルオ
キシダーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社）、及び福島県内で飼養さ
れていたホルスタイン種牛７７頭の全血を用いた。さら
に同サンプルについて蛍光検出高速液体クロマトグラフ
ィー法によるセレン濃度の測定も行った。
【００３０】市販のグルタチオンペルオキシダーゼをサ
ンプルとして測定した結果を、標準曲線として図５に示
した。また、７７頭の全血について、ＥＬＩＳＡでの測
定値と全血セレン濃度との相関関係を示したものが図６
であり、相関係数Ｒは０．８３６と高い価であった。こ
の結果求められたＹ＝１３４．８Ｘ＋２２．２４という
式を用いることにより、ＥＬＩＳＡ測定値から全血セレ
ン濃度への換算が可能であることが明らかとなった。
ンプルとして測定した結果を、標準曲線として図５に示
した。また、７７頭の全血について、ＥＬＩＳＡでの測
定値と全血セレン濃度との相関関係を示したものが図６
であり、相関係数Ｒは０．８３６と高い価であった。こ
の結果求められたＹ＝１３４．８Ｘ＋２２．２４という
式を用いることにより、ＥＬＩＳＡ測定値から全血セレ
ン濃度への換算が可能であることが明らかとなった。
【００３１】試験３（マウスモノクローナル抗体を用い
たサンドイッチＥＬＩＳＡ法による牛乳汁中グルタチオ
ンペルオキシダーゼ及び体細胞数の測定）試験１のａで
作製したモノクローナル抗体のうち、酵素活性阻害作用
の最も強かったＧＰＪ−１、及び酵素活性阻害作用を全
く示さなかったＧＰＩ−２の２種類を用いてサンドイッ
チＥＬＩＳＡを作製した。９６穴イムノプレート（Ｎｕ
ｎｃ社）に、ＰＢＳで２μｇ／ｍｌに調製した精製ＧＰ
Ｉ−１を１ウェルあたり１００μｌ加え、３７℃で１時
間静置して固相化した。次に、ＢＳＡ−ＰＢＳを１ウェ
ルあたり１００μｌ添加し、３７℃で１時間反応させ、
ブロッキングを行った。このように作製した抗体固相化
済みプレートは、測定時まで−２０℃で保存した。測定
時には、プレートを数分間室温に放置後、１ウェル当た
り１００μｌ〜３００μｌのＴｗ２０−ＰＢＳで１回洗
浄し、市販の牛赤血球由来グルタチオンペルオキシダー
ゼ（ＴＯＹＯＢＯ社）、またはホルスタイン種由来乳汁
９３検体を１ウェルあたり５０μｌ加え３７℃で１時間
反応させた。これらの乳汁は、福島県酪連生乳検査所で
乳質検査終了後のものであり、体細胞を完全に破壊する
ため−７０℃で２回凍結融解後、その原液をサンプルと
した。Ｔｗ２０−ＰＢＳで３回洗浄後、ＢＳＡ−ＰＢＳ
で８０００倍に希釈したビオチン化ＧＰＪ−１を１ウェ
ルあたり５０μｌ加え、３７℃で１時間反応させた。精
製ＧＰＪ−１のビオチン化は、市販のビオチン化キット
（アメリカンコーレックス社）を用いて行った。再びＴ
ｗ２０−ＰＢＳで３回洗浄後、市販のアビジンービオチ
ン試薬（フナコシ社）を、使用説明書通りにＰＢＳで調
整後、使用直前にＢＳＡ−ＰＢＳで１６倍に希釈したも
のを１ウェルあたり５０μｌ加え、同様に３７℃で１時
間反応させた。Ｔｗ２０−ＰＢＳで３回洗浄後、基質液
［０．０６７５％（Ｗ／Ｖ）ＡＢＴＳ（シグマ社）及び
０．０２５％（Ｖ／Ｖ）Ｈ2Ｏ2加１００ｍＭクエン酸緩
衝液ｐＨ４．０］を５０μｌ加え、３７℃で１０分間反
応させた後、０．３２％ＮａＦ溶液をさらに５０μｌ加
えて反応を停止させ、４１４ｎｍでの吸光度を測定し
た。
たサンドイッチＥＬＩＳＡ法による牛乳汁中グルタチオ
ンペルオキシダーゼ及び体細胞数の測定）試験１のａで
作製したモノクローナル抗体のうち、酵素活性阻害作用
の最も強かったＧＰＪ−１、及び酵素活性阻害作用を全
く示さなかったＧＰＩ−２の２種類を用いてサンドイッ
チＥＬＩＳＡを作製した。９６穴イムノプレート（Ｎｕ
ｎｃ社）に、ＰＢＳで２μｇ／ｍｌに調製した精製ＧＰ
Ｉ−１を１ウェルあたり１００μｌ加え、３７℃で１時
間静置して固相化した。次に、ＢＳＡ−ＰＢＳを１ウェ
ルあたり１００μｌ添加し、３７℃で１時間反応させ、
ブロッキングを行った。このように作製した抗体固相化
済みプレートは、測定時まで−２０℃で保存した。測定
時には、プレートを数分間室温に放置後、１ウェル当た
り１００μｌ〜３００μｌのＴｗ２０−ＰＢＳで１回洗
浄し、市販の牛赤血球由来グルタチオンペルオキシダー
ゼ（ＴＯＹＯＢＯ社）、またはホルスタイン種由来乳汁
９３検体を１ウェルあたり５０μｌ加え３７℃で１時間
反応させた。これらの乳汁は、福島県酪連生乳検査所で
乳質検査終了後のものであり、体細胞を完全に破壊する
ため−７０℃で２回凍結融解後、その原液をサンプルと
した。Ｔｗ２０−ＰＢＳで３回洗浄後、ＢＳＡ−ＰＢＳ
で８０００倍に希釈したビオチン化ＧＰＪ−１を１ウェ
ルあたり５０μｌ加え、３７℃で１時間反応させた。精
製ＧＰＪ−１のビオチン化は、市販のビオチン化キット
（アメリカンコーレックス社）を用いて行った。再びＴ
ｗ２０−ＰＢＳで３回洗浄後、市販のアビジンービオチ
ン試薬（フナコシ社）を、使用説明書通りにＰＢＳで調
整後、使用直前にＢＳＡ−ＰＢＳで１６倍に希釈したも
のを１ウェルあたり５０μｌ加え、同様に３７℃で１時
間反応させた。Ｔｗ２０−ＰＢＳで３回洗浄後、基質液
［０．０６７５％（Ｗ／Ｖ）ＡＢＴＳ（シグマ社）及び
０．０２５％（Ｖ／Ｖ）Ｈ2Ｏ2加１００ｍＭクエン酸緩
衝液ｐＨ４．０］を５０μｌ加え、３７℃で１０分間反
応させた後、０．３２％ＮａＦ溶液をさらに５０μｌ加
えて反応を停止させ、４１４ｎｍでの吸光度を測定し
た。
【００３２】市販のグルタチオンペルオキシダーゼを本
法で測定した結果を標準曲線として図７に示した。試験
１のｂの方法と比較すると、本法は約６０倍高感度であ
ることが明らかとなった。この９３検体の乳汁について
は、蛍光光学式体細胞数測定機（フォスエレクトリック
社製コンビフォス３６０システム）により体細胞数の測
定を行い、ＥＬＩＳＡ測定値と体細胞数との相関性につ
いて検討を行った（図８）。この結果、両者の間では、
相関係数Ｒが０．９０７という高い相関性が認められた
ことから、乳汁中グルタチオンペルオキシダーゼのほと
んどのものが体細胞中に存在していることが示唆され
た。また、Ｙ＝２８４．４Ｘ−７７．５１という換算式
を用いることにより、本法は体細胞数の簡易測定法とし
て利用可能であることが明らかとなった。
法で測定した結果を標準曲線として図７に示した。試験
１のｂの方法と比較すると、本法は約６０倍高感度であ
ることが明らかとなった。この９３検体の乳汁について
は、蛍光光学式体細胞数測定機（フォスエレクトリック
社製コンビフォス３６０システム）により体細胞数の測
定を行い、ＥＬＩＳＡ測定値と体細胞数との相関性につ
いて検討を行った（図８）。この結果、両者の間では、
相関係数Ｒが０．９０７という高い相関性が認められた
ことから、乳汁中グルタチオンペルオキシダーゼのほと
んどのものが体細胞中に存在していることが示唆され
た。また、Ｙ＝２８４．４Ｘ−７７．５１という換算式
を用いることにより、本法は体細胞数の簡易測定法とし
て利用可能であることが明らかとなった。
【００３３】乳汁１ｍｌ中の体細胞数が５０万から１０
０万個であれば乳房炎の疑い、１００万個以上であれば
乳房炎とする判定基準が一般に用いられている。従っ
て、この換算式から体細胞数５０万個に相当するＥＬＩ
ＳＡ測定値０．４５という値を用いることにより、サン
ドイッチＥＬＩＳＡ法を用いた乳房炎の判定が可能とな
った。
０万個であれば乳房炎の疑い、１００万個以上であれば
乳房炎とする判定基準が一般に用いられている。従っ
て、この換算式から体細胞数５０万個に相当するＥＬＩ
ＳＡ測定値０．４５という値を用いることにより、サン
ドイッチＥＬＩＳＡ法を用いた乳房炎の判定が可能とな
った。
【００３４】本発明によって、牛全血中のグルタチオン
ペルオキシダーゼを測定することにより、全血中のグル
タチオンペルオキシダーゼ活性と高い相関性を示す全血
セレン濃度を同時に測定することができる。また、本発
明では、従来のグルタチオンペルオキシダーゼ活性測定
法では測定不可能であった乳汁中の本酵素の測定が可能
であり、乳汁中の本酵素の大部分が体細胞に存在してい
ることから、間接的に、体細胞数の測定も同時に行うこ
とができる。
ペルオキシダーゼを測定することにより、全血中のグル
タチオンペルオキシダーゼ活性と高い相関性を示す全血
セレン濃度を同時に測定することができる。また、本発
明では、従来のグルタチオンペルオキシダーゼ活性測定
法では測定不可能であった乳汁中の本酵素の測定が可能
であり、乳汁中の本酵素の大部分が体細胞に存在してい
ることから、間接的に、体細胞数の測定も同時に行うこ
とができる。
【００３５】また、間接的に測定された乳汁中体細胞数
から牛の乳房炎を判定することができる。
から牛の乳房炎を判定することができる。
【００３６】
【実施例】以下、本発明の実施例をあげて詳述するが、
本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３７】実施例１（マウスモノクローナル抗体を用
いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法による牛血中グルタチオ
ンペルオキシダーゼ及び全血セレン濃度の測定） 日本全薬工業株式会社中央研究所付属臨床研究牧場で飼
養されている成牛黒毛和種牛２２頭について、ヘパリン
加真空採血管を用いて、頸静脈から５ｍｌ採血し、試験
１のｂと同様の操作を行い、ＥＬＩＳＡ測定値から全血
グルタチオンペルオキシダーゼ活性値及び全血セレン濃
度を換算した。また同時に、同検体について、Ｐａｇｌ
ｉａ ａｎｄ ＶａｌｅｎｔｉｎｅのＳｃｈｏｌｚらに
よる変法による酵素活性値及び蛍光検出高速液体クロマ
トグラフィー法による全血セレン濃度の測定も行った
（表２）。
いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法による牛血中グルタチオ
ンペルオキシダーゼ及び全血セレン濃度の測定） 日本全薬工業株式会社中央研究所付属臨床研究牧場で飼
養されている成牛黒毛和種牛２２頭について、ヘパリン
加真空採血管を用いて、頸静脈から５ｍｌ採血し、試験
１のｂと同様の操作を行い、ＥＬＩＳＡ測定値から全血
グルタチオンペルオキシダーゼ活性値及び全血セレン濃
度を換算した。また同時に、同検体について、Ｐａｇｌ
ｉａ ａｎｄ ＶａｌｅｎｔｉｎｅのＳｃｈｏｌｚらに
よる変法による酵素活性値及び蛍光検出高速液体クロマ
トグラフィー法による全血セレン濃度の測定も行った
（表２）。
【００３８】
【表２】
【００３９】この結果、ＥＬＩＳＡ測定値から換算され
た酵素活性値とＰａｇｌｉａ ａｎｄ Ｖａｌｅｎｔｉ
ｎｅのＳｃｈｏｌｚらによる変法による酵素活性値との
相関係数は０．９５６、またＥＬＩＳＡ測定値から換算
された全血セレン濃度と蛍光検出高速液体クロマトグラ
フィー法での全血セレン濃度との相関係数は０．９２０
と高い関連性が示された。
た酵素活性値とＰａｇｌｉａ ａｎｄ Ｖａｌｅｎｔｉ
ｎｅのＳｃｈｏｌｚらによる変法による酵素活性値との
相関係数は０．９５６、またＥＬＩＳＡ測定値から換算
された全血セレン濃度と蛍光検出高速液体クロマトグラ
フィー法での全血セレン濃度との相関係数は０．９２０
と高い関連性が示された。
【００４０】実施例２（抗血清を用いたサンドイッチＥ
ＬＩＳＡ法による牛全血セレン濃度の測定） 日本全薬工業株式会社中央研究所付属臨床研究牧場で飼
養されているホルスタイン種牛１５頭について、ヘパリ
ン加真空採血管を用いて、頸静脈から５ｍｌ採血し、試
験２のｂと同様の操作を行い、ＥＬＩＳＡ測定値から全
血セレン濃度を換算した。また同時に、同検体につい
て、蛍光検出高速液体クロマトグラフィー法による全血
セレン濃度の測定も行った（表３）。
ＬＩＳＡ法による牛全血セレン濃度の測定） 日本全薬工業株式会社中央研究所付属臨床研究牧場で飼
養されているホルスタイン種牛１５頭について、ヘパリ
ン加真空採血管を用いて、頸静脈から５ｍｌ採血し、試
験２のｂと同様の操作を行い、ＥＬＩＳＡ測定値から全
血セレン濃度を換算した。また同時に、同検体につい
て、蛍光検出高速液体クロマトグラフィー法による全血
セレン濃度の測定も行った（表３）。
【００４１】
【表３】
【００４２】この結果、ＥＬＩＳＡ測定値から換算され
た全血セレン濃度と蛍光検出高速液体クロマトグラフィ
ー法での全血セレン濃度との相関係数は０．８９８であ
り、両者の間の高い関連性が示された。
た全血セレン濃度と蛍光検出高速液体クロマトグラフィ
ー法での全血セレン濃度との相関係数は０．８９８であ
り、両者の間の高い関連性が示された。
【００４３】実施例３（マウスモノクローナル抗体を用
いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法による牛乳汁中体細胞数
の測定） 福島県内の１酪農家で飼養されているホルスタイン種牛
１３頭の左前及び左後分房から搾乳された分房別乳汁２
６検体について、試験３の方法により体細胞数の測定を
行った（表４）。
いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法による牛乳汁中体細胞数
の測定） 福島県内の１酪農家で飼養されているホルスタイン種牛
１３頭の左前及び左後分房から搾乳された分房別乳汁２
６検体について、試験３の方法により体細胞数の測定を
行った（表４）。
【００４４】
【表４】
【００４５】その結果、ＥＬＩＳＡ測定値から換算式に
より求められた体細胞数と、蛍光光学式体細胞数測定機
による測定値との間で、相関係数０．８８２という高い
相関性が認められた。
より求められた体細胞数と、蛍光光学式体細胞数測定機
による測定値との間で、相関係数０．８８２という高い
相関性が認められた。
【００４６】実施例４（サンドイッチＥＬＩＳＡ法によ
る乳房炎の判定） 福島県内の１酪農家で飼養されていたホルスタイン種乳
牛３３頭由来分房別乳汁１３２検体について、試験３の
方法に従って測定を行い、体細胞数を測定するととも
に、試験３で求められた換算式より、体細胞数５０万個
に相当するＥＬＩＳＡ測定値０．４５以上を乳房炎乳と
判定した。その結果、１３２検体中９２検体（６９．７
％）が乳房炎乳と判定された。また、同じ１３２検体に
ついて、乳房炎の簡易診断法として普及しているＰＬテ
スト（日本全薬工業株式会社）を用いて乳房炎の判定を
行い、ＥＬＩＳＡ測定値とＰＬテストによる判定結果と
の関連性について検討を行った（図９）。ＥＬＩＳＡ測
定値が０．４５以上であった９２検体中、ＰＬテストで
疑陽性または陽性と判定されたものは７９検体（８５．
９％）であり、また、ＰＬテストで陽性と判定されたも
のに、ＥＬＩＳＡ測定値０．４５以下の例がなかったこ
とから、サンドイッチＥＬＩＳＡ法とＰＬテストとの間
での高い相関性が示された。
る乳房炎の判定） 福島県内の１酪農家で飼養されていたホルスタイン種乳
牛３３頭由来分房別乳汁１３２検体について、試験３の
方法に従って測定を行い、体細胞数を測定するととも
に、試験３で求められた換算式より、体細胞数５０万個
に相当するＥＬＩＳＡ測定値０．４５以上を乳房炎乳と
判定した。その結果、１３２検体中９２検体（６９．７
％）が乳房炎乳と判定された。また、同じ１３２検体に
ついて、乳房炎の簡易診断法として普及しているＰＬテ
スト（日本全薬工業株式会社）を用いて乳房炎の判定を
行い、ＥＬＩＳＡ測定値とＰＬテストによる判定結果と
の関連性について検討を行った（図９）。ＥＬＩＳＡ測
定値が０．４５以上であった９２検体中、ＰＬテストで
疑陽性または陽性と判定されたものは７９検体（８５．
９％）であり、また、ＰＬテストで陽性と判定されたも
のに、ＥＬＩＳＡ測定値０．４５以下の例がなかったこ
とから、サンドイッチＥＬＩＳＡ法とＰＬテストとの間
での高い相関性が示された。
【００４７】
【発明の効果】以上説明したように、本発明によれば、
牛由来グルタチオンペルオキシダーゼを免疫抗原として
常法により作製した抗血清及びモノクローナル抗体を利
用した免疫化学的測定法を用いて、特異的かつ高感度に
グルタチオンペルオキシダーゼを測定することにより、
間接的に全血セレン濃度及び乳汁中体細胞数の測定、並
びに乳房炎の診断を行うことができる。
牛由来グルタチオンペルオキシダーゼを免疫抗原として
常法により作製した抗血清及びモノクローナル抗体を利
用した免疫化学的測定法を用いて、特異的かつ高感度に
グルタチオンペルオキシダーゼを測定することにより、
間接的に全血セレン濃度及び乳汁中体細胞数の測定、並
びに乳房炎の診断を行うことができる。
【図１】モノクローナル抗体による酵素活性阻害試験で
の酵素活性と抗体量との関係を示す線図である。
の酵素活性と抗体量との関係を示す線図である。
【図２】モノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡの標準
曲線図である。
曲線図である。
【図３】ＥＬＩＳＡ測定値と酵素活性値との相関関係を
示した線図である。
示した線図である。
【図４】ＥＬＩＳＡ測定値と全血セレン濃度との相関関
係を示した線図である。
係を示した線図である。
【図５】抗血清を用いたＥＬＩＳＡの標準曲線図であ
る。
る。
【図６】ＥＬＩＳＡでの測定値と全血セレン濃度との相
関関係を示した線図である。
関関係を示した線図である。
【図７】モノクローナル抗体を用いたＡＢＣ−ＥＬＩＳ
Ａの標準曲線図である。
Ａの標準曲線図である。
【図８】ＥＬＩＳＡ測定値と体細胞数との相関関係を示
した線図である。
した線図である。
【図９】ＥＬＩＳＡ測定値とＰＬテストでの乳房炎判定
結果との関係図である。
結果との関係図である。
【図１０】グルタチオンペルオキシダーゼの反応様式図
である。
である。
Claims (6)
- 【請求項１】 牛由来グルタチオンペルオキシダーゼに
対する抗体を用いた免疫化学的測定法を利用し、血中グ
ルタチオンペルオキシダーゼを測定することによる、全
血セレン濃度の間接的測定法。 - 【請求項２】 免疫化学的測定法として酵素抗体法を用
いる、請求項１記載の全血セレン濃度の間接的測定法。 - 【請求項３】 牛由来グルタチオンペルオキシダーゼに
対する抗体を用いた免疫化学的測定法を利用し、乳汁中
グルタチオンペルオキシダーゼを測定することによる、
乳汁中体細胞数の間接的測定法。 - 【請求項４】 免疫化学的測定法として酵素抗体法を用
いる、請求項３記載の乳汁中体細胞数の間接的測定法。 - 【請求項５】 牛由来グルタチオンペルオキシダーゼに
対する抗体を用いた免疫化学的測定法を利用し、乳汁中
グルタチオンペルオキシダーゼを測定して乳汁中体細胞
数を間接的に測定することにより乳房炎を診断する乳房
炎診断法。 - 【請求項６】 免疫化学的測定法として酵素抗体法を用
いる、請求項５記載の乳房炎診断法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20090795A JPH0949842A (ja) | 1995-08-07 | 1995-08-07 | 抗体を用いた牛の血中グルタチオンペルオキシダーゼ、全血セレン濃度、乳汁中体細胞数の測定法及び乳房炎診断法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20090795A JPH0949842A (ja) | 1995-08-07 | 1995-08-07 | 抗体を用いた牛の血中グルタチオンペルオキシダーゼ、全血セレン濃度、乳汁中体細胞数の測定法及び乳房炎診断法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0949842A true JPH0949842A (ja) | 1997-02-18 |
Family
ID=16432256
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20090795A Pending JPH0949842A (ja) | 1995-08-07 | 1995-08-07 | 抗体を用いた牛の血中グルタチオンペルオキシダーゼ、全血セレン濃度、乳汁中体細胞数の測定法及び乳房炎診断法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0949842A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009244041A (ja) * | 2008-03-31 | 2009-10-22 | National Agriculture & Food Research Organization | 過酸化水素の分解反応による乳房炎検出方法 |
| CN114113064A (zh) * | 2021-12-27 | 2022-03-01 | 郑州大学 | 基于苯并双噻唑的光响应类氧化物酶及其制备方法和在比色检测食品中谷胱甘肽的应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0587815A (ja) * | 1991-02-08 | 1993-04-06 | Taiyo Kagaku Co Ltd | 抗血漿型グルタチオンパーオキシダーゼ抗体及びこれを用いた診断薬 |
-
1995
- 1995-08-07 JP JP20090795A patent/JPH0949842A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0587815A (ja) * | 1991-02-08 | 1993-04-06 | Taiyo Kagaku Co Ltd | 抗血漿型グルタチオンパーオキシダーゼ抗体及びこれを用いた診断薬 |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009244041A (ja) * | 2008-03-31 | 2009-10-22 | National Agriculture & Food Research Organization | 過酸化水素の分解反応による乳房炎検出方法 |
| CN114113064A (zh) * | 2021-12-27 | 2022-03-01 | 郑州大学 | 基于苯并双噻唑的光响应类氧化物酶及其制备方法和在比色检测食品中谷胱甘肽的应用 |
| CN114113064B (zh) * | 2021-12-27 | 2023-09-08 | 郑州大学 | 基于苯并双噻唑的光响应类氧化物酶及其制备方法和在比色检测食品中谷胱甘肽的应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4638350B2 (ja) | ヒトまたは動物の組織、血液もしくは体液中のヘプシジンの存在または量を検出する方法 | |
| EP0166623A2 (en) | Antibody lectin sandwich assay | |
| JP3673522B2 (ja) | 抗アネキシンｖモノクローナル抗体並びにその利用及びそれを産生するハイブリドーマ細胞系 | |
| KR100756117B1 (ko) | 모노클로날 항체, 하이브리도마, 면역분석 방법 및 진단킷트 | |
| WO1986002364A1 (en) | Monoclonal antibodies and their use | |
| JP2008239511A (ja) | モノクローナル抗体、ウマｓａａ測定用キット及びウマ炎症性疾患診断方法 | |
| JP2867325B2 (ja) | 抗ｐｉｖｋａ−ｉｉ抗体産生ハイブリドーマ及び免疫学的測定方法 | |
| EP3919906A1 (en) | Method for immunologically analyzing free aim in biological specimen, and method for detecting nash in subject | |
| US5525476A (en) | Immunoassay, monoclonal antibody, and hybridoma | |
| JPH0949842A (ja) | 抗体を用いた牛の血中グルタチオンペルオキシダーゼ、全血セレン濃度、乳汁中体細胞数の測定法及び乳房炎診断法 | |
| Headings et al. | Identification of specific hemoglobins within individual erythrocytes | |
| JP3998245B2 (ja) | 酸化アポリポタンパク質ａｉ及びそれを含有する酸化リポタンパク質の測定法及びキット | |
| RU2210074C2 (ru) | Иммунологический анализ человеческого медуллазина и диагностика рассеянного склероза с его помощью | |
| CA1287801C (en) | Method for determining human collagen peptides by way of enzyme immunoassay | |
| JP4178632B2 (ja) | 干渉作用を回避する方法及び試薬 | |
| JP4164804B2 (ja) | 酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂに特異的なモノクローナル抗体およびその用途 | |
| JP3142786B2 (ja) | 動脈硬化症の測定用キット及びこれに用いる抗体 | |
| JP6667806B2 (ja) | 甲状腺刺激ホルモンレセプター抗体アイソタイプ測定を用いたバセドウ病の病態診断キット及びバセドウ病の病態の診断方法 | |
| WO1986002359A1 (en) | Monoclonal antibodies and their use | |
| JP4422291B2 (ja) | ヒトメダラシンの免疫学的測定方法 | |
| JPH02141665A (ja) | 糞便中のヘモグロビンの検出方法 | |
| JPH0875743A (ja) | 競合抗体を利用するセルロプラスミンの測定方法 | |
| JP3512545B2 (ja) | ヘモグロビンａ１ｃの測定方法 | |
| RU2197736C1 (ru) | Реагент для иммуноферментного анализа и способ иммуноферментного тестирования специфических антител при описторхозе, вызываемом печеночной трематодой opisthorhis felineus | |
| JP4037586B2 (ja) | ヒトメダラシンの免疫学的測定方法 |